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Chemistry

एक लेबल-मुक्त अमाइलॉइड संरचनात्मक लक्षण वर्णन के लिए ध्रुवीकरण-संवेदनशील दो-फोटॉन माइक्रोस्कोपी

Published: September 8, 2023 doi: 10.3791/65670
Automatic Translation
1, 1, 1
1Institute of Advanced Materials, Wrocław University of Science and Technology

Summary

यह पत्र बताता है कि ध्रुवीकरण-संवेदनशील दो-फोटॉन माइक्रोस्कोपी को लेबल-मुक्त अमाइलॉइड सुपरस्ट्रक्चर-स्फेरुलाइट्स के भीतर स्थानीय संगठन को चिह्नित करने के लिए कैसे लागू किया जा सकता है। यह यह भी वर्णन करता है कि नमूना कैसे तैयार करें और मापें, आवश्यक सेटअप को इकट्ठा करें, और अमाइलॉइड फाइब्रिल के स्थानीय संगठन के बारे में जानकारी प्राप्त करने के लिए डेटा का विश्लेषण करें।

Abstract

अपने एक-फोटॉन समकक्ष की तुलना में, दो-फोटॉन उत्तेजना बायोइमेजिंग प्रयोगों के लिए फायदेमंद है क्योंकि इसकी कम फोटोटॉक्सिसिटी, गहरी ऊतक पैठ, घनी पैक प्रणालियों में कुशल संचालन, और फ्लोरोफोर्स के कोणीय फोटोसेलेक्शन को कम किया जाता है। इस प्रकार, दो-फोटॉन प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (2PFM) में ध्रुवीकरण विश्लेषण की शुरूआत रैखिक ऑप्टिकल प्रक्रियाओं के आधार पर मानक इमेजिंग विधियों की तुलना में एक नमूने में आणविक संगठन का अधिक सटीक निर्धारण प्रदान करती है। इस काम में, हम ध्रुवीकरण-संवेदनशील 2PFM (ps-2PFM) और जटिल जैव-संरचनाओं-एमिलॉइड स्फेरुलाइट्स के भीतर आणविक क्रम के निर्धारण में इसके अनुप्रयोग पर ध्यान केंद्रित करते हैं। अल्जाइमर या पार्किंसंस जैसे न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों का निदान अक्सर एक बिगड़ा हुआ प्रोटीन मिसफोल्डिंग प्रक्रिया के कारण गठित एमाइलॉयड्स-प्रोटीन समुच्चय का पता लगाने के माध्यम से किया जाता है। उनकी संरचना की खोज से उनके निर्माण मार्ग की बेहतर समझ होती है और परिणामस्वरूप, अधिक संवेदनशील नैदानिक विधियों को विकसित किया जाता है। यह पेपर गोजातीय इंसुलिन स्फेरुलाइट्स और गोलाकार अमाइलॉइडोजेनिक प्रोटीन समुच्चय के अंदर स्थानीय फाइब्रिल ऑर्डरिंग के निर्धारण के लिए अनुकूलित ps-2PFM प्रस्तुत करता है। इसके अलावा, हम साबित करते हैं कि प्रस्तावित तकनीक गोलाकार के अंदर फाइब्रिल के त्रि-आयामी संगठन को हल कर सकती है।

Introduction

पिछले दशकों में, हालांकि प्रोटीन और उनके समुच्चय1 की बायोइमेजिंग के लिए कई प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी तकनीकों का महत्वपूर्ण विकास हुआ है, केवल कुछ का उपयोग नमूना 2,3 के भीतर अपने स्थानीय आदेश को हल करने के लिए किया गया है। प्रतिदीप्ति जीवनकाल इमेजिंग माइक्रोस्कोपी4 का उपयोग अमाइलॉइड सुपरस्ट्रक्चर-स्फेरुलाइट्स की आंतरिक संरचनात्मक विषमता का अध्ययन करने के लिए किया गया था। इसके अलावा, इस तरह के spherulites के रूप में जटिल और घनी पैक biostructures के अंदर स्थानीय आदेश के मात्रात्मक निर्धारण ध्रुवीकरण संवेदनशील तरीकों3 का उपयोग कर हल किया जा सकता है. हालांकि, सतही ऊतक पैठ के साथ मानक प्रतिदीप्ति तकनीक सीमित हैं क्योंकि विवो में फ्लोरोफोर्स को उत्तेजित करने के लिए यूवी-वीआईएस तरंग दैर्ध्य का उपयोग करने से उच्च ऊतक प्रकाश बिखरने की ओर जाता है5. इसके अलावा, इस तरह की इमेजिंग को अक्सर लक्षित बायोमोलेक्यूल के लिए विशिष्ट फ्लोरोसेंट जांच को डिजाइन करने और बाध्य करने की आवश्यकता होती है, जिससे इमेजिंग करने के लिए आवश्यक लागत और कार्य की मात्रा बढ़ जाती है।

हाल ही में, इन मुद्दों को हल करने के लिए, हमारी टीम ने जैविक संरचनाओं 6,7 के लेबल-मुक्त इमेजिंग के लिए ध्रुवीकरण-संवेदनशील दो-फोटॉन उत्साहित प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (ps-2PFM) को अनुकूलित किया है। Ps-2PFM उत्तेजना बीम के रैखिक ध्रुवीकरण की दिशा में दो फोटॉन प्रतिदीप्ति तीव्रता की निर्भरता और उत्सर्जित प्रतिदीप्ति8 के ध्रुवीकरण के विश्लेषण के लिए अनुमति देता है. इस तकनीक के कार्यान्वयन के लिए प्रकाश ध्रुवीकरण विमान को नियंत्रित करने के लिए एक आधा लहर प्लेट के साथ मानक बहु फोटॉन माइक्रोस्कोप सेटअप उत्तेजना पथ (चित्रा 1) के पूरक की आवश्यकता है. फिर, ध्रुवीय ग्राफ, उत्तेजना लेजर बीम के ध्रुवीकरण पर दो-फोटॉन उत्तेजित प्रतिदीप्ति तीव्रता की निर्भरता का चित्रण, दो हिमस्खलन फोटोडायोड द्वारा एकत्र किए गए संकेतों से बनाए जाते हैं, इस प्रकार प्रतिदीप्ति ध्रुवीकरण के दो, पारस्परिक रूप से लंबवत घटकों को इकट्ठा करते हैं।

अंतिम चरण डेटा विश्लेषण प्रक्रिया है, जो ध्रुवीकरण पर ऑप्टिकल तत्वों, जैसे डाइक्रोइक दर्पण या उच्च संख्यात्मक एपर्चर उद्देश्य के प्रभाव को ध्यान में रखता है। दो-फोटॉन प्रक्रिया की प्रकृति के कारण, यह विधि कम कोणीय फोटो-चयन और बढ़ाया अक्षीय संकल्प दोनों प्रदान करती है, क्योंकि फोकल विमान के बाहर फ्लोरोफोर्स के दो-फोटॉन उत्तेजना संभाव्य रूप से सीमित है। यह भी साबित हुआ कि इसी तरह के तरीकों को सफलतापूर्वक गहरे ऊतक इमेजिंग9 के लिए निकट-अवरक्त जांच (एनआईआर) के विवो इमेजिंग में लागू किया जा सकता है। Ps-2PFM पहले सेल झिल्ली10 और डीएनए 11,12, साथ ही सोने नैनोकणों13 के रूप में जैविक प्रणालियों के गैर मानक फ्लोरोसेंट मार्करों, में छवि fluorophores के लिए लागू किया गया है. हालांकि, इन सभी उदाहरणों में, बायोमोलेक्यूल्स के संगठन के बारे में जानकारी अप्रत्यक्ष रूप से प्राप्त की गई थी और एक फ्लोरोफोरे और एक बायोमोलेक्यूल के बीच एक पूर्वनिर्धारित पारस्परिक अभिविन्यास की आवश्यकता थी।

हमारे हाल के कागजात में से एक में, हमने दिखाया है कि ps-2PFM को थियोफ्लेविन टी से अमाइलॉइड सुपरस्ट्रक्चर और प्रतिदीप्ति के ऑटोफ्लोरेसेंस के स्थानीय ध्रुवीकरण का निर्धारण करने के लिए सफलतापूर्वक लागू किया जा सकता है, एक अमाइलॉइड-विशिष्ट डाई, जो स्फेरुलाइट्स6 में एमिलॉयड फाइब्रिल से बंधी है। इसके अलावा, एक और में, हमने साबित कर दिया है कि ps-2PFM का उपयोग उप-माइक्रोन आकार के शासन में अमाइलॉइड स्फेरुलाइट्स के अंदर अमाइलॉइड फाइब्रिल अभिविन्यास का पता लगाने के लिए किया जा सकता है, जिसकी पुष्टि ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (टीईएम) इमेजिंग7 के साथ सहसंबंधित करके की गई थी। इस परिणाम की उपलब्धि i) स्फेरुलाइट्स-एमिलॉयड के आंतरिक ऑटोफ्लोरेसेंस के लिए संभव थी, जब एक या दो फोटॉनों के साथ उत्साहित होते हैं, तो 450 से 500 एनएम की सीमा में स्थित उत्सर्जन मैक्सिमा के साथ आंतरिक ऑटोफ्लोरेसेंस प्रदर्शित करते हैं और मानक फ्लोरोसेंट रंगों के साथ तुलनीय दो-फोटॉन अवशोषण क्रॉस सेक्शन14, ii) गणितीय मॉडल पहले पेश किए गए थे कि जैविक झिल्ली और डीएनए संरचनाओं को लेबल करने वाले रंगों के ps-2PEF को कैसे लागू किया जा सकता है प्रतिदीप्ति गोलाकार और उन्हें करने के लिए बाध्य रंगों द्वारा प्रदर्शित 8,11,15. इस प्रकार, विश्लेषण के साथ आगे बढ़ने से पहले, हम अत्यधिक अनुशंसा करते हैं कि दोनों में वर्णित आवश्यक सिद्धांत को देखें, मुख्य पाठ और इस विषय से संबंधित हमारे पहले पेपर की सहायक जानकारी6. यहां, हम गोजातीय इंसुलिन स्फेरुलाइट्स के लेबल-मुक्त अमाइलॉइड संरचनात्मक लक्षण वर्णन के लिए ps-2PFM तकनीक को लागू करने के तरीके के लिए प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं।

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Protocol

1. पूरी तरह से विकसित spherulites के साथ खुर्दबीन स्लाइड तैयार करना

नोट: इस प्रोटोकॉल में उपयोग की जाने वाली सभी सामग्रियों, अभिकर्मकों और उपकरणों के बारे में विवरण के लिए सामग्री की तालिका देखें। सभी समाधान जल शोधन प्रणाली से प्राप्त विआयनीकृत पानी (25 डिग्री सेल्सियस पर 18.2 MΩ· सेमी) के साथ तैयार किए गए थे।

  1. Krebs एट अल16 द्वारा वर्णित प्रोटोकॉल के आधार पर amyloid spherulites सेते हैं. कुछ संशोधनों के साथ, जैसा कि नीचे वर्णित है।
    1. 1.5 एमएल ट्यूब में 10 मिलीग्राम इंसुलिन पाउडर का वजन करें।
    2. विआयनीकृत एच2हे/एचसीएल समाधान (पीएच 1.5) के 1 एमएल विभाज्य के साथ पाउडर को भंग करें।
    3. टेप के साथ नमूना सील और 70 डिग्री सेल्सियस (0 आरपीएम) पर 24 घंटे के लिए सेते करने के लिए एक थर्मल मिक्सर में डाल दिया.
      नोट: अपने मूल (यानी, हाइड्रेटेड) वातावरण में अमाइलॉइड की इमेजिंग करने और निर्जलीकरण के कारण नमूना विरूपण को रोकने के लिए, निम्नलिखित विवरण (चित्रा 2में दिखाई गई योजना) के अनुसार माइक्रोस्कोप स्लाइड तैयार करना आवश्यक है।
  2. खुर्दबीन कांच स्लाइड पानी के साथ अच्छी तरह से धो लें.
  3. मेथनॉल में स्लाइड डुबकी और उन्हें एक धूल मुक्त पोंछे पर परिवेश की स्थिति के तहत सूखी करने के लिए छोड़ दें.
  4. एक स्वचालित विंदुक (चरण 1.1.2) के साथ ट्यूब से गोलाकार समाधान के 100 माइक्रोन विभाज्य लें और इसे माइक्रोस्कोप स्लाइड के मध्य क्षेत्र में स्थित अच्छी तरह से जोड़ें।
  5. एक कवरस्लिप के साथ समाधान को कवर करें, हवा के बुलबुले के गठन से बचें।
  6. स्फेरुलाइट्स के मूल समाधान को सील करने के लिए एक स्वचालित विंदुक के साथ स्लाइड पर कवरस्लिप के किनारों के साथ माउंटेंट जमा करें।
    नोट: यह दोनों coverslip के साथ ही स्लाइड सतहों पर स्लाइड mountant जमा करने के लिए बहुत महत्व का है. वाष्पशील विलायक (xylene) की विषाक्तता के कारण फ्यूमिंग हुड के नीचे ऐसा करें। चित्रा 2 में इनसेट देखें।
  7. माउंटेंट को सख्त करने के लिए परिवेश की स्थिति के तहत माइक्रोस्कोप नमूना छोड़ दें।
    नोट: सख्त प्रक्रिया तापमान- और आर्द्रता-निर्भर है लेकिन इसे 12 घंटे के भीतर पूरा किया जाना चाहिए।
  8. जांचें कि क्या इंसुलिन स्फेरुलाइट्स को पार किए गए ध्रुवीकरण के साथ ध्रुवीकृत ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप (पीओएम) का उपयोग करके सही ढंग से बनाया गया था। नमूने के माध्यम से स्कैन उज्ज्वल क्षेत्रों की एक विशेषता पैटर्न की तलाश में, जिसे माल्टीज़ क्रॉस कहा जाता है, जैसा कि चित्र 3में दिखाया गया है।
    नोट: अमाइलॉइड स्फेरुलाइट्स को गोलाकार सुपरस्ट्रक्चर के रूप में परिभाषित किया जा सकता है जो कोर-शेल संरचना के साथ एक विषम आकृति विज्ञान की विशेषता है। विस्तार से, वे एक अनाकार कोर और रेडियल रूप से बढ़ते अमाइलॉइड फाइब्रिल16 से बने होते हैं। स्फेरुलाइट संरचनाओं के अनिसोट्रोपिक चरित्र के कारण, वे विशिष्ट रूप से ध्रुवीकृत प्रकाश (जैसे, अपवर्तन द्वारा) के साथ बातचीत कर सकते हैं और अपने चरण को बदल सकते हैं, जिसे पार किए गए ध्रुवीकरण के साथ पीओएम के तहत आसानी से देखा जा सकता है। इस पद्धति का उपयोग केवल पूरी तरह से विकसित स्फेरुलाइट्स का अध्ययन करने के लिए किया गया था, जो एक मॉडल की तरह माल्टेज क्रॉस पैटर्न की विशेषता थी। नतीजतन, समुच्चय या संरचनात्मक रूप से विकृत स्फेरुलाइट्स को आगे की जांच से बाहर रखा गया था।

2. सिस्टम का निर्माण और संरेखण

नोट: एक ध्रुवीकरण के प्रति संवेदनशील दो फोटॉन खुर्दबीन का एक योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व चित्रा 1 में पाया जा सकता है.

  1. 690-1,080 एनएम रेंज में आउटपुट तरंग दैर्ध्य ट्यूनेबिलिटी के साथ एक फेमटोसेकंड लेजर स्थापित करें, उदाहरण के लिए, एक मोड-लॉक टीआई पर काम करना: नीलम लेजर ~ 100 एफएस दालों के साथ 80 मेगाहर्ट्ज पुनरावृत्ति दर।
  2. XY माइक्रोस्कोप नमूना विमान में घटना प्रकाश के ध्रुवीकरण को नियंत्रित करने के लिए सेटअप के उत्तेजना पथ के लिए एक रोटेशन चरण पर घुड़सवार एक आधा लहर प्लेट जोड़ें.
  3. पता लगाने प्रकाशिकी से उत्तेजना बीम को काटने के लिए डाइक्रोइक दर्पण स्थापित करें।
    नोट: एक डाइक्रोइक दर्पण की ऑप्टिकल विशेषताओं को तरंग दैर्ध्य की एनआईआर रेंज में उत्तेजना बीम (नमूने के लिए) को प्रतिबिंबित करने की अनुमति देनी चाहिए और नमूनों से उत्सर्जन के अनुरूप तरंग दैर्ध्य रेंज के लिए एक साथ पारदर्शी होना चाहिए।
  4. एक चुने हुए Z के लिए XY विमान के भीतर रेखापुंज स्कैन के लिए एक पीजोइलेक्ट्रिक स्कैनिंग चरण स्थापित करें।
  5. उच्च NA विसर्जन उद्देश्य माउंट करें, उदाहरण के लिए, एक एपोक्रोमैटिक तेल विसर्जन उद्देश्य 100x/1.4 NA।
    नोट: जैसा कि पूरे सेटअप एक एपी-प्रतिदीप्ति मोड में संचालित होता है, घटना और उत्सर्जित संकेत एक ही उद्देश्य से गुजर रहे हैं।
  6. उत्सर्जन पथ में, एक ध्रुवीकरण बीम-स्प्लिटर जोड़ें जो दो-फोटॉन उत्साहित उत्सर्जन को दो ऑर्थोगोनल ध्रुवीकृत घटकों (IX औरIY) में विभाजित करता है
  7. एक विन्यास में दो फोटॉन गिनती हिमस्खलन photodiodes (APDs) उन्हें स्थानांतरित प्रकाश इकट्ठा करने के लिए अनुमति देता है और बीम फाड़नेवाला, क्रमशः (चित्रा 1) का उपयोग कर परिलक्षित स्थापित करें.
  8. सिस्टम के उत्तेजना और उत्सर्जन पथ पर सही तरंग दैर्ध्य-निर्भर कट-ऑफ फिल्टर माउंट करें, उदाहरण के लिए, उत्तेजना ऑप्टिकल पथ में सीधे 800 एनएम लंबा-पास फिल्टर और उत्सर्जन पथ में 700 शॉर्ट-पास फिल्टर।
    नोट: गोलाकार से उत्सर्जन स्पेक्ट्रा का विश्लेषण करें ताकि दूसरी हार्मोनिक पीढ़ी (एसएचजी) या लेजर प्रकाश से किसी भी संभावित योगदान को सही उत्सर्जन फिल्टर का उपयोग करके बाहर रखा जा सके। यह भी ध्यान देने योग्य है कि इस प्रणाली को ध्रुवीकरण-संवेदनशील एसएचजी के माप की भी अनुमति देनी चाहिए, जिसका उपयोग नमूनों के भीतर बायोमोलेक्यूल्स के आदेश को हल करने के लिए किया जा सकता है। हालांकि, एसएचजी सिग्नल का डेटा विश्लेषण प्रतिदीप्ति से भिन्न होता है, जो अधिक विस्तार से, एट-बेल्केसम एट अल.17द्वारा वर्णित किया गया था।
  9. पूरे सिस्टम को संरेखित करें (कई लेज़रों में निर्मित संरेखण मोड का उपयोग करके) जब तक कि समान सिग्नल तीव्रता दोनों फोटोडायोड का उपयोग करके एकत्र नहीं की जाती है।
  10. उच्च एनए उद्देश्य द्वारा ध्यान केंद्रित उत्तेजना बीम और एक कैमरे पर imaged चित्रा 4A में प्रस्तुत के रूप में एक गाढ़ा परिपत्र आकार है कि क्या जाँच करें.
  11. नमूने पर घटना लेजर द्वारा प्रेरित क्षति को कम करने के लिए स्कैन समय और संबंधित शक्ति को समायोजित करें। अनुकरणीय बिंदु की तरह जलने चित्रा 4 बी में प्रस्तुत किया गया है. माइक्रोस्कोप के शरीर के प्रवेश द्वार पर स्थित एक फोटोडायोड पावर सेंसर से जुड़े डिजिटल हैंडहेल्ड पावर मीटर का उपयोग करके नाममात्र शक्ति को मापें।
    नोट: लेजर रोशनी के कारण जैविक नमूनों को आसानी से जलाया जा सकता है। इस मामले में, 100 -900 μW पावर रेंज (उद्देश्य लेंस के केंद्र बिंदु पर) नमूना स्थिरता और तीव्र उत्सर्जन के बीच एक उत्कृष्ट व्यापार-बंद पाया गया।
  12. नमूना माप से पहले, एक आइसोट्रोपिक संदर्भ नमूने (जैसे, अनाकार बहुलक में सन्निहित फ्लोरेसिन) के साथ प्रकाशिकी के संरेखण की गुणवत्ता का परीक्षण करें। अंशांकन जांच करने के लिए, एक अमाइलॉइड नमूने के बजाय एक आइसोट्रोपिक संदर्भ का उपयोग करके धारा 3 में वर्णित प्रक्रिया का पालन करें।
    नोट: एक धारणा के साथ कि माइक्रोस्कोपी सेटअप आदर्श रूप से आइसोट्रोपिक गुणों के साथ नमूने के लिए समायोजित किया जाता है, दो एपीडी के साथ पता चला दोनों 2 पी उत्सर्जन घटकों (आईएक्स और आईवाई) को एक ही तीव्रता(चित्रा 4सी)की विशेषता होनी चाहिए।

3. गोजातीय इंसुलिन spherulites का मापन

नोट: सभी वर्णित ps-2PF माप करने के लिए, हाथ से लिखे गए सॉफ़्टवेयर का उपयोग किया गया था, जो पीजोइलेक्ट्रिक चरण और अर्ध-तरंग प्लेट की स्थिति को नियंत्रित करता है और दोनों फोटोडायोड से संकेत एकत्र करता है, जिससे XY स्कैन (रेखापुंज स्कैन) की साजिश रचने की अनुमति मिलती है। प्रोटोकॉल में अतिरिक्त नोट्स भी जोड़े गए हैं, जो उपयोगकर्ताओं को इसके बिना माप करने की अनुमति देगा, क्योंकि आधा-तरंग प्लेट को घुमाने के लिए उपयोग किए जाने वाले पीजो-स्टेज और रोटेशन चरण दोनों को अपने स्वयं के नियंत्रकों या संबंधित सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके नियंत्रित किया जा सकता है। फिर भी, दोनों फोटोडायोड के साथ एकत्र किए गए 2PEF तीव्रता के साथ एक अर्ध-तरंग प्लेट के रोटेशन कोण के संयोजन के लिए एक एल्गोरिथ्म लिखने की दृढ़ता से अनुशंसा की जाती है क्योंकि यह सहसंबंध (ध्रुवीय ग्राफ) उचित डेटा विश्लेषण के लिए महत्वपूर्ण है जिसके परिणामस्वरूप संरचनात्मक जानकारी होती है।

  1. पीजोइलेक्ट्रिक चरण पर गोलाकार के साथ नमूना माउंट करें (टेप के साथ ग्लास स्लाइड को स्थिर करें)। इसे इस तरह से माउंट करना सुनिश्चित करें जहां एक पतली कांच की तरफ (कवरस्लिप) उद्देश्य का सामना कर रहा है क्योंकि उच्च संख्यात्मक उद्देश्यों को अपेक्षाकृत कम कामकाजी दूरी की विशेषता है।
    नोट: जैसा कि तेल विसर्जन का उपयोग किया जाता है, नमूना बढ़ते और ध्यान केंद्रित करने से पहले खनिज तेल की एक छोटी बूंद को उद्देश्य पर लागू किया जाना चाहिए।
  2. माइक्रोस्कोप knobs का उपयोग XY और जेड पदों को बदलने से, समाधान में पाया spherulites में से एक पर उद्देश्य ध्यान केंद्रित, लेकिन क्योंकि spherulite व्यास μm के दसियों की सीमा में आम तौर पर कर रहे हैं कि ध्यान रखें, पूरे संरचना के मध्य क्षेत्र के भीतर ध्यान केंद्रित. क्रमशः अंडर- और ऊपरी-फोकस के संकेत के रूप में विशिष्ट गोलाकार के चारों ओर काले और सफेद प्रभामंडल की तलाश करें। इन चरम सीमाओं के बीच होने के लिए "Z" अक्ष को समायोजित करें।
    नोट: संरचनात्मक दोषों के बिना एक अलग नमूना खोजना महत्वपूर्ण है। उद्देश्य द्वारा पेश किए गए भौतिक तनाव के कारण बेहद छोटे गोलाकार बह सकते हैं, जबकि सबसे बड़ी संरचनाएं संभवतः एकत्रित या अत्यधिक विकृत होती हैं।
  3. मनाया सूक्ष्म विमान के देखने के क्षेत्र में spherulite केंद्र और एक्स और वाई दिशाओं में कितने piezostage कदम (piezostage नियंत्रक पर या अपने सॉफ्टवेयर में प्रदर्शित) पूरे संरचना के क्षेत्र को कवर करने के लिए आवश्यक हैं पर देख द्वारा XY स्कैन के आकार का निर्धारण.
    नोट: सिस्टम को इस तरह से सेट करने की सिफारिश की जाती है कि XY स्कैन की शुरुआत स्फेरुलाइट के कोनों में से एक के पास स्थित है और चरण की शून्य स्थिति (X और Y = 0) के साथ मेल खाती है
  4. निम्नलिखित स्कैनिंग पैरामीटर समायोजित करें:
    1. उत्तेजना बीम के ध्रुवीकरण को समायोजित करें, और खुर्दबीन नमूना विमान के "एक्स" और "वाई" अक्षों के अनुरूप ध्रुवीकरण प्राप्त करने के लिए आधा लहर प्लेट को घुमाएं।
      नोट: यह फ्लोरेसिन जैसे आइसोट्रोपिक फ्लोरोसेंट माध्यम के ध्रुवीय रेखांकन को मापकर किया जा सकता है। ऐसी सामग्रियों के लिए, अधिकतम प्रतिदीप्ति तीव्रता उत्तेजना बीम ध्रुवीकरण के समानांतर है; इस प्रकार, अर्ध-तरंग प्लेट को घुमाने से अवलोकन तल पर एक्स और वाई अक्ष के साथ ध्रुवीकरण को समायोजित किया जाता है, जिसे ध्रुवीय रेखांकन पर एक्स और वाई अक्ष के रूप में भी दर्शाया जाता है जैसा कि चित्र 4 सी में है। पूर्ण ध्रुवीय रेखांकन को अर्ध-तरंग प्लेट (उत्तेजना प्रकाश ध्रुवीकरण के 360 डिग्री रोटेशन) के 180 डिग्री रोटेशन के लिए दोनों फोटोडायोड पर मापा 2PEF तीव्रता एकत्र करके और उत्तेजना प्रकाश ध्रुवीकरण कोण के साथ तीव्रता को सहसंबंधित करके मापा जा सकता है। यह मैन्युअल रूप से किया जा सकता है, प्रत्येक अर्ध-तरंग प्लेट कोण के लिए उत्सर्जन तीव्रता को अलग से मापकर और फिर इसे डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर में ध्रुवीय ग्राफ में या स्वचालित रूप से समर्पित या स्व-लिखित सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके इकट्ठा करके।
    2. पीजोस्टेज मापदंडों को समायोजित करें: स्कैनिंग गति, कदम, और पूरे गोलाकार के क्षेत्र को कवर करने के लिए सीमा।
      नोट: स्कैनिंग रेंज पूरी तरह से रेखापुंज स्कैन के भीतर पूरे अधिरचना फ्रेम करने के लिए गोलाकार व्यास से अधिक होना चाहिए. कम स्कैनिंग गति और कदम उपयोगकर्ताओं को उच्च-गुणवत्ता वाली छवियां प्राप्त करने की अनुमति देते हैं; हालांकि, इसके परिणामस्वरूप नमूना जल सकता है। इसलिए, गोलाकार आकार पर निर्भर एक व्यापार-बंद आवश्यक है। ये पैरामीटर सार्वभौमिक रूप से लागू नहीं किए जा सकते। चित्रा 5 ए में उपयोग किए जाने वाले अनुकरणीय पैरामीटर: स्कैनिंग रेंज 45 x 45 माइक्रोन, स्कैनिंग चरण 1 माइक्रोन, और स्कैनिंग गति 2 माइक्रोन /
  5. शटर खोलें, फोटोडायोड चालू करें, और चयनित स्कैनिंग क्षेत्र के हर एक चरण के लिए 2P उत्सर्जन घटकों को इकट्ठा Equation 1 करें - Equation 2 उत्तेजना बीम के लिए एक्स और फिर, वाई अक्षों के अनुरूप ध्रुवीकृत किया गया। अनुकरणीय दो-फोटॉन उत्साहित ऑटोफ्लोरेसेंस (2PAF) इंसुलिन स्फेरुलाइट्स के रेखापुंज स्कैन चित्रा 5A में प्रस्तुत किए जाते हैं।
    नोट: रेखापुंज स्कैन को मापने के लिए पीजो चरण निर्देशांक के साथ Equation 1 सहसंबंधित पीजो चरण निर्देशांक की आवश्यकता होती है और Equation 2 जो मैन्युअल रूप से किया जा सकता है, चयनित क्षेत्र के हर एक बिंदु में तीव्रता को मापकर और फिर इसे 2 डी मैट्रिक्स में इकट्ठा करके, या स्वचालित रूप से, स्व-लिखित सॉफ्टवेयर के माध्यम से। रेखापुंज स्कैन को एक विशिष्ट उत्सर्जन घटक के लिए उत्सर्जन घटकों की तीव्रता या विशिष्ट रूप से योग के Equation 1 Equation 2 रूप में प्रस्तुत किया जा सकता है। चूंकि वे अत्यधिक संरचना-निर्भर हैं, गोलाकार के भीतर संरचनात्मक विकृतियां आसानी से दिखाई देती हैं। हालांकि, माइक्रोस्कोप चरण के आंदोलन के कारण, कुछ नमूने देखने के क्षेत्र से दूर हो सकते हैं। इसलिए, कलाकृतियों के लिए छवियों की जांच करने की आवश्यकता है। स्कैन से पहले और बाद में स्फेरुलाइट की स्थिति की जांच करना आवश्यक है।
  6. नमूने पर विशिष्ट स्थान से पूर्ण ध्रुवीकरण विश्लेषण करने के लिए, उत्तेजना बीम बंद करें।
  7. इसके बाद, गोलाकार पर चुने हुए स्थान के अनुरूप पीजोस्टेज के विशिष्ट निर्देशांक चुनें जहां अणुओं के उन्मुखीकरण के बारे में जानकारी उप-माइक्रोन संकल्प के साथ आवश्यक है।
  8. संकेत (एक्स, वाई) पर देखने के क्षेत्र को केंद्र में रखने के लिए पीजोइलेक्ट्रिक चरण को समायोजित करें।
  9. उत्तेजना बीम चालू करें और अर्ध-तरंग प्लेट (180 डिग्री रोटेशन) के Equation 1 रोटेशन को चालू करके पूर्ण (360 डिग्री) ध्रुवीकरण विश्लेषण और Equation 2 उत्सर्जन करें। ध्रुवीय ग्राफ के रूप में 2PF Ix और Iy घटकों को प्रस्तुत करें (जैसा कि चित्र 5B में दिखाया गया है)।
    नोट: पर्याप्त मात्रा में डेटा एकत्र करने के लिए नमूने में विभिन्न स्थानों पर यह चरण दोहराया जा सकता है।

4. गोजातीय इंसुलिन स्फेरुलाइट्स के अंदर स्थानीय फाइब्रिल ऑर्डरिंग का निर्धारण

नोट: डेटा विश्लेषण से जुड़ी सभी संख्यात्मक गणना पायथन प्रोग्रामिंग भाषा का उपयोग करके और पुस्तकालयों NumPy और SciPy में उपलब्ध कार्यों के आधार पर की गई थी। डेटा प्लॉट करने के लिए Matplotlib लाइब्रेरी की आवश्यकता होती है। सभी गणना Obstarczyk et al.6 द्वारा कागजात में से एक में सहायक जानकारी में प्रस्तुत सूत्रों पर आधारित हैं।

  1. घटना प्रकाश ध्रुवीकरण की एक चयनित दिशा के साथ अणुओं के निर्दिष्ट वितरण के लिए उत्साहित दो-फोटॉन प्रतिदीप्ति की तीव्रता का अनुकरण (द्वारा चिह्नित) α)
    नोट: प्रस्तुत सूत्र एक फ्लोरोफोर के समानांतर अवशोषण और उत्सर्जन द्विध्रुवीय क्षणों की धारणा पर आधारित हैं। अन्य मामलों की चर्चा के लिए (उदाहरण के लिए, अवशोषण और उत्सर्जन द्विध्रुवीय क्षणों की विभिन्न दिशाएं, फ्लोरोफोर्स के बीच ऊर्जा हस्तांतरण), ले फ्लोक एट अल द्वारा पेपर देखें8.
    1. एक सेटअप में घुड़सवार डाइक्रोइक दर्पण के कारण ध्रुवीकरण मिश्रण और विध्रुवण प्रभावों द्वारा विद्युत क्षेत्र की भिन्नता के लिए लेखांकन मापदंडों का पता लगाएं:
      1. γ एक डाइक्रोइक दर्पण से परावर्तनशीलता Equation 3 और Equation 4 ध्रुवीकृत प्रकाश के बीच आयाम कारक का प्रतिनिधित्व करता है।
      2. δ ध्रुवीकृत प्रकाश के बीच Equation 3 Equation 4 चरण बदलाव (अंडाकारता) का प्रतिनिधित्व करता है।
        नोट: सही ढंग से इन दो मापदंडों को परिभाषित करने के लिए मापा ध्रुवीय रेखांकन11,18 के आकार पर उनके मजबूत प्रभाव की वजह से सफल संरचनात्मक लक्षण वर्णन के लिए महत्वपूर्ण है. प्रस्तुत प्रणाली के मामले में, दोनों मापदंडों को एक प्रणाली में लागू एक डाइक्रोइक दर्पण के दीर्घवृत्त माप के दौरान निर्धारित किया गया था।
    2. समीकरणों (1-5) का उपयोग करके ps-TPFM माप के दौरान मापा गया प्रत्येक कोण के X और Y अक्षों में फैलने वाले घटना विद्युत क्षेत्र वैक्टर की गणना करें।
      Equation 5 (1)
      Equation 6 (2)
      Equation 7 (3)
      Equation 8 (4)
      Equation 9 (5)
      नोट यदि तीव्रता को चरण 1 डिग्री के साथ पूरे 360 डिग्री पर मापा जाता है, तो सभी 360 डिग्री के लिए विद्युत क्षेत्र वैक्टर की गणना करें। सभी कोण रेडियंस में होने चाहिए। ρ पैरामीटर अनुरूपित विद्युत क्षेत्र (ρ=ω·) के ऑप्टिकल आवृत्ति ω से जुड़ा होता हैt) और ps-TPFM माप के दौरान मापा α प्रत्येक कोण के लिए X और Y अक्ष में प्रचारित घटना विद्युत क्षेत्र वैक्टर की गणना के दौरान 0 से 2π तक एकीकृत उपयोग किया जाता है।
    3. समीकरणों (6-8) के अनुसार कार्तीय प्रणाली के तीन अक्षों की दिशाओं में संक्रमण द्विध्रुवीय क्षणों के लिए कार्यों को परिभाषित करें:
      Equation 10 (6)
      Equation 11 (7)
      Equation 12 (8)
      नोट: φ XY नमूना फ्रेम में अमाइलॉइड फाइब्रिल लंबी धुरी का अभिविन्यास कोण है। θ और φ कोण ध्रुवीय और अज़ीमुथल कोण हैं जिनका उपयोग फ्लोरोफोर के संक्रमण द्विध्रुवीय क्षण अभिविन्यास को परिभाषित करने के लिए किया जाता है।
    4. चरण 4.1.3 में परिभाषित कार्यों का उपयोग करें। Jx (Φ, θ, φ) और JY(Φ, θ, φ) के लिए कार्यों को परिभाषित करने के लिए, जो समीकरणों का उपयोग करके X और Y दिशा में प्रतिदीप्ति ध्रुवीकरण का पता लगाने के लिए उच्च संख्यात्मक एपर्चर उद्देश्य के साथ ध्यान केंद्रित करने वाले तंग प्रकाश के योगदान के लिए जिम्मेदार है (9, 10).
      Equation 13 (9)
      Equation 14 (10)
      नोट: K1, K2, K3 कारक ps-TPFM माप के दौरान उपयोग किए जाने वाले माइक्रोस्कोप उद्देश्य से संबंधित हैं। इन प्रयोगों में, एक एपोक्रोमैटिक तेल विसर्जन उद्देश्य 100x/1.4 NA का उपयोग किया गया था और K1, K2, K3 कारक क्रमशः 2.945, 0.069 और 1.016 थे।
    5. एफ (Ω) के लिए एक फ़ंक्शन को परिभाषित करें, जो एक आणविक कोणीय वितरण है, जो एक फ्लोरोफोर शंकु Ψ के आधे एपर्चर पर निर्भर करता है, एक चर मोटाई ΔΨ के साथ; समीकरण (11) का उपयोग कीजिए। अमाइलॉइड फाइब्रिल से संबंधित सभी तीन कोणों का चित्रमय प्रतिनिधित्व चित्र 6 में प्रस्तुत किया गया है।
      Equation 15(11)
      नोट: घातांक लिखते समय सावधान रहें- फ़ंक्शन तर्क पर 2 की शक्ति काम करती है, पूरे फ़ंक्शन पर नहीं!
    6. समीकरणों (12-21) में दिखाए गए अनुसार सभी fWWIJKL कारकों को परिभाषित करें।
      Equation 16 (12)
      Equation 17 (13)
      Equation 18 (14)
      Equation 19 (15)
      Equation 20 (16)
      Equation 21 (17)
      Equation 22 (18)
      Equation 23 (19)
      Equation 24 (20)
      Equation 25 (21)
    7. समीकरणों (22, 23) का उपयोग करके दो-फोटॉन उत्तेजित प्रतिदीप्ति तीव्रता Equation 26 की गणना करें और Equation 27 प्रत्येक मापा कोण (इसी तरह बिंदु 4.1.2 के समान) के लिए।
      Equation 28Equation 29 = (22)
      Equation 30Equation 31 = (23)
    8. जांचें कि क्या सिमुलेशन निम्नलिखित चर मानों (चित्रा 7 के लिए किंवदंती में रखा गया) का उपयोग करके सही ढंग से काम कर रहा है और चित्रा 7 ए-सी के साथ प्राप्त परिणामों की तुलना करें।
      नोट: सभी डिग्री रेडियंस में लिखी जानी चाहिए।
  2. ps-2PFM माप के दौरान एकत्र गोजातीय इंसुलिन spherulites के दो फोटॉन-उत्साहित autofluorecence की तीव्रता में नकली तीव्रता फिट.
    नोट: ps-2PFM माप के आधार पर गोलाकार संरचना को हल करने के लिए प्रोटोकॉल में लिखे समीकरणों का उपयोग करने के लिए दो-फोटॉन उत्साहित प्रतिदीप्ति की सैद्धांतिक तीव्रता का अनुकरण करने और आणविक फ्लोरोफोर के आदेश से जुड़े सभी मापदंडों को फिट करने की आवश्यकता होती है। इसके लिए Φ के विभिन्न मूल्यों पर कई पुनरावृत्तियों की आवश्यकता होती है, XY माइक्रोस्कोप नमूने में फाइब्रिल के रोटेशन का वर्णन करने वाला एक कोण, और ΔΨ, उत्सर्जन द्विध्रुवीय Ψ के शंक्वाकार वितरण के विचलन के कारण स्थिर Ψ के लिए फिलामेंट्स में आणविक घूर्णन जब तक माप के दौरान एकत्र किए गए सामान्यीकृत दो-फोटॉन उत्तेजित प्रतिदीप्ति संकेत तीव्रता और सामान्यीकृत तीव्रता के अनुसार अनुकरण नहीं किया जाता प्रोटोकॉल का चरण 4.1।
    1. Ψ अर्ध-कोण ज्ञात कीजिए।
      नोट: गोजातीय इंसुलिन स्फेरुलाइट्स के लिए, यह Ψ = 29 ° 6 के बराबर होना चाहिए।
    2. फिटिंग वर्कफ़्लो:
      1. 0° से 180° तक Φ का मान चुनिए ( चित्र 8A और 8B Φ = 16° और 127° में, क्रमशः)।
      2. ΔΨ का मान 0° से 90° तक चुनें (चित्र 8A,B, δψ = 24° और 1° में, क्रमशः)।
      3. Φ और ΔΨ के चुने हुए मानों का उपयोग करके θ कोणों की संपूर्ण मापी गई सीमा के लिए (समीकरण 22) और Equation 30(समीकरण 23) की गणना Equation 28 करें।
      4. सिमुलेशन के दौरान गणना की गई तीव्रता की तुलना करें (दोनों के अधिकतम मूल्य के लिए सामान्यीकृत
      5. की सामान्यीकृत तीव्रता के साथ गणना Equation 28करें
      6. ps-2PFM Equation 1 माप के दौरान मापा गया गणना और Equation 2 (दोनों के अधिकतम मूल्य के Equation 1लिए सामान्यीकृत)।
        नोट: प्रस्तुत प्रयोगों में, पियर्सन उत्पाद-क्षण सहसंबंध गुणांक की गणना NumPy पायथन लाइब्रेरी से "corrcoef" फ़ंक्शन का उपयोग करके की गई थी।
    3. अंत में, Φ औरΔ Ψ के मूल्यों का चयन करें जो उच्चतम सहसंबंध गुणांक और नकली तीव्रता और मापा संकेत के बीच अभिसरण की ओर ले जाता है जो चित्र 8 में दिखाया गया है।

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Representative Results

प्रस्तुत प्रोटोकॉल ps-2PFM के साथ परीक्षण के लिए अमाइलॉइड सुपरस्ट्रक्चर की तैयारी, सूक्ष्म प्रणाली के निर्माण और उचित नमूने के माप के माध्यम से चरण-दर-चरण मार्गदर्शन प्रदान करता है। हालांकि, माप के अंतिम सेट से पहले, एपीडी को एक आइसोट्रोपिक संदर्भ के साथ ठीक से संरेखित करना महत्वपूर्ण है, जिसके परिणामस्वरूप दोनों डिटेक्टरों(चित्रा 4सी)पर समान आकार और तीव्रता का सममित संकेत एकत्र करना चाहिए। एक्स और वाई अक्षों में डिटेक्टरों पर मापा तीव्रता के बीच भी न्यूनतम अंतर को आगे के माप में और विशेष रूप से, विश्लेषण के दौरान एक उपयुक्त सुधार कारक के रूप में ध्यान में रखा जाना चाहिए। बढ़ते के बाद, एकल spherulites युक्त नमूना, चित्रा 2B में के रूप में पोम पर एक विशेषता माल्टीज़ पार दे, और एक 2PFM रेखापुंज स्कैन प्रदर्शन करने के बाद, छवि चित्रा 5A में दिखाया गया है के समान दिखना चाहिए, जो रिपोर्ट किए गए 2PFM रेखापुंज स्कैन के अनुरूप है spherulites 6,7 और विभिन्न संगठित biomolecules11,12. कोई उच्चतम चमक के साथ अक्ष के स्थान में कुछ बदलावों का निरीक्षण कर सकता है, जो इस तथ्य से संबंधित है कि प्रतिदीप्ति संकेत तीव्रता दृढ़ता से उत्तेजना बीम के ध्रुवीकरण पर निर्भर करती है। इसलिए, यह सत्यापित करना आवश्यक है कि अर्ध-तरंग प्लेट की कौन सी स्थिति एक्स (चित्रा 5 ए, शीर्ष) और वाई (चित्रा 5 ए, नीचे) कुल्हाड़ियों के साथ नमूने की उत्तेजना से मेल खाती है। यह भी ध्यान देने योग्य है कि विभिन्न चयनित स्थानों से पूर्ण ध्रुवीकरण विश्लेषण करते समय ध्रुवीय ग्राफ कैसे बदलते हैं। गोलाकार के बाहर, ध्रुवीय ग्राफ कलाकृतियों और यादृच्छिक संकेत शोर स्पाइक्स(चित्रा 5बी, मैं)के संग्रह की तरह दिखता है. ऐसा ग्राफ माप के बीच गोलाकार के बहाव का संकेत भी दे सकता है और एक और 2PF रेखापुंज स्कैन द्वारा संपूर्ण संरचना के नए निर्देशांक खोजने की आवश्यकता होती है। एक्स और वाई अक्षों के साथ इंसुलिन स्फेरुलाइट के अत्यधिक आदेशित स्थानों से उचित रूप से मापा ध्रुवीय रेखांकन क्रमशः चित्रा 5 बी द्वितीय और तृतीय में दिखाया गया है। चयनित स्थान7 से मापा गया फ्लोरोफोर्स के स्थानीय अभिविन्यास और संगठन के आधार पर उनके पास अलग-अलग आकार और ज्यामिति हो सकती हैं।

प्रोटोकॉल के अंतिम चरण XY विमान Φ में अमाइलॉइड फाइबर के उन्मुखीकरण के संयोजन, संबंधित फ्लोरोफोर क्षणिक द्विध्रुवीय क्षणों Ψ, और उनके विपथन ΔΨ (चित्रा 6) तीव्रता Equation 1 के साथ और Equation 2 दो फोटॉन प्रेरित प्रतिदीप्ति के साथ एक गणितीय मॉडल के आधार पर एक एल्गोरिथ्म का उपयोग करके प्राप्त डेटा के विश्लेषण पर केंद्रित है। प्रोटोकॉल में प्रस्तुत सही ढंग से कार्यान्वित कार्यों को उचित इनपुट डेटा (प्रोटोकॉल चरण 4.9) दर्ज करने के बाद, चित्रा 7 में प्रस्तुत समान ध्रुवीय रेखांकन का उत्पादन करना चाहिए। कोई भी विचलन-अलग डेटा अभिविन्यास, तीव्रता, या सिम्युलेटेड Equation 26 और Equation 32-सिग्नल त्रुटियों के आकार कोड में। यदि मॉडल काम करता है, तो कोई प्रोटोकॉल के अंतिम चरण पर आगे बढ़ सकता है-ps-2PFM माप से प्राप्त वास्तविक डेटा के लिए सिम्युलेटेड डेटा को फिट कर सकता है। उच्चतम सहसंबंध गुणांक और नकली तीव्रता और मापा संकेत के बीच अभिसरण के साथ Φ और ΔΨ के चुने हुए मूल्यों को चित्र 8में दिखाए गए समान छवियों को जन्म देना चाहिए। समग्र अभिविन्यास और आकार Equation 1 के लिए सर्वोत्तम संभव फिट Equation 26 और Equation 32 कार्य होना चाहिए और Equation 2 Φ और ΔΨ के मान गोलाकार पर मापा स्थान में फाइब्रिल और फ्लोरोफोर्स के स्थानीय अभिविन्यास के अनुरूप होने चाहिए। इसी तरह के मॉडल और फिटिंग विधियों का उपयोग डीएनए11 जैसे अन्य बायोमोलेक्यूल्स के स्थानीय संगठन के निर्धारण के लिए भी किया जा सकता है।

Figure 1
चित्रा 1: दो-फोटॉन ध्रुवीकरण-संवेदनशील माइक्रोस्कोपी सेटअप। गोजातीय इंसुलिन spherulites के ध्रुवीकरण-संवेदनशील दो फोटॉन उत्साहित प्रतिदीप्ति माप के लिए इस्तेमाल किया दो फोटॉन खुर्दबीन सेटअप दिखा योजना. दो-फोटॉन उत्साहित उत्सर्जन क्षैतिज और लंबवत ध्रुवीकृत (माइक्रोस्कोप नमूना विमान के लिए) घटकों को क्रमशः IX, और IY के साथ दर्शाया गया है। संक्षिप्ताक्षर: एसपी = नमूना विमान; ओ = उद्देश्य; डीएम = डाइक्रोइक दर्पण; λ/2 = अर्ध-तरंग प्लेट; LPF = लॉन्ग-पास फिल्टर; BE = बीम विस्तारक; पी = ग्लेन पोलराइज़र; Ti: Sa = Titan: नीलम लेजर प्रकाश स्रोत; एम = दर्पण; एसपीएफ़ = शॉर्ट पास फिल्टर; पीबीएस = ध्रुवीकरण बीम फाड़नेवाला; एल = ऑप्टिकल लेंस; APD = हिमस्खलन फोटोडायोड। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: स्लाइड तैयारी/फोटो दिखा योजना. (ए) सीलबंद नमूना तैयारी दिखा योजना; (बी) नमूना सीलिंग के लिए बाद के चरणों की तस्वीरें। मैं: एक अच्छी तरह से माइक्रोस्कोपी स्लाइड पर गोलाकार समाधान के एक 100 माइक्रोन विभाज्य के साथ, द्वितीय: समाधान के शीर्ष पर गिरा coverslip; III: जमा बहुलक (माउंटेंट) से बनी तंग सील। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: एक ध्रुवीकृत-प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत इंसुलिन स्फेरुलाइट्स का गुणवत्ता नियंत्रण। (ए 1, बी 1) ब्राइटफील्ड मोड के साथ-साथ (ए 2, बी 2) ने ध्रुवीकरण को पार किया। विशेषता माल्टीज़ क्रॉस पैटर्न को पार किए गए पोलराइज़र के साथ ली गई संबंधित छवियों पर देखा जा सकता है। (ए) संरचनात्मक विकृतियों के साथ गोलाकार समुच्चय, (बी) उच्च गुणवत्ता वाले पृथक स्फेरुलाइट। स्केल सलाखों = 5 माइक्रोन. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: ps-2PFM प्रणाली के संरेखण का परीक्षण। (ए) फ्लोरेसिन प्रतिदीप्ति की गाढ़ा विकेंद्रित छवि जैसा कि (ए 1) के बिना और (ए 2) डाइक्रोइक दर्पण के साथ देखा गया है, (बी) एक्स और वाई दिशाओं के साथ चयनित बिंदुओं में लम्बी ध्रुवीकरण विश्लेषण के कारण उत्पन्न होने वाले जले हुए छेद के साथ फोटोडैमेज स्फेरुलाइट, (सी) एक आइसोट्रोपिक नमूने (फ्लोरेसिन समाधान) के लिए पंजीकृत घटना प्रकाश ध्रुवीकरण कोण पर निर्भरता में दो-फोटॉन उत्साहित उत्सर्जन घटक। और क्रमशः एक्स और वाई उत्सर्जन ध्रुवीकरण अक्ष को मापने वाले हिमस्खलन फोटोडायोड द्वारा मापा उत्सर्जन घटकों को निरूपित करें। स्केल बार = 5 माइक्रोन (ए 1, ए 2), 10 माइक्रोन (बी)। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: लेबल मुक्त इंसुलिन स्फेरुलाइट से अनुकरणीय 2 पीएफएम रेखापुंज स्कैन और ध्रुवीय ग्राफ। (ए) लेबल-मुक्त इंसुलिन स्फेरुलाइट्स के 2PF तीव्रता रेखापुंज स्कैन: उत्तेजना प्रकाश का ध्रुवीकरण: (A1) क्षैतिज ध्रुवीकरण, (A2) ऊर्ध्वाधर ध्रुवीकरण, और उत्सर्जन को सफेद तीरों के साथ दर्शाया जाता है, और इनसेट एक मानक ध्रुवीकृत प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत पार किए गए ध्रुवीकरण के साथ एक ही गोलाकार दिखाता है। (बी) ए 1 स्कैन (बी 1, आई; बी 2, द्वितीय; बी 3, III)। Ixऔर Iyक्रमशः X और Y उत्सर्जन ध्रुवीकरण अक्ष को मापने वाले हिमस्खलन फोटोडायोड द्वारा मापा गया उत्सर्जन घटकों को दर्शाते हैं। संक्षिप्त: 2PF = दो-फोटॉन प्रतिदीप्ति। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: लंबे फाइब्रिल अक्ष के संबंध में डाई (आधा कोण, Ψ) के उत्सर्जन द्विध्रुव का शंक्वाकार वितरण। धराशायी रेखा लंबी फाइब्रिल अक्ष दिखाती है। XY माइक्रोस्कोप नमूना विमान में तंतु का घूर्णन कोण द्वारा वर्णित है। तंतुओं में आण्विक घूर्णन के कारण Ψ के विपथन को ΔΨ द्वारा वर्णित किया गया है। यह आंकड़ा Obstarczyk एट अल6 से है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 7
चित्रा 7: ध्रुवीकृत दो-फोटॉन उत्साहित प्रतिदीप्ति की नकली तीव्रता। प्रतिदीप्ति की गणना (ए) φ = 1°, ψ = 1°, δψ = 1° के लिए की जाती है; (इ) φ = 1°, ψ = 30°, δψ = 1°; (ब) φ = 1°, ψ = 30°, δψ = 60°। लाल, नीली और पीली रेखाएँ क्रमशः , Equation 32, और Equation 26 + Equation 32, के अनुरूप हैंEquation 26। Φ कोण XY सूक्ष्मदर्शी नमूना विमान में फाइब्रिल के घूर्णन का वर्णन करता है, Ψ - उत्सर्जन द्विध्रुव का शंक्वाकार वितरण, और ΔΨ- फिलामेंट्स में आणविक घूर्णन के कारण विपथन। अन्य सभी पैरामीटर सभी मामलों में समान थे: K1 = 2.945, K2 = 0.069, K3 = 1.016, γ = 0.01, और δ = 0.98845। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 8
चित्रा 8: प्रयोगात्मक डेटासेट के ध्रुवीय ग्राफ। (ए, बी) गोजातीय इंसुलिन spherulites के ps-TPFM माप के दौरान एकत्र दो प्रयोगात्मक datasets फिट करने के बाद अनुकरणीय ध्रुवीय रेखांकन एक्स और वाई उत्सर्जन ध्रुवीकरण अक्ष के लिए मापा Equation 1 और Equation 2 दो-फोटॉन उत्साहित उत्सर्जन घटकों को क्रमशः लाल और नीले डॉट्स के साथ प्रस्तुत किया जाता है; इस बीच, ठोस लाइनें एक्स और वाई उत्सर्जन ध्रुवीकरण अक्ष Equation 26 के लिए इसी नकली दो-फोटॉन उत्साहित प्रतिदीप्ति उत्सर्जन घटकों को प्रस्तुत करती हैं और Equation 32। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

ध्रुवीकरण-संवेदनशील दो-फोटॉन माइक्रोस्कोपी अमाइलॉइड सुपरस्ट्रक्चर के अंदर फाइब्रिल के स्थानीय क्रम का अध्ययन करने के लिए एक मूल्यवान उपकरण है, जिसमें मानक मल्टीफोटन सेटअप के केवल छोटे संशोधनों की आवश्यकता होती है। चूंकि यह नॉनलाइनियर ऑप्टिकल घटना पर काम करता है, इसलिए एक-फोटॉन उत्साहित प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी विधियों की तुलना में कम कोणीय फोटो-चयन और बढ़ाया अक्षीय संकल्प प्राप्त किया जा सकता है। इसके अलावा, यह कम प्रकाश बिखरने, कम phototoxicity, और गहरी नमूना पैठ जब एक फोटॉन उत्तेजना प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी तकनीक19,20 की तुलना में की ओर जाता है. जैसा कि हम पहले ही साबित कर चुके हैं, यह स्फेरुलाइट्स जैसे प्रोटीन के घनी-पैक समुच्चय के माप के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है, जिसे लेबल-मुक्ततरीके से 21 में किया जा सकता है।

हालांकि, यहां वर्णित विधि का प्रभावी ढंग से उपयोग करने के लिए, कई महत्वपूर्ण मुद्दों पर ध्यान दिया जाना चाहिए। नमूना तैयार करने और इसकी गुणवत्ता के साथ शुरू, अर्थात्, इनक्यूबेशन, हमेशा सुनिश्चित करें कि अमाइलॉइड सुपरस्ट्रक्चर सही ढंग से बढ़े हैं। स्फेरुलाइट्स के मामले में, हमने परिपक्व स्फेरुलाइट्स को स्थानीय बनाने के लिए पार किए गए पोलराइज़र के साथ एक ध्रुवीकृत ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप का उपयोग किया, जो एक विशेषता माल्टीज़ क्रॉस पैटर्न देते हैं, और ~ 5 माइक्रोन16 की त्रिज्या रखते हैं। हालांकि, गोलाकार विषम हैं, और नमूने के भीतर विशिष्ट संरचनाएं देखी जा सकती हैं। इसलिए, अलग और गैर-विकृत प्रजातियों को चुनना महत्वपूर्ण है। माप प्रणाली के लिए ही के रूप में, यह घटना प्रकाश के ध्रुवीकरण को नियंत्रित करने के लिए इतना है कि खुर्दबीन शरीर के प्रवेश द्वार पर बीम के ध्रुवीकरण ठीक से निर्धारित किया जाना चाहिए और ऑप्टिकल तत्वों का इस्तेमाल किया द्वारा शुरू किया विध्रुवण22 को कम से कम किया जाना चाहिए के रूप में. सर्वोत्तम प्रदर्शन को आश्वस्त करने के लिए, हम उत्तेजना और प्रतिदीप्ति उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य से मेल खाने वाले उच्च गुणवत्ता वाले चांदी के दर्पण और ऑप्टिकल फिल्टर का उपयोग करने की सलाह देते हैं। उत्सर्जन पथ में भी प्रकाश ध्रुवीकरण की महत्वपूर्ण भूमिका के कारण, वास्तविक माप से पहले एक आइसोट्रोपिक संदर्भ नमूने को मापना आवश्यक है। यदि उत्तेजना पथ और एपीडी डिटेक्टरों को सही ढंग से गठबंधन किया जाता है, तो किसी को चित्रा 4 सी में प्रस्तुत दोनों डिटेक्टरों पर समान रूप से तीव्र संकेत देखना चाहिए। संदर्भ फोटोब्लीचिंग से बचने के लिए अपेक्षाकृत कम लेजर शक्ति पर एक मजबूत दो-फोटॉन उत्साहित प्रतिदीप्ति उत्पन्न करना चाहिए; हम fluorescein इस्तेमाल के बाद से अपने दो फोटॉन अवशोषण विभिन्न तरंग दैर्ध्य के लिए पार वर्गों पहले से ही साहित्य23 में रिपोर्ट कर रहे थे.

गोलाकार के अंदर संरचनाओं की व्यवस्था को सही ढंग से निर्धारित करने के लिए, डेटा विश्लेषण पर भी बहुत ध्यान दिया जाना चाहिए। इस मॉडल की मूल धारणा प्रकाश अवशोषण और उत्सर्जन के संक्रमण द्विध्रुवीय क्षण की कोलिनियरिटी है। उस धारणा के तहत, घटना प्रकाश के ध्रुवीकरण के समानांतर अणु के संक्रमण द्विध्रुवीय क्षण को संरेखित करने से परीक्षण किए गए नमूने की आंतरिक संरचना के साथ इसके संयोजन की अनुमति मिलती है, जिससे उच्चतम उत्सर्जन तीव्रता प्राप्त होती है। दिए गए मॉडल का उपयोग दो द्विध्रुव आघूर्ण8 के बीच के कोण में छोटे अंतर के लिए एक अच्छे सन्निकटन के रूप में भी किया जा सकता है, लेकिन बड़े विचलनों के लिए और संशोधनों की आवश्यकता होती है। इसलिए, जैसा कि वर्णित है, नमूना के बारे में कुछ मान्यताओं इमेजिंग और डेटा विश्लेषण के लिए एक प्राथमिकता को ध्यान में रखा जाना चाहिए. मॉडल मामले में जिस पर सिमुलेशन और इस पद्धति में उपयोग किए जाने वाले समीकरण आधारित हैं, सिस्टम में विध्रुवण का मुख्य स्रोत डाइक्रोइक दर्पण है। इसलिए, डेटा विश्लेषण के साथ आगे बढ़ने से पहले, एकत्रित ध्रुवीय रेखांकन के आकार पर उनके प्रभाव के कारण डाइक्रोइक दर्पण द्वारा पेश किए गए विध्रुवण के लिए जिम्मेदार मापदंडों को निर्धारित करना आवश्यक है और इसके परिणामस्वरूप, फिटिंग18 के दौरान जांच की गई संरचना के भीतर अणुओं के संगठन का सही निर्धारण. यह एक महत्वपूर्ण समस्या बन जाता है, विशेष रूप से कई तरंग दैर्ध्य के लिए माप के मामले में, क्योंकि डाइक्रोइक दर्पण की अंडाकार में परिवर्तन विशिष्ट तरंग दैर्ध्य12 पर निर्भर है। विध्रुवण का प्रेरण एकत्रित संकेत11 की विशेषताओं को दृढ़ता से प्रभावित कर सकता है। अंतिम लेकिन कम से कम, डेटा विश्लेषण के लिए स्क्रिप्ट बनाते समय, प्रोटोकॉल के अंतिम भाग में प्रस्तुत गणितीय कार्यों और चर को पेश करते समय किसी को ध्यान देना चाहिए। त्रुटियों से बचने के लिए, कई फ़ंक्शन कॉलिंग और वैश्विक मापदंडों जैसी सुविधाओं पर ध्यान केंद्रित करें, जो विश्लेषण समय को भी काफी तेज कर देगा।

हमें वर्णित विधि का उपयोग करते समय सबसे आम समस्याओं का भी उल्लेख करना चाहिए। नमूना तैयार करने का समय माउंटेंट सख्त होने की गति पर बहुत निर्भर है। इसे गति देने के लिए, हम अनुशंसा करते हैं कि नमूने गर्म, सूखी जगह में तैयार किए जाएं और स्फेरुलाइट समाधान को माइक्रोस्कोप में माउंट करने से पहले सील कर दिया जाए। बहुत जल्दी किए गए माप स्लाइड की सील को खोलने और उपयोग किए गए उद्देश्य लेंस के विनाश का कारण बन सकते हैं। इसके अलावा, उचित नमूना तैयार करने के बावजूद, उद्देश्य द्वारा पेश किए गए भौतिक तनाव के कारण माप के दौरान छोटे गोलाकार समाधान में तैर सकते हैं। इससे बचने के लिए, हम पृथक मध्यम आकार की संरचनाओं को स्कैन करने की सलाह देते हैं क्योंकि सबसे बड़े आमतौर पर समुच्चय होते हैं। यह स्कैन किया गया है कि क्या स्कैन spherulite डेटा अधिग्रहण के बाद ले जाया गया है की जाँच करने के लिए सिफारिश की है, माप शुरू करने से पहले छवि की तुलना में. इसके अलावा, ps-2PFM को मापने के लिए उपयोग किए जाने वाले सभी ऑप्टिकल तत्वों और डिटेक्टरों के सही संरेखण के बावजूद, मापा तीव्रता Equation 1 और Equation 2 आइसोट्रोपिक संदर्भ अभी भी तीव्रता में थोड़ा भिन्न हो सकता है। ऐसे मामले में, संदर्भ माप के दौरान निर्धारित सुधार कारक द्वारा तीव्रता में से एक को गुणा करके नमूना माप से डेटा का विश्लेषण करते समय इसे ध्यान में रखना आवश्यक है। अंतिम, लेकिन कम से कम, यह संभव है कि फिटिंग प्रक्रिया के दौरान, स्क्रिप्ट Φ और ΔΨ के किसी भी मिलान मान को खोजने में सक्षम नहीं होगी। यह कई कारकों के कारण हो सकता है-डेटा एक नमूने पर एक अव्यवस्थित स्थान से एकत्र किया गया था, उदाहरण के लिए, एक गोलाकार का मूल; अध्ययन की गई संरचना इनक्यूबेशन के दौरान पूरी तरह से नहीं बनी थी; और Equation 32का गलत सिमुलेशन ; फिटिंग के Equation 26 दौरान प्रत्येक पुनरावृत्ति के बीच Φ और ΔΨ कोणों के लिए बहुत बड़ा कदम सेट γ और δ गलत डाइक्रोइक दर्पण पैरामीटर का उपयोग करना। एक असंगठित स्थान के मामले में, हम जांच की गई संरचना की परिधि के करीब स्थित बिंदुओं से डेटा एकत्र करने की कोशिश करने की सलाह देते हैं। अपूर्ण रूप से गठित संरचना के मामले में, इनक्यूबेशन दोहराएं या अन्य संरचनाओं के लिए स्लाइड खोजें। गलत सिमुलेशन के मामले में, मैन्युअल रूप से जांचें कि क्या पैरामीटर Φ, Ψ, और ΔΨ को बदलकर, नकली तीव्रता Equation 26 और कोड में किसी भी त्रुटि को बदलें और Equation 32 ठीक करें। गलत डाइक्रोइक दर्पण मापदंडों के मामले में, माप के दौरान उपयोग किए जाने वाले डाइक्रोइक दर्पण के γ और δ मापदंडों की सावधानीपूर्वक जांच करें। फिटिंग के दौरान कोणों के लिए निर्धारित एक बड़े चरण के मामले में, क्रमिक पुनरावृत्तियों के बीच के चरण को 2º या 1º तक कम करें। यह भी याद रखना चाहिए कि संरचना के मजबूत स्थानीय अव्यवस्था के मामले में, आर2 हमेशा कम होगा, अक्सर 0.5-0.6 की सीमा में। ऐसा इसलिए है क्योंकि प्रस्तुत मॉडल अत्यधिक क्रमबद्ध अणुओं का वर्णन करता है जहां अधिकांश क्षणिक द्विध्रुवीय क्षण एक समान दिशा में संरेखित होते हैं; इसलिए, अनाकार या अत्यधिक अव्यवस्थित संरचनाओं का मिलान कम सहसंबंध गुणांक की ओर जाता है। इसलिए, प्राप्त डेटा का सही विश्लेषण करने के लिए माप से पहले नमूने पर कम से कम कुछ संरचनात्मक जानकारी रखना महत्वपूर्ण है।

यह भी ध्यान देने योग्य है कि प्रस्तुत विधि में कई सीमाएँ हैं। डेटा विश्लेषण के परिणामस्वरूप उच्च पर्याप्त सहसंबंध कारकों के साथ Φ और ΔΨ कोणों के कई मान हो सकते हैं, जिससे प्रयोगकर्ता को उपयुक्त मूल्यों का चयन करने के लिए अपने ज्ञान और अनुभव का उपयोग करने की आवश्यकता होती है। इस मामले में, सीमा की स्थिति को ध्यान में रखा जाना चाहिए, जैसे कि फ्लोरोफोर शंकु अर्ध-कोण Ψ हमेशा इसके विपथन ΔΨ से बड़ा होना चाहिए। इसके अलावा, साहित्य के साथ हमारे डेटा की तुलना करते समय, यह ध्यान देने योग्य है कि कुछ कागजात Ψ को पूर्ण-शंकु कोण के रूप में वर्णित करते हैं, जबकि हम अर्ध-शंकु कोण पर काम करते हैं। एक और सीमा माप संकल्प है, जो एक उप-माइक्रोन रिज़ॉल्यूशन तक सीमित है। उसके कारण, सिस्टम की फोटो-चयनात्मकता और परिणामस्वरूप स्थानीय संगठन निर्धारण एकल संरचनाओं के बजाय फोकल स्पॉट में उत्साहित फाइब्रिल से औसत संकेत पर आधारित होते हैं। इसके अलावा, नमूना ही पर्याप्त प्रतिदीप्ति क्वांटम उपज के अधिकारी की जरूरत है, के रूप में लंबे समय तक जोखिम एफएस घटना लेजर शक्ति (ध्रुवीय रेखांकन के लिए डेटा प्राप्त करने के लिए आवश्यक) विनाशकारी हो सकता है और परिणामों को प्रभावित कर सकता है.

इन कठिनाइयों के बावजूद, हम मानते हैं कि इस पत्र में प्रस्तुत विधि में हाइड्रेटेड और जटिल वातावरण में बायोस्ट्रक्चर के लेबल-आधारित और लेबल-मुक्त इमेजिंग के लिए अनुप्रयोगों की एक विस्तृत श्रृंखला है। हमने पहले दिखाया था कि पीएस -2 पीईएफ डेटा से गणना की गई स्थानीय फाइब्रिल ऑर्डरिंग ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी7 से प्राप्त जानकारी से संबंधित है। इसलिए, हमने जैव-इमेजिंग में ps-2PEF की वैधता की पुष्टि की और अमाइलॉइड सुपरस्ट्रक्चर के संरचनात्मक क्रम पर ज्ञान का और विस्तार किया। इस विधि को जैविक नमूनों के विभिन्न घटकों के मामले में देखे गए आंतरिक प्रतिदीप्ति की उत्पत्ति के बारे में जानने के लिए लागू किया जा सकता है, जैसे कि प्रोटीन समुच्चय-एमिलॉयड के ऑटोफ्लोरेसेंस। एमिलॉयड फाइब्रिल की लंबी धुरी के संबंध में अवशोषण/उत्सर्जन द्विध्रुवीय क्षण दिशाओं के उन्मुखीकरण के बारे में प्रासंगिक डेटा को देखते हुए, फाइब्रिल के ऑप्टिकल गुणों को उनकी संरचना6 के साथ सहसंबद्ध किया जा सकता है। हमने संकेत दिया कि पहले से ही निर्धारित Ψ कोण वाली संरचनाओं के लिए, यह तकनीक उनके संगठन7 के स्तर के आधार पर अमाइलॉइड सुपरस्ट्रक्चर और इंसुलिन सुपरस्ट्रक्चर के बहुरूपियों की विशिष्ट संरचनात्मक विशेषताओं का पता लगाने की अनुमति देती है। जैसा कि पहले प्रोटोकॉल में उल्लेख किया गया है, प्रस्तुत सेटअप भी एक लेबल मुक्त दो फोटॉन माइक्रोस्कोपी तकनीक24 है जो ध्रुवीकरण-संवेदनशील दूसरी हार्मोनिक पीढ़ी माप, के लिए भी लागू किया जा सकता है. यह न केवल विभिन्न ऑप्टिकल फिल्टर बढ़ते लेकिन यह भी डेटा विश्लेषण25 के लिए इस्तेमाल सूत्रों को बदलने की आवश्यकता होगी. इसके अलावा, एक ठीक से गठबंधन तिमाही तरंग के अलावा के साथ, यह परिपत्र ध्रुवीकृत प्रकाश, जो अमाइलॉइड के चिरल nonlinear ऑप्टिकल गुणों की पीढ़ी के लिए नेतृत्व कर सकते हैं के साथ नमूना उत्तेजित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है क्योंकि वे पुष्टि की मजबूत चिरोप्टिकल गुण26 के साथ चिरल biopolymers हैं. हालांकि, ऐसे मामले में, लगातार घूमने वाले इलेक्ट्रिक वेक्टर उत्तेजित उत्सर्जन की लगातार बदलती दिशा को जन्म देंगे, जिससे इस पांडुलिपि में प्रस्तुत समीकरणों का उपयोग करके किसी भी संरचनात्मक जानकारी को निर्धारित करना असंभव हो जाएगा। सब सब में, ps-2PEF आदेशित उत्सर्जन द्विध्रुवों के साथ कई जटिल जैव-संरचनाओं के भीतर संगठन के निर्धारण के लिए एक आशाजनक उपकरण है, जैसे कि प्रोटीन समुच्चय, डीएनए, या गैर-आक्रामक तरीके से ऊतक।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को पोलैंड में राष्ट्रीय विज्ञान केंद्र द्वारा वित्तपोषित सोनाटा बीआईएस 9 परियोजना (2019/34/ई/एसटी5/00276) द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sample preparation
Coverslips, 24 x 24 mm Chemland 04-298.202.04
DPX mountant for histology Sigma-Aldrich 6522 Slide mountant
Eppendorf Safe-Lock tubes, 1.5 mL, polypropylene Chemland 02-63102
Eppendorf ThermoMixer C Eppendorf Used for spherulite incubation
HLP 5UV Water purification system Hydrolab Source of dionized water used in sample preparation
Hydrochloric acid (≥37%, APHA ≤10), Sigma-Aldrich 30721-M
Insulin powder from the bovine pancreas (≥25 units/mg (HPLC)) Sigma-Aldrich I5500
Methanol (HPLC grade) Sigma-Aldrich 270474
Microscope slides with a concave, 76 x 26 x 1 mm Chemland 04-296.202.09
Olympus BX60 Olympus Polarized Optical Microscope used in Figure 2
PTFE thread seal tape, 12 mm x 12 mm x 0.1 mm, 60 gm2 Chemland VIT131097
Microscope ps-2PFM setup
Chameleon Ultra II Coherent
FELH0800 - Ø25.0 mm Longpass Filter Thorlabs
FESH0700 - Ø25.0 mm Shortpass Filter Thorlabs
IDQ100 photon-counting avalanche photodiodes  ID Quantique
Multiphoton short-pass emission filter 720 nm  Semrock
Mounted Achromatic Half-Wave Plate, 690-1200 nm Thorlabs
Nikon Plan Apo Oil Immersion 100x/1.4 NA Nikon
piezo 3D stage Piezosystem Jena
Polarizing Beamsplitter Thorlabs
S130C - Slim Photodiode Power Sensor, Si, 400 - 1100 nm, 500 mW Thorlabs
Software
LabView 2018 National Instruments Version 18.0.1f2
Matplotlib library Version 3.3.2
NumPy library Version 1.19.2
SciPy library Version 1.5.2
Spyder Python 3 IDE Version 4.1.5

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References

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ध्रुवीकरण-संवेदनशील दो-फोटॉन माइक्रोस्कोपी लेबल-मुक्त अमाइलॉइड संरचनात्मक लक्षण वर्णन बायोइमेजिंग प्रयोग फोटोटॉक्सिसिटी ऊतक प्रवेश घनी पैक सिस्टम कोणीय फोटोसेलेक्शन फ्लोरोफोरस ध्रुवीकरण विश्लेषण दो-फोटॉन प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (2PFM) आणविक संगठन मानक इमेजिंग तरीके रैखिक ऑप्टिकल प्रक्रियाएं ध्रुवीकरण-संवेदनशील 2PFM (ps-2PFM) आणविक आदेश जटिल जैव-संरचनाएं अमाइलॉइड स्फेरुलाइट्स न्यूरोडीजेनेरेटिव रोग अल्जाइमर पार्किंसंस एमाइलॉइड-प्रोटीन एग्रीगेट्स बिगड़ा हुआ प्रोटीन मिसफोल्डिंग प्रक्रिया नैदानिक तरीके स्थानीय फाइब्रिल ऑर्डरिंग गोजातीय इंसुलिन स्फेरुलाइट्स
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Lipok, M., Obstarczyk, P., Olesiak-Bańska, J. Polarization-Sensitive Two-Photon Microscopy for a Label-Free Amyloid Structural Characterization. J. Vis. Exp. (199), e65670, doi:10.3791/65670 (2023).

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