Summary
מאמר זה מתאר כיצד ניתן ליישם מיקרוסקופ דו-פוטוני רגיש לקיטוב כדי לאפיין את הארגון המקומי בתוך מבני-על-עמילואיד-ספרוליטים נטולי תוויות. הוא גם מתאר כיצד להכין ולמדוד את הדגימה, להרכיב את ההתקנה הנדרשת, ולנתח את הנתונים כדי לקבל מידע על הארגון המקומי של סיבי עמילואיד.
Abstract
בהשוואה למקבילו בעל פוטון אחד, עירור של שני פוטונים מועיל לניסויי הדמיה ביולוגית בגלל רעילות האור הנמוכה שלו, חדירה עמוקה יותר של רקמות, פעולה יעילה במערכות צפופות ובחירת אור זוויתית מופחתת של פלואורופורים. לפיכך, הכנסת ניתוח קיטוב במיקרוסקופ פלואורסצנטי של שני פוטונים (2PFM) מספקת קביעה מדויקת יותר של הארגון המולקולרי בדגימה בהשוואה לשיטות הדמיה סטנדרטיות המבוססות על תהליכים אופטיים ליניאריים. בעבודה זו אנו מתמקדים ב-2PFM (ps-2PFM) הרגיש לקיטוב ויישומו בקביעת הסדר המולקולרי בתוך ביו-מבנים מורכבים-עמילואיד ספרוליטים. מחלות נוירודגנרטיביות כגון אלצהיימר או פרקינסון מאובחנות לעתים קרובות באמצעות זיהוי של אגרגטים עמילואידים-חלבונים שנוצרו עקב תהליך קיפול שגוי של חלבון. חקירת המבנה שלהם מובילה להבנה טובה יותר של מסלול היצירה שלהם וכתוצאה מכך, לפיתוח שיטות אבחון רגישות יותר. מאמר זה מציג את ps-2PFM המותאם לקביעת סדר פיבריל מקומי בתוך ספרוליטים של אינסולין בקר וצברי חלבונים עמילואידוגניים כדוריים. יתר על כן, אנו מוכיחים כי הטכניקה המוצעת יכולה לפתור את הארגון התלת ממדי של סיבים בתוך הספרוליט.
Introduction
במהלך העשורים האחרונים, למרות שחלה התפתחות משמעותית של טכניקות מיקרוסקופיה פלואורסצנטיות רבות לדימות ביולוגי של חלבונים וצברים שלהם1, רק מעטים שימשו כדי לפתור את הסדר המקומי שלהם בתוך הדגימה 2,3. מיקרוסקופ הדמיה פלואורסצנטי4 שימש לחקר ההטרוגניות המבנית הפנימית של מבני-על עמילואידים-ספרוליטים. יתר על כן, קביעה כמותית של הסדר המקומי בתוך מבנים ביולוגיים מורכבים וצפופים כגון ספרוליטים יכולה להיפתר באמצעות שיטות רגישות לקיטוב3. עם זאת, טכניקות פלואורסצנטיות סטנדרטיות עם חדירה שטחית לרקמות מוגבלות מכיוון ששימוש באורכי גל UV-VIS כדי לעורר פלואורופורים in vivo מוביל לפיזור אור רקמה גבוה5. בנוסף, הדמיה כזו דורשת לעתים קרובות תכנון וקשירה של גשושיות פלואורסצנטיות ספציפיות לביומולקולה ממוקדת, ובכך מגדילה את העלות ואת כמות העבודה הדרושה לביצוע הדמיה.
לאחרונה, כדי לטפל בבעיות אלה, הצוות שלנו התאים מיקרוסקופ פלואורסצנטי מעורר שני פוטונים רגישים לקיטוב (ps-2PFM) להדמיה ללא תוויות של מבנים ביולוגיים 6,7. Ps-2PFM מאפשר למדוד את התלות של עוצמת פלואורסצנטיות של שני פוטונים בכיוון הקיטוב הליניארי של קרן העירור וניתוח הקיטוב של הפלואורסצנטיות הנפלטת8. היישום של שיטה זו דורש תוספת של נתיב עירור סטנדרטי של מערך מיקרוסקופ רב-פוטונים (איור 1) עם לוח חצי גל כדי לשלוט במישור קיטוב האור. לאחר מכן, גרפים קוטביים, המתארים את התלות של עוצמת פלואורסצנטיות מעוררת של שני פוטונים בקיטוב של קרן לייזר העירור, נוצרים מאותות שנאספו על ידי שתי פוטודיודות מפולת שלגים, ובכך אוספים את שני המרכיבים המאונכים זה לזה של קיטוב פלואורסצנטי.
השלב האחרון הוא תהליך ניתוח הנתונים, תוך התחשבות בהשפעת האלמנטים האופטיים, כגון מראות דיכרואיות או יעד צמצם מספרי גבוה, על הקיטוב. בגלל אופיו של תהליך שני פוטונים, שיטה זו מספקת הן בחירת צילום זוויתית מופחתת והן רזולוציה צירית משופרת, שכן עירור שני פוטונים של פלואורופורים מחוץ למישור המוקד מוגבל מבחינה הסתברותית. כמו כן הוכח כי שיטות דומות יכולות להיות מיושמות בהצלחה עבור הדמיה in vivo של בדיקות אינפרא אדום קרוב (NIR) עבור דימות רקמות עמוקות9. Ps-2PFM יושם בעבר על פלואורופורים של תמונות בקרומי תאים10 ו-DNA11,12, כמו גם על סמנים פלואורסצנטיים לא סטנדרטיים של מערכות ביולוגיות, כגון ננו-חלקיקי זהב13. עם זאת, בכל הדוגמאות הללו, המידע על ארגון הביומולקולות התקבל בעקיפין ודרש אוריינטציה הדדית מוגדרת מראש בין פלואורופור לביומולקולה.
באחד המאמרים האחרונים שלנו, הראינו כי ps-2PFM יכול להיות מיושם בהצלחה לקביעת הקיטוב המקומי של אוטופלואורסצנטיות של מבני על עמילואיד ופלואורסנציה מתיופלבין T, צבע ספציפי לעמילואיד, הקשור לסיבי עמילואיד בספרוליטים6. יתר על כן, במקרה אחר, הוכחנו כי ps-2PFM יכול לשמש כדי לזהות כיוון פיבריל עמילואיד בתוך ספרוליטים עמילואיד במשטר גודל תת-מיקרון, אשר אושר על ידי קורלציה עם דימות מיקרוסקופ אלקטרונים שידור (TEM)7. ההישג של תוצאה זו התאפשר הודות ל-i) אוטופלואורסנציה פנימית של ספרוליטים-עמילואידים, כאשר הם מעוררים עם פוטון אחד או שניים, מציגים אוטופלואורסצנטיות פנימית עם מקסימום פליטה הממוקם בטווח שבין 450 ל-500 ננומטר ושני חתכי בליעה של שני פוטונים הדומים לצבעים פלואורסצנטיים סטנדרטיים14, ii) מודלים מתמטיים שהוצגו בעבר כדי לתאר כיצד ps-2PEF של צבעים המסמנים קרומים ביולוגיים ומבני DNA יכולים להיות מיושמים על פלואורסצנטיות המוצגת על ידי ספרוליטים וצבעים הקשורים אליהם 8,11,15. לכן, לפני שנמשיך בניתוח, אנו ממליצים בחום לעבור על התיאוריה הנדרשת המתוארת בשניהם, הטקסט העיקרי והמידע התומך של המאמר הראשון שלנו בנושאזה 6. כאן, אנו מציגים את הפרוטוקול כיצד ליישם את טכניקת ps-2PFM עבור אפיון מבני עמילואיד ללא תווית של ספרוליטים של אינסולין בקר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת שקופיות המיקרוסקופ עם ספרוליטים מגודלים במלואם
הערה: עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים על כל החומרים, הריאגנטים והציוד המשמשים בפרוטוקול זה. כל התמיסות הוכנו עם מים נטולי יונים, (18.2 MΩ·cm ב-25°C) שהתקבלו ממערכת טיהור המים.
- לדגור על הספרוליטים העמילואידיים בהתבסס על הפרוטוקול המתואר על ידי Krebs et al16. עם כמה שינויים, כמתואר להלן.
- שוקלים 10 מ"ג אבקת אינסולין בצינור של 1.5 מ"ל.
- ממיסים את האבקה עם aliquot 1 מ"ל של תמיסת H2O/HCl נטולת יונים (pH 1.5).
- אוטמים את הדגימה עם הסרט ומכניסים אותו למיקסר תרמי כדי לדגור במשך 24 שעות ב 70 ° C (0 סל"ד).
הערה: כדי לבצע הדמיה של עמילואידים בסביבתם הטבעית (כלומר, רוויית מים) ולמנוע עיוות דגימה עקב התייבשות, יש להכין שקופיות מיקרוסקופ בהתאם לתיאור הבא (סכימה המוצגת באיור 2).
- שטפו היטב את זכוכית המיקרוסקופ במים.
- טבלו את המגלשות במתנול והניחו להן להתייבש בתנאי סביבה על מגבון נטול אבק.
- קח aliquot 100 μL של תמיסת ספרוליט מן הצינור עם פיפטה אוטומטית (שלב 1.1.2) ולהוסיף אותו לבאר הממוקם באזור המרכזי של שקופית המיקרוסקופ.
- כסו את התמיסה בכיסוי, והימנעו מהיווצרות בועות אוויר.
- הפקדה לאורך שולי הכיסוי על המגלשה עם פיפטה אוטומטית כדי לאטום את הפתרון המקורי של הספרוליטים.
הערה: יש חשיבות רבה להפקיד הרכבה של מגלשה הן על הכיסוי והן על משטחי המגלשה. עשו זאת מתחת למכסה המנוע בגלל הרעילות של הממס הנדיף (קסילן). ראו את הכניסה באיור 2. - השאירו את דגימת המיקרוסקופ בתנאי סביבה כדי שהתושבת תתקשה.
הערה: תהליך ההתקשות תלוי טמפרטורה ולחות, אך יש להשלימו תוך 12 שעות. - בדוק אם ספרוליטים של אינסולין נוצרו כראוי באמצעות מיקרוסקופ אופטי מקוטב (POM) עם מקטבים מוצלבים. סרקו את הדגימה בחיפוש אחר תבנית אופיינית של אזורים בהירים, שנקראת צלב מלטזי, כפי שמוצג באיור 3.
הערה: ניתן להגדיר את הספרוליטים העמילואידיים כמבני-על כדוריים המאופיינים במורפולוגיה הטרוגנית עם מבנה מעטפת הליבה. בפירוט, הם מורכבים מליבה אמורפית וסיבי עמילואיד הגדלים רדיאלית16. בשל האופי האנאיזוטרופי של מבני ספרוליט, הם יכולים לתקשר באופן ייחודי עם אור מקוטב (למשל, על ידי שבירה) ולשנות את הפאזה שלהם, אשר ניתן לראות בקלות תחת POM עם מקטבים מוצלבים. שיטה זו שימשה לחקר רק ספרוליטים מפותחים במלואם המאופיינים בתבנית צלב מלטאז דמוית מודל. כתוצאה מכך, אגרגטים או ספרוליטים מעוותים מבחינה מבנית הוצאו מחקירות נוספות.
2. בנייה ויישור המערכת
הערה: ייצוג סכמטי של מיקרוסקופ דו-פוטוני רגיש לקיטוב ניתן למצוא באיור 1.
- התקן לייזר פמטו-שניות עם כוונון אורך גל פלט בטווח של 690-1,080 ננומטר, לדוגמה, הפועל על לייזר Ti: Sapphire נעול במצב עם ~100 פולסים fs של קצב חזרה של 80 MHz.
- הוסף לוח חצי גל המורכב על שלב סיבוב לנתיב העירור של ההתקנה כדי לשלוט בקיטוב של אור האירוע במישור הדגימה של מיקרוסקופ XY.
- התקן את המראה הדיכרואית כדי לנתק את קרן העירור מאופטיקת הגילוי.
הערה: המאפיינים האופטיים של מראה דיכרואית צריכים לאפשר לשקף את קרן העירור (לדגימה) בתחום אורכי הגל NIR ולהיות שקופים בו זמנית עבור תחום אורכי הגל המתאים לפליטה מהדגימות. - התקן שלב סריקה פיאזואלקטרי לסריקות רסטר בתוך מישור XY עבור Z נבחר.
- הרכיבו את יעד הטבילה הגבוה של NA, לדוגמה, יעד טבילה אפוכרומטי בשמן 100x/1.4 NA.
הערה: מכיוון שכל המערך פועל במצב אפי-פלואורסצנטי, האירוע והאותות הנפלטים עוברים באותה מטרה. - בנתיב הפליטה, הוסף מפצל קרן מקטב המפצל פליטה מעוררת של שני פוטונים לשני רכיבים מקוטבים אורתוגונלית (IX ו- IY)
- התקינו שתי פוטודיודות של מפולות פוטונים (APDs) בתצורה המאפשרת להן לאסוף אור המועבר ומוחזר באמצעות מפצל הקרן, בהתאמה (איור 1).
- הרכיבו מסנני חיתוך תלויי אורך גל נכונים בנתיב העירור והפליטה של המערכת, לדוגמה, מסנן מעבר ארוך של 800 ננומטר ישירות בנתיב האופטי של העירור ומסנן של 700 מעבר קצר בנתיב הפליטה.
הערה: נתח את ספקטרום הפליטה מספרוליט כך שניתן יהיה לשלול כל תרומה פוטנציאלית מיצירה הרמונית שנייה (SHG) או מאור לייזר באמצעות מסנני הפליטה הנכונים. ראוי גם לציין כי מערכת זו צריכה גם לאפשר מדידות של SHG רגיש לקיטוב, אשר יכול לשמש כדי לפתור את הסדר של biomolecules בתוך הדגימות. עם זאת, ניתוח הנתונים של אות SHG שונה פלואורסצנטי, אשר, בפירוט רב יותר, תואר על ידי Aït-Belkacem et al.17. - יישר את המערכת כולה (באמצעות מצב היישור המובנה בלייזרים רבים) עד לאיסוף עוצמות אות דומות באמצעות שתי הפוטודיודות.
- בדקו אם לקרן העירור הממוקדת על-ידי מטרת NA גבוהה ומצולמת במצלמה יש צורה מעגלית קונצנטרית כפי שמוצג באיור 4A.
- התאם את זמן הסריקה ואת העוצמה המתאימה כדי למזער את הנזק שנגרם על ידי לייזר האירוע על הדגימה. צריבה נקודתית לדוגמה מוצגת באיור 4B. מדידת ההספק הנומינלי באמצעות מד הספק דיגיטלי ידני המחובר לחיישן הספק פוטודיודה הממוקם בכניסה לגוף המיקרוסקופ.
הערה: ניתן לשרוף דגימות ביולוגיות בקלות עקב תאורת לייזר. במקרה זה, טווח ההספק של 100-900 μW (בנקודת המוקד של עדשת המטרה) נמצא כפשרה מצוינת בין יציבות הדגימה לבין פליטה אינטנסיבית. - לפני מדידת הדגימה, בדוק את איכות היישור של אופטיקה עם דגימת ייחוס איזוטרופית (למשל, פלואורסצאין המגולם בפולימר אמורפי). כדי לבצע את בדיקת הכיול, בצע את ההליך המתואר בסעיף 3 באמצעות ייחוס איזוטרופי במקום דגימת עמילואיד.
הערה: בהנחה שמערך המיקרוסקופ מותאם באופן אידיאלי לדגימה בעלת תכונות איזוטרופיות, שני רכיבי הפליטה הדו-פרצופית (IX ו-IY) שזוהו עם שני APDs צריכים להיות מאופיינים באותה עוצמה (איור 4C).
3. מדידת ספרוליטים של אינסולין בקר
הערה: כדי לבצע את כל מדידות ps-2PF המתוארות, נעשה שימוש בתוכנה בכתב יד, השולטת במיקומים של השלב הפיזואלקטרי וחצי לוח הגל ואוספת את האות משתי הפוטודיודות, מה שמאפשר שרטוט של סריקות XY (סריקות רסטר) מאזורים נבחרים בשקופיות מיקרוסקופ וכן גרפים קוטביים מקואורדינטות מדגם ספציפיות. הערות נוספות נוספו גם לפרוטוקול, אשר יאפשר למשתמשים לבצע את המדידה בלעדיו, שכן הן שלב piezo והן שלב סיבוב המשמש לסיבוב צלחת חצי גל ניתן לשלוט באמצעות בקרים משלהם או תוכנה מתאימה. עם זאת, מומלץ מאוד לכתוב אלגוריתם המשלב את זווית הסיבוב של לוח חצי גל עם עוצמת 2PEF שנאספת עם שתי הפוטודיודות, שכן מתאם זה (גרפים קוטביים) חיוני לניתוח נתונים נכון וכתוצאה מכך מידע מבני.
- הר את הדגימה עם spherulites על הבמה piezoelectric (לשתק את מגלשת זכוכית עם קלטת). הקפידו להרכיב אותו באופן שבו צד זכוכית דק (כיסוי) פונה למטרה, שכן יעדים מספריים גבוהים מאופיינים במרחקי עבודה קצרים יחסית.
הערה: כאשר משתמשים בטבילת שמן, יש למרוח טיפה קטנה של שמן מינרלי על המטרה לפני הרכבת הדגימה והתמקדותה. - על ידי שינוי מיקומי XY ו-Z באמצעות ידיות מיקרוסקופ, מקדו את המטרה באחד הספרוליטים הנמצאים בתמיסה, אך שימו לב שמכיוון שקוטר הספרוליט הוא בדרך כלל בטווח של עשרות מיקרומטר, התמקדו באזור המרכזי של המבנה כולו. חפשו הילות שחורות ולבנות סביב הספרוליט הספציפי כסימנים למיקוד תחתון ועליון, בהתאמה. התאם את ציר "Z" כך שיהיה בין הקצוות האלה.
הערה: חשוב למצוא מדגם בודד ללא פגמים מבניים. ספרוליטים קטנים מאוד עשויים להיסחף עקב הלחץ החומרי שנוצר על ידי המטרה, בעוד שהמבנים הגדולים ביותר הם כנראה מצטברים או מעוותים מאוד. - מרכז את הספרוליט בשדה הראייה של המישור המיקרוסקופי הנצפה וקבע את גודל סריקת XY על ידי התבוננות בכמה צעדים פיאזושלב בכיווני X ו- Y (המוצגים בבקר הפיזוסטייג או בתוכנה שלו) נדרשים כדי לכסות את שטח המבנה כולו.
הערה: מומלץ להגדיר את המערכת כך שתחילת סריקת XY ממוקמת בסמוך לאחת מפינות הספרוליט וחופפת למיקום האפס של השלב (X ו- Y = 0) - התאם את פרמטרי הסריקה הבאים:
- התאימו את הקיטוב של קרן העירור, וסובבו את לוח חצי הגל כדי לקבל את הקיטוב המתאים לצירי "X" ו- "Y" של מישור הדגימה במיקרוסקופ.
הערה: ניתן לעשות זאת על ידי מדידת הגרפים הקוטביים של תווך פלואורסצנטי איזוטרופי כגון פלואורסצאין. עבור חומרים כאלה, עוצמת הפלואורסצנטיות המרבית מקבילה לקיטוב קרן העירור; לפיכך, סיבוב לוח חצי הגל מתאים את הקיטוב עם ציר X וציר Y במישור התצפית, המסומן גם כציר X וציר Y בגרפים קוטביים כמו באיור 4C. גרפים קוטביים מלאים יכולים להימדד על ידי איסוף עוצמת 2PEF הנמדדת בשתי הפוטודיודות עבור סיבוב של 180° של לוח חצי גל (סיבוב של 360° של קיטוב אור עירור) ומתאם את העוצמה עם זווית קיטוב האור העירור. ניתן לעשות זאת באופן ידני, על ידי מדידת עוצמת הפליטה עבור כל זווית לוח חצי גל בנפרד ולאחר מכן הרכבתה לגרף קוטבי בתוכנת ניתוח נתונים או באופן אוטומטי, באמצעות תוכנה ייעודית או בכתיבה עצמית. - התאם את הפרמטרים piezostage: מהירות הסריקה, צעד, וטווח כדי לכסות את השטח של spherulite כולו.
הערה: טווח הסריקה חייב להיות גבוה מקוטר הספרוליט כדי למסגר באופן מלא את כל מבנה-העל בסריקת הרסטר. מהירות סריקה נמוכה וצעד מאפשרים למשתמשים להשיג תמונות באיכות גבוהה; עם זאת, הדבר עלול לגרום לשריפת דגימה. לכן, פשרה התלויה בגודל הספרוליט היא הכרחית. פרמטרים אלה אינם ניתנים ליישום אוניברסלי. פרמטרים לדוגמה המשמשים באיור 5A: טווח סריקה 45 x 45 מיקרומטר, שלב סריקה 1 מיקרומטר ומהירות סריקה 2 מיקרומטר לשנייה.
- התאימו את הקיטוב של קרן העירור, וסובבו את לוח חצי הגל כדי לקבל את הקיטוב המתאים לצירי "X" ו- "Y" של מישור הדגימה במיקרוסקופ.
- פתחו את התריס, הפעילו את הפוטודיודות ואספו
רכיבי פליטה של 
2P עבור כל שלב ושלב באזור הסריקה שנבחר - עבור קרן העירור המקוטבת בהתאמה לצירי X ולאחר מכן לצירי Y. סריקות רסטר לדוגמה של שני פוטונים מעוררים אוטופלואורסנציה (2PAF) של ספרוליטים של אינסולין מוצגות באיור 5A.
הערה: מדידת סריקות רסטר דורשת התאמה בין קואורדינטות שלב פייזו לבין רכיבי פליטה שנאספו , דבר שניתן לעשות באופן ידני, על ידי מדידת העוצמה בכל נקודה ונקודה באזור שנבחר ולאחר מכן הרכבתה למטריצה דו-ממדית, או אוטומטית, באמצעות תוכנה בכתיבה עצמית. סריקות רסטר יכולות להיות מוצגות כסיכום ועוצמת רכיבי הפליטה או באופן ייחודי עבור רכיב פליטה ספציפי. מכיוון שהם תלויים מאוד במבנה, עיוותים מבניים בתוך ספרוליטים נראים בקלות. עם זאת, בשל תנועת שלב המיקרוסקופ, חלק מהדגימות עשויות להיסחף משדה הראייה. לכן, תמונות צריך להיות מוקרן עבור חפצים. יש לבדוק את מיקום הספרוליט לפני ואחרי הסריקה. - כדי לבצע ניתוח קיטוב מלא מהנקודה הספציפית בדגימה, כבה את קרן העירור.
- לאחר מכן, בחר קואורדינטות ספציפיות של piezostage המתאים למיקום שנבחר על הספרוליט שבו המידע על הכיוון של מולקולות נדרש עם רזולוציה sub-μm.
- כוונן את השלב הפיזואלקטרי כדי למרכז את שדה הראייה במצוין (X, Y).
- הפעל את קרן העירור ובצע ניתוח קיטוב מלא (360°) של ופליטה על ידי הפעלת סיבוב לוח חצי הגל (סיבוב של 180°). הציגו רכיבי 2PF Ix ו-Iy בצורת גרף קוטבי (כפי שמוצג באיור 5B).
הערה: ניתן לחזור על שלב זה במיקומים שונים במדגם כדי לאסוף כמות מספקת של נתונים.
4. קביעת סדר פיבריל מקומי בתוך ספרוליטים של אינסולין בקר
הערה: כל החישובים המספריים הקשורים לניתוח הנתונים נעשו באמצעות שפת התכנות Python ובהתבסס על הפונקציות הזמינות בספריות NumPy ו- SciPy. התוויית הנתונים דורשת את ספריית Matplotlib. כל החישובים מבוססים על נוסחאות המוצגות במידע תומך באחד המאמרים של Obstarczyk et al.6.
- הדמיית עוצמת הפלואורסצנטיות של שני פוטונים המעוררת להתפלגות מוגדרת של מולקולות עם כיוון נבחר של קיטוב האור (מסומן על ידי α)
הערה: הנוסחאות המוצגות מבוססות על ההנחה של מומנטי דיפול בליעה ופליטה מקבילים של פלואורופור. לדיון במקרים אחרים (למשל, כיוונים שונים של מומנטי דיפול בליעה ופליטה, מעבר אנרגיה בין הפלואורופורים), ראו את המאמר של Le Floc'h et al8.- מצא את הפרמטרים המביאים בחשבון את השונות של השדה החשמלי על ידי ערבוב קיטוב והשפעות דה-פולריזציה הנגרמות על ידי המראה הדיכרואית המותקנת בהתקנה:
- γ מייצג את גורם המשרעת בין ההשתקפות של
אור מקוטב לבין 
אור מקוטב ממראה דיכרואית. - δ מייצג את שינוי הפאזה (אליפטיות) בין אור מקוטב לאור מקוטב.
הערה: הגדרה נכונה של שני פרמטרים אלה חיונית לאפיון מבני מוצלח בגלל השפעתם החזקה על צורת הגרפים הקוטבייםהנמדדים 11,18. במקרה של המערכת המוצגת, שני הפרמטרים נקבעו במהלך מדידות אליפסומטריה של מראה דיכרואית המיושמת במערכת.
- γ מייצג את גורם המשרעת בין ההשתקפות של
- חשב את וקטורי השדה החשמלי המתפשטים בצירי X ו- Y בכל זווית שנמדדה במהלך מדידת ps-TPFM באמצעות משוואות (1-5).
(1)
(2)
(3)
(4)
(5)
הערה: אם העוצמה נמדדת על פני 360° כולה עם שלב 1°, חשב וקטורי שדה חשמלי עבור כל 360°. כל הזוויות צריכות להיות ברדיאנים. פרמטר ρ מחובר לתדר אופטי ω של השדה החשמלי המדומה (ρ=ω·t) ונעשה בו שימוש משולב מ-0 עד 2π במהלך חישובי וקטורי השדה החשמלי המתפשטים בציר X ו-Y עבור כל זווית α שנמדדו במהלך מדידת ps-TPFM. - הגדר את הפונקציות למומנטי דיפול מעבר בכיוונים של שלושה צירים של מערכת קרטזית על פי משוואות (6-8):
(6)
(7)
(8)
הערה: φ היא זווית הכיוון של הציר הארוך של עמילואיד פיבריל במסגרת הדגימה XY. זוויות θ ו-φ הן הזוויות הקוטביות והאזימוטליות המשמשות להגדרת כיוון מומנט דיפול המעבר של פלואורופור. - השתמש בפונקציות שהוגדרו בשלב 4.1.3. להגדיר פונקציות עבור Jx (Φ,θ,φ) ו- JY(Φ,θ,φ), המביאות בחשבון את תרומתו של מיקוד אור הדוק עם יעד צמצם מספרי גבוה לזיהוי הקיטוב הפלואורסצנטי בכיוון X ו- Y באמצעות משוואות (9, 10).
(9)
(10)
הערה: גורמי K1, K2, K3 קשורים למטרה במיקרוסקופ המשמשת במהלך מדידת ps-TPFM. בניסויים אלה נעשה שימוש ביעד טבילת שמן אפוכרומטי 100x/1.4 NA וגורמי K1, K2, K3 היו 2.945, 0.069 ו-1.016, בהתאמה. - הגדר פונקציה עבור f(Ω), שהיא התפלגות זוויתית מולקולרית, בהתאם לחצי הצמצם של חרוט פלואורופור Ψ, עם עובי משתנה ΔΨ; השתמש במשוואה (11). הייצוג הגרפי של כל שלוש הזוויות הנוגעות לפיבריל עמילואיד מוצג באיור 6.
(11)
הערה: היזהר בעת כתיבת המעריך - החזקה של 2 פועלת על ארגומנט הפונקציה, לא על הפונקציה כולה! - הגדר את כל גורמי fWWIJKL כפי שמוצג במשוואות (12-21).
(12)
(13)
(14)
(15)
(16)
(17)
(18)
(19)
(20)
(21) - חישוב עוצמות פלואורסצנטיות
מעוררות של שני פוטונים ועבור 
כל זווית נמדדת (בדומה לנקודה 4.1.2) באמצעות משוואות (22, 23).
= 
(22)
= 
(23) - בדוק אם הסימולציה פועלת כראוי באמצעות ערכי המשתנים הבאים (ממוקמים במקרא לאיור 7) והשווה את התוצאות שהתקבלו עם איור 7A-C.
הערה: כל המעלות צריכות להיות כתובות ברדיאנים.
- מצא את הפרמטרים המביאים בחשבון את השונות של השדה החשמלי על ידי ערבוב קיטוב והשפעות דה-פולריזציה הנגרמות על ידי המראה הדיכרואית המותקנת בהתקנה:
- התאימו את העוצמות המדומות לעוצמה של אוטופלואורסצנטיות מעוררת שני פוטונים של ספרוליטים של אינסולין בקר שנאספו במהלך מדידות ps-2PFM.
הערה: פתרון מבנה הספרוליט בהתבסס על מדידות ps-2PFM דורש שימוש במשוואות הכתובות בפרוטוקול כדי לדמות את העוצמה התיאורטית של פלואורסצנטיות מעוררת של שני פוטונים ולהתאים את כל הפרמטרים הקשורים לסדר של פלואורופור מולקולרי. הוא דורש חזרות מרובות על הערכים השונים של Φ, זווית המתארת את סיבוב הפיבריל בדגימת המיקרוסקופ XY, ו-ΔΨ, סטיות של ההתפלגות החרוטית של דיפול הפליטה Ψ עקב הסיבובים המולקולריים בחוטים עבור Ψ קבוע עד הגעה למקדם R2 הגבוה ביותר האפשרי בין עוצמת אות פלואורסצנטי מעורר של שני פוטונים מנורמל שנאסף במהלך המדידה לבין עוצמות מנורמלות המדומות על פי שלב 4.1 של הפרוטוקול.- קבע את חצי הזווית Ψ .
הערה: עבור ספרוליטים של אינסולין בקר, הוא צריך להיות שווה ל-Ψ = 29°6. - התאמת זרימת עבודה:
- בחר את הערך של Φ בין 0° ל- 180° ( באיור 8A ו- 8B Φ = 16° ו- 127°, בהתאמה).
- בחר את הערך של ΔΨ בין 0° ל- 90° (באיור 8A,B, ΔΨ = 24° ו- 1°, בהתאמה).
- חשב (משוואה 22) ו - (משוואה 23) עבור כל הטווח הנמדד של זוויות θ באמצעות הערכים שנבחרו של Φ ו- ΔΨ.
- השווה את העוצמות שחושבו במהלך סימולציות (שתיהן מנורמלות לערך המרבי של
- חישוב ) עם עוצמות מנורמלות של
- חשב ו - (שניהם מנורמלים לערך המרבי של ) שנמדדו במהלך מדידת ps-2PFM.
הערה: בניסויים שהוצגו, מקדמי מתאם מכפלה-רגע של פירסון חושבו באמצעות הפונקציה "corrcoef" מספריית NumPy Python.
- בסופו של דבר, בחרו את הערכים של Φ ו-ΔΨ המובילים למקדמי המתאם הגבוהים ביותר ולהתכנסות בין העוצמות המדומות לבין האות הנמדד בדומה למה שמוצג באיור 8.
- קבע את חצי הזווית Ψ .
אור מקוטב לבין 
אור מקוטב ממראה דיכרואית.
(1)
(2)
(3)
(4)
(5)
(6)
(7)
(8)
(9)
(10)
(11)
(12)
(13)
(14)
(15)
(16)
(17)
(18)
(19)
(20)
(21)
כל זווית נמדדת (בדומה לנקודה 4.1.2) באמצעות משוואות (22, 23).
= 
(22)
= 
(23)Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הפרוטוקול המוצג מספק הדרכה שלב אחר שלב באמצעות הכנת מבני על עמילואידיים לבדיקה עם ps-2PFM, בניית המערכת המיקרוסקופית ומדידות של הדגימה המתאימה. אולם לפני סדרת המדידות הסופית, חיוני ליישר כראוי את ה-APDs עם ייחוס איזוטרופי, מה שאמור לגרום לאיסוף אות סימטרי בעל צורה ועוצמה דומות בשני הגלאים (איור 4C). אפילו הבדלים מזעריים בין העוצמות הנמדדות על הגלאים בצירי X ו-Y צריכים להילקח בחשבון במדידות נוספות ובמיוחד במהלך הניתוח כגורם תיקון מתאים. לאחר ההרכבה, הדגימה מכילה ספרוליטים בודדים, הנותנים צלב מלטזי אופייני על POM כמו באיור 2B, ולאחר ביצוע סריקת רסטר 2PFM, התמונה צריכה להיראות דומה למה שמוצג באיור 5A, אשר עולה בקנה אחד עם סריקות רסטר 2PFM מדווחות של ספרוליטים 6,7 וביומומולקולות מאורגנות שונות11,12. ניתן להבחין בכמה שינויים במיקום הציר עם הבהירות הגבוהה ביותר, אשר קשורה לעובדה כי עוצמת אות פלואורסצנטי תלוי מאוד בקיטוב של קרן העירור. לכן, יש לוודא איזה מיקום של חצי לוחית הגל מתאים לעירור הדגימה לאורך צירי X (איור 5A, למעלה) ו-Y (איור 5A, למטה). ראוי גם לציין כיצד גרפים קוטביים משתנים בעת ביצוע ניתוח קיטוב מלא מנקודות נבחרות שונות. מחוץ לספרוליט, הגרף הקוטבי נראה כמו אוסף של ממצאים וקופיצים אקראיים של רעש אותות (איור 5B, I). גרף כזה עשוי גם להצביע על סחף הספרוליט בין מדידות ולדרוש מציאת קואורדינטות חדשות של המבנה כולו על ידי סריקת רסטר 2PF נוספת. גרפים קוטביים שנמדדו כראוי ממקומות מסודרים מאוד של אינסולין ספרוליט לאורך צירי X ו-Y מוצגים באיור 5B, II ו-III, בהתאמה. הם יכולים להיות בעלי צורות וגיאומטריות שונות, בהתאם לכיוון המקומי ולארגון של פלואורופורים שנמדדו מהנקודה שנבחרה7.
השלב האחרון של הפרוטוקול מתמקד בניתוח הנתונים המתקבלים באמצעות אלגוריתם המבוסס על מודל מתמטי המשלב את הכיוון של סיבי עמילואיד במישור XY Φ, מומנטי הדיפול הארעי הפלואורופור הקשורים Ψ, והסטיות שלהם ΔΨ (איור 6) עם עוצמה 
ושל 
פלואורסצנטיות המושרה על ידי שני פוטונים. פונקציות המיושמות כהלכה המוצגות בפרוטוקול אמורות, לאחר הזנת נתוני הקלט המתאימים (שלב פרוטוקול 4.9), להפיק גרפים קוטביים זהים לאלה המוצגים באיור 7. כל סטייה - כיוון נתונים שונה, עוצמות או צורות שונות של סימולציה 
ו 
- מציינות שגיאות בקוד. אם המודל עובד, אפשר להמשיך לשלב האחרון של הפרוטוקול - התאמת הנתונים המדומים לנתונים אמיתיים המתקבלים ממדידת ps-2PFM. ערכים נבחרים של Φ ו-ΔΨ עם מקדמי המתאם הגבוהים ביותר והתכנסות בין העוצמות המדומות לבין האות הנמדד אמורים להוביל לתמונות דומות כפי שמוצג באיור 8. צריכה להיות ההתאמה והפונקציות הטובות ביותר האפשריות לכיוון ולצורה הכוללים של ו - והערכים של Φ ו- ΔΨ צריכים להתאים לכיוון המקומי של סיבים ופלואורופורים בנקודה הנמדדת על הספרוליט. מודלים דומים ושיטות התאמה דומים יכולים לשמש גם לקביעת הארגון המקומי של ביומולקולות אחרות כמו דנ"א11.
איור 1: מערך מיקרוסקופיה רגישה לקיטוב של שני פוטונים. סכמה המציגה את מערך המיקרוסקופ הדו-פוטוני המשמש למדידות פלואורסצנטיות מעוררות של שני פוטונים רגישים לקיטוב של ספרוליטים של אינסולין בקר. רכיבים של פליטה מעוררת של שני פוטונים אופקית ומקוטבת אנכית (למישור דגימה במיקרוסקופ) מתוארים עם IX ו- IY, בהתאמה. קיצורים: SP = מישור מדגם; O = אובייקטיבי; DM = מראה דיכרואית; λ/2 = צלחת חצי גל; LPF = מסנן מעבר ארוך; BE = מרחיב קרן; P = מקטב גלאן; Ti: Sa = טיטאן: מקור אור לייזר ספיר; M = מראה; SPF = מסנן מעבר קצר; PBS = מפצל קרן קיטוב; L = עדשה אופטית; APD = פוטודיודת מפולת שלגים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: סכימה המציגה את הכנת השקופית/תמונה. (A) סכימה המציגה את הכנת הדגימה האטומה; (B) צילומים של השלבים הבאים לאיטום הדגימה. I: aliquot 100 μL של תמיסת הספרוליט על שקופית המיקרוסקופ עם באר, II: כיסוי נפל על גבי התמיסה; III: אטם הדוק שנוצר מפולימר שהושקע (mountant). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: בקרת איכות של כדורי האינסולין תחת מיקרוסקופ אור מקוטב. (A1,B1) מצב Brightfield וכן תחת (A2,B2) חוצה מקטבים. ניתן לראות דפוס צלב מלטזי אופייני בתמונות המתאימות שצולמו עם מקטבים מוצלבים. (A) אגרגטים ספרוליטים עם עיוותים מבניים, (B) ספרוליט מבודד באיכות גבוהה. פסי קנה מידה = 5 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: בדיקת היישור של מערכת ps-2PFM. (A) תמונה לא ממוקדת קונצנטרית של פלואורסצנטיות פלואורסצאין כפי שהיא נראית ללא (A1) ועם (A2) מראה דיכרואית, (B) ספרוליט פגום עם חורים שרופים הנובעים מניתוח הקיטוב המוארך בנקודות נבחרות לאורך כיווני x ו-y, (C) רכיבי פליטה מעוררים של שני פוטונים בתלות בזווית קיטוב האור כפי שנרשמו עבור דגימה איזוטרופית (תמיסת פלואורסצאין). ולציין רכיבי פליטה הנמדדים על ידי פוטודיודות מפולת שלגים המודדות את ציר קיטוב הפליטה X ו- Y, בהתאמה. מוטות קנה מידה = 5 מיקרומטר (A1,A2), 10 מיקרומטר (B). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: סריקות רסטר מופתיות של 2PFM וגרפים קוטביים מספרוליט אינסולין ללא תוויות. (A) סריקות רסטר בעוצמה 2PF של ספרוליטים אינסולין ללא תוויות: קיטוב של אור עירור: (A1) קיטוב אופקי, (A2) קיטוב אנכי ופליטה מסומנים בחצים לבנים, והכניסה מראה את אותו ספרוליט שצולם תחת מיקרוסקופ אור מקוטב סטנדרטי עם מקטבים מוצלבים. (B) גרפים קוטביים הנגזרים משלושה כתמים המסומנים בסריקת A1 (B1, I; ב2, ב; ב3, ג). Ixו - Iyמציינים רכיבי פליטה הנמדדים על ידי פוטודיודות מפולת שלגים המודדות את ציר קיטוב הפליטה X ו- Y, בהתאמה. קיצור: 2PF = פלואורסצנטיות של שני פוטונים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: התפלגות חרוטית של דיפול הפליטה של הצבע (חצי זווית, Ψ) ביחס לציר הפיבריל הארוך. הקו המקווקו מציג את ציר הפיבריל הארוך. סיבוב הפיבריל במישור הדגימה במיקרוסקופ XY מתואר על ידי הזווית. סטיות של Ψ עקב הסיבובים המולקולריים בחוטים מתוארות על ידי ΔΨ. נתון זה הוא מ Obstarczyk et al6. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 7: עוצמה מדומה של פלואורסצנטיות מעוררת של שני פוטונים מקוטבים. פלואורסצנטיות מחושבת עבור (A) Φ = 1°, Ψ = 1°, ΔΨ = 1°; (B) φ = 1°, ψ = 30°, δψ = 1°; (c) φ = 1°, ψ = 30°, δψ = 60°. קווים אדומים, כחולים וצהובים תואמים ל - , ו - + , בהתאמה. זווית Φ מתארת את סיבוב הפיבריל במישור הדגימה במיקרוסקופ XY, Ψ - התפלגות חרוטית של דיפול הפליטה, ו- ΔΨ- סטיות של Ψ עקב הסיבובים המולקולריים בחוטים. כל שאר הפרמטרים היו זהים בכל המקרים: K1 = 2.945, K2 = 0.069, K3 = 1.016, γ = 0.01 ו- δ = 0.98845. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 8: גרפים קוטביים של מערכי נתונים ניסיוניים. (A,B) גרפים קוטביים לדוגמה לאחר התאמת שני מערכי נתונים ניסיוניים שנאספו במהלך מדידות ps-TPFM של ספרוליטים של אינסולין בקר. רכיבי פליטה נמדדים ושני פוטונים מעוררים עבור ציר קיטוב הפליטה X ו- Y מוצגים עם נקודות אדומות וכחולות, בהתאמה; בינתיים, קווים מוצקים מציגים את רכיבי הפליטה הפלואורסצנטיים המעוררים המתאימים של שני פוטונים עבור ציר קיטוב הפליטה X ו- Y ו - . אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מיקרוסקופ שני פוטונים רגיש לקיטוב הוא כלי רב ערך לחקר הסדר המקומי של סיבים בתוך מבני העל של עמילואיד, הדורש רק שינויים קטנים של מערך המולטיפוטונים הסטנדרטי. מכיוון שהוא פועל על תופעות אופטיות לא ליניאריות, ניתן להשיג בחירת צילום זוויתית מופחתת ורזולוציה צירית משופרת בהשוואה לשיטות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית מעוררת של פוטון אחד. בנוסף, הוא מוביל לפיזור אור נמוך יותר, רעילות אור נמוכה יותר וחדירת דגימה עמוקה יותר בהשוואה לטכניקות מיקרוסקופ פלואורסצנטי עירור פוטון אחד19,20. כפי שכבר הוכחנו, הוא מתאים היטב למדידות של אגרגטים צפופים של חלבונים כגון ספרוליטים, אשר ניתן לבצע באופן ללא תוויות21.
עם זאת, כדי להשתמש ביעילות בשיטה המתוארת כאן, יש לשים לב למספר נושאים מרכזיים. החל מהכנת הדגימה ואיכותה, כלומר הדגירה, תמיד לוודא כי מבני העל עמילואיד גדלו כראוי. במקרה של ספרוליטים, השתמשנו במיקרוסקופ אופטי מקוטב עם מקטבים מוצלבים כדי למקם ספרוליטים בוגרים, אשר נותנים תבנית צלב מלטזית אופיינית, ויש להם רדיוס של ~ 5 מיקרומטר16. עם זאת, ספרוליטים הם הטרוגניים, וניתן לראות מבנים ייחודיים בתוך המדגם. לכן, חשוב לבחור מינים מופרדים ולא מעוותים. באשר למערכת המדידה עצמה, חיוני לשלוט בקיטוב של אור התקרית כך שיש לקבוע במדויק את הקיטוב של הקרן בכניסה לגוף המיקרוסקופ ולמזער את הדפולריזציה שהוכנסה על ידי האלמנטים האופטיים המשמשים22. כדי להבטיח את הביצועים הטובים ביותר, אנו ממליצים להשתמש במראות כסף באיכות גבוהה ובמסננים אופטיים המותאמים לאורכי גל העירור והפלואורסצנטיות. בשל תפקיד המפתח של קיטוב האור גם בנתיב הפליטה, חיוני למדוד דגימת ייחוס איזוטרופית לפני המדידה בפועל. אם נתיב העירור וגלאי APD מיושרים כהלכה, יש לראות אות באותה עוצמה בשני הגלאים כפי שמוצג באיור 4C. הייחוס אמור ליצור פלואורסצנטיות מעוררת חזקה של שני פוטונים בעוצמת לייזר נמוכה יחסית כדי למנוע הלבנה; השתמשנו בפלואורסצאין מאחר שחתך בליעת שני פוטונים באורכי גל שונים כבר דווח בספרות23.
כדי לקבוע נכונה את הסדר של מבנים בתוך spherulites, הרבה תשומת לב צריך להיות מוקדש גם ניתוח נתונים. הנחת היסוד של מודל זה היא הקולינאריות של מומנט דיפול המעבר של בליעה ופליטה של אור. על פי הנחה זו, יישור מומנט דיפול המעבר של המולקולה במקביל לקיטוב של אור האירוע מאפשר את שילובו עם המבנה הפנימי של הדגימה הנבדקת, ומניב את עוצמת הפליטה הגבוהה ביותר. המודל הנתון יכול לשמש גם כקירוב טוב להבדלים קטנים בזווית בין שני מומנטי הדיפול8 , אך דורש שינויים נוספים עבור סטיות גדולות. לכן, כמתואר, יש לקחת בחשבון כמה הנחות לגבי הדגימה מראש לצורך הדמיה וניתוח נתונים. במקרה המודל שעליו מתבססות הסימולציה והמשוואות המשמשות בשיטה זו, המקור העיקרי לדפולריזציה במערכת הוא המראה הדיכרואית. לכן, לפני שנמשיך בניתוח הנתונים, יש לקבוע את הפרמטרים האחראים לדפולריזציה שהוצגה על ידי המראה הדיכרואית בשל השפעתם על צורת הגרפים הקוטביים שנאספו וכתוצאה מכך, קביעה נכונה של ארגון המולקולות בתוך המבנה הנבדק במהלך התאמה18. זה הופך לבעיה מרכזית, במיוחד במקרה של מדידות למספר אורכי גל, שכן השינוי באליפטיות של המראה הדיכרואית תלוי באורכי גל12 באופן מובהק. אינדוקציה של דפולריזציה יכולה להשפיע מאוד על המאפיינים של האות שנאסף11. אחרון חביב, בעת יצירת הסקריפט לניתוח נתונים, יש לשים לב תוך הצגת פונקציות מתמטיות ומשתנים המוצגים בחלק האחרון של הפרוטוקול. כדי להימנע משגיאות, התמקדו בתכונות כגון קריאות מרובות לפונקציות ופרמטרים גלובליים, שגם יאיצו משמעותית את זמן הניתוח.
עלינו להזכיר גם את הבעיות הנפוצות ביותר שניתן להיתקל בהן בעת שימוש בשיטה המתוארת. זמן הכנת המדגם תלוי מאוד במהירות ההתקשות הרכובה. כדי לזרז זאת, אנו ממליצים להכין את הדגימות במקום חם ויבש ולאטום את תמיסת הספרוליט לפני הרכבתה במיקרוסקופ. מדידות המבוצעות מוקדם מדי עלולות להוביל לפתיחת השקופית ולהרס עדשת המטרה המשומשת. בנוסף, למרות הכנת הדגימה הנכונה, ספרוליטים קטנים עשויים לצוף בתמיסה במהלך המדידה בשל הלחץ החומרי שמציגה המטרה. כדי להימנע מכך, אנו ממליצים לסרוק מבנים מבודדים בגודל בינוני מכיוון שהגדולים ביותר הם בדרך כלל אגרגטים. מומלץ לבדוק אם הספרוליט הסרוק זז לאחר איסוף הנתונים, בהשוואה לתמונה לפני תחילת המדידה. בנוסף, למרות היישור הנכון של כל האלמנטים האופטיים והגלאים המשמשים למדידת ps-2PFM, העוצמות הנמדדות והייחוס האיזוטרופי עדיין עשויים להיות שונים מעט בעוצמתם. במקרה כזה, יש לקחת זאת בחשבון בעת ניתוח הנתונים ממדידות המדגם על ידי הכפלת אחת העוצמות במקדם התיקון שנקבע במהלך מדידות הייחוס. אחרון חביב, ייתכן כי במהלך הליך ההתאמה, הסקריפט לא יוכל למצוא ערכים תואמים של Φ ו- ΔΨ. זה יכול להיות בגלל מספר גורמים - נתונים נאספו מנקודה לא מאורגנת על מדגם, למשל, הליבה של ספרוליט; המבנה הנחקר לא נוצר במלואו במהלך הדגירה; סימולציה שגויה של ו - ; שימוש בפרמטרים שגויים של מראה דיכרואית γ ו- δ; סט צעדים גדול מדי עבור זוויות Φ ו- ΔΨ בין כל איטרציה במהלך ההתאמה. במקרה של נקודה לא מאורגנת, אנו ממליצים לנסות לאסוף נתונים מנקודות השוכנות קרוב יותר להיקף המבנה הנבדק. במקרה של מבנה שנוצר באופן חלקי, חזור על הדגירה או חפש בשקופית מבנים אחרים. במקרה של סימולציות שגויות, בדוק ידנית אם על ידי שינוי הפרמטרים Φ, Ψ ו- ΔΨ, את העוצמות המדומות ושנה ותקן שגיאות בקוד. במקרה של פרמטרים שגויים של מראה דיכרואית, בדוק היטב את γ ואת δ הפרמטרים של המראה הדיכרואית המשמשת במהלך המדידות. במקרה של סט גדול שנקבע לזוויות במהלך ההתאמה, צמצם את המדרגה בין חזרות עוקבות ל- 2º או 1º. כמו כן יש לזכור כי במקרה של חוסר ארגון מקומי חזק של המבנה, R2 תמיד יהיה נמוך יותר, לעתים קרובות בטווח של 0.5-0.6. הסיבה לכך היא שהמודל המוצג מתאר מולקולות מסודרות מאוד שבהן רוב מומנטי הדיפול הארעי מיושרים בכיוון דומה; לפיכך, התאמה בין מבנים אמורפיים או מאוד לא מסודרים מובילה למקדמי מתאם נמוכים יותר. לכן, חיוני להחזיק לפחות מידע מבני על המדגם לפני המדידה כדי לנתח נכונה את הנתונים המתקבלים.
ראוי גם לציין כי השיטה המוצגת בעלת מספר מגבלות. ניתוח נתונים יכול לגרום למספר ערכים של זוויות Φ ו- ΔΨ עם גורמי מתאם גבוהים מספיק, הדורשים מהנסיין להשתמש בידע ובניסיון שלו כדי לבחור ערכים מתאימים. במקרה זה, יש לקחת בחשבון את תנאי הגבול, כגון שחצי חרוט פלואורופור Ψ חייב תמיד להיות גדול יותר מהסטייה שלו ΔΨ. בנוסף, כאשר משווים את הנתונים שלנו עם הספרות, ראוי לציין כי כמה מאמרים מתארים Ψ כזווית חרוט מלא, בעוד שאנו פועלים על זווית חצי חרוט. מגבלה נוספת היא רזולוציית המדידה, המוגבלת לרזולוציה תת-מיקרונית. מסיבה זו, הסלקטיביות הפוטו-סלקטיבית של המערכת וקביעת הארגון המקומי המתקבלת מבוססים על האות הממוצע מסיבים המעוררים בנקודת המוקד ולא ממבנים בודדים. יתר על כן, הדגימה עצמה צריכה להיות בעלת תפוקה קוונטית פלואורסצנטית מספקת, שכן חשיפה ארוכה תחת עוצמת לייזר אירוע fs (הכרחית להשגת נתונים עבור גרפים קוטביים) עלולה להיות הרסנית ולהשפיע על התוצאות.
למרות קשיים אלה, אנו מאמינים כי לשיטה המוצגת במאמר זה יש מגוון רחב של יישומים, להדמיה מבוססת תוויות וללא תוויות של מבנים ביולוגיים בסביבות לחות ומורכבות. בעבר הראינו כי סדר פיבריל מקומי המחושב מנתוני ps-2PEF נמצא בקורלציה עם מידע המופק ממיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת7. לכן, אישרנו את התוקף של ps-2PEF בהדמיה ביולוגית והרחבנו עוד יותר את הידע על הסדר המבני של מבני על עמילואידים. שיטה זו יכולה להיות מיושמת כדי ללמוד על המקור של פלואורסצנטיות פנימית שנצפתה במקרה של רכיבים שונים של דגימות ביולוגיות, כגון autofluorescence של אגרגטים חלבונים - עמילואידים. בהינתן נתונים רלוונטיים על כיוון מומנט הדיפול של בליעה/פליטה ביחס לציר הארוך של סיבי עמילואיד, התכונות האופטיות של הסיבים יכולות להיות מתואמות עם המבנה שלהם6. הצבענו על כך שעבור מבנים עם זווית Ψ שכבר נקבעה, טכניקה זו מאפשרת זיהוי של תכונות מבניות מובחנות של מבני על עמילואידיים ופולימורפים של מבני-על של אינסולין בהתבסס על רמת הארגון שלהם7. כפי שצוין קודם לכן בפרוטוקול, ניתן ליישם את המערך המוצג גם למדידות דור הרמוני שני רגיש לקיטוב, שהוא גם טכניקה ללא תווית של מיקרוסקופיה של שני פוטונים24. זה ידרוש לא רק הרכבה של מסננים אופטיים שונים, אלא גם שינוי הנוסחאות המשמשות לניתוח נתונים25. יתר על כן, עם תוספת של רבע לוחית גל מיושרת כראוי, זה יכול לשמש כדי לעורר את הדגימה עם אור מקוטב מעגלי, אשר עשוי להוביל ליצירת תכונות אופטיות כיראליות לא ליניאריות של עמילואידים שכן הם ביופולימרים כיראליים עם תכונות כיראופטיות חזקות מאושרות26. עם זאת, במקרה כזה, הווקטור החשמלי המסתובב כל הזמן יוביל לשינוי הכיוון המתמיד של הפליטה המעוררת, מה שלא יאפשר לקבוע מידע מבני כלשהו באמצעות המשוואות המוצגות בכתב יד זה. בסך הכל, ps-2PEF הוא כלי מבטיח לקביעת הארגון בתוך מבנים ביולוגיים מורכבים רבים עם דיפולים פליטה מסודרים, כגון אגרגטים של חלבונים, DNA או רקמות באופן לא פולשני.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי פרויקט סונטה ביס 9 (2019/34/E/ST5/00276) שמומן על ידי המרכז הלאומי למדע בפולין.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sample preparation | |||
| Coverslips, 24 x 24 mm | Chemland | 04-298.202.04 | |
| DPX mountant for histology | Sigma-Aldrich | 6522 | Slide mountant |
| Eppendorf Safe-Lock tubes, 1.5 mL, polypropylene | Chemland | 02-63102 | |
| Eppendorf ThermoMixer C | Eppendorf | Used for spherulite incubation | |
| HLP 5UV Water purification system | Hydrolab | Source of dionized water used in sample preparation | |
| Hydrochloric acid (≥37%, APHA ≤10), | Sigma-Aldrich | 30721-M | |
| Insulin powder from the bovine pancreas (≥25 units/mg (HPLC)) | Sigma-Aldrich | I5500 | |
| Methanol (HPLC grade) | Sigma-Aldrich | 270474 | |
| Microscope slides with a concave, 76 x 26 x 1 mm | Chemland | 04-296.202.09 | |
| Olympus BX60 | Olympus | Polarized Optical Microscope used in Figure 2 | |
| PTFE thread seal tape, 12 mm x 12 mm x 0.1 mm, 60 gm2 | Chemland | VIT131097 | |
| Microscope ps-2PFM setup | |||
| Chameleon Ultra II | Coherent | ||
| FELH0800 - Ø25.0 mm Longpass Filter | Thorlabs | ||
| FESH0700 - Ø25.0 mm Shortpass Filter | Thorlabs | ||
| IDQ100 photon-counting avalanche photodiodes | ID Quantique | ||
| Multiphoton short-pass emission filter 720 nm | Semrock | ||
| Mounted Achromatic Half-Wave Plate, 690-1200 nm | Thorlabs | ||
| Nikon Plan Apo Oil Immersion 100x/1.4 NA | Nikon | ||
| piezo 3D stage | Piezosystem Jena | ||
| Polarizing Beamsplitter | Thorlabs | ||
| S130C - Slim Photodiode Power Sensor, Si, 400 - 1100 nm, 500 mW | Thorlabs | ||
| Software | |||
| LabView 2018 | National Instruments | Version 18.0.1f2 | |
| Matplotlib library | Version 3.3.2 | ||
| NumPy library | Version 1.19.2 | ||
| SciPy library | Version 1.5.2 | ||
| Spyder Python 3 IDE | Version 4.1.5 |
References
- Petazzi, R. A., Aji, A. K., Chiantia, S. Progress in Molecular Biology and Translational Science. Giraldo, J., Ciruela, F. 169, Academic Press. 1-41 (2020).
- Kress, A., et al. Probing orientational behavior of MHC class I protein and lipid probes in cell membranes by fluorescence polarization-resolved imaging. Biophysical Journal. 101 (2), 468-476 (2011).
- Duboisset, J., et al. Thioflavine-T and Congo Red reveal the polymorphism of insulin amyloid fibrils when probed by polarization-resolved fluorescence microscopy. The Journal of Physical Chemistry B. 117 (3), 784-788 (2013).
- De Luca, G., et al. Probing ensemble polymorphism and single aggregate structural heterogeneity in insulin amyloid self-assembly. Journal of Colloid and Interface Science. 574, 229-240 (2020).
- Helmchen, F., Denk, W.
- Obstarczyk, P., Lipok, M., Grelich-Mucha, M., Samoć, M., Olesiak-Bańska, J. Two-photon excited polarization-dependent autofluorescence of amyloids as a label-free method of fibril organization imaging. The Journal of Physical Chemistry Letters. 12 (5), 1432-1437 (2021).
- Obstarczyk, P., Lipok, M., Żak, A., Cwynar, P., Olesiak-Bańska, J. Amyloid fibrils in superstructures - local ordering revealed by polarization analysis of two-photon excited autofluorescence. Biomaterials Science. 10 (6), 1554-1561 (2022).
- Le Floc'h, V., Brasselet, S., Roch, J. -F., Zyss, J. Monitoring of orientation in molecular ensembles by polarization sensitive nonlinear microscopy. The Journal of Physical Chemistry B. 107 (45), 12403-12410 (2003).
- Chen, C., et al. In vivo near-infrared two-photon imaging of amyloid plaques in deep brain of Alzheimer's disease mouse model. ACS Chemical Neuroscience. 9 (12), 3128-3136 (2018).
- Gasecka, P., Balla, N. K., Sison, M., Brasselet, S. Lipids-fluorophores interactions probed by combined nonlinear polarized microscopy. The Journal of Physical Chemistry B. 125 (50), 13718-13729 (2021).
- Mojzisova, H., et al. Polarization-sensitive two-photon microscopy study of the organization of liquid-crystalline DNA. Biophysical Journal. 97 (8), 2348-2357 (2009).
- Olesiak-Banska, J., et al. Liquid crystal phases of DNA: Evaluation of DNA organization by two-photon fluorescence microscopy and polarization analysis. Biopolymers. 95 (6), 365-375 (2011).
- Olesiak-Banska, J., et al. Gold nanorods as multifunctional probes in a liquid crystalline DNA matrix. Nanoscale. 5 (22), 10975-10981 (2013).
- Grelich-Mucha, M., Lipok, M., Różycka, M., Samoć, M., Olesiak-Bańska, J. One- and two-photon excited autofluorescence of lysozyme amyloids. The Journal of Physical Chemistry Letters. 13 (21), 4673-4681 (2022).
- Brasselet, S., et al. Fluorescent Methods to Study Biological Membranes. Mély, Y., Duportail, G. , Springer. Berlin Heidelberg. 311-337 (2013).
- Krebs, M. R., et al. The formation of spherulites by amyloid fibrils of bovine insulin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (40), 14420-14424 (2004).
- Aït-Belkacem, D., Gasecka, A., Munhoz, F., Brustlein, S., Brasselet, S. Influence of birefringence on polarization resolved nonlinear microscopy and collagen SHG structural imaging. Optics Express. 18 (14), 14859-14870 (2010).
- Schön, P., Munhoz, F., Gasecka, A., Brustlein, S., Brasselet, S. Polarization distortion effects in polarimetric two-photon microscopy. Optics Express. 16 (25), 20891-20901 (2008).
- Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron. 50 (6), 823-839 (2006).
- Zipfel, W. R., Williams, R. M., Webb, W. W. Nonlinear magic: multiphoton microscopy in the biosciences. Nature Biotechnology. 21 (11), 1369-1377 (2003).
- Ferrand, P., et al. Ultimate use of two-photon fluorescence microscopy to map orientational behavior of fluorophores. Biophysical Journal. 106 (11), 2330-2339 (2014).
- Chipman, R. A. Depolarization index and the average degree of polarization. Applied Optics. 44 (13), 2490-2495 (2005).
- de Reguardati, S., Pahapill, J., Mikhailov, A., Stepanenko, Y., Rebane, A. High-accuracy reference standards for two-photon absorption in the 680–1050 nm wavelength range. Optics Express. 24 (8), 9053-9066 (2016).
- Mansfield, J. C., Mandalia, V., Toms, A., Winlove, C. P., Brasselet, S. Collagen reorganization in cartilage under strain probed by polarization sensitive second harmonic generation microscopy. Journal of The Royal Society Interface. 16 (150), 20180611 (2019).
- Duboisset, J., Aït-Belkacem, D., Roche, M., Rigneault, H., Brasselet, S. Generic model of the molecular orientational distribution probed by polarization-resolved second-harmonic generation. Physical Review A. 85 (4), 043829 (2012).
- Loksztejn, A., Dzwolak, W. Chiral Bifurcation in aggregating insulin: an induced circular dichroism study. Journal of Molecular Biology. 379 (1), 9-16 (2008).
