Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Polarisatiegevoelige twee-fotonmicroscopie voor een labelvrije structurele karakterisering van amyloïden

Published: September 8, 2023 doi: 10.3791/65670
Automatic Translation
1, 1, 1
1Institute of Advanced Materials, Wrocław University of Science and Technology

Summary

Dit artikel beschrijft hoe polarisatiegevoelige twee-fotonmicroscopie kan worden toegepast om de lokale organisatie binnen labelvrije amyloïde superstructuren-sferulieten te karakteriseren. Het beschrijft ook hoe het monster moet worden voorbereid en gemeten, de vereiste opstelling moet worden samengesteld en de gegevens moeten worden geanalyseerd om informatie te verkrijgen over de lokale organisatie van amyloïde fibrillen.

Abstract

Vergeleken met zijn tegenhanger met één foton is excitatie met twee fotonen gunstig voor bioimaging-experimenten vanwege de lagere fototoxiciteit, diepere weefselpenetratie, efficiënte werking in dicht opeengepakte systemen en verminderde hoekfotoselectie van fluoroforen. De introductie van polarisatieanalyse in twee-fotonfluorescentiemicroscopie (2PFM) zorgt dus voor een nauwkeurigere bepaling van de moleculaire organisatie in een monster in vergelijking met standaard beeldvormingsmethoden op basis van lineaire optische processen. In dit werk richten we ons op polarisatiegevoelige 2PFM (ps-2PFM) en de toepassing ervan bij de bepaling van moleculaire ordening binnen complexe biostructuren-amyloïde sferulieten . Neurodegeneratieve ziekten zoals de ziekte van Alzheimer of Parkinson worden vaak gediagnosticeerd door de detectie van amyloïde-eiwitaggregaten die worden gevormd als gevolg van een verstoord eiwitmisvouwingsproces. Het onderzoeken van hun structuur leidt tot een beter begrip van hun creatiepad en bijgevolg tot het ontwikkelen van gevoeligere diagnostische methoden. Dit artikel presenteert de ps-2PFM die is aangepast voor de bepaling van lokale fibrilordening in de runderinsuline-sferulieten en sferische amyloïdogene eiwitaggregaten. Bovendien bewijzen we dat de voorgestelde techniek de driedimensionale organisatie van fibrillen in de sferuliet kan oplossen.

Introduction

In de afgelopen decennia, hoewel er een aanzienlijke ontwikkeling is geweest van talrijke fluorescentiemicroscopietechnieken voor bioimaging van eiwitten en hun aggregaten1, zijn er slechts enkele gebruikt om hun lokale ordening binnen het monster op te lossen 2,3. Fluorescentie lifetime imaging microscopie4 werd gebruikt om de intrinsieke structurele heterogeniteit van amyloïde superstructuren-sferulieten te bestuderen. Bovendien zou kwantitatieve bepaling van de lokale ordening in complexe en dicht opeengepakte biostructuren zoals sferulieten kunnen worden opgelost met behulp van polarisatiegevoelige methoden3. Standaard fluorescentietechnieken met oppervlakkige weefselpenetratie zijn echter beperkt, aangezien het gebruik van UV-VIS-golflengten om fluoroforen in vivo te exciteren leidt tot een hoge verstrooiing van weefsellicht5. Bovendien vereist dergelijke beeldvorming vaak het ontwerpen en binden van specifieke fluorescerende sondes aan een gericht biomolecuul, waardoor de kosten en de hoeveelheid werk die nodig is om beeldvorming uit te voeren, toenemen.

Om deze problemen aan te pakken, heeft ons team onlangs de polarisatiegevoelige twee-foton geëxciteerde fluorescentiemicroscopie (ps-2PFM) aangepast voor labelvrije beeldvorming van biologische structuren 6,7. Ps-2PFM maakt het mogelijk om de afhankelijkheid van de intensiteit van de fluorescentie van twee fotonen te meten van de richting van de lineaire polarisatie van de excitatiestraal en de polarisatie van de uitgezonden fluorescentiete analyseren 8. De implementatie van deze techniek vereist aanvulling van het standaard excitatiepad van de multi-fotonenmicroscoopopstelling (Figuur 1) met een halfgolfplaat om het lichtpolarisatievlak te regelen. Vervolgens worden polaire grafieken, die de afhankelijkheid van de intensiteit van de geëxciteerde fluorescentie met twee fotonen van de polarisatie van de excitatielaserstraal weergeven, gemaakt van signalen die worden verzameld door twee lawinefotodiodes, waardoor de twee, onderling loodrecht op elkaar staande componenten van fluorescentiepolarisatie worden verzameld.

De laatste stap is het data-analyseproces, waarbij rekening wordt gehouden met de impact van de optische elementen, zoals dichroïsche spiegels of een objectief met een hoge numerieke apertuur, op polarisatie. Vanwege de aard van het twee-fotonproces biedt deze methode zowel een verminderde hoekfotoselectie als een verbeterde axiale resolutie, aangezien de excitatie van fluoroforen met twee fotonen buiten het brandpuntsvlak waarschijnlijk beperkt is. Het werd ook bewezen dat soortgelijke methoden met succes konden worden geïmplementeerd voor in vivo beeldvorming van nabij-infraroodsondes (NIR)voor beeldvorming van diep weefsel9. Ps-2PFM is eerder toegepast op beeldfluoroforen in celmembranen10 en DNA11,12, evenals niet-standaard fluorescerende markers van biologische systemen, zoals gouden nanodeeltjes13. In al deze voorbeelden werd de informatie over de organisatie van biomoleculen echter indirect verkregen en vereiste een vooraf gedefinieerde wederzijdse oriëntatie tussen een fluorofoor en een biomolecuul.

In een van onze recente artikelen hebben we aangetoond dat ps-2PFM met succes kan worden toegepast voor het bepalen van de lokale polarisatie van de autofluorescentie van amyloïde superstructuren en fluorescentie van thioflavine T, een amyloïde-specifieke kleurstof, gebonden aan amyloïde fibrillen in sferulieten6. Bovendien hebben we in een andere bewezen dat ps-2PFM kan worden gebruikt om de oriëntatie van amyloïde fibrillen in amyloïde sferulieten te detecteren in een regime van submicrongrootte, wat werd bevestigd door het te correleren met transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) beeldvorming7. Het bereiken van dit resultaat was mogelijk dankzij i) intrinsieke autofluorescentie van sferulieten en amyloïden, wanneer ze worden geëxciteerd met één of twee fotonen, intrinsieke autofluorescentie vertonen met emissiemaxima in een bereik van 450 tot 500 nm en absorptiedoorsneden van twee fotonen die vergelijkbaar zijn met standaard fluorescerende kleurstoffen14, ii) wiskundige modellen die eerder zijn geïntroduceerd om te beschrijven hoe ps-2PEF van kleurstoffen die biologische membranen en DNA-structuren labelen, kunnen worden toegepast op fluorescentie vertoond door sferulieten en kleurstoffen die eraan zijn gebonden 8,11,15. Daarom raden we ten zeerste aan om, voordat we verder gaan met de analyse, de vereiste theorie door te nemen die wordt beschreven in zowel de hoofdtekst als de ondersteunende informatie van ons eerste artikel over dit onderwerp6. Hier presenteren we het protocol voor het toepassen van de ps-2PFM-techniek voor een labelvrije amyloïde structurele karakterisering van runderinsuline sferulieten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Voorbereiding van de microscoopglaasjes met volgroeide sferulieten

OPMERKING: Zie de materiaaltabel voor meer informatie over alle materialen, reagentia en apparatuur die in dit protocol worden gebruikt. Alle oplossingen werden bereid met gedeïoniseerd water (18,2 MΩ·cm bij 25 °C) verkregen uit het waterzuiveringssysteem.

  1. Incubeer de amyloïde sferulieten op basis van het protocol beschreven door Krebs et al16. met enkele aanpassingen, zoals hieronder beschreven.
    1. Weeg 10 mg insulinepoeder af in een buisje van 1,5 ml.
    2. Los het poeder op met een aliquot van 1 ml van de gedeïoniseerdeH2O/HCl-oplossing (pH 1,5).
    3. Sluit het monster af met de tape en plaats het in een thermische mixer om gedurende 24 uur bij 70 °C (0 rpm) te incuberen.
      OPMERKING: Om beeldvorming van amyloïden in hun oorspronkelijke (d.w.z. gehydrateerde) omgeving uit te voeren en vervorming van het monster als gevolg van uitdroging te voorkomen, is het noodzakelijk om microscoopglaasjes te maken volgens de volgende beschrijving (schema weergegeven in afbeelding 2).
  2. Was het glazen objectglaasje van de microscoop grondig met water.
  3. Dompel de glaasjes in methanol en laat ze onder omgevingsomstandigheden drogen op een stofvrij doekje.
  4. Neem met een automatische pipet een aliquot van 100 μl van de sferuliet uit het buisje (stap 1.1.2) en voeg dit toe aan het putje dat zich in het centrale gedeelte van het objectglaasje bevindt.
  5. Bedek de oplossing met een dekglaasje en vermijd de vorming van luchtbellen.
  6. Breng het monteerproduct langs de randen van het dekglaasje op het glaasje aan met een automatische pipet om de natuurlijke oplossing van de sferulieten te verzegelen.
    OPMERKING: Het is van groot belang om de bevestiging van de schuif op zowel het dekglaasje als de schuifoppervlakken te deponeren. Doe dit onder de dampende kap i.v.m. de giftigheid van het vluchtige oplosmiddel (xyleen). Zie het inzetstuk in figuur 2.
  7. Laat het microscoopmonster onder omgevingsomstandigheden staan zodat het monteermiddel kan uitharden.
    OPMERKING: Het uithardingsproces is temperatuur- en vochtigheidsafhankelijk, maar moet binnen 12 uur zijn voltooid.
  8. Controleer of insulinesferulieten correct zijn gevormd met behulp van een gepolariseerde optische microscoop (POM) met gekruiste polarisatoren. Scan door het monster op zoek naar een karakteristiek patroon van heldere gebieden, een Maltees kruis genoemd, zoals weergegeven in figuur 3.
    OPMERKING: De amyloïde sferulieten kunnen worden gedefinieerd als bolvormige superstructuren die worden gekenmerkt door een heterogene morfologie met een kern-schaalstructuur. In detail zijn ze samengesteld uit een amorfe kern en radiaal groeiende amyloïde fibrillen16. Vanwege het anisotrope karakter van sferuliet structuren, kunnen ze onderscheidend interageren met gepolariseerd licht (bijv. door breking) en hun fase veranderen, wat gemakkelijk kan worden waargenomen onder POM met gekruiste polarisatoren. Deze methode werd gebruikt om alleen volledig ontwikkelde sferulieten te bestuderen die werden gekenmerkt door een modelachtig Maltase-kruispatroon. Bijgevolg werden aggregaten of structureel vervormde sferulieten uitgesloten van verder onderzoek.

2. Bouwen en uitlijnen van het systeem

OPMERKING: Een schematische weergave van een polarisatiegevoelige twee-fotonenmicroscoop is te vinden in figuur 1.

  1. Installeer een femtosecondelaser met de uitgangsgolflengte in het bereik van 690-1.080 nm, bijvoorbeeld werkend op een modusvergrendelde Ti:Sapphire-laser met ~100 fs-pulsen met een herhalingsfrequentie van 80 MHz.
  2. Voeg een halfgolfplaat gemonteerd op een rotatietafel toe aan het excitatiepad van de opstelling om de polarisatie van het invallende licht in het XY-microscoopmonstervlak te regelen.
  3. Installeer de dichroïsche spiegel om de excitatiestraal van de detectieoptiek af te snijden.
    OPMERKING: De optische eigenschappen van een dichroïsche spiegel moeten het mogelijk maken de excitatiestraal (naar het monster) te reflecteren in het NIR-golflengtebereik en tegelijkertijd transparant te zijn voor het golflengtebereik dat overeenkomt met de emissie van de monsters.
  4. Installeer een piëzo-elektrische scantafel voor rasterscans binnen het XY-vlak voor een gekozen Z.
  5. Monteer het hoge NA-immersieobjectief, bijvoorbeeld een apochromatisch olie-immersieobjectief 100x/1.4 NA.
    OPMERKING: Aangezien de hele opstelling in een epifluorescentiemodus werkt, passeren de invallende en uitgezonden signalen hetzelfde doel.
  6. Voeg in het emissiepad een polariserende bundelsplitser toe die de geëxciteerde emissie van twee fotonen splitst in twee orthogonaal gepolariseerde componenten (IX en IY)
  7. Installeer twee fotontellende lawinefotodiodes (APD's) in een configuratie waardoor ze respectievelijk licht kunnen opvangen dat wordt overgedragen en gereflecteerd met behulp van de bundelsplitser (Figuur 1).
  8. Monteer de juiste golflengteafhankelijke cut-off filters op het excitatie- en emissiepad van het systeem, bijvoorbeeld een 800 nm long-pass filter direct in het excitatie optische pad en een 700 short-pass filter in het emissiepad.
    NOTITIE: Analyseer de emissiespectra van sferuliet zodat elke mogelijke bijdrage van tweede harmonische generatie (SHG) of laserlicht kan worden uitgesloten met behulp van de juiste emissiefilters. Het is ook vermeldenswaard dat dit systeem ook metingen van polarisatiegevoelige SHG mogelijk zou moeten maken, die kunnen worden gebruikt om de ordening van biomoleculen in de monsters op te lossen. De data-analyse van het SHG-signaal verschilt echter van fluorescentie, die meer in detail werd beschreven door Aït-Belkacem et al.17.
  9. Lijn het hele systeem uit (met behulp van de uitlijningsmodus die in veel lasers is ingebouwd) totdat vergelijkbare signaalintensiteiten worden verzameld met behulp van beide fotodiodes.
  10. Controleer of de excitatiestraal die wordt scherpgesteld door het hoge NA-objectief en wordt afgebeeld op een camera een concentrische cirkelvorm heeft, zoals weergegeven in afbeelding 4A.
  11. Pas de scantijd en het bijbehorende vermogen aan om de schade die door de invallende laser op het monster wordt veroorzaakt, tot een minimum te beperken. Voorbeeldige puntvormige verbranding wordt weergegeven in figuur 4B. Meet het nominale vermogen met behulp van een digitale draagbare vermogensmeter die is aangesloten op een fotodiodevermogenssensor die zich bij de ingang van de behuizing van de microscoop bevindt.
    NOTITIE: Biologische monsters kunnen gemakkelijk worden verbrand dankzij laserverlichting. In dit geval bleek het vermogensbereik van 100 -900 μW (bij het brandpunt van de objectieflens) een uitstekende afweging te zijn tussen de stabiliteit van het monster en intense emissie.
  12. Test vóór de monstermeting de kwaliteit van de uitlijning van de optica met een isotroop referentiemonster (bijv. fluoresceïne belichaamd in het amorfe polymeer). Om de kalibratiecontrole uit te voeren, volgt u de procedure beschreven in rubriek 3 met behulp van een isotrope referentie in plaats van een amyloïdmonster.
    OPMERKING: In de veronderstelling dat de microscopie-opstelling ideaal is aangepast voor het monster met isotrope eigenschappen, moeten beide 2P-emissiecomponenten (IX en IY) die met twee APD's worden gedetecteerd, worden gekenmerkt door dezelfde intensiteit (Figuur 4C).

3. Meting van de runderinsuline sferulieten

OPMERKING: Om alle beschreven ps-2PF-metingen uit te voeren, werd handgeschreven software gebruikt, die de posities van de piëzo-elektrische trap en de halve golfplaat regelt en het signaal van beide fotodiodes verzamelt, waardoor de XY-scans (rasterscans) van geselecteerde gebieden op microscoopglaasjes kunnen worden uitgezet, evenals polaire grafieken van specifieke monstercoördinaten. Er zijn ook aanvullende opmerkingen aan het protocol toegevoegd, waardoor gebruikers de meting zonder protocol kunnen uitvoeren, aangezien zowel de piëzo-trap als de rotatietrap die wordt gebruikt om de halfgolfplaat te roteren, kunnen worden bestuurd met hun eigen controllers of bijbehorende software. Toch wordt het sterk aanbevolen om een algoritme te schrijven dat de rotatiehoek van een halfgolfplaat combineert met een intensiteit van 2PEF die met beide fotodiodes wordt verzameld, aangezien deze correlatie (polaire grafieken) cruciaal is voor een goede data-analyse die resulteert in structurele informatie.

  1. Monteer het preparaat met de sferulieten op de piëzo-elektrische tafel (immobiliseer het glasplaatje met tape). Zorg ervoor dat u het zo monteert dat een dunne glazen zijde (dekglaasje) naar het objectief is gericht, aangezien hoge numerieke objectieven worden gekenmerkt door relatief korte werkafstanden.
    OPMERKING: Aangezien onderdompeling in olie wordt gebruikt, moet een kleine druppel minerale olie op het objectief worden aangebracht voordat het monster wordt gemonteerd en scherpgesteld.
  2. Door de XY- en Z-posities te veranderen met behulp van microscoopknoppen, richt u het objectief op een van de sferulieten in de oplossing, maar houd er rekening mee dat, omdat sferuliet diameters meestal in het bereik van tientallen μm liggen, u zich concentreert binnen het centrale gebied van de hele structuur. Zoek naar zwarte en witte halo's rond de specifieke sferuliet als tekenen van respectievelijk onder- en bovenfocus. Pas de "Z"-as aan zodat deze tussen deze uitersten ligt.
    OPMERKING: Het is belangrijk om een geïsoleerd monster te vinden zonder structurele defecten. Extreem kleine sferulieten kunnen afdrijven als gevolg van de materiaalspanning die door het objectief wordt veroorzaakt, terwijl de grootste structuren waarschijnlijk geaggregeerd of sterk vervormd zijn.
  3. Centreer de sferuliet in het gezichtsveld van het waargenomen microscopische vlak en bepaal de grootte van de XY-scan door te kijken hoeveel piëzofasestappen in X- en Y-richtingen (weergegeven op de piëzostage-controller of in de software) nodig zijn om het gebied van de hele structuur te bestrijken.
    NOTITIE: Het wordt aanbevolen om het systeem zo in te stellen dat het begin van de XY-scan zich in de buurt van een van de hoeken van de sferuliet bevindt en samenvalt met de nulpositie van de tafel (X en Y = 0)
  4. Pas de volgende scanparameters aan:
    1. Pas de polarisatie van de excitatiestraal aan en draai de halfgolfplaat om de polarisatie te verkrijgen die overeenkomt met de "X"- en "Y"-assen van het microscoopmonstervlak.
      OPMERKING: Dit kan worden gedaan door de polaire grafieken van isotroop fluorescerend medium zoals fluoresceïne te meten. Voor dergelijke materialen is de maximale fluorescentie-intensiteit parallel aan de polarisatie van de excitatiestraal; dus het roteren van de halfgolfplaat past de polarisatie aan met de X- en Y-as op het waarnemingsvlak, ook aangeduid als X- en Y-as op polaire grafieken zoals in figuur 4C. Volledige polaire grafieken kunnen worden gemeten door de gemeten 2PEF-intensiteit op beide fotodiodes te verzamelen voor 180° rotatie van de halfgolfplaat (360° rotatie van excitatielichtpolarisatie) en de intensiteit te correleren met de polarisatiehoek van het excitatielicht. Het kan handmatig worden gedaan, door de emissie-intensiteit voor elke halve golfplaathoek afzonderlijk te meten en deze vervolgens samen te voegen tot een polaire grafiek in data-analysesoftware of automatisch, met behulp van speciale of zelfgeschreven software.
    2. Pas de piëzostage-parameters aan: scansnelheid, stap en bereik om het gebied van de hele sferuliet te bestrijken.
      OPMERKING: Het scanbereik moet groter zijn dan de diameter van de sferuliet om de gehele bovenbouw volledig in te kaderen binnen de rasterscan. Lage scansnelheid en stap stellen gebruikers in staat om afbeeldingen van hoge kwaliteit te verkrijgen; Dit kan echter leiden tot verbranding van het monster. Daarom is een afweging afhankelijk van de grootte van de sferuliet noodzakelijk. Deze parameters kunnen niet universeel worden toegepast. Voorbeelden van parameters die in figuur 5A worden gebruikt: scanbereik 45 x 45 μm, scanstap 1 μm en scansnelheid 2 μm/s.
  5. Open de sluiter, zet de fotodiodes aan en verzamel en Equation 2 2P-emissiecomponenten Equation 1 voor elke stap van het geselecteerde scangebied - voor de excitatiestraal die overeenkomstig is gepolariseerd met de X- en vervolgens de Y-as. Voorbeeldige twee-foton geëxciteerde autofluorescentie (2PAF) rasterscans van insulinesferulieten worden weergegeven in figuur 5A.
    OPMERKING: Het meten van rasterscans vereist het correleren van piëzofase-coördinaten met Equation 1 en Equation 2 verzamelde emissiecomponenten, wat handmatig kan worden gedaan door de intensiteit op elk afzonderlijk punt van het geselecteerde gebied te meten en deze vervolgens samen te voegen tot een 2D-matrix, of automatisch, via zelfgeschreven software. Rasterscans kunnen worden gepresenteerd als een optelsom van de intensiteit van Equation 1 de Equation 2 emissiecomponenten of als onderscheidend voor een specifieke emissiecomponent. Omdat ze sterk structuurafhankelijk zijn, zijn structurele vervormingen in sferulieten gemakkelijk zichtbaar. Door de beweging van de microscooptafel kunnen sommige monsters echter buiten het gezichtsveld afdrijven. Daarom moeten afbeeldingen worden gescreend op artefacten. Het is noodzakelijk om de positie van de sferuliet voor en na de scan te controleren.
  6. Om een volledige polarisatieanalyse uit te voeren vanaf de specifieke plek op het monster, schakelt u de excitatiestraal uit.
  7. Kies vervolgens specifieke coördinaten van piëzostage die overeenkomen met de gekozen locatie op de sferuliet waar de informatie over de oriëntatie van moleculen vereist is met de sub-μm-resolutie.
  8. Pas de piëzo-elektrische tafel aan om het gezichtsveld te centreren op aangegeven (X, Y).
  9. Schakel de excitatiestraal in en voer een volledige (360°) polarisatieanalyse van Equation 1 en Equation 2 emissie uit door de rotatie van de halfgolfplaat (180° rotatie) in te schakelen. Presenteer 2PF Ix- en Iy-componenten in de vorm van een polaire grafiek (zoals weergegeven in figuur 5B).
    OPMERKING: Deze stap kan op verschillende plaatsen in de steekproef worden herhaald om voldoende gegevens te verzamelen.

4. Bepaling van de lokale fibrilordening in de runderinsuline sferulieten

OPMERKING: Alle numerieke berekeningen die verband houden met de data-analyse zijn uitgevoerd met behulp van de programmeertaal Python en gebaseerd op de functies die beschikbaar zijn in de bibliotheken NumPy en SciPy. Voor het plotten van de gegevens is de Matplotlib-bibliotheek vereist. Alle berekeningen zijn gebaseerd op formules die in ondersteunende informatie worden gepresenteerd in een van de artikelen van Obstarczyk et al.6.

  1. Simulatie van de intensiteit van twee-fotonfluorescentie geëxciteerd voor de gespecificeerde verdeling van moleculen met een geselecteerde richting van de polarisatie van het invallende licht (aangeduid met α)
    OPMERKING: De gepresenteerde formules zijn gebaseerd op de aanname van parallelle absorptie- en emissiedipoolmomenten van een fluorofoor. Voor een bespreking van andere gevallen (bijv. verschillende richtingen van de absorptie- en emissiedipoolmomenten, energieoverdracht tussen de fluoroforen), zie het artikel van Le Floc'h et al8.
    1. Zoek de parameters die verantwoordelijk zijn voor de variatie van het elektrische veld door polarisatiemenging en depolarisatie-effecten veroorzaakt door de dichroïsche spiegel die in een opstelling is gemonteerd:
      1. γ vertegenwoordigt de amplitudefactor tussen de reflectiviteit van Equation 3 en Equation 4 gepolariseerd licht van een dichroïsche spiegel.
      2. δ staat voor de faseverschuiving (ellipticiteit) tussen Equation 3 en Equation 4 gepolariseerd licht.
        OPMERKING: Het correct definiëren van deze twee parameters is cruciaal voor een succesvolle structurele karakterisering vanwege hun sterke invloed op de vorm van gemeten polaire grafieken11,18. In het geval van het gepresenteerde systeem werden beide parameters bepaald tijdens ellipsometriemetingen van een dichroïsche spiegel die in een systeem werd toegepast.
    2. Bereken de invallende elektrische veldvectoren die zich voortplanten in de X- en Y-as van elke hoek gemeten tijdens de ps-TPFM-meting met behulp van vergelijkingen (1-5).
      Equation 5 (1)
      Equation 6 (2)
      Equation 7 (3)
      Equation 8 (4)
      Equation 9 (5)
      OPMERKING Als de intensiteit met stap 1° over de hele 360° wordt gemeten, bereken dan de elektrische veldvectoren voor alle 360°. Alle hoeken moeten in radialen zijn. ρ parameter is verbonden met de optische frequentie ω van het gesimuleerde elektrische veld (ρ=ω·t) en geïntegreerd gebruikt van 0 tot 2π tijdens de berekeningen van de invallende elektrische veldvectoren die zich voortplanten in de X- en Y-as voor elke hoek α gemeten tijdens de ps-TPFM-meting.
    3. Definieer de functies voor overgangsdipoolmomenten in richtingen van drie assen van een cartesisch systeem volgens vergelijkingen (6-8):
      Equation 10 (6)
      Equation 11 (7)
      Equation 12 (8)
      OPMERKING: φ is de oriëntatiehoek van de lange as van amyloïde fibrillen in het XY-monsterframe. θ- en φ-hoeken zijn de polaire en azimutale hoeken die worden gebruikt om de oriëntatie van het overgangsdipoolmoment van een fluorofoor te definiëren.
    4. Gebruik de in stap 4.1.3 gedefinieerde functies. om functies te definiëren voor Jx (Φ,θ,φ) en JY(Φ,θ,φ), die verantwoordelijk zijn voor de bijdrage van focussering bij strak licht met een hoog numeriek apertuurobjectief aan de fluorescentiepolarisatiedetectie in X- en Y-richting met behulp van vergelijkingen (9, 10).
      Equation 13 (9)
      Equation 14 (10)
      OPMERKING: K1, K2, K3 factoren zijn gerelateerd aan het microscoopobjectief dat wordt gebruikt tijdens de ps-TPFM-meting. In deze experimenten werd een apochromatisch olie-immersieobjectief van 100x/1.4 NA gebruikt en de factoren K1, K2, K3 waren respectievelijk 2.945, 0.069 en 1.016.
    5. Definieer een functie voor f(Ω), een moleculaire hoekverdeling, afhankelijk van de halve opening van een fluorofoorkegel Ψ, met een variabele dikte ΔΨ; Gebruik vergelijking (11). De grafische weergave van alle drie de hoeken met betrekking tot amyloïdfibril is weergegeven in figuur 6.
      Equation 15(11)
      OPMERKING: Wees voorzichtig bij het schrijven van de exponent - de macht van 2 werkt op het functieargument, niet op de hele functie!
    6. Definieer alle fWWIJKL-factoren zoals weergegeven in vergelijkingen (12-21).
      Equation 16 (12)
      Equation 17 (13)
      Equation 18 (14)
      Equation 19 (15)
      Equation 20 (16)
      Equation 21 (17)
      Equation 22 (18)
      Equation 23 (19)
      Equation 24 (20)
      Equation 25 (21)
    7. Bereken de intensiteit Equation 26 van de geëxciteerde fluorescentie van twee fotonen en voor elke gemeten hoek (op dezelfde manier als in punt 4.1.2) met behulp van vergelijkingen Equation 27 (22, 23).
      Equation 28Equation 29 = (22)
      Equation 30Equation 31 = (23)
    8. Controleer of de simulatie correct werkt aan de hand van de volgende variabelewaarden (geplaatst in de legenda van Figuur 7) en vergelijk de verkregen resultaten met Figuur 7A-C.
      OPMERKING: Alle graden moeten in radialen worden geschreven.
  2. Pas de gesimuleerde intensiteiten aan in de intensiteit van twee-foton-geëxciteerde autofluorescentie van runderinsulinesferulieten verzameld tijdens ps-2PFM-metingen.
    OPMERKING: Het oplossen van de sferulaatstructuur op basis van ps-2PFM-metingen vereist het gebruik van de vergelijkingen die in het protocol zijn geschreven om de theoretische intensiteit van twee-foton geëxciteerde fluorescentie te simuleren en alle parameters te passen die verband houden met de bestelling van moleculaire fluorofoor. Het vereist meerdere iteraties over de verschillende waarden van Φ, een hoek die de rotatie van de fibril in het XY-microscoopmonster beschrijft, en ΔΨ, aberraties van de conische verdeling van de emissiedipool Ψ als gevolg van de moleculaire rotaties in filamenten voor vaste Ψ tot het bereiken van de hoogst mogelijke R 2-coëfficiënt tussen genormaliseerde intensiteit van het door twee fotonen geëxciteerde fluorescentiesignaal verzameld tijdens de meting en genormaliseerde intensiteiten gesimuleerd volgens Stap 4.1 van het protocol.
    1. Bepaal de halve hoek Ψ .
      OPMERKING: Voor runderinsuline sferulieten moet deze gelijk zijn aan Ψ = 29°6.
    2. Passende workflow:
      1. Kies de waarde van Φ van 0° tot 180° (in figuur 8A en 8B Φ = respectievelijk 16° en 127°).
      2. Kies de waarde van ΔΨ van 0° tot 90° (in figuur 8A,B, ΔΨ = respectievelijk 24° en 1°).
      3. Bereken Equation 28 (vergelijking 22) en Equation 30(vergelijking 23) voor het gehele gemeten bereik van θ-hoeken met behulp van de gekozen waarden van Φ en ΔΨ.
      4. Vergelijk de intensiteiten die tijdens simulaties zijn berekend (beide genormaliseerd tot de maximale waarde van
      5. Bereken Equation 28) met genormaliseerde intensiteiten van
      6. Bereken Equation 1 en Equation 2 (beide genormaliseerd naar de maximale waarde van Equation 1) gemeten tijdens ps-2PFM-meting.
        OPMERKING: In de gepresenteerde experimenten werden de Pearson-correlatiecoëfficiënten voor product-momenten berekend met behulp van de functie "corrcoef" uit de NumPy Python-bibliotheek.
    3. Kies uiteindelijk de waarden van Φ en ΔΨ die leiden tot de hoogste correlatiecoëfficiënten en convergentie tussen de gesimuleerde intensiteiten en het gemeten signaal, vergelijkbaar met wat wordt weergegeven in figuur 8.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Het gepresenteerde protocol biedt stapsgewijze begeleiding bij de voorbereiding van amyloïde superstructuren voor testen met ps-2PFM, de constructie van het microscopische systeem en metingen van het juiste monster. Vóór de laatste reeks metingen is het echter van vitaal belang om de APD's goed uit te lijnen met een isotrope referentie, wat zou moeten resulteren in het verzamelen van een symmetrisch signaal van vergelijkbare vorm en intensiteit op beide detectoren (Figuur 4C). Zelfs minimale verschillen tussen de intensiteiten die op de detectoren in de X- en Y-as worden gemeten, moeten in aanmerking worden genomen bij verdere metingen en vooral tijdens de analyse als een geschikte correctiefactor. Na montage moet het monster met enkelvoudige sferulieten een karakteristiek Maltezer kruis op de POM geven zoals in figuur 2B, en na het uitvoeren van een 2PFM-rasterscan, moet het beeld er ongeveer zo uitzien als in figuur 5A, wat consistent is met gerapporteerde 2PFM-rasterscans van sferulieten 6,7 en verschillende georganiseerde biomoleculen11,12. Men kan enkele veranderingen waarnemen in de locatie van de as met de hoogste helderheid, wat verband houdt met het feit dat de intensiteit van het fluorescentiesignaal sterk afhangt van de polarisatie van de excitatiestraal. Daarom is het noodzakelijk om na te gaan welke positie van de halfgolfplaat overeenkomt met de excitatie van het monster langs de assen X (Figuur 5A, boven) en Y (Figuur 5A, onder). Het is ook vermeldenswaard hoe polaire grafieken veranderen tijdens het uitvoeren van een volledige polarisatieanalyse vanaf verschillende geselecteerde plekken. Buiten de sferuliet ziet de polaire grafiek eruit als een verzameling artefacten en willekeurige signaalruispieken (Figuur 5B, I). Zo'n grafiek kan ook de drift van de sferuliet tussen metingen aangeven en vereist het vinden van nieuwe coördinaten van de hele structuur door een andere 2PF-rasterscan. Goed gemeten polaire grafieken van zeer geordende locaties van insulinesferuliet langs de X- en Y-as worden weergegeven in respectievelijk figuur 5B II en III. Ze kunnen verschillende vormen en geometrieën hebben, afhankelijk van de lokale oriëntatie en organisatie van fluoroforen gemeten vanaf de geselecteerde plek7.

De laatste stap van het protocol is gericht op de analyse van de verkregen gegevens met behulp van een algoritme op basis van een wiskundig model dat de oriëntatie van amyloïde vezels in het XY-vlak Φ, de bijbehorende fluorofoor transiënte dipoolmomenten Ψ en hun aberraties ΔΨ (Figuur 6) combineert met intensiteit Equation 1 en Equation 2 van door twee fotonen geïnduceerde fluorescentie. Correct geïmplementeerde functies die in het protocol worden gepresenteerd, moeten, na het invoeren van de juiste invoergegevens (protocolstap 4.9), identieke polaire grafieken opleveren als die in figuur 7. Eventuele afwijkingen - verschillende gegevensoriëntatie, intensiteiten of vormen van gesimuleerde en Equation 32- duiden Equation 26 op fouten in de code. Als het model werkt, kan men doorgaan naar de laatste stap van het protocol, waarbij de gesimuleerde gegevens worden aangepast aan echte gegevens die zijn verkregen uit de ps-2PFM-meting. De gekozen waarden van Φ en ΔΨ met de hoogste correlatiecoëfficiënten en convergentie tussen de gesimuleerde intensiteiten en het gemeten signaal zouden moeten leiden tot vergelijkbare beelden als weergegeven in figuur 8. Equation 26 Equation 2 Equation 32 Equation 1 De waarden van Φ en ΔΨ moeten overeenkomen met de plaatselijke oriëntatie van fibrillen en fluoroforen op de gemeten plek op sferuliet. Vergelijkbare modellen en aanpassingsmethoden kunnen ook worden gebruikt voor het bepalen van de lokale organisatie van andere biomoleculen zoals DNA11.

Figure 1
Figuur 1: Opstelling met twee foton polarisatiegevoelige microscopie. Schema met de opstelling van de twee-fotonmicroscoop die wordt gebruikt voor de polarisatiegevoelige twee-foton geëxciteerde fluorescentiemetingen van runderinsuline-sferulieten . Twee-foton geëxciteerde emissie horizontaal en verticaal gepolariseerde (naar microscoop sample vlak) componenten worden afgebeeld met respectievelijk IX en IY. Afkortingen: SP = sample plane; O = objectief; DM = dichroïsche spiegel; λ/2 = halfgolfplaat; LPF = langdoorlaatfilter; BE = bundel expander; P = Glan polarisator; Ti: Sa = Titan: saffieren laserlichtbron; M = Spiegel; SPF = kortdoorlaatfilter; PBS = polarisatie straal splitter; L = optische lens; APD = lawine fotodiode. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Schema met de voorbereiding van de objectglaasjes/foto. (A) Schema met de verzegelde monstervoorbereiding; B) foto's van de volgende stappen voor het verzegelen van het monster. I: een aliquot van 100 μl van de sferuliet op het microscopieglaasje met een putje, II: dekglaasje dat bovenop de oplossing is gevallen; III: dichte afdichting gevormd uit afgezet polymeer (mountant). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Kwaliteitscontrole van de insuline sferulieten onder een gepolariseerd licht microscoop. (A1,B1) Brightfield-modus en onder (A2,B2) gekruiste polarisatoren. Karakteristiek Maltees kruispatroon kan worden waargenomen op de overeenkomstige afbeeldingen die zijn gemaakt met gekruiste polarisatoren. (A) sferulieten aggregaten met structurele vervormingen, (B) hoogwaardige geïsoleerde sferuliet . Schaalbalken = 5 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: Testen van de uitlijning van het ps-2PFM-systeem. (A) Concentrisch onscherp beeld van de fluoresceïnefluorescentie zoals gezien zonder (A1) en met (A2) dichroïsche spiegel, (B) fotobeschadigde sferuliet met verbrande gaten die ontstaan als gevolg van de langwerpige polarisatieanalyse in geselecteerde punten langs x- en y-richtingen, (C) twee-foton geëxciteerde emissiecomponenten in afhankelijkheid van de polarisatiehoek van invallend licht zoals geregistreerd voor een isotroop monster (fluoresceïne-oplossing). en duiden emissiecomponenten aan die worden gemeten door lawinefotodiodes die respectievelijk de X- en Y-emissiepolarisatie-as meten. Schaalbalken = 5 μm (A1,A2), 10 μm (B). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 5
Figuur 5: Voorbeeldige 2PFM-rasterscans en polaire grafieken van labelvrije insulinesferuliet (A) 2PF-intensiteitsrasterscans van labelvrije insulinesferulieten Polarisatie van excitatielicht: (A1) horizontale polarisatie, (A2) verticale polarisatie en emissie worden aangeduid met witte pijlen, en de inzet toont dezelfde sferuliet afgebeeld onder een standaard gepolariseerde lichtmicroscoop met gekruiste polarisatoren. (B) Polaire grafieken afgeleid van drie punten die zijn aangegeven op de A1-scan (B1, I; B2, II; B3, III). Ixen Iyduiden emissiecomponenten aan die worden gemeten door lawinefotodiodes die respectievelijk de X- en Y-emissiepolarisatie-as meten. Afkorting: 2PF = twee-foton fluorescentie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 6
Figuur 6: Conische verdeling van de emissiedipool van de kleurstof (halve hoek, Ψ) ten opzichte van de lange fibril-as. De stippellijn toont de lange fibril-as. De rotatie van de fibril in het XY-microscoopmonstervlak wordt beschreven door de hoek. Aberraties van Ψ als gevolg van de moleculaire rotaties in filamenten worden beschreven door ΔΨ. Deze figuur is afkomstig van Obstarczyk et al6. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 7
Figuur 7: Gesimuleerde intensiteit van gepolariseerde twee-foton geëxciteerde fluorescentie. Fluorescentie berekend voor (A) Φ = 1°, Ψ = 1°, ΔΨ = 1°; (b) Φ = 1°, Ψ = 30°, ΔΨ = 1°; (C) Φ = 1°, Ψ = 30°, ΔΨ = 60°. Rode, blauwe en gele lijnen komen overeen met Equation 26respectievelijk , Equation 32, en Equation 26 + Equation 32. De hoek van Φ beschrijft de rotatie van de fibril in het XY-microscoopmonstervlak, Ψ - conische verdeling van de emissiedipool, en ΔΨ- aberraties van Ψ als gevolg van de moleculaire rotaties in filamenten. Alle andere parameters waren in alle gevallen identiek: K1 = 2,945, K2 = 0,069, K3 = 1,016, γ = 0,01 en δ = 0,98845. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 8
Figuur 8: Polaire grafieken van experimentele datasets. (A,B) Voorbeeldige polaire grafieken na het passen van twee experimentele datasets verzameld tijdens ps-TPFM-metingen van runderinsuline sferulieten. Gemeten Equation 1 en Equation 2 twee-foton geëxciteerde emissiecomponenten voor X- en Y-emissiepolarisatie-assen worden weergegeven met respectievelijk rode en blauwe stippen; ondertussen presenteren ononderbroken lijnen de overeenkomstige gesimuleerde twee-foton geëxciteerde fluorescentie-emissiecomponenten voor X- en Y-emissiepolarisatie-as Equation 26 en Equation 32. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Polarisatiegevoelige twee-fotonmicroscopie is een waardevol hulpmiddel voor het bestuderen van de lokale ordening van fibrillen in de amyloïde superstructuren, waarvoor slechts kleine aanpassingen van de standaard multifotonenopstelling nodig zijn. Omdat het werkt op niet-lineaire optische verschijnselen, kunnen verminderde hoekfotoselectie en verbeterde axiale resolutie worden bereikt in vergelijking met één-foton geëxciteerde fluorescentiemicroscopiemethoden. Bovendien leidt het tot een lagere lichtverstrooiing, lagere fototoxiciteit en diepere monsterpenetratie in vergelijking met de fluorescentiemicroscopietechnieken met één fotonexcitatie 19,20. Zoals we al hebben bewezen, is het zeer geschikt voor metingen van dicht opeengepakte aggregaten van eiwitten zoals sferulieten die op een labelvrije manier kunnen worden uitgevoerd21.

Om de hier beschreven methode effectief te gebruiken, moet echter aandacht worden besteed aan een aantal belangrijke kwesties. Begin met de monstervoorbereiding en de kwaliteit ervan, namelijk incubatie, en zorg er altijd voor dat de amyloïde superstructuren correct zijn gegroeid. In het geval van sferulieten gebruikten we een gepolariseerde optische microscoop met gekruiste polarisatoren om rijpe sferulieten te lokaliseren, die een karakteristiek Maltezer kruispatroon geven en een straal hebben van ~5 μm16. Sferulieten zijn echter heterogeen en er kunnen onderscheidende structuren in het monster worden waargenomen. Daarom is het van cruciaal belang om gescheiden en niet-vervormde soorten te kiezen. Wat het meetsysteem zelf betreft, is het van cruciaal belang om de polarisatie van invallend licht te regelen, zodat de polarisatie van de bundel bij de ingang van het microscooplichaam nauwkeurig moet worden bepaald en de depolarisatie die door de gebruikte optische elementen wordt veroorzaakt, tot een minimum moet worden beperkt22. Om de beste prestaties te garanderen, raden we aan om hoogwaardige zilveren spiegels en optische filters te gebruiken die zijn afgestemd op de golflengten van de excitatie- en fluorescentie-emissie. Vanwege de sleutelrol van lichtpolarisatie ook in het emissiepad, is het essentieel om een isotroop referentiemonster te meten vóór de eigenlijke meting. Als het excitatiepad en de APD-detectoren correct zijn uitgelijnd, zou men op beide detectoren een even intens signaal moeten zien als weergegeven in figuur 4C. Referentie moet een sterke twee-foton geëxciteerde fluorescentie genereren bij een relatief laag laservermogen om fotobleken te voorkomen; We gebruikten fluoresceïne omdat de absorptiedoorsneden van twee fotonen voor verschillende golflengten al in de literatuur waren gerapporteerd23.

Om de rangschikking van structuren in de sferulieten correct te bepalen, moet ook veel aandacht worden besteed aan data-analyse. De basisaanname van dit model is de collineariteit van het overgangsdipoolmoment van lichtabsorptie en -emissie. Volgens die veronderstelling maakt het uitlijnen van het overgangsdipoolmoment van het molecuul parallel aan de polarisatie van het invallende licht de combinatie met de interne structuur van het geteste monster mogelijk, wat de hoogste emissie-intensiteit oplevert. Het gegeven model kan ook worden gebruikt als een goede benadering voor kleine verschillen in de hoek tussen de twee dipoolmomenten8 , maar vereist verdere aanpassingen voor grote afwijkingen. Daarom moeten, zoals beschreven, bij beeldvorming en gegevensanalyse a priori rekening worden gehouden met enkele aannames met betrekking tot de steekproef. In het modelgeval waarop de simulatie en de vergelijkingen die in deze methode worden gebruikt, zijn gebaseerd, is de belangrijkste bron van depolarisatie in het systeem de dichroïsche spiegel. Daarom is het, alvorens verder te gaan met de gegevensanalyse, noodzakelijk om de parameters te bepalen die verantwoordelijk zijn voor de depolarisatie die door de dichroïsche spiegel wordt geïntroduceerd vanwege hun impact op de vorm van de verzamelde polaire grafieken en bijgevolg de juiste bepaling van de organisatie van de moleculen binnen de onderzochte structuur tijdens fitting18. Dit wordt een belangrijk probleem, vooral in het geval van metingen voor verschillende golflengten, aangezien de verandering in de ellipticiteit van de dichroïsche spiegel duidelijk golflengte-afhankelijk is12. Inductie van depolarisatie kan de eigenschappen van het verzamelde signaal sterk beïnvloeden11. Last but not least, bij het maken van het script voor data-analyse, moet men opletten bij het introduceren van wiskundige functies en variabelen die in het laatste deel van het protocol worden gepresenteerd. Om fouten te voorkomen, moet u zich concentreren op functies zoals het aanroepen van meerdere functies en globale parameters, die ook de analysetijd aanzienlijk zullen versnellen.

We moeten ook de meest voorkomende problemen noemen die men kan tegenkomen bij het gebruik van de beschreven methode. De voorbereidingstijd van het monster is sterk afhankelijk van de snelheid van het uitharden van het montagemiddel. Om dit te versnellen, raden we aan om de monsters op een warme, droge plaats te bereiden en de sferuliet te verzegelen voordat deze in een microscoop wordt gemonteerd. Te vroeg uitgevoerde metingen kunnen leiden tot het loskomen van de afdichting van de objectglaasje en het vernietigen van de gebruikte objectieflens. Bovendien kunnen er, ondanks een goede monstervoorbereiding, tijdens de meting kleine sferulieten in de oplossing drijven als gevolg van de materiaalspanning die door het objectief wordt veroorzaakt. Om dit te voorkomen, raden we aan om geïsoleerde middelgrote structuren te scannen, aangezien de grootste gewoonlijk aggregaten zijn. Het wordt aanbevolen om te controleren of de gescande sferuliet is verplaatst na gegevensverzameling, in vergelijking met het beeld voordat u met de meting begint. Bovendien kunnen, ondanks de juiste uitlijning van alle optische elementen en detectoren die worden gebruikt om de ps-2PFM te meten, de gemeten intensiteiten Equation 1 en Equation 2 van de isotrope referentie nog steeds enigszins verschillen in intensiteit. In een dergelijk geval moet hiermee rekening worden gehouden bij de analyse van de gegevens van de monstermetingen door een van de intensiteiten te vermenigvuldigen met de correctiefactor die tijdens de referentiemetingen is bepaald. Last but not least is het mogelijk dat het script tijdens de aanpasprocedure geen overeenkomende waarden van Φ en ΔΨ kan vinden. Dit kan te wijten zijn aan verschillende factoren: gegevens werden verzameld van een ongeorganiseerde plek op een monster, bijvoorbeeld de kern van een sferuliet ; de bestudeerde structuur was niet volledig gevormd tijdens de incubatie; onjuiste simulatie van en Equation 32; met behulp van Equation 26 onjuiste dichroïsche spiegelparameters γ en δ; te grote stappen ingesteld voor Φ en ΔΨ hoeken tussen elke iteratie tijdens het passen. In het geval van een ongeorganiseerde plek, raden we aan om te proberen gegevens te verzamelen van punten die dichter bij de omtrek van de onderzochte structuur liggen. In het geval van een onvolledig gevormde structuur, herhaal de incubatie of zoek op het glaasje naar andere structuren. Controleer in het geval van onjuiste simulaties handmatig of door het wijzigen van de parameters Φ, Ψ en ΔΨ, de gesimuleerde intensiteiten Equation 26 en eventuele fouten in de code wijzigen en Equation 32 corrigeren. In het geval van onjuiste dichroïsche spiegelparameters, controleer dan zorgvuldig de γ en δ parameters van de dichroïsche spiegel die tijdens de metingen wordt gebruikt. In het geval van een grote stap die is ingesteld voor de hoeken tijdens het passen, verkleint u de stap tussen opeenvolgende iteraties tot 2º of 1º. Er moet ook aan worden herinnerd dat in het geval van een sterke lokale desorganisatie van de structuur, R2 altijd lager zal zijn, vaak in het bereik van 0,5-0,6. Dit komt omdat het gepresenteerde model zeer geordende moleculen beschrijft waarbij de meeste transiënte dipoolmomenten in een vergelijkbare richting zijn uitgelijnd; Vandaar dat het matchen van amorfe of sterk ongeordende structuren leidt tot lagere correlatiecoëfficiënten. Daarom is het van cruciaal belang om vóór de meting op zijn minst over enige structurele informatie over het monster te beschikken om de verkregen gegevens correct te analyseren.

Het is ook vermeldenswaard dat de gepresenteerde methode verschillende beperkingen heeft. Data-analyse kan resulteren in verschillende waarden van Φ- en ΔΨ-hoeken met voldoende hoge correlatiefactoren, waarbij de onderzoeker zijn kennis en ervaring moet gebruiken om geschikte waarden te selecteren. In dit geval moet rekening worden gehouden met de randvoorwaarden, zoals dat de halve hoek Ψ van de fluorofoorkegel altijd groter moet zijn dan de aberratie ΔΨ. Bovendien is het bij het vergelijken van onze gegevens met de literatuur vermeldenswaard dat sommige artikelen Ψ beschrijven als een hoek met een volledige kegel, terwijl we werken met een hoek van een halve kegel. Een andere beperking is de meetresolutie, beperkt tot een resolutie van minder dan een micron. Daarom zijn de fotoselectiviteit van het systeem en de daaruit voortvloeiende bepaling van de lokale organisatie gebaseerd op het gemiddelde signaal van fibrillen die in het brandpunt worden geëxciteerd in plaats van op afzonderlijke structuren. Bovendien moet het monster zelf voldoende fluorescentie-kwantumopbrengst hebben, aangezien langdurige blootstelling aan invallend laservermogen (nodig om gegevens voor polaire grafieken te verkrijgen) destructief kan zijn en de resultaten kan beïnvloeden.

Ondanks deze moeilijkheden zijn wij van mening dat de methode die in dit artikel wordt gepresenteerd, een breed scala aan toepassingen heeft, voor labelgebaseerde en labelvrije beeldvorming van biostructuren in gehydrateerde en complexe omgevingen. We hadden eerder aangetoond dat lokale fibrilordening berekend op basis van ps-2PEF-gegevens correleert met informatie die is afgeleid van transmissie-elektronenmicroscopie7. Daarom bevestigden we de validiteit van ps-2PEF in bio-imaging en breidden we de kennis over de structurele ordening van amyloïde superstructuren verder uit. Deze methode kan worden toegepast om meer te weten te komen over de oorsprong van intrinsieke fluorescentie die wordt waargenomen in het geval van verschillende componenten van biologische monsters, zoals de autofluorescentie van eiwitaggregaten - amyloïden. Gegeven relevante gegevens over de oriëntatie van absorptie/emissie dipoolmomentrichtingen ten opzichte van de lange as van amyloïde fibrillen, kunnen de optische eigenschappen van de fibrillen worden gecorreleerd met hun structuur6. We gaven aan dat voor structuren met een reeds bepaalde Ψ-hoek , deze techniek het mogelijk maakt om verschillende structurele kenmerken van amyloïde superstructuren en polymorfen van insuline-superstructuren te detecteren op basis van het niveau van hun organisatie7. Zoals eerder opgemerkt in het protocol, kan de gepresenteerde opstelling ook worden toegepast voor polarisatiegevoelige metingen van de tweede harmonische generatie, wat ook een labelvrije twee-fotonmicroscopietechniek is24. Dit vereist niet alleen het monteren van verschillende optische filters, maar ook het wijzigen van de formules die worden gebruikt voor data-analyses25. Bovendien zou het, met de toevoeging van een goed uitgelijnde kwartgolfplaat, kunnen worden gebruikt om het monster te exciteren met circulair gepolariseerd licht, wat zou kunnen leiden tot het genereren van chirale niet-lineaire optische eigenschappen van amyloïden, aangezien het chirale biopolymeren zijn met bevestigde sterke chiroptische eigenschappen26. In zo'n geval zou de constant roterende elektrische vector echter leiden tot de constant veranderende richting van de geëxciteerde emissie, waardoor het onmogelijk wordt om structurele informatie te bepalen met behulp van de vergelijkingen die in dit manuscript worden gepresenteerd. Al met al is ps-2PEF een veelbelovend hulpmiddel voor de bepaling van de organisatie binnen tal van complexe biostructuren met geordende emissiedipolen, zoals eiwitaggregaten, DNA of weefsels op een niet-invasieve manier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben geen belangenconflicten om bekend te maken.

Acknowledgments

Dit werk werd ondersteund door het Sonata Bis 9-project (2019/34/E/ST5/00276), gefinancierd door het Nationaal Wetenschapscentrum in Polen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sample preparation
Coverslips, 24 x 24 mm Chemland 04-298.202.04
DPX mountant for histology Sigma-Aldrich 6522 Slide mountant
Eppendorf Safe-Lock tubes, 1.5 mL, polypropylene Chemland 02-63102
Eppendorf ThermoMixer C Eppendorf Used for spherulite incubation
HLP 5UV Water purification system Hydrolab Source of dionized water used in sample preparation
Hydrochloric acid (≥37%, APHA ≤10), Sigma-Aldrich 30721-M
Insulin powder from the bovine pancreas (≥25 units/mg (HPLC)) Sigma-Aldrich I5500
Methanol (HPLC grade) Sigma-Aldrich 270474
Microscope slides with a concave, 76 x 26 x 1 mm Chemland 04-296.202.09
Olympus BX60 Olympus Polarized Optical Microscope used in Figure 2
PTFE thread seal tape, 12 mm x 12 mm x 0.1 mm, 60 gm2 Chemland VIT131097
Microscope ps-2PFM setup
Chameleon Ultra II Coherent
FELH0800 - Ø25.0 mm Longpass Filter Thorlabs
FESH0700 - Ø25.0 mm Shortpass Filter Thorlabs
IDQ100 photon-counting avalanche photodiodes  ID Quantique
Multiphoton short-pass emission filter 720 nm  Semrock
Mounted Achromatic Half-Wave Plate, 690-1200 nm Thorlabs
Nikon Plan Apo Oil Immersion 100x/1.4 NA Nikon
piezo 3D stage Piezosystem Jena
Polarizing Beamsplitter Thorlabs
S130C - Slim Photodiode Power Sensor, Si, 400 - 1100 nm, 500 mW Thorlabs
Software
LabView 2018 National Instruments Version 18.0.1f2
Matplotlib library Version 3.3.2
NumPy library Version 1.19.2
SciPy library Version 1.5.2
Spyder Python 3 IDE Version 4.1.5

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Petazzi, R. A., Aji, A. K., Chiantia, S. Progress in Molecular Biology and Translational Science. Giraldo, J., Ciruela, F. 169, Academic Press. 1-41 (2020).
  2. Kress, A., et al. Probing orientational behavior of MHC class I protein and lipid probes in cell membranes by fluorescence polarization-resolved imaging. Biophysical Journal. 101 (2), 468-476 (2011).
  3. Duboisset, J., et al. Thioflavine-T and Congo Red reveal the polymorphism of insulin amyloid fibrils when probed by polarization-resolved fluorescence microscopy. The Journal of Physical Chemistry B. 117 (3), 784-788 (2013).
  4. De Luca, G., et al. Probing ensemble polymorphism and single aggregate structural heterogeneity in insulin amyloid self-assembly. Journal of Colloid and Interface Science. 574, 229-240 (2020).
  5. Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
  6. Obstarczyk, P., Lipok, M., Grelich-Mucha, M., Samoć, M., Olesiak-Bańska, J. Two-photon excited polarization-dependent autofluorescence of amyloids as a label-free method of fibril organization imaging. The Journal of Physical Chemistry Letters. 12 (5), 1432-1437 (2021).
  7. Obstarczyk, P., Lipok, M., Żak, A., Cwynar, P., Olesiak-Bańska, J. Amyloid fibrils in superstructures - local ordering revealed by polarization analysis of two-photon excited autofluorescence. Biomaterials Science. 10 (6), 1554-1561 (2022).
  8. Le Floc'h, V., Brasselet, S., Roch, J. -F., Zyss, J. Monitoring of orientation in molecular ensembles by polarization sensitive nonlinear microscopy. The Journal of Physical Chemistry B. 107 (45), 12403-12410 (2003).
  9. Chen, C., et al. In vivo near-infrared two-photon imaging of amyloid plaques in deep brain of Alzheimer's disease mouse model. ACS Chemical Neuroscience. 9 (12), 3128-3136 (2018).
  10. Gasecka, P., Balla, N. K., Sison, M., Brasselet, S. Lipids-fluorophores interactions probed by combined nonlinear polarized microscopy. The Journal of Physical Chemistry B. 125 (50), 13718-13729 (2021).
  11. Mojzisova, H., et al. Polarization-sensitive two-photon microscopy study of the organization of liquid-crystalline DNA. Biophysical Journal. 97 (8), 2348-2357 (2009).
  12. Olesiak-Banska, J., et al. Liquid crystal phases of DNA: Evaluation of DNA organization by two-photon fluorescence microscopy and polarization analysis. Biopolymers. 95 (6), 365-375 (2011).
  13. Olesiak-Banska, J., et al. Gold nanorods as multifunctional probes in a liquid crystalline DNA matrix. Nanoscale. 5 (22), 10975-10981 (2013).
  14. Grelich-Mucha, M., Lipok, M., Różycka, M., Samoć, M., Olesiak-Bańska, J. One- and two-photon excited autofluorescence of lysozyme amyloids. The Journal of Physical Chemistry Letters. 13 (21), 4673-4681 (2022).
  15. Brasselet, S., et al. Fluorescent Methods to Study Biological Membranes. Mély, Y., Duportail, G. , Springer. Berlin Heidelberg. 311-337 (2013).
  16. Krebs, M. R., et al. The formation of spherulites by amyloid fibrils of bovine insulin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (40), 14420-14424 (2004).
  17. Aït-Belkacem, D., Gasecka, A., Munhoz, F., Brustlein, S., Brasselet, S. Influence of birefringence on polarization resolved nonlinear microscopy and collagen SHG structural imaging. Optics Express. 18 (14), 14859-14870 (2010).
  18. Schön, P., Munhoz, F., Gasecka, A., Brustlein, S., Brasselet, S. Polarization distortion effects in polarimetric two-photon microscopy. Optics Express. 16 (25), 20891-20901 (2008).
  19. Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron. 50 (6), 823-839 (2006).
  20. Zipfel, W. R., Williams, R. M., Webb, W. W. Nonlinear magic: multiphoton microscopy in the biosciences. Nature Biotechnology. 21 (11), 1369-1377 (2003).
  21. Ferrand, P., et al. Ultimate use of two-photon fluorescence microscopy to map orientational behavior of fluorophores. Biophysical Journal. 106 (11), 2330-2339 (2014).
  22. Chipman, R. A. Depolarization index and the average degree of polarization. Applied Optics. 44 (13), 2490-2495 (2005).
  23. de Reguardati, S., Pahapill, J., Mikhailov, A., Stepanenko, Y., Rebane, A. High-accuracy reference standards for two-photon absorption in the 680–1050 nm wavelength range. Optics Express. 24 (8), 9053-9066 (2016).
  24. Mansfield, J. C., Mandalia, V., Toms, A., Winlove, C. P., Brasselet, S. Collagen reorganization in cartilage under strain probed by polarization sensitive second harmonic generation microscopy. Journal of The Royal Society Interface. 16 (150), 20180611 (2019).
  25. Duboisset, J., Aït-Belkacem, D., Roche, M., Rigneault, H., Brasselet, S. Generic model of the molecular orientational distribution probed by polarization-resolved second-harmonic generation. Physical Review A. 85 (4), 043829 (2012).
  26. Loksztejn, A., Dzwolak, W. Chiral Bifurcation in aggregating insulin: an induced circular dichroism study. Journal of Molecular Biology. 379 (1), 9-16 (2008).

Tags

Polarisatiegevoelige twee-fotonmicroscopie labelvrij amyloïde structurele karakterisering bioimaging-experimenten fototoxiciteit weefselpenetratie dicht opeengepakte systemen hoekfotoselectie fluoroforen polarisatieanalyse twee-fotonfluorescentiemicroscopie (2PFM) moleculaire organisatie standaard beeldvormingsmethoden lineaire optische processen polarisatiegevoelige 2PFM (ps-2PFM) moleculaire ordening complexe biostructuren amyloïde sferulieten en neurodegeneratieve ziekten Alzheimer Parkinson amyloïde-eiwitaggregaten verstoord eiwitvouwingsproces diagnostische methoden lokale fibrilbestelling runderinsulinesferulieten
Polarisatiegevoelige twee-fotonmicroscopie voor een labelvrije structurele karakterisering van amyloïden
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lipok, M., Obstarczyk, P.,… More

Lipok, M., Obstarczyk, P., Olesiak-Bańska, J. Polarization-Sensitive Two-Photon Microscopy for a Label-Free Amyloid Structural Characterization. J. Vis. Exp. (199), e65670, doi:10.3791/65670 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter