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Chemistry

Microscopia a due fotoni sensibile alla polarizzazione per una caratterizzazione strutturale dell'amiloide label-free

Published: September 8, 2023 doi: 10.3791/65670
Automatic Translation
1, 1, 1
1Institute of Advanced Materials, Wrocław University of Science and Technology

Summary

Questo articolo descrive come la microscopia a due fotoni sensibile alla polarizzazione potrebbe essere applicata per caratterizzare l'organizzazione locale all'interno di sovrastrutture-sferuliti amiloidi label-free. Descrive inoltre come preparare e misurare il campione, assemblare la configurazione richiesta e analizzare i dati per ottenere informazioni sull'organizzazione locale delle fibrille amiloidi.

Abstract

Rispetto alla sua controparte a un fotone, l'eccitazione a due fotoni è vantaggiosa per gli esperimenti di bioimaging a causa della sua minore fototossicità, della penetrazione più profonda nei tessuti, del funzionamento efficiente in sistemi densamente impacchettati e della ridotta fotoselezione angolare dei fluorofori. Pertanto, l'introduzione dell'analisi di polarizzazione nella microscopia a fluorescenza a due fotoni (2PFM) fornisce una determinazione più precisa dell'organizzazione molecolare in un campione rispetto ai metodi di imaging standard basati su processi ottici lineari. In questo lavoro, ci concentriamo sulla 2PFM sensibile alla polarizzazione (ps-2PFM) e sulla sua applicazione nella determinazione dell'ordinamento molecolare all'interno di biostrutture complesse-sferuliti amiloidi. Le malattie neurodegenerative come l'Alzheimer o il Parkinson sono spesso diagnosticate attraverso il rilevamento di aggregati amiloidi-proteici formatisi a causa di un alterato processo di misfolding proteico. L'esplorazione della loro struttura porta a una migliore comprensione del loro percorso di creazione e, di conseguenza, allo sviluppo di metodi diagnostici più sensibili. Questo articolo presenta il ps-2PFM adattato per la determinazione dell'ordinamento locale delle fibrille all'interno delle sferuliti di insulina bovina e degli aggregati proteici amiloidogenici sferici. Inoltre, dimostriamo che la tecnica proposta può risolvere l'organizzazione tridimensionale delle fibrille all'interno della sferulite.

Introduction

Negli ultimi decenni, sebbene vi sia stato uno sviluppo significativo di numerose tecniche di microscopia a fluorescenza per il bioimaging delle proteine e dei loro aggregati1, solo alcune sono state utilizzate per risolvere il loro ordinamento locale all'interno del campione 2,3. Lamicroscopia a fluorescenza 4 è stata utilizzata per studiare l'eterogeneità strutturale intrinseca delle sovrastrutture-sferuliti amiloidi. Inoltre, la determinazione quantitativa dell'ordinamento locale all'interno di biostrutture complesse e densamente impacchettate come le sferuliti potrebbe essere risolta utilizzando metodi sensibili alla polarizzazione3. Tuttavia, le tecniche di fluorescenza standard con penetrazione superficiale nei tessuti sono limitate poiché l'utilizzo di lunghezze d'onda UV-VIS per eccitare i fluorofori in vivo porta a un'elevata diffusione della luce tissutale5. Inoltre, tale imaging richiede spesso la progettazione e il legame di sonde fluorescenti specifiche a una biomolecola mirata, aumentando così il costo e la quantità di lavoro necessario per eseguire l'imaging.

Recentemente, per affrontare questi problemi, il nostro team ha adattato la microscopia a fluorescenza eccitata a due fotoni sensibile alla polarizzazione (ps-2PFM) per l'imaging label-free di strutture biologiche 6,7. Ps-2PFM consente di misurare la dipendenza dell'intensità della fluorescenza a due fotoni dalla direzione della polarizzazione lineare del fascio di eccitazione e di analizzare la polarizzazione della fluorescenza emessa8. L'implementazione di questa tecnica richiede l'integrazione del percorso di eccitazione standard del microscopio multi-fotone (Figura 1) con una piastra a semionda per controllare il piano di polarizzazione della luce. Quindi, i grafici polari, che descrivono la dipendenza dell'intensità della fluorescenza eccitata a due fotoni dalla polarizzazione del raggio laser di eccitazione, vengono creati dai segnali raccolti da due fotodiodi a valanga, raccogliendo così le due componenti reciprocamente perpendicolari della polarizzazione della fluorescenza.

L'ultimo passaggio è il processo di analisi dei dati, tenendo conto dell'impatto degli elementi ottici, come gli specchi dicroici o un obiettivo ad alta apertura numerica, sulla polarizzazione. A causa della natura del processo a due fotoni, questo metodo fornisce sia una ridotta fotoselezione angolare che una migliore risoluzione assiale, poiché l'eccitazione a due fotoni dei fluorofori al di fuori del piano focale è probabilisticamente limitata. È stato inoltre dimostrato che metodi simili potrebbero essere implementati con successo per l'imaging in vivo di sonde nel vicino infrarosso (NIR) per l'imaging dei tessuti profondi9. Ps-2PFM è stato precedentemente applicato a fluorofori di immagine nelle membrane cellulari10 e DNA11,12, nonché a marcatori fluorescenti non standard di sistemi biologici, come le nanoparticelle d'oro13. Tuttavia, in tutti questi esempi, le informazioni sull'organizzazione delle biomolecole sono state ottenute indirettamente e hanno richiesto un orientamento reciproco predefinito tra un fluoroforo e una biomolecola.

In uno dei nostri recenti articoli, abbiamo dimostrato che la ps-2PFM potrebbe essere applicata con successo per determinare la polarizzazione locale dell'autofluorescenza delle sovrastrutture amiloidi e la fluorescenza dalla tioflavina T, un colorante specifico per l'amiloide, legato alle fibrille amiloidi nelle sferuliti6. Inoltre, in un altro, abbiamo dimostrato che ps-2PFM potrebbe essere utilizzato per rilevare l'orientamento delle fibrille amiloidi all'interno delle sferuliti amiloidi in un regime di dimensioni inferiori al micron, che è stato confermato correlandolo con l'imaging al microscopio elettronico a trasmissione (TEM)7. Il raggiungimento di questo risultato è stato possibile grazie a i) autofluorescenza intrinseca di sferuliti-amiloidi, quando eccitate con uno o due fotoni, mostrano un'autofluorescenza intrinseca con massimi di emissione situati in un intervallo compreso tra 450 e 500 nm e sezioni d'urto di assorbimento a due fotoni paragonabili ai coloranti fluorescenti standard14, ii) modelli matematici introdotti in precedenza per descrivere come ps-2PEF di coloranti che marcano membrane biologiche e strutture del DNA potrebbero essere applicati a fluorescenza esibita da sferuliti e coloranti ad essi legati 8,11,15. Pertanto, prima di procedere con l'analisi, consigliamo vivamente di esaminare la teoria richiesta descritta sia nel testo principale che nelle informazioni di supporto del nostro primo articolo riguardante questo argomento6. Qui, presentiamo il protocollo su come applicare la tecnica ps-2PFM per una caratterizzazione strutturale amiloide label-free di sferuliti di insulina bovina.

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Protocol

1. Preparazione dei vetrini del microscopio con sferuliti completamente cresciute

NOTA: Vedere la tabella dei materiali per i dettagli su tutti i materiali, i reagenti e le apparecchiature utilizzati in questo protocollo. Tutte le soluzioni sono state preparate con acqua deionizzata (18,2 MΩ·cm a 25 °C) ottenuta dal sistema di purificazione dell'acqua.

  1. Incubare le sferuliti amiloidi in base al protocollo descritto da Krebs et al16. con alcune modifiche, come descritto di seguito.
    1. Pesare 10 mg di insulina in polvere in una provetta da 1,5 ml.
    2. Sciogliere la polvere con un'aliquota di 1 mL della soluzione deionizzata di H2O/HCl (pH 1,5).
    3. Sigillare il campione con il nastro adesivo e metterlo in un miscelatore termico per incubare per 24 ore a 70 °C (0 giri/min).
      NOTA: Per eseguire l'imaging delle amiloidi nel loro ambiente nativo (cioè idratato) e prevenire la deformazione del campione dovuta alla disidratazione, è necessario preparare i vetrini del microscopio secondo la seguente descrizione (schema mostrato nella Figura 2).
  2. Lavare accuratamente il vetrino del microscopio con acqua.
  3. Immergere i vetrini nel metanolo e lasciarli asciugare in condizioni ambientali su un panno privo di polvere.
  4. Prelevare un'aliquota di 100 μL della soluzione di sferulite dalla provetta con una pipetta automatica (passaggio 1.1.2) e aggiungerla al pozzetto situato nell'area centrale del vetrino del microscopio.
  5. Coprire la soluzione con un vetrino coprioggetti, evitando la formazione di bolle d'aria.
  6. Depositare il mountant lungo i bordi del vetrino coprioggetti sul vetrino con una pipetta automatica per sigillare la soluzione nativa delle sferuliti.
    NOTA: È di grande importanza depositare il supporto per vetrini sia sul vetrino coprioggetto che sulle superfici dei vetrini. Fallo sotto la cappa fumante a causa della tossicità del solvente volatile (xilene). Vedere il riquadro nella Figura 2.
  7. Lasciare il campione del microscopio in condizioni ambientali affinché il supporto si indurisca.
    NOTA: Il processo di indurimento dipende dalla temperatura e dall'umidità, ma deve essere completato entro 12 ore.
  8. Controllare se le sferuliti di insulina si sono formate correttamente utilizzando un microscopio ottico polarizzato (POM) con polarizzatori incrociati. Scansiona il campione alla ricerca di un modello caratteristico di aree luminose, chiamato croce di Malta, come mostrato nella Figura 3.
    NOTA: Le sferuliti amiloidi possono essere definite come sovrastrutture sferiche caratterizzate da una morfologia eterogenea con una struttura core-shell. Nel dettaglio, sono composti da un nucleo amorfo e fibrille amiloidi a crescita radiale16. A causa del carattere anisotropo delle strutture sferiche, possono interagire distintamente con la luce polarizzata (ad esempio, per rifrazione) e alterare la loro fase, che può essere facilmente osservata sotto POM con polarizzatori incrociati. Questo metodo è stato utilizzato per studiare solo le sferuliti completamente sviluppate, caratterizzate da un modello di croce maltese simile a un modello. Di conseguenza, gli aggregati o le sferuliti strutturalmente distorte sono stati esclusi da ulteriori indagini.

2. Costruzione e allineamento del sistema

NOTA: Una rappresentazione schematica di un microscopio a due fotoni sensibile alla polarizzazione è riportata nella Figura 1.

  1. Installare un laser a femtosecondi con la sintonizzabilità della lunghezza d'onda di uscita nell'intervallo 690-1.080 nm, ad esempio, operando su un laser Ti: Zaffiro con ~100 impulsi fs di frequenza di ripetizione di 80 MHz.
  2. Aggiungere una piastra a semionda montata su uno stadio di rotazione al percorso di eccitazione della configurazione per controllare la polarizzazione della luce incidente nel piano del campione del microscopio XY.
  3. Installare lo specchio dicroico per tagliare il fascio di eccitazione dall'ottica di rilevamento.
    NOTA: Le caratteristiche ottiche di uno specchio dicroico devono consentire di riflettere il fascio di eccitazione (al campione) nell'intervallo di lunghezze d'onda NIR ed essere contemporaneamente trasparente per l'intervallo di lunghezze d'onda corrispondente all'emissione dai campioni.
  4. Installare uno stadio di scansione piezoelettrico per le scansioni raster all'interno del piano XY per una Z scelta.
  5. Montare l'obiettivo ad immersione ad alto NA, ad esempio un obiettivo a immersione in olio apocromatico 100x/1.4 NA.
    NOTA: Poiché l'intera configurazione funziona in modalità epifluorescenza, i segnali incidenti ed emessi passano dallo stesso obiettivo.
  6. Nel percorso di emissione, aggiungere un divisore di fascio polarizzatore che divide l'emissione eccitata a due fotoni in due componenti polarizzate ortogonalmente (I,X e I,Y)
  7. Installare due fotodiodi a valanga (APD) per il conteggio dei fotoni in una configurazione che consenta loro di raccogliere la luce trasferita e riflessa utilizzando rispettivamente il divisore di fascio (Figura 1).
  8. Montare filtri di cut-off corretti dipendenti dalla lunghezza d'onda sul percorso di eccitazione ed emissione del sistema, ad esempio un filtro passa-lungo da 800 nm direttamente nel percorso ottico di eccitazione e un filtro passa-corto da 700 nel percorso di emissione.
    NOTA: Analizzare gli spettri di emissione della sferulite in modo da escludere qualsiasi potenziale contributo della generazione di seconda armonica (SHG) o della luce laser utilizzando i filtri di emissione corretti. Vale anche la pena notare che questo sistema dovrebbe anche consentire misurazioni di SHG sensibile alla polarizzazione, che potrebbe essere utilizzato per risolvere l'ordine delle biomolecole all'interno dei campioni. Tuttavia, l'analisi dei dati del segnale SHG differisce dalla fluorescenza, che, in modo più dettagliato, è stata descritta da Aït-Belkacem et al.17.
  9. Allineare l'intero sistema (utilizzando la modalità di allineamento incorporata in molti laser) fino a quando non vengono raccolte intensità di segnale simili utilizzando entrambi i fotodiodi.
  10. Controllare se il fascio di eccitazione focalizzato dall'obiettivo ad alto NA e ripreso su una fotocamera ha una forma circolare concentrica come mostrato nella Figura 4A.
  11. Regolare il tempo di scansione e la potenza corrispondente per ridurre al minimo il danno indotto dal laser incidente sul campione. Un esemplare di bruciatura puntiforme è presentato nella Figura 4B. Misurare la potenza nominale utilizzando un misuratore di potenza digitale portatile collegato a un sensore di potenza a fotodiodo situato all'ingresso del corpo del microscopio.
    NOTA: I campioni biologici possono essere facilmente bruciati grazie all'illuminazione laser. In questo caso, l'intervallo di potenza di 100-900 μW (nel punto focale dell'obiettivo) è risultato essere un eccellente compromesso tra la stabilità del campione e l'emissione intensa.
  12. Prima della misurazione del campione, testare la qualità dell'allineamento dell'ottica con un campione di riferimento isotropo (ad esempio, fluoresceina incorporata nel polimero amorfo). Per eseguire il controllo di calibrazione, seguire la procedura descritta nella sezione 3 utilizzando un riferimento isotropo invece di un campione di amiloide.
    NOTA: Supponendo che la configurazione microscopica sia idealmente regolata per il campione con proprietà isotrope, entrambe le componenti di emissione 2P (IX e IY) rilevate con due APD dovrebbero essere caratterizzate dalla stessa intensità (Figura 4C).

3. Misurazione delle sferuliti di insulina bovina

NOTA: Per eseguire tutte le misure ps-2PF descritte, è stato utilizzato un software scritto a mano, che controlla le posizioni dello stadio piezoelettrico e della piastra a semionda e raccoglie il segnale da entrambi i fotodiodi, consentendo di tracciare le scansioni XY (scansioni raster) da aree selezionate su vetrini da microscopio e grafici polari da coordinate specifiche del campione. Sono state inoltre aggiunte ulteriori note al protocollo, che consentiranno agli utenti di eseguire la misurazione senza di esso, poiché sia lo stadio piezoelettrico che lo stadio di rotazione utilizzati per ruotare la piastra a semionda potrebbero essere controllati utilizzando i propri controller o il software corrispondente. Tuttavia, si consiglia vivamente di scrivere un algoritmo che combini l'angolo di rotazione di una piastra a semionda con l'intensità 2PEF raccolta con entrambi i fotodiodi, poiché questa correlazione (grafici polari) è fondamentale per una corretta analisi dei dati che si traduce in informazioni strutturali.

  1. Montare il provino con le sferuliti sul tavolino piezoelettrico (immobilizzare il vetrino con del nastro adesivo). Assicurarsi di montarlo in modo che un sottile lato di vetro (vetrino coprioggetti) sia rivolto verso l'obiettivo, poiché gli obiettivi numerici elevati sono caratterizzati da distanze di lavoro relativamente brevi.
    NOTA: Poiché si utilizza l'immersione in olio, è necessario applicare una piccola goccia di olio minerale sull'obiettivo prima di montare e mettere a fuoco il campione.
  2. Cambiando le posizioni XY e Z utilizzando le manopole del microscopio, focalizzare l'obiettivo su una delle sferuliti presenti nella soluzione, ma tenere presente che, poiché i diametri delle sferuliti sono tipicamente nell'intervallo delle decine di μm, mettere a fuoco all'interno dell'area centrale dell'intera struttura. Cerca aloni bianchi e neri intorno alla sferulite specifica come segni di messa a fuoco inferiore e superiore, rispettivamente. Regolare l'asse "Z" in modo che si trovi tra questi estremi.
    NOTA: È importante trovare un campione isolato senza difetti strutturali. Spheruliti estremamente piccole possono allontanarsi a causa della sollecitazione del materiale introdotta dall'obiettivo, mentre le strutture più grandi sono probabilmente aggregate o altamente distorte.
  3. Centrare la sferulite nel campo visivo del piano microscopico osservato e determinare la dimensione della scansione XY osservando quanti passi del piezostadio nelle direzioni X e Y (visualizzati sul controller del piezostadio o nel suo software) sono necessari per coprire l'area dell'intera struttura.
    NOTA: Si consiglia di impostare il sistema in modo tale che l'inizio della scansione XY si trovi vicino a uno degli angoli della sferulite e coincida con la posizione zero del tavolino (X e Y = 0)
  4. Regolare i seguenti parametri di scansione:
    1. Regolare la polarizzazione del fascio di eccitazione e ruotare la piastra a semionda per ottenere la polarizzazione corrispondente agli assi "X" e "Y" del piano del campione del microscopio.
      NOTA: Questo può essere fatto misurando i grafici polari di un mezzo fluorescente isotropo come la fluoresceina. Per tali materiali, l'intensità massima della fluorescenza è parallela alla polarizzazione del fascio di eccitazione; quindi, ruotando la piastra a semionda si regola la polarizzazione con gli assi X e Y sul piano di osservazione, indicati anche come assi X e Y sui grafici polari come in Figura 4C. I grafici polari completi possono essere misurati raccogliendo l'intensità 2PEF misurata su entrambi i fotodiodi per la rotazione di 180° della piastra a semionda (rotazione di 360° della polarizzazione della luce di eccitazione) e correlando l'intensità con l'angolo di polarizzazione della luce di eccitazione. Potrebbe essere fatto manualmente, misurando l'intensità dell'emissione per ogni angolo di placca a semionda separatamente e quindi assemblandolo in un grafico polare in un software di analisi dei dati o automaticamente, utilizzando un software dedicato o auto-scritto.
    2. Regola i parametri del piezostadio: velocità di scansione, passo e portata per coprire l'area dell'intera sferulite.
      NOTA: L'intervallo di scansione deve essere superiore al diametro della sferulite per inquadrare completamente l'intera sovrastruttura all'interno della scansione raster. La bassa velocità di scansione e il passo consentono agli utenti di ottenere immagini di alta qualità; tuttavia, ciò potrebbe causare la bruciatura del campione. Pertanto, è necessario un compromesso dipendente dalla dimensione della sferulite. Questi parametri non possono essere applicati universalmente. Parametri esemplari utilizzati nella Figura 5A: campo di scansione 45 x 45 μm, passo di scansione 1 μm e velocità di scansione 2 μm/s.
  5. Aprire l'otturatore, accendere i fotodiodi e raccogliere Equation 1 Equation 2 i componenti di emissione 2P per ogni singolo passo dell'area di scansione selezionata, per il fascio di eccitazione polarizzato corrispondentemente agli assi X e quindi Y. Nella Figura 5A sono presentate scansioni raster esemplari di autofluorescenza eccitata a due fotoni (2PAF) di sferuliti di insulina.
    NOTA: La misurazione delle scansioni raster richiede la correlazione delle coordinate dello stadio piezoelettrico con Equation 1 le componenti di emissione raccolte e Equation 2 raccolte, che potrebbe essere eseguita manualmente, misurando l'intensità in ogni singolo punto dell'area selezionata e quindi assemblandola in una matrice 2D, o automaticamente, tramite un software auto-scritto. Le scansioni raster possono essere presentate come una somma dell'intensità e dell'intensità delle componenti di emissione o in modo distintivo per una specifica componente di Equation 1 Equation 2 emissione. Poiché sono altamente dipendenti dalla struttura, le distorsioni strutturali all'interno delle sferuliti sono facilmente visibili. Tuttavia, a causa del movimento del tavolino del microscopio, alcuni campioni potrebbero allontanarsi dal campo visivo. Pertanto, le immagini devono essere sottoposte a screening per rilevare la presenza di artefatti. È necessario controllare la posizione della sferulite prima e dopo la scansione.
  6. Per eseguire l'analisi di polarizzazione completa dal punto specifico del campione, spegnere il fascio di eccitazione.
  7. Successivamente, scegliere le coordinate specifiche del piezostadio corrispondenti alla posizione scelta sulla sferulite in cui sono richieste le informazioni sull'orientamento delle molecole con una risoluzione inferiore al μm.
  8. Regolare il tavolino piezoelettrico per centrare il campo visivo in corrispondenza di quanto indicato (X, Y).
  9. Accendere il fascio di eccitazione ed eseguire l'analisi di polarizzazione completa (360°) e Equation 2 l'emissione attivando Equation 1 la rotazione della piastra a semionda (rotazione di 180°). Presentare le componenti 2PF Ix e Iy sotto forma di grafico polare (come mostrato nella Figura 5B).
    NOTA: questo passaggio può essere ripetuto in punti diversi del campione per raccogliere una quantità sufficiente di dati.

4. Determinazione dell'ordinamento locale delle fibrille all'interno delle sferuliti di insulina bovina

NOTA: Tutti i calcoli numerici connessi all'analisi dei dati sono stati eseguiti utilizzando il linguaggio di programmazione Python e basandosi sulle funzioni disponibili nelle librerie NumPy e SciPy. Per tracciare i dati è necessaria la libreria Matplotlib. Tutti i calcoli si basano su formule presentate nelle informazioni di supporto in uno degli articoli di Obstarczyk et al.6.

  1. Simulare l'intensità della fluorescenza a due fotoni eccitata per la distribuzione specificata di molecole con una direzione selezionata della polarizzazione della luce incidente (indicata con α)
    NOTA: Le formule presentate si basano sull'assunzione di momenti di dipolo paralleli di assorbimento ed emissione di un fluoroforo. Per una discussione di altri casi (ad esempio, diverse direzioni dei momenti di dipolo di assorbimento e di emissione, trasferimento di energia tra i fluorofori), si veda l'articolo di Le Floc'h et al8.
    1. Trova i parametri che tengono conto della variazione del campo elettrico mediante la miscelazione della polarizzazione e gli effetti di depolarizzazione causati dallo specchio dicroico montato in una configurazione:
      1. γ rappresenta il fattore di ampiezza tra la riflettività e Equation 4 la polarizzazione della Equation 3 luce proveniente da uno specchio dicroico.
      2. δ rappresenta lo sfasamento (ellitticità) tra Equation 3 la luce polarizzata e Equation 4 la luce polarizzata.
        NOTA: La corretta definizione di questi due parametri è fondamentale per il successo della caratterizzazione strutturale a causa della loro forte influenza sulla forma dei grafi polari misurati11,18. Nel caso del sistema presentato, entrambi i parametri sono stati determinati durante le misure di ellissometria di uno specchio dicroico applicato in un sistema.
    2. Calcolare i vettori del campo elettrico incidente che si propagano negli assi X e Y di ogni angolo misurato durante la misurazione ps-TPFM utilizzando le equazioni (1-5).
      Equation 5 (1)
      Equation 6 (2)
      Equation 7 (3)
      Equation 8 (4)
      Equation 9 (5)
      NOTA Se l'intensità viene misurata su tutti i 360° con il passo 1°, calcolare i vettori del campo elettrico per tutti i 360°. Tutti gli angoli devono essere espressi in radianti. ρ è collegato alla frequenza ottica ω del campo elettrico simulato (ρ=ω·t) e utilizzato integrato da 0 a 2π durante i calcoli dei vettori di campo elettrico incidente che si propagano negli assi X e Y per ogni angolo α misurato durante la misura ps-TPFM.
    3. Definire le funzioni per i momenti di dipolo di transizione nelle direzioni dei tre assi di un sistema cartesiano secondo le equazioni (6-8):
      Equation 10 (6)
      Equation 11 (7)
      Equation 12 (8)
      NOTA: φ è l'angolo di orientamento dell'asse lungo della fibrilla amiloide nel fotogramma del campione XY. Gli angoli θ e φ sono gli angoli polari e azimutali utilizzati per definire l'orientamento del momento di dipolo di transizione di un fluoroforo.
    4. Utilizzare le funzioni definite al punto 4.1.3. definire le funzioni per Jx (Φ,θ,φ) e JY(Φ,θ,φ), che spiegano il contributo della focalizzazione a luce stretta con obiettivo ad alta apertura numerica alla rivelazione della polarizzazione della fluorescenza in direzione X e Y utilizzando le equazioni (9, 10).
      Equation 13 (9)
      Equation 14 (10)
      NOTA: I fattori K1, K2, K3 sono correlati all'obiettivo del microscopio utilizzato durante la misurazione ps-TPFM. In questi esperimenti, è stato utilizzato un obiettivo apocromatico ad immersione in olio 100x/1.4 NA e i fattori K1, K2, K3 erano rispettivamente 2.945, 0.069 e 1.016.
    5. Definire una funzione per f(Ω), che è una distribuzione angolare molecolare, dipendente dalla semiapertura di un cono fluoroforo Ψ, con spessore variabile ΔΨ; Utilizzare l'equazione (11). La rappresentazione grafica di tutti e tre gli angoli relativi alle fibrille amiloidi è presentata nella Figura 6.
      Equation 15(11)
      NOTA: Fai attenzione mentre scrivi l'esponente: la potenza di 2 funziona sull'argomento della funzione, non sull'intera funzione!
    6. Definire tutti i fattori fWWIJKL come mostrato nelle equazioni (12-21).
      Equation 16 (12)
      Equation 17 (13)
      Equation 18 (14)
      Equation 19 (15)
      Equation 20 (16)
      Equation 21 (17)
      Equation 22 (18)
      Equation 23 (19)
      Equation 24 (20)
      Equation 25 (21)
    7. Calcolare le intensità di Equation 26 fluorescenza eccitata a due fotoni e Equation 27 per ogni angolo misurato (analogamente a quanto indicato al punto 4.1.2) utilizzando le equazioni (22, 23).
      Equation 28Equation 29 = (22)
      Equation 30Equation 31 = (23)
    8. Verificare se la simulazione funziona correttamente utilizzando i seguenti valori di variabili (inseriti nella legenda della Figura 7) e confrontare i risultati ottenuti con la Figura 7A-C.
      NOTA: Tutti i gradi devono essere scritti in radianti.
  2. Adattare le intensità simulate all'intensità dell'autofluorescenza eccitata da due fotoni di sferuliti di insulina bovina raccolte durante le misurazioni di ps-2PFM.
    NOTA: La risoluzione della struttura della sferulite basata su misure ps-2PFM richiede l'utilizzo delle equazioni scritte nel protocollo per simulare l'intensità teorica della fluorescenza eccitata a due fotoni e l'adattamento di tutti i parametri connessi all'ordinamento del fluoroforo molecolare. Richiede iterazioni multiple sui vari valori di Φ, un angolo che descrive la rotazione della fibrilla nel campione del microscopio XY, e ΔΨ, aberrazioni della distribuzione conica del dipolo di emissione Ψ dovute alle rotazioni molecolari nei filamenti per Ψ fisso fino a raggiungere il più alto coefficiente R2 possibile tra l'intensità del segnale di fluorescenza eccitata a due fotoni normalizzata raccolta durante la misurazione e le intensità normalizzate simulate secondo Passaggio 4.1 del protocollo.
    1. Determinare il semiangolo Ψ .
      NOTA: Per le sferuliti di insulina bovina, dovrebbe essere uguale a Ψ = 29°6.
    2. Flusso di lavoro di adattamento:
      1. Scegliere il valore di Φ da 0° a 180° (in Figura 8A e 8B Φ = 16° e 127°, rispettivamente).
      2. Scegliere il valore di ΔΨ da 0° a 90° (nella Figura 8A,B, ΔΨ = 24° e 1°, rispettivamente).
      3. Calcolare Equation 28 (equazione 22) e Equation 30(equazione 23) per l'intero intervallo misurato di angoli θ utilizzando i valori scelti di Φ e ΔΨ.
      4. Confrontare le intensità calcolate durante le simulazioni (entrambe normalizzate al valore massimo di
      5. Calcola Equation 28) con intensità normalizzate di
      6. Calcolare Equation 1 e Equation 2 (entrambi normalizzati al valore massimo di Equation 1) misurati durante la misurazione ps-2PFM.
        NOTA: Negli esperimenti presentati, i coefficienti di correlazione prodotto-momento di Pearson sono stati calcolati utilizzando la funzione "corrcoef" della libreria Python NumPy.
    3. Alla fine, scegliere i valori di Φ e ΔΨ che portano ai coefficienti di correlazione più alti e alla convergenza tra le intensità simulate e il segnale misurato in modo simile a quanto mostrato nella Figura 8.

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Representative Results

Il protocollo presentato fornisce una guida passo dopo passo attraverso la preparazione delle sovrastrutture amiloidi per il test con ps-2PFM, la costruzione del sistema microscopico e le misurazioni del campione appropriato. Tuttavia, prima della serie finale di misurazioni, è fondamentale allineare correttamente gli APD con un riferimento isotropo, che dovrebbe portare alla raccolta di un segnale simmetrico di forma e intensità simili su entrambi i rivelatori (Figura 4C). Anche le differenze minime tra le intensità misurate sui rivelatori sugli assi X e Y dovrebbero essere prese in considerazione in ulteriori misurazioni e, soprattutto, durante l'analisi come fattore di correzione appropriato. Dopo il montaggio, il campione contenente singole sferuliti, dando una caratteristica croce di Malta sul POM come in Figura 2B, e dopo aver eseguito una scansione raster 2PFM, l'immagine dovrebbe apparire simile a quella mostrata in Figura 5A, che è coerente con le scansioni raster 2PFM riportate di sferuliti 6,7 e diverse biomolecole organizzate11,12. Si possono osservare alcuni cambiamenti nella posizione dell'asse con la luminosità più alta, che è correlata al fatto che l'intensità del segnale di fluorescenza dipende fortemente dalla polarizzazione del fascio di eccitazione. Pertanto, è necessario verificare quale posizione della piastra semionda corrisponde all'eccitazione del campione lungo gli assi X (Figura 5A, in alto) e Y (Figura 5A, in basso). Vale anche la pena notare come i grafici polari cambiano durante l'esecuzione di un'analisi di polarizzazione completa da diversi punti selezionati. Al di fuori della sferulite, il grafico polare appare come un insieme di artefatti e picchi casuali di rumore del segnale (Figura 5B, I). Tale grafico può anche indicare la deriva della sferulite tra le misurazioni e richiedere la ricerca di nuove coordinate dell'intera struttura da parte di un'altra scansione raster 2PF. I grafici polari correttamente misurati da posizioni altamente ordinate di sferulite di insulina lungo gli assi X e Y sono mostrati rispettivamente nella Figura 5B II e III. Possono avere forme e geometrie diverse, a seconda dell'orientamento locale e dell'organizzazione dei fluorofori misurati dal punto selezionato7.

L'ultima fase del protocollo è focalizzata sull'analisi dei dati ottenuti utilizzando un algoritmo basato su un modello matematico che combina l'orientamento delle fibre amiloidi nel piano XY Φ, i momenti di dipolo transitorio fluorofori associati Ψ e le loro aberrazioni ΔΨ (Figura 6) con l'intensità Equation 1 e Equation 2 la fluorescenza indotta da due fotoni. Le funzioni correttamente implementate presentate nel protocollo dovrebbero, dopo aver inserito i dati di input appropriati (passaggio 4.9 del protocollo), produrre grafici polari identici a quelli presentati nella Figura 7. Eventuali deviazioni, diverso orientamento dei dati, intensità o forme di simulato Equation 26 e Equation 32indicano errori nel codice. Se il modello funziona, si può procedere all'ultima fase del protocollo: adattare i dati simulati ai dati reali ottenuti dalla misura ps-2PFM. I valori scelti di Φ e ΔΨ con i coefficienti di correlazione più elevati e la convergenza tra le intensità simulate e il segnale misurato dovrebbero portare a immagini simili a quelle mostrate nella Figura 8. Ci dovrebbe essere il miglior adattamento possibile di Equation 26 e Equation 32 funzioni all'orientamento e alla forma complessivi di e Equation 2 e Equation 1 i valori di Φ e ΔΨ dovrebbero corrispondere all'orientamento locale delle fibrille e dei fluorofori nel punto misurato sulla sferulite. Modelli e metodi di fitting simili potrebbero essere utilizzati anche per la determinazione dell'organizzazione locale di altre biomolecole come il DNA11.

Figure 1
Figura 1: Configurazione della microscopia sensibile alla polarizzazione a due fotoni. Schema che mostra la configurazione del microscopio a due fotoni utilizzata per le misure di fluorescenza eccitata a due fotoni sensibili alla polarizzazione delle sferuliti di insulina bovina. Le componenti dell'emissione eccitata a due fotoni polarizzate orizzontalmente e verticalmente (sul piano del campione del microscopio) sono rappresentate rispettivamente con IX e IY. Abbreviazioni: SP = piano campione; O = obiettivo; DM = specchio dicroico; λ/2 = piastra semiondulata; LPF = filtro passa-lungo; BE = espansore di fascio; P = Polarizzatore di glan; Ti: Sa = Titano: sorgente di luce laser zaffiro; M = Specchio; SPF = filtro passa-corto; PBS = divisore di fascio di polarizzazione; L = lente ottica; APD = fotodiodo da valanga. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Schema che mostra la preparazione del vetrino/foto. (A) Schema che mostra la preparazione del campione sigillato; (B) fotografie delle fasi successive per la sigillatura del campione. I: un'aliquota di 100 μL della soluzione di sferulite sul vetrino per microscopia con un pozzetto, II: vetrino coprioggetto caduto sopra la soluzione; III: tenuta ermetica formata da polimero depositato (mountant). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Controllo di qualità delle sferuliti di insulina al microscopio a luce polarizzata. (A1,B1) Modalità campo chiaro e sotto polarizzatori incrociati (A2,B2). Il caratteristico modello a croce di Malta può essere osservato nelle corrispondenti immagini scattate con polarizzatori incrociati. (A) aggregati di sferuliti con distorsioni strutturali, (B) sferulite isolata di alta qualità. Barre di scala = 5 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Test dell'allineamento del sistema ps-2PFM. (A) Immagine concentrica sfocata della fluorescenza della fluoresceina vista senza (A1) e con (A2) specchio dicroico, (B) sferulite fotodanneggiata con fori bruciati derivanti dall'analisi della polarizzazione allungata in punti selezionati lungo le direzioni x e y, (C) Componenti di emissione eccitate a due fotoni in funzione dell'angolo di polarizzazione della luce incidente registrato per un campione isotropo (soluzione di fluoresceina). e denotano le componenti di emissione misurate da fotodiodi a valanga che misurano rispettivamente l'asse di polarizzazione dell'emissione X e Y. Barre di scala = 5 μm (A1,A2), 10 μm (B). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: Scansioni raster 2PFM esemplari e grafici polari da sferulite di insulina label-free. (A) Scansioni raster di intensità 2PF di sferuliti di insulina label-free: polarizzazione della luce di eccitazione: (A1) polarizzazione orizzontale, (A2) polarizzazione verticale ed emissione sono indicate con frecce bianche e il riquadro mostra la stessa sferulite ripresa con un microscopio a luce polarizzata standard con polarizzatori incrociati. (B) Grafici polari derivati da tre punti indicati sulla scansione A1 (B1, I; B2, II; B3, III). Ixe Iyindicano le componenti di emissione misurate dai fotodiodi a valanga che misurano rispettivamente l'asse di polarizzazione dell'emissione X e Y. Abbreviazione: 2PF = fluorescenza a due fotoni. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 6
Figura 6: Distribuzione conica del dipolo di emissione del colorante (semiangolo, Ψ) rispetto all'asse lungo della fibrilla. La linea tratteggiata mostra l'asse lungo delle fibrille. La rotazione della fibrilla nel piano del campione del microscopio XY è descritta dall'angolo. Le aberrazioni di Ψ dovute alle rotazioni molecolari nei filamenti sono descritte da ΔΨ. Questa figura è tratta da Obstarczyk et al6. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 7
Figura 7: Intensità simulata della fluorescenza polarizzata eccitata a due fotoni. Fluorescenza calcolata per (A) Φ = 1°, Ψ = 1°, ΔΨ = 1°; (B) Φ = 1°, Ψ = 30°, ΔΨ = 1°; (C) Φ = 1°, Ψ = 30°, ΔΨ = 60°. Le linee rosse, blu e gialle corrispondono rispettivamente a Equation 26, Equation 32, e Equation 26 + Equation 32. L'angolo Φ descrive la rotazione della fibrilla nel piano del campione del microscopio XY, Ψ - distribuzione conica del dipolo di emissione e ΔΨ- aberrazioni di Ψ dovute alle rotazioni molecolari nei filamenti. Tutti gli altri parametri erano identici in tutti i casi: K1 = 2,945, K2 = 0,069, K3 = 1,016, γ = 0,01 e δ = 0,98845. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 8
Figura 8: Grafici polari di set di dati sperimentali. (A,B) Grafici polari esemplari dopo l'adattamento di due set di dati sperimentali raccolti durante le misurazioni ps-TPFM di sferuliti di insulina bovina. Le componenti di emissione eccitate a due fotoni misurate Equation 1 e Equation 2 a due fotoni per gli assi di polarizzazione dell'emissione X e Y sono presentate rispettivamente con punti rossi e blu; mentre le linee continue presentano le corrispondenti componenti di emissione di fluorescenza eccitate a due fotoni simulate per l'asse Equation 26 di polarizzazione dell'emissione X e Y e Equation 32. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

La microscopia a due fotoni sensibile alla polarizzazione è uno strumento prezioso per studiare l'ordinamento locale delle fibrille all'interno delle sovrastrutture amiloidi, richiedendo solo piccole modifiche alla configurazione multifotone standard. Poiché opera su fenomeni ottici non lineari, è possibile ottenere una ridotta fotoselezione angolare e una maggiore risoluzione assiale rispetto ai metodi di microscopia a fluorescenza eccitata con un fotone. Inoltre, porta a una minore dispersione della luce, a una minore fototossicità e a una penetrazione più profonda del campione rispetto alle tecniche di microscopia a fluorescenza a un fotone19,20. Come abbiamo già dimostrato, è adatto per le misurazioni di aggregati densamente impacchettati di proteine come le sferuliti, che possono essere eseguite in modo privo di marcatura21.

Tuttavia, per utilizzare efficacemente il metodo qui descritto, è necessario prestare attenzione a diverse questioni chiave. A partire dalla preparazione del campione e dalla sua qualità, vale a dire l'incubazione, assicurarsi sempre che le sovrastrutture amiloidi siano cresciute correttamente. Nel caso delle sferuliti, abbiamo utilizzato un microscopio ottico polarizzato con polarizzatori incrociati per localizzare le sferuliti mature, che danno un caratteristico pattern a croce maltese e hanno un raggio di ~5 μm16. Tuttavia, le sferuliti sono eterogenee e all'interno del campione si possono osservare strutture distintive. Pertanto, è fondamentale scegliere specie separate e non distorte. Per quanto riguarda il sistema di misura stesso, è fondamentale controllare la polarizzazione della luce incidente in modo da determinare con precisione la polarizzazione del fascio all'ingresso del corpo del microscopio e ridurre al minimo la depolarizzazione introdotta dagli elementi ottici utilizzati22. Per garantire le migliori prestazioni, si consiglia di utilizzare specchi d'argento di alta qualità e filtri ottici abbinati alle lunghezze d'onda di eccitazione e di emissione della fluorescenza. A causa del ruolo chiave della polarizzazione della luce anche nel percorso di emissione, è essenziale misurare un campione isotropo di riferimento prima della misurazione effettiva. Se il percorso di eccitazione e i rivelatori APD sono allineati correttamente, si dovrebbe vedere un segnale ugualmente intenso su entrambi i rivelatori, come presentato nella Figura 4C. Il riferimento dovrebbe generare una forte fluorescenza eccitata a due fotoni a una potenza laser relativamente bassa per evitare il fotosbiancamento; Abbiamo utilizzato la fluoresceina poiché le sue sezioni d'urto di assorbimento a due fotoni per diverse lunghezze d'onda erano già riportate in letteratura23.

Per determinare correttamente la disposizione delle strutture all'interno delle sferuliti, è necessario dedicare molta attenzione anche all'analisi dei dati. L'assunto di base di questo modello è la collinearità del momento di dipolo di transizione dell'assorbimento e dell'emissione della luce. In base a tale ipotesi, l'allineamento del momento di dipolo di transizione della molecola parallelamente alla polarizzazione della luce incidente consente la sua combinazione con la struttura interna del campione testato, ottenendo la massima intensità di emissione. Il modello dato può anche essere usato come una buona approssimazione per piccole differenze nell'angolo tra i due momenti di dipolo8 , ma richiede ulteriori modifiche per grandi deviazioni. Pertanto, come descritto, alcune ipotesi riguardanti il campione devono essere prese in considerazione a priori per l'imaging e l'analisi dei dati. Nel caso del modello su cui si basano la simulazione e le equazioni utilizzate in questo metodo, la principale fonte di depolarizzazione nel sistema è lo specchio dicroico. Pertanto, prima di procedere con l'analisi dei dati, è necessario determinare i parametri responsabili della depolarizzazione introdotta dallo specchio dicroico a causa del loro impatto sulla forma dei grafi polari raccolti e, di conseguenza, la corretta determinazione dell'organizzazione delle molecole all'interno della struttura esaminata durante il fitting18. Questo diventa un problema chiave, specialmente nel caso di misure per diverse lunghezze d'onda, poiché la variazione dell'ellitticità dello specchio dicroico è distintamente dipendente dalla lunghezza d'onda12. L'induzione della depolarizzazione può influenzare fortemente le caratteristiche del segnale raccolto11. Ultimo ma non meno importante, quando si crea lo script per l'analisi dei dati, si dovrebbe prestare attenzione quando si introducono funzioni e variabili matematiche presentate nell'ultima parte del protocollo. Per evitare errori, concentrati su funzionalità come la chiamata di più funzioni e i parametri globali, che accelereranno anche significativamente il tempo di analisi.

Dovremmo anche menzionare i problemi più comuni che si possono incontrare quando si utilizza il metodo descritto. Il tempo di preparazione del campione dipende molto dalla velocità di indurimento del supporto. Per accelerare questo processo, si consiglia di preparare i campioni in un luogo caldo e asciutto e di sigillare la soluzione di sferulite prima di montarla al microscopio. Le misurazioni eseguite troppo presto possono portare alla desigillatura del vetrino e alla distruzione della lente dell'obiettivo utilizzata. Inoltre, nonostante la corretta preparazione del campione, piccole sferuliti possono galleggiare nella soluzione durante la misurazione a causa dello stress del materiale introdotto dall'obiettivo. Per evitare ciò, si consiglia di eseguire la scansione di strutture isolate di medie dimensioni, poiché quelle più grandi sono comunemente aggregati. Si consiglia di verificare se la sferulite scansionata si è spostata dopo l'acquisizione dei dati, rispetto all'immagine prima di iniziare la misurazione. Inoltre, nonostante il corretto allineamento di tutti gli elementi ottici e dei rivelatori utilizzati per misurare il ps-2PFM, le intensità Equation 1 misurate e Equation 2 del riferimento isotropo possono ancora differire leggermente in intensità. In tal caso, è necessario tenerne conto quando si analizzano i dati delle misurazioni del campione moltiplicando una delle intensità per il fattore di correzione determinato durante le misurazioni di riferimento. Ultimo, ma non meno importante, è possibile che durante la procedura di adattamento, lo script non sia in grado di trovare alcun valore corrispondente di Φ e ΔΨ. Ciò può essere dovuto a diversi fattori: i dati sono stati raccolti da un punto disorganizzato su un campione, ad esempio il nucleo di una sferulite; La struttura studiata non era completamente formata durante l'incubazione; simulazione errata di e Equation 32; utilizzo di Equation 26 parametri di specchio dicroico errati γ e δ; passo troppo grande impostato per gli angoli Φ e ΔΨ tra ogni iterazione durante il montaggio. Nel caso di un punto disorganizzato, si consiglia di provare a raccogliere dati da punti che si trovano più vicini al perimetro della struttura esaminata. Nel caso di una struttura formata in modo incompleto, ripetere l'incubazione o cercare altre strutture nel vetrino. In caso di simulazioni errate, verificare manualmente se modificando i parametri Φ, Ψ e ΔΨ, le intensità Equation 26 simulate e Equation 32 modificare e correggere eventuali errori nel codice. In caso di parametri dello specchio dicroico errati, controllare attentamente i parametri γ e δ dello specchio dicroico utilizzato durante le misurazioni. Nel caso di un passo di grandi dimensioni impostato per gli angoli durante il montaggio, ridurre il passo tra le iterazioni successive a 2º o 1º. Va anche ricordato che in caso di forte disorganizzazione locale della struttura, R2 sarà sempre più basso, spesso nell'intervallo 0,5-0,6. Questo perché il modello presentato descrive molecole altamente ordinate in cui la maggior parte dei momenti di dipolo transitori sono allineati in una direzione simile; Quindi, l'abbinamento di strutture amorfe o altamente disordinate porta a coefficienti di correlazione più bassi. Pertanto, è fondamentale possedere almeno alcune informazioni strutturali sul campione prima della misurazione per analizzare correttamente i dati ottenuti.

Vale anche la pena notare che il metodo presentato possiede diverse limitazioni. L'analisi dei dati potrebbe portare a diversi valori degli angoli Φ e ΔΨ con fattori di correlazione sufficientemente elevati, richiedendo allo sperimentatore di utilizzare le proprie conoscenze ed esperienze per selezionare i valori appropriati. In questo caso, devono essere prese in considerazione le condizioni al contorno, ad esempio che il semiangolo del cono fluoroforo Ψ deve essere sempre maggiore della sua aberrazione ΔΨ. Inoltre, quando si confrontano i nostri dati con la letteratura, vale la pena notare che alcuni articoli descrivono Ψ come un angolo a cono pieno, mentre noi operiamo su un angolo a semicono. Un'altra limitazione è la risoluzione di misurazione, limitata a una risoluzione sub-micron. Per questo motivo, la foto-selettività del sistema e la conseguente determinazione dell'organizzazione locale si basano sul segnale medio delle fibrille eccitate nella macchia focale piuttosto che sulle singole strutture. Inoltre, il campione stesso deve possedere una resa quantica di fluorescenza sufficiente, poiché una lunga esposizione sotto la potenza del laser incidente fs (necessaria per acquisire i dati per i grafici polari) può essere distruttiva e avere un impatto sui risultati.

Nonostante queste difficoltà, riteniamo che il metodo presentato in questo articolo abbia una vasta gamma di applicazioni, per l'imaging label-based e label-free di biostrutture in ambienti idrati e complessi. In precedenza avevamo dimostrato che l'ordinamento locale delle fibrille calcolato dai dati ps-2PEF è correlato con le informazioni derivate dalla microscopia elettronica a trasmissione7. Pertanto, abbiamo confermato la validità di ps-2PEF nel bio-imaging e ampliato ulteriormente le conoscenze sull'ordinamento strutturale delle sovrastrutture amiloidi. Questo metodo può essere applicato per conoscere l'origine della fluorescenza intrinseca osservata nel caso di vari componenti di campioni biologici, come l'autofluorescenza degli aggregati proteici, gli amiloidi. Dati i dati rilevanti sull'orientamento delle direzioni del momento di dipolo di assorbimento/emissione rispetto all'asse lungo delle fibrille amiloidi, le proprietà ottiche delle fibrille possono essere correlate con la loro struttura6. Abbiamo indicato che per le strutture con un angolo Ψ già determinato, questa tecnica consente di rilevare caratteristiche strutturali distinte delle sovrastrutture amiloidi e dei polimorfi delle sovrastrutture dell'insulina in base al livello della loro organizzazione7. Come precedentemente notato nel protocollo, la configurazione presentata potrebbe essere applicata anche per misure di generazione di seconde armoniche sensibili alla polarizzazione, che è anche una tecnica di microscopia a due fotoni label-free24. Ciò richiederà non solo il montaggio di diversi filtri ottici, ma anche la modifica delle formule utilizzate per l'analisi dei dati25. Inoltre, con l'aggiunta di una piastra a quarto d'onda correttamente allineata, potrebbe essere utilizzata per eccitare il campione con luce polarizzata circolarmente, il che potrebbe portare alla generazione di proprietà ottiche chirali non lineari delle amiloidi poiché sono biopolimeri chirali con forti proprietà chirotticheconfermate 26. Tuttavia, in tal caso, il vettore elettrico in costante rotazione porterebbe al costante cambiamento di direzione dell'emissione eccitata, rendendo impossibile determinare qualsiasi informazione strutturale utilizzando le equazioni presentate in questo manoscritto. Nel complesso, ps-2PEF è uno strumento promettente per la determinazione dell'organizzazione all'interno di numerose biostrutture complesse con dipoli di emissione ordinati, come aggregati proteici, DNA o tessuti in modo non invasivo.

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Disclosures

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato sostenuto dal progetto Sonata Bis 9 (2019/34/E/ST5/00276) finanziato dal National Science Centre in Polonia.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sample preparation
Coverslips, 24 x 24 mm Chemland 04-298.202.04
DPX mountant for histology Sigma-Aldrich 6522 Slide mountant
Eppendorf Safe-Lock tubes, 1.5 mL, polypropylene Chemland 02-63102
Eppendorf ThermoMixer C Eppendorf Used for spherulite incubation
HLP 5UV Water purification system Hydrolab Source of dionized water used in sample preparation
Hydrochloric acid (≥37%, APHA ≤10), Sigma-Aldrich 30721-M
Insulin powder from the bovine pancreas (≥25 units/mg (HPLC)) Sigma-Aldrich I5500
Methanol (HPLC grade) Sigma-Aldrich 270474
Microscope slides with a concave, 76 x 26 x 1 mm Chemland 04-296.202.09
Olympus BX60 Olympus Polarized Optical Microscope used in Figure 2
PTFE thread seal tape, 12 mm x 12 mm x 0.1 mm, 60 gm2 Chemland VIT131097
Microscope ps-2PFM setup
Chameleon Ultra II Coherent
FELH0800 - Ø25.0 mm Longpass Filter Thorlabs
FESH0700 - Ø25.0 mm Shortpass Filter Thorlabs
IDQ100 photon-counting avalanche photodiodes  ID Quantique
Multiphoton short-pass emission filter 720 nm  Semrock
Mounted Achromatic Half-Wave Plate, 690-1200 nm Thorlabs
Nikon Plan Apo Oil Immersion 100x/1.4 NA Nikon
piezo 3D stage Piezosystem Jena
Polarizing Beamsplitter Thorlabs
S130C - Slim Photodiode Power Sensor, Si, 400 - 1100 nm, 500 mW Thorlabs
Software
LabView 2018 National Instruments Version 18.0.1f2
Matplotlib library Version 3.3.2
NumPy library Version 1.19.2
SciPy library Version 1.5.2
Spyder Python 3 IDE Version 4.1.5

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References

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Sensibile alla polarizzazione Microscopia a due fotoni Label-free Caratterizzazione strutturale dell'amiloide Esperimenti di bioimaging Fototossicità Penetrazione tissutale Sistemi densamente impacchettati Fotoselezione angolare Fluorofori Analisi di polarizzazione Microscopia a fluorescenza a due fotoni (2PFM) Organizzazione molecolare Metodi di imaging standard Processi ottici lineari 2PFM sensibile alla polarizzazione (ps-2PFM) Ordinamento molecolare Biostrutture complesse Sferuliti amiloidi Malattie neurodegenerative Alzheimer Parkinson aggregati di proteine amiloidi alterato processo di misfolding proteico metodi diagnostici ordinazione locale delle fibrille sferuliti di insulina bovina
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