Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Polarisasjonsfølsom to-foton mikroskopi for en etikettfri amyloid strukturell karakterisering

Published: September 8, 2023 doi: 10.3791/65670
Automatic Translation
1, 1, 1
1Institute of Advanced Materials, Wrocław University of Science and Technology

Summary

Dette papiret beskriver hvordan polarisasjonsfølsom to-foton mikroskopi kan brukes til å karakterisere den lokale organisasjonen innen etikettfrie amyloidoverbygninger-sfærulitter. Den beskriver også hvordan du forbereder og måler prøven, setter sammen det nødvendige oppsettet og analyserer dataene for å få informasjon om den lokale organisasjonen av amyloidfibriller.

Abstract

Sammenlignet med sin en-foton motpart, er to-foton excitasjon gunstig for bioimaging eksperimenter på grunn av sin lavere fototoksisitet, dypere vev penetrasjon, effektiv drift i tettpakkede systemer og redusert vinkelfotoseleksjon av fluoroforer. Dermed gir innføringen av polarisasjonsanalyse i to-foton fluorescensmikroskopi (2PFM) en mer presis bestemmelse av molekylær organisasjon i en prøve sammenlignet med standard bildebehandlingsmetoder basert på lineære optiske prosesser. I dette arbeidet fokuserer vi på polarisasjonsfølsom 2PFM (ps-2PFM) og dens anvendelse i bestemmelsen av molekylær rekkefølge innenfor komplekse biostrukturer-amyloidsfærulitter. Neurodegenerative sykdommer som Alzheimers eller Parkinsons blir ofte diagnostisert ved påvisning av amyloider-proteinaggregater dannet på grunn av en nedsatt proteinfoldingsprosess. Å utforske deres struktur fører til en bedre forståelse av deres skapelsesvei og følgelig til å utvikle mer følsomme diagnostiske metoder. Denne artikkelen presenterer ps-2PFM tilpasset for bestemmelse av lokal fibrilbestilling inne i bovine insulinsfærulitter og sfæriske amyloidogene proteinaggregater. Videre beviser vi at den foreslåtte teknikken kan løse den tredimensjonale organisasjonen av fibriller inne i sfærulitten.

Introduction

I løpet av de siste tiårene, selv om det har vært betydelig utvikling av mange fluorescensmikroskopiteknikker for bioimaging av proteiner og deres aggregater1, har bare noen få blitt brukt til å løse deres lokale bestilling i prøven 2,3. Fluorescens levetid imaging mikroskopi4 ble brukt til å studere den inneboende strukturelle heterogeniteten av amyloid overbygninger-sfærulitter. Videre kan kvantitativ bestemmelse av lokal orden i komplekse og tettpakkede biostrukturer som sfærulitter løses ved hjelp av polarisasjonsfølsomme metoder3. Imidlertid er standard fluorescensteknikker med overfladisk vevspenetrasjon begrenset, siden bruk av UV-VIS-bølgelengder for å eksitere fluoroforer in vivo fører til høy vevslysspredning5. I tillegg krever slik avbildning ofte å designe og binde spesifikke fluorescerende prober til et målrettet biomolekyl, og dermed øke kostnadene og mengden arbeid som trengs for å utføre bildebehandling.

Nylig, for å løse disse problemene, har teamet vårt tilpasset polarisasjonsfølsom to-foton eksitert fluorescensmikroskopi (ps-2PFM) for etikettfri avbildning av biologiske strukturer 6,7. Ps-2PFM tillater måling av avhengigheten av to-foton fluorescensintensitet på retningen av lineær polarisering av eksitasjonsstrålen og analyse av polarisasjonen av den utstrålede fluorescensen8. Implementeringen av denne teknikken krever supplering av standard multi-foton mikroskopoppsett eksitasjonsbane (figur 1) med en halvbølgeplate for å kontrollere lyspolarisasjonsplanet. Deretter opprettes polare grafer, som viser avhengigheten av to-foton eksitert fluorescensintensitet på polarisasjonen av eksitasjonslaserstrålen, fra signaler samlet av to lavinefotodioder, og samler dermed de to, gjensidig vinkelrette komponentene av fluorescenspolarisasjon.

Det siste trinnet er dataanalyseprosessen, med tanke på virkningen av de optiske elementene, for eksempel dikroiske speil eller et høyt numerisk blenderåpningsmål, på polarisasjon. På grunn av naturen til to-foton prosessen, gir denne metoden både redusert vinkelfotoseleksjon og forbedret aksial oppløsning, da to-foton eksitasjon av fluoroforer utenfor fokalplanet er probabilistisk begrenset. Det ble også bevist at lignende metoder med hell kunne implementeres for in vivo-avbildning av nær-infrarøde sonder (NIR) for dypvevsavbildning9. Ps-2PFM har tidligere blitt brukt på bildefluoroforer i cellemembraner10 og DNA11,12, samt ikke-standardiserte fluorescerende markører for biologiske systemer, for eksempel gullnanopartikler13. Men i alle disse eksemplene ble informasjonen om organisering av biomolekyler oppnådd indirekte og krevde en forhåndsdefinert gjensidig orientering mellom en fluorofor og en biomolekyl.

I en av våre siste papirer har vi vist at ps-2PFM kunne brukes til å bestemme den lokale polarisasjonen av autofluorescensen av amyloidoverbygninger og fluorescens fra Thioflavin T, et amyloidspesifikt fargestoff, bundet til amyloidfibriller i sfærulitter6. Videre har vi i en annen vist at ps-2PFM kunne brukes til å oppdage amyloidfibrilorientering inne i amyloidsfærulitter i et submikronstørrelsesregime, som ble bekreftet ved å korrelere det med transmisjonselektronmikroskopi (TEM) avbildning7. Oppnåelsen av dette resultatet var mulig takket være i) inneboende autofluorescens av sfærulitter-amyloider, når de er begeistret med enten en eller to fotoner, utviser inneboende autofluorescens med utslippsmaksima lokalisert i et område fra 450 til 500 nm og to-foton absorpsjonstverrsnitt sammenlignbare med standard fluorescerende fargestoffer14, ii) matematiske modeller introdusert tidligere for å beskrive hvordan ps-2PEF av fargestoffer som merker biologiske membraner og DNA-strukturer kan brukes på fluorescens utvist av sfærulitter og fargestoffer bundet til dem 8,11,15. Før vi går videre med analysen, anbefaler vi derfor å se gjennom den nødvendige teorien beskrevet i begge, hovedteksten og støtteinformasjonen til vårt første papir om dette emnet6. Her presenterer vi protokollen for hvordan man bruker ps-2PFM-teknikken for en etikettfri amyloidstrukturell karakterisering av bovine insulinsfærulitter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Klargjøre mikroskoplysbildene med fullvoksne sfærulitter

MERK: Se materialfortegnelsen for detaljer om alle materialer, reagenser og utstyr som brukes i denne protokollen. Alle løsningene ble fremstilt med avionisert vann (18,2 MΩ·cm ved 25 °C) oppnådd fra vannrensesystemet.

  1. Inkubere amyloid sfærulitter basert på protokollen beskrevet av Krebs et al16. med noen modifikasjoner, som beskrevet nedenfor.
    1. Vei 10 mg insulinpulver i en 1,5 ml tube.
    2. Løs opp pulveret med en 1 ml alikot av den avioniserteH2O/HCl-oppløsningen (pH 1,5).
    3. Forsegl prøven med tapen og legg den i en termisk mikser for å inkubere i 24 timer ved 70 °C (0 o / min).
      MERK: For å utføre avbildning av amyloider i deres opprinnelige (dvs. hydrerte) miljø og forhindre prøvedeformasjon på grunn av dehydrering, er det nødvendig å forberede mikroskoplysbilder i henhold til følgende beskrivelse (skjema vist i figur 2).
  2. Vask mikroskopglasset grundig med vann.
  3. Dypp lysbildene i metanol og la dem tørke under omgivelsesforhold på en støvfri våtserviett.
  4. Ta en 100 μL alikot av sfærulittoppløsningen fra røret med en automatisk pipette (trinn 1.1.2) og legg den til brønnen som ligger i det sentrale området av mikroskoplysbildet.
  5. Dekk til oppløsningen med et deksel, unngå dannelse av luftbobler.
  6. Avleiringsmonteringsmiddel langs kantene på dekselet på lysbildet med en automatisk pipette for å forsegle sfærulittenes opprinnelige løsning.
    MERK: Det er av stor betydning å montere glidemonteringsmiddel på både dekkslip og glideflater. Gjør dette under avtrekkshetten på grunn av giftigheten til det flyktige løsningsmidlet (xylen). Se innfelt i figur 2.
  7. La mikroskopprøven stå under omgivelsesforhold for at monteringsmidlet skal herdes.
    MERK: Herdeprosessen er temperatur- og fuktighetsavhengig, men bør fullføres innen 12 timer.
  8. Sjekk om insulinsfærulitter ble dannet riktig ved hjelp av et polarisert optisk mikroskop (POM) med kryssede polarisatorer. Skann gjennom prøven på jakt etter et karakteristisk mønster av lyse områder, kalt et maltesisk kors, som vist i figur 3.
    MERK: Amyloidsfærulittene kan defineres som sfæriske overbygninger karakterisert ved en heterogen morfologi med en kjerneskallstruktur. I detalj består de av en amorf kjerne og radialt voksende amyloidfibriller16. På grunn av den anisotrope karakteren av sfærulittstrukturer, kan de særegent samhandle med polarisert lys (f.eks. ved brytning) og endre fasen, som lett kan observeres under POM med kryssede polarisatorer. Denne metoden ble brukt til å studere kun fullt utviklede sfærulitter karakterisert ved et modelllignende maltesisk kryssmønster. Følgelig ble aggregater eller strukturelt forvrengte sfærulitter ekskludert fra videre undersøkelser.

2. Bygge og justere systemet

MERK: En skjematisk fremstilling av et polarisasjonsfølsomt to-foton mikroskop finnes i figur 1.

  1. Installer en femtosekund laser med utgangsbølgelengdejusteringen i 690-1,080 nm-området, for eksempel, som opererer på en moduslåst Ti: Safirlaser med ~ 100 fs pulser på 80 MHz repetisjonsfrekvens.
  2. Legg til en halvbølgeplate montert på et rotasjonstrinn til eksitasjonsbanen til oppsettet for å kontrollere polariseringen av det innfallende lyset i XY-mikroskopprøveplanet.
  3. Monter det dikroiske speilet for å kutte av eksitasjonsstrålen fra detekteringsoptikken.
    MERK: De optiske egenskapene til et dikroisk speil skal tillate å reflektere eksitasjonsstrålen (til prøven) i NIR-bølgelengdeområdet og samtidig være gjennomsiktig for bølgelengdeområdet som tilsvarer utslipp fra prøvene.
  4. Installer et piezoelektrisk skannetrinn for rasterskanninger i XY-planet for en valgt Z.
  5. Monter det høye NA-nedsenkingsmålet, for eksempel et apokromatisk oljenedsenkingsmål 100x/1.4 NA.
    MERK: Siden hele oppsettet opererer i en epi-fluorescensmodus, passerer hendelsen og utsendte signaler det samme målet.
  6. I utslippsbanen, legg til en polariserende strålesplitter som deler to-foton eksitert utslipp i to ortogonalt polariserte komponenter (IX og IY)
  7. Installer to fotontellende skredfotodioder (APD) i en konfigurasjon som tillater dem å samle lys overført og reflektert ved hjelp av henholdsvis strålesplitteren (figur 1).
  8. Monter riktige bølgelengdeavhengige avskjæringsfiltre på eksitasjons- og utslippsbanen til systemet, for eksempel et 800 nm langpassfilter direkte i den optiske eksitasjonsbanen og et 700 kortpassfilter i utslippsbanen.
    MERK: Analyser utslippsspektrene fra sfærulitt slik at eventuelle bidrag fra andre harmoniske generasjon (SHG) eller laserlys kan utelukkes ved hjelp av de riktige utslippsfiltrene. Det er også verdt å merke seg at dette systemet også bør tillate målinger av polarisasjonsfølsom SHG, som kan brukes til å løse rekkefølgen av biomolekyler i prøvene. Dataanalysen av SHG-signalet er imidlertid forskjellig fra fluorescens, som mer detaljert ble beskrevet av Aït-Belkacem et al.17.
  9. Juster hele systemet (ved hjelp av justeringsmodusen som er innebygd i mange lasere) til lignende signalintensiteter samles inn ved hjelp av begge fotodiodene.
  10. Sjekk om eksitasjonsstrålen fokusert av det høye NA-målet og avbildet på et kamera har en konsentrisk sirkulær form som presentert i figur 4A.
  11. Juster skannetiden og tilsvarende effekt for å minimere skaden forårsaket av hendelseslaseren på prøven. Eksemplarisk punktlignende brenning er presentert i figur 4B. Mål den nominelle effekten ved hjelp av en digital håndholdt kraftmåler koblet til en fotodiodestrømsensor plassert ved inngangen til mikroskopets kropp.
    MERK: Biologiske prøver kan lett brennes på grunn av laserbelysning. I dette tilfellet ble effektområdet 100-900 μW (i fokuspunktet til objektivlinsen) funnet å være en utmerket avveining mellom prøvestabilitet og intens utslipp.
  12. Før prøvemåling, test kvaliteten på justeringen av optikk med en isotrop referanseprøve (f.eks. fluorescein legemliggjort i den amorfe polymeren). For å utføre kalibreringskontrollen, følg prosedyren beskrevet i avsnitt 3 ved bruk av en isotropisk referanse i stedet for en amyloidprøve.
    MERK: Med en antagelse om at mikroskopioppsettet er ideelt justert for prøven med isotrope egenskaper, bør begge 2P-utslippskomponentene (IX og IY) detektert med to APDer karakteriseres med samme intensitet (figur 4C).

3. Måling av sfærulittene fra storfe

MERK: For å utføre alle de beskrevne ps-2PF-målingene ble det brukt håndskrevet programvare som styrer posisjonene til det piezoelektriske trinnet og halvbølgeplaten og samler signalet fra begge fotodiodene, noe som muliggjør plotting av XY-skanningene (rasterskanninger) fra utvalgte områder på mikroskoplysbilder samt polære grafer fra spesifikke prøvekoordinater. Ytterligere notater er også lagt til protokollen, som vil tillate brukere å utføre målingen uten den, siden både piezo-trinnet og rotasjonstrinnet som brukes til å rotere halvbølgeplaten, kan styres ved hjelp av egne kontrollere eller tilsvarende programvare. Likevel anbefales det sterkt å skrive en algoritme som kombinerer rotasjonsvinkelen til en halvbølgeplate med 2PEF-intensitet samlet med begge fotodioder, siden denne korrelasjonen (polære grafer) er avgjørende for riktig dataanalyse som resulterer i strukturell informasjon.

  1. Monter prøven med sfærulittene på det piezoelektriske stadiet (immobiliser glassglasset med tape). Sørg for å montere den på en måte der en tynn glassside (coverslip) vender mot målet, da høye numeriske mål er preget av relativt korte arbeidsavstander.
    MERK: Når oljenedsenking brukes, bør en liten dråpe mineralolje påføres målet før prøvemontering og fokusering.
  2. Ved å endre XY- og Z-posisjoner ved hjelp av mikroskopknapper, fokuser målet på en av sfærulittene som finnes i løsningen, men vær oppmerksom på at fordi sfærulittdiametre vanligvis ligger i området titalls μm, fokuser du innenfor det sentrale området av hele strukturen. Se etter svarte og hvite glorier rundt de spesifikke sfærulittene som tegn på henholdsvis under- og øvre fokus. Juster "Z"-aksen til å være mellom disse ytterpunktene.
    MERK: Det er viktig å finne en isolert prøve uten strukturelle defekter. Ekstremt små sfærulitter kan drive av på grunn av materialspenningen introdusert av objektivet, mens de største strukturene sannsynligvis er aggregerte eller sterkt forvrengte.
  3. Sentrer sfærulitten i synsfeltet til det observerte mikroskopiske planet og bestem størrelsen på XY-skanningen ved å se på hvor mange piezostage-trinn i X- og Y-retninger (vist på piezostage-kontrolleren eller i programvaren) som trengs for å dekke området av hele strukturen.
    MERK: Det anbefales å stille systemet på en slik måte at begynnelsen av XY-skanningen ligger nær et av hjørnene av sfærulitten og sammenfaller med nullposisjonen til scenen (X og Y = 0)
  4. Juster følgende skanneparametere:
    1. Juster polarisasjonen til eksitasjonsstrålen, og roter halvbølgeplaten for å oppnå polarisasjonen som tilsvarer "X" og "Y" -aksene i mikroskopprøveplanet.
      MERK: Dette kan gjøres ved å måle polargrafene til isotropt fluorescerende medium som fluorescein. For slike materialer er maksimal fluorescensintensitet parallell med eksitasjonsstrålepolarisasjonen; Dermed justerer rotering av halvbølgeplaten polarisasjonen med X- og Y-aksen på observasjonsplanet, også betegnet som X- og Y-akse på polære grafer som i figur 4C. Full polargrafer kan måles ved å samle den målte 2PEF-intensiteten på begge fotodiodene for 180 ° rotasjon av halvbølgeplaten (360 ° rotasjon av eksitasjonslyspolarisasjon) og korrelere intensiteten med eksitasjonslyspolarisasjonsvinkelen. Det kan gjøres manuelt ved å måle utslippsintensiteten for hver halvbølgeplatevinkel separat og deretter sette den sammen til en polargraf i dataanalyseprogramvare eller automatisk, ved hjelp av dedikert eller selvskrevet programvare.
    2. Juster piezostageparametrene: skannehastighet, trinn og rekkevidde for å dekke området av hele sfærulittene.
      MERK: Skanneområdet må være høyere enn sfærulittdiameteren for å fullstendig ramme inn hele overbygningen i rasterskanningen. Lav skannehastighet og trinn tillater brukere å få bilder av høy kvalitet; Dette kan imidlertid føre til prøvebrenning. Derfor er det nødvendig med en avveining avhengig av sfærulittstørrelsen. Disse parametrene kan ikke brukes universelt. Eksempler på parametere brukt i figur 5A: skanneområde 45 x 45 μm, skannetrinn 1 μm og skannehastighet 2 μm/s.
  5. Åpne lukkeren, slå på fotodiodene og samle Equation 1 og Equation 2 2P-utslippskomponenter for hvert enkelt trinn i det valgte skanneområdet - for eksitasjonsstrålen polarisert tilsvarende X og deretter Y-aksene. Eksempler på to-foton eksitert autofluorescens (2PAF) rasterskanninger av insulinsfærulitter er presentert i figur 5A.
    MERK: Måling av rasterskanninger krever korrelering av piezo-trinnskoordinater med Equation 1 og Equation 2 innsamlede utslippskomponenter, noe som kan gjøres manuelt, ved å måle intensiteten i hvert enkelt punkt i det valgte området og deretter sette det sammen i en 2D-matrise, eller automatisk, via selvskrevet programvare. Rasterskanninger kan presenteres som en summering av Equation 1 og Equation 2 utslippskomponentenes intensitet eller særegent for en bestemt utslippskomponent. Siden de er svært strukturavhengige, er strukturelle forvrengninger i sfærulitter lett synlige. På grunn av bevegelsen av mikroskoptrinnet kan imidlertid noen prøver drive av fra synsfeltet. Derfor må bilder screenes for artefakter. Det er nødvendig å kontrollere posisjonen til sfærulitten før og etter skanningen.
  6. For å utføre full polarisasjonsanalyse fra det spesifikke stedet på prøven, slå av eksitasjonsstrålen.
  7. Deretter velger du spesifikke koordinater for piezostage som svarer til det valgte stedet på sfærulitten der informasjonen om orienteringen av molekyler er nødvendig med sub-μm-oppløsningen.
  8. Juster det piezoelektriske trinnet for å sentrere synsfeltet på indikert (X, Y).
  9. Slå på eksitasjonsstrålen og utfør full (360°) polarisasjonsanalyse av Equation 1 og Equation 2 utslipp ved å slå på rotasjonen av halvbølgeplaten (180° rotasjon). Presenter 2PF-, Ix- og Iy-komponenter i form av en polargraf (som vist i figur 5B).
    MERK: Dette trinnet kan gjentas på forskjellige steder i prøven for å samle inn en tilstrekkelig mengde data.

4. Bestemmelse av lokal fibrilbestilling inne i bovine insulinsfærulitter

MERK: Alle numeriske beregninger knyttet til dataanalysen ble gjort ved hjelp av programmeringsspråket Python og basert på funksjonene som er tilgjengelige i bibliotekene NumPy og SciPy. Plotting av dataene krever Matplotlib-biblioteket. Alle beregninger er basert på formler presentert i støtteinformasjon i en av artiklene av Obstarczyk et al.6.

  1. Simulering av intensiteten av to-foton fluorescens opphisset for den spesifiserte fordeling av molekyler med en valgt retning av den innfallende lyspolarisasjonen (betegnet med α)
    MERK: De presenterte formlene er basert på antagelsen om parallelle absorpsjons- og utslippsdipolmomenter av en fluorofor. For en diskusjon av andre tilfeller (f.eks. forskjellige retninger av absorpsjons- og utslippsdipolmomentene, energioverføring mellom fluoroforene), se artikkelen av Le Floc'h et al8.
    1. Finn parametrene som står for variasjonen i det elektriske feltet ved polarisasjonsblanding og depolarisasjonseffekter forårsaket av det dikroiske speilet montert i et oppsett:
      1. γ representerer amplitudefaktoren mellom reflektiviteten Equation 3 til og Equation 4 polarisert lys fra et dikroisk speil.
      2. δ representerer faseforskyvningen (elliptisitet) mellom Equation 3 og Equation 4 polarisert lys.
        MERK: Korrekt definisjon av disse to parametrene er avgjørende for vellykket strukturell karakterisering på grunn av deres sterke innflytelse på formen på målte polære grafer11,18. I tilfelle av det presenterte systemet ble begge parametrene bestemt under ellipsometrimålinger av et dikroisk speil påført i et system.
    2. Beregne de innfallende elektriske feltvektorene som forplanter seg i X- og Y-aksene i alle vinkler målt under ps-TPFM-målingen ved hjelp av ligninger (1-5).
      Equation 5 (1)
      Equation 6 (2)
      Equation 7 (3)
      Equation 8 (4)
      Equation 9 (5)
      MERK Hvis intensiteten måles over hele 360° med trinn 1°, beregner du elektriske feltvektorer for alle 360°. Alle vinkler skal være i radianer. ρ-parameteren er koblet til optisk frekvens ω for det simulerte elektriske feltet (ρ=ω·t) og brukt integrert fra 0 til 2π under beregningene av de innfallende elektriske feltvektorene som forplanter seg i X- og Y-aksen for hver vinkel α målt under ps-TPFM-målingen.
    3. Definer funksjonene for overgangsdipolmomenter i retninger av tre akser i et kartesisk system i henhold til ligninger (6-8):
      Equation 10 (6)
      Equation 11 (7)
      Equation 12 (8)
      MERK: φ er orienteringsvinkelen til den lange amyloidfibrilaksen i XY-prøverammen. θ og φ vinkler er polar- og asimutvinklene som brukes til å definere overgangsdipolmomentorienteringen til en fluorofor.
    4. Bruk funksjonene som er definert i trinn 4.1.3. å definere funksjoner for Jx (Φ,θ,φ) og JY(Φ,θ,φ), som står for bidraget fra tett lysfokusering med høy numerisk blenderåpning til fluorescenspolarisasjonsdeteksjonen i X- og Y-retning ved hjelp av ligninger (9, 10).
      Equation 13 (9)
      Equation 14 (10)
      MERK: K1, K2, K3 faktorer er relatert til mikroskopmålet som brukes under ps-TPFM-målingen. I disse forsøkene ble et apokromatisk oljenedsenkingsmål 100x/1.4 NA brukt og K1, K2, K3 faktorer var henholdsvis 2.945, 0.069 og 1.016.
    5. Definer en funksjon for f (Ω), som er en molekylær vinkelfordeling, avhengig av halv blenderåpning av en fluoroforkegle Ψ, med en variabel tykkelse ΔΨ; Bruk ligning (11). Den grafiske fremstillingen av alle tre vinkler vedrørende amyloidfibriller er presentert i figur 6.
      Equation 15(11)
      MERK: Vær forsiktig når du skriver eksponenten-kraften til 2 fungerer på funksjonen argumentet, ikke hele funksjonen!
    6. Definer allef WWIJKL-faktorer som vist i ligninger (12-21).
      Equation 16 (12)
      Equation 17 (13)
      Equation 18 (14)
      Equation 19 (15)
      Equation 20 (16)
      Equation 21 (17)
      Equation 22 (18)
      Equation 23 (19)
      Equation 24 (20)
      Equation 25 (21)
    7. Beregn to-foton eksitert fluorescensintensitet Equation 26 og Equation 27 for hver målt vinkel (tilsvarende som i punkt 4.1.2) ved hjelp av ligninger (22, 23).
      Equation 28Equation 29 = (22)
      Equation 30Equation 31 = (23)
    8. Sjekk om simuleringen fungerer riktig ved å bruke følgende variabelverdier (plassert i forklaringen til figur 7) og sammenlign de oppnådde resultatene med figur 7A-C.
      MERK: Alle grader skal skrives i radianer.
  2. Tilpass de simulerte intensitetene til intensiteten av to-foton-eksitert autofluorescens av bovine insulinsfærulitter samlet under ps-2PFM-målinger.
    MERK: Oppløsning av sfærulittstrukturen basert på ps-2PFM-målinger krever bruk av ligningene skrevet i protokollen for å simulere den teoretiske intensiteten til to-foton eksitert fluorescens og montering av alle parametrene som er koblet til rekkefølgen av molekylær fluorofor. Det krever flere iterasjoner over de forskjellige verdiene av Φ, en vinkel som beskriver rotasjonen av fibrillen i XY-mikroskopprøven, og ΔΨ, avvik fra den koniske fordelingen av emisjonsdipolen Ψ på grunn av molekylære rotasjoner i filamenter for fast Ψ til den når høyest mulig R 2-koeffisient mellom normalisert to-foton eksitert fluorescenssignalintensitet samlet under måling og normaliserte intensiteter simulert i henhold til Trinn 4.1 i protokollen.
    1. Bestem Ψ-halvvinkelen.
      MERK: For bovine insulinsfærulitter skal den være lik Ψ = 29°6.
    2. Montering av arbeidsflyt:
      1. Velg verdien av Φ fra 0° til 180° (i figur 8A og 8B Φ = henholdsvis 16° og 127°).
      2. Velg verdien av ΔΨ fra 0° til 90° (i figur 8A,B, ΔΨ = henholdsvis 24° og 1°).
      3. Beregn Equation 28 (ligning 22) og Equation 30(ligning 23) for hele det målte området av θ-vinkler ved å bruke de valgte verdiene av Φ og ΔΨ.
      4. Sammenlign intensitetene beregnet under simuleringer (begge normalisert til maksimumsverdien av
      5. Beregn Equation 28) med normaliserte intensiteter på
      6. Beregn Equation 1 og Equation 2 (begge normalisert til maksimumsverdien av Equation 1) målt under ps-2PFM-måling.
        MERK: I de presenterte forsøkene ble Pearsons produktmomentkorrelasjonskoeffisienter beregnet ved hjelp av "corrcoef" -funksjonen fra NumPy Python-biblioteket.
    3. Til slutt velger du verdiene til Φ og ΔΨ som fører til de høyeste korrelasjonskoeffisientene og konvergensen mellom de simulerte intensitetene og målt signal som ligner på det som er vist i figur 8.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Den presenterte protokollen gir trinnvis veiledning gjennom fremstilling av amyloidoverbygninger for testing med ps-2PFM, konstruksjon av det mikroskopiske systemet og målinger av riktig prøve. Før det endelige settet med målinger er det imidlertid viktig å justere APD-ene riktig med en isotropisk referanse, noe som skal resultere i å samle et symmetrisk signal med lignende form og intensitet på begge detektorene (figur 4C). Selv minimale forskjeller mellom intensitetene målt på detektorene i X- og Y-aksene bør tas i betraktning ved ytterligere målinger og spesielt under analysen som en passende korreksjonsfaktor. Etter montering skal prøven som inneholder enkle sfærulitter, noe som gir et karakteristisk maltesisk kryss på POM som i figur 2B, og etter å ha utført en 2PFM rasterskanning, skal bildet ligne på det som er vist i figur 5A, noe som stemmer overens med rapporterte 2PFM rasterskanninger av sfærulitter 6,7 og forskjellige organiserte biomolekyler11,12. Man kan observere noen endringer i plasseringen av aksen med høyest lysstyrke, noe som er relatert til det faktum at fluorescenssignalintensiteten sterkt avhenger av polariseringen av eksitasjonsstrålen. Derfor er det nødvendig å verifisere hvilken posisjon av halvbølgeplaten som tilsvarer eksitasjonen av prøven langs X-aksene (figur 5A, øverst) og Y (figur 5A, nederst). Det er også verdt å merke seg hvordan polære grafer endres mens du utfører en full polarisasjonsanalyse fra forskjellige utvalgte steder. Utenfor sfærulittene ser polargrafen ut som en samling artefakter og tilfeldige signalstøytopper (figur 5B, I). En slik graf kan også indikere driften av sfærulitten mellom målinger og kreve å finne nye koordinater for hele strukturen ved en annen 2PF rasterskanning. Korrekt målte polargrafer fra høyt ordnede steder av insulinsfærulitt langs X- og Y-aksene er vist i henholdsvis figur 5B, II og III. De kan ha forskjellige former og geometrier, avhengig av lokal orientering og organisering av fluoroforer målt fra det valgte punktet7.

Det siste trinnet i protokollen er fokusert på analysen av de oppnådde dataene ved hjelp av en algoritme basert på en matematisk modell som kombinerer orienteringen av amyloidfibre i XY-planet Φ, de tilhørende fluorofortransiente dipolmomentene Ψ og deres avvik ΔΨ (figur 6) med intensitet Equation 1 og Equation 2 to-foton indusert fluorescens. Korrekt implementerte funksjoner presentert i protokollen skal, etter å ha lagt inn de aktuelle inngangsdataene (protokolltrinn 4.9), produsere identiske polære grafer som de som presenteres i figur 7. Eventuelle avvik - forskjellig dataretning, intensiteter eller former for simulerte og Equation 32-indikere Equation 26 feil i koden. Hvis modellen fungerer, kan man gå videre til det siste trinnet i protokollen som tilpasser de simulerte dataene til ekte data hentet fra ps-2PFM-målingen. Valgte verdier av Φ og ΔΨ med de høyeste korrelasjonskoeffisientene og konvergens mellom simulerte intensiteter og målt signal skal føre til lignende bilder som vist i figur 8. Det skal være best mulig tilpasning av Equation 26 og Equation 32 funksjoner til den generelle orienteringen og formen på Equation 1 og Equation 2 og verdiene av Φ og ΔΨ skal tilsvare den lokale orienteringen av fibriller og fluoroforer i det målte punktet på sfærulitt. Lignende modeller og tilpasningsmetoder kan også brukes til bestemmelse av den lokale organisasjonen av andre biomolekyler som DNA11.

Figure 1
Figur 1: To-foton polarisasjonssensitivt mikroskopioppsett. Skjema som viser to-foton mikroskopoppsettet som brukes til polarisasjonsfølsomme to-foton eksiterte fluorescensmålinger av bovine insulin sfærulitter. To-foton eksitert utslipp horisontalt og vertikalt polariserte (til mikroskopprøveplan) komponenter er avbildet med henholdsvis IX og IY. Forkortelser: SP = prøveplan; O = objektiv; DM = dikroisk speil; λ/2 = halvbølgeplate; LPF = langpassfilter; BE = stråleutvider; P = Glan polarisator; Ti: Sa = Titan: safir laser lyskilde; m = speil; SPF = kortpassfilter; PBS = polarisasjonsstrålesplitter; L = optisk linse; APD = skredfotodiode. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Skjema som viser lysbildeforberedelsen/bildet. a) skjema som viser klargjøring av den forseglede prøven, (B) fotografier av de påfølgende trinnene for prøveforseglingen. I: en 100 μL alikot av sfærulittoppløsningen på mikroskopilysbildet med en brønn, II: dekselslip falt på toppen av løsningen; III: tett forsegling dannet av avsatt polymer (monteringsmiddel). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Kvalitetskontroll av insulinsfærulittene under et polarisert lysmikroskop. (A1,B1) Brightfield-modus så vel som under (A2,B2) kryssede polarisatorer. Karakteristisk maltesisk kryssmønster kan observeres på de tilsvarende bildene tatt med kryssede polarisatorer. (A) Sfærulitter aggregater med strukturelle forvrengninger, (B) høykvalitets isolert sfærulitt. Skalastenger = 5 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Testing av justeringen av ps-2PFM-systemet. (A) Konsentrisk defokusert bilde av fluoresceinfluorescensen sett uten (A1) og med (A2) dikroisk speil, (B) fotoskadet sfærulitt med brente hull som oppstår på grunn av den langstrakte polarisasjonsanalysen i utvalgte punkter langs x- og y-retninger, (C) to-foton eksiterte emisjonskomponenter i avhengighet av innfallende lyspolarisasjonsvinkel som registrert for en isotrop prøve (fluoresceinløsning). og betegne utslippskomponenter målt med skredfotodioder som måler henholdsvis X- og Y-utslippspolarisasjonsaksen. Skalastenger = 5 μm (A1,A2), 10 μm (B). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Eksemplariske 2PFM-rasterskanninger og polare grafer fra etikettfrie insulinsfærulitter. (A) 2PF intensitet rasterskanninger av etikettfrie insulinsfærulitter: polarisering av eksitasjonslys: (A1) horisontal polarisasjon, (A2) vertikal polarisasjon og utslipp er betegnet med hvite piler, og innsatsen viser den samme sfærulitten avbildet under et standard polarisert lysmikroskop med kryssede polarisatorer. (B) Polære grafer avledet fra tre flekker angitt på A1-skanningen (B1, I; B2, II; B3, III). Ixog Iybetegner utslippskomponenter målt med skredfotodioder som måler henholdsvis X- og Y-utslippspolarisasjonsaksen. Forkortelse: 2PF = to-foton fluorescens. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: Konisk fordeling av emisjonsdipolen til fargestoffet (halv vinkel, Ψ) i forhold til den lange fibrilaksen. Den stiplede linjen viser den lange fibrilaksen. Rotasjonen av fibrillen i XY-mikroskopprøveplanet er beskrevet av vinkelen. Aberrasjoner av Ψ på grunn av molekylære rotasjoner i filamenter er beskrevet av ΔΨ. Denne figuren er fra Obstarczyk et al6. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 7
Figur 7: Simulert intensitet av polarisert to-foton eksitert fluorescens. Fluorescens beregnet for (A) Φ = 1°, Ψ = 1°, ΔΨ = 1°; (b) φ = 1°, ψ = 30°, δψ = 1°; (c) φ = 1°, ψ = 30°, δψ = 60°. Røde, blå og gule linjer tilsvarer Equation 26henholdsvis , Equation 32, og Equation 26 +Equation 32. Φ-vinkelen beskriver rotasjonen av fibrillen i XY-mikroskopprøveplanet, Ψ-konisk fordeling av emisjonsdipolen og ΔΨ- avvik av Ψ på grunn av molekylære rotasjoner i filamenter. Alle andre parametere var identiske i alle tilfeller: K1 = 2,945, K2 = 0,069, K3 = 1,016, γ = 0,01 og δ = 0,98845. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 8
Figur 8: Polære grafer av eksperimentelle datasett. (A,B) Eksempler på polargrafer etter montering av to eksperimentelle datasett samlet inn under ps-TPFM-målinger av bovine insulinsfærulitter. Målte Equation 1 og Equation 2 to-foton eksiterte utslippskomponenter for X- og Y-utslippspolarisasjonsakse presenteres med henholdsvis røde og blå prikker; I mellomtiden presenterer faste linjer de tilsvarende simulerte to-foton eksiterte fluorescensutslippskomponentene for X- og Y-utslippspolarisasjonsakse Equation 26 og Equation 32. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Polarisasjonsfølsom to-foton mikroskopi er et verdifullt verktøy for å studere lokal rekkefølge av fibriller inne i amyloidoverbygningene, og krever bare små modifikasjoner av standard multifotonoppsett. Siden den opererer på ikke-lineære optiske fenomener, kan redusert vinkelfotoseleksjon og forbedret aksial oppløsning oppnås sammenlignet med en-foton eksitert fluorescensmikroskopimetoder. I tillegg fører det til lavere lysspredning, lavere fototoksisitet og dypere prøvepenetrasjon sammenlignet med en-foton eksitasjonsfluorescensmikroskopiteknikker19,20. Som vi allerede har bevist, er den velegnet til målinger av tettpakkede aggregater av proteiner som sfærulitter, som kan utføres på en etikettfri måte21.

For å effektivt bruke metoden beskrevet her, bør det imidlertid tas hensyn til flere viktige problemer. Fra og med prøvepreparering og dens kvalitet, nemlig inkubasjon, sørg alltid for at amyloide overbygninger har vokst riktig. Når det gjelder sfærulitter, brukte vi et polarisert optisk mikroskop med kryssede polarisatorer for å lokalisere modne sfærulitter, som gir et karakteristisk maltesisk kryssmønster, og har en radius på ~ 5 μm16. Imidlertid er sfærulitter heterogene, og særegne strukturer kan observeres i prøven. Derfor er det avgjørende å plukke separerte og ikke-forvrengte arter. Når det gjelder selve målesystemet, er det avgjørende å kontrollere polarisasjonen av innfallende lys slik at polarisasjonen av strålen ved inngangen til mikroskoplegemet skal bestemmes nøyaktig og depolariseringen introdusert av de optiske elementene som brukes, bør minimeres22. For å sikre best mulig ytelse anbefaler vi å bruke sølvspeil av høy kvalitet og optiske filtre som passer til eksitasjons- og fluorescensutslippsbølgelengder. På grunn av nøkkelrollen til lyspolarisasjon også i utslippsbanen, er det viktig å måle en isotrop referanseprøve før selve målingen. Hvis eksitasjonsbanen og APD-detektorene er riktig justert, bør man se et like intenst signal på begge detektorene som presentert i figur 4C. Referanse skal generere en sterk to-foton eksitert fluorescens ved relativt lav lasereffekt for å unngå fotobleking; Vi brukte fluorescein siden tverrsnittene av to-foton absorpsjon for forskjellige bølgelengder allerede var rapportert i litteraturen23.

For å bestemme arrangementet av strukturer inne i sfærulittene, bør det også legges stor vekt på dataanalyse. Den grunnleggende antagelsen for denne modellen er kollineariteten til overgangsdipolmomentet for lysabsorpsjon og utslipp. Under denne antagelsen tillater justering av molekylets overgangsdipolmoment parallelt med polarisasjonen av det innfallende lyset kombinasjonen med den indre strukturen til den testede prøven, noe som gir den høyeste utslippsintensiteten. Den gitte modellen kan også brukes som en god tilnærming for små forskjeller i vinkelen mellom de to dipolmomentene8 , men krever ytterligere modifikasjoner for store avvik. Som beskrevet må det derfor tas hensyn til noen forutsetninger om utvalget a priori til avbildning og dataanalyse. I modelltilfellet som simuleringen og ligningene som brukes i denne metoden er basert, er hovedkilden til depolarisering i systemet det dikroiske speilet. Derfor, før du fortsetter med dataanalysen, er det nødvendig å bestemme parametrene som er ansvarlige for depolariseringen introdusert av det dikroiske speilet på grunn av deres innvirkning på formen på de innsamlede polære grafene og følgelig riktig bestemmelse av organisasjonen av molekylene i den undersøkte strukturen under montering18. Dette blir et sentralt problem, spesielt ved målinger for flere bølgelengder, siden endringen i elliptisiteten til det dikroiske speilet er utpreget bølgelengdeavhengig12. Induksjon av depolarisering kan sterkt påvirke egenskapene til det innsamlede signalet11. Sist men ikke minst, når man lager skriptet for dataanalyse, bør man være oppmerksom når man introduserer matematiske funksjoner og variabler presentert i den siste delen av protokollen. For å unngå feil, fokuser på funksjoner som flere funksjonskall og globale parametere, noe som også vil øke hastigheten på analysetiden betydelig.

Vi bør også nevne de vanligste problemene man kan støte på når man bruker den beskrevne metoden. Prøveprepareringstiden er veldig avhengig av hastigheten på monteringsherdingen. For å øke hastigheten på dette, anbefaler vi at prøvene fremstilles på et varmt, tørt sted og sfærulittoppløsningen forsegles før den monteres i et mikroskop. Målinger som utføres for tidlig, kan føre til forsegling av lysbildet og ødeleggelse av den brukte objektivlinsen. I tillegg, til tross for riktig prøvepreparering, kan små sfærulitter flyte i løsningen under målingen på grunn av materialspenningen som innføres av målet. For å unngå dette, anbefaler vi å skanne isolerte mellomstore strukturer, siden de største ofte er aggregater. Det anbefales å sjekke om den skannede sfærulitten har beveget seg etter datainnsamling, sammenlignet med bildet før du starter målingen. I tillegg, til tross for riktig justering av alle optiske elementer og detektorer som brukes til å måle ps-2PFM, kan de målte intensitetene Equation 1 og Equation 2 den isotrope referansen fortsatt variere noe i intensitet. I et slikt tilfelle er det nødvendig å ta hensyn til dette ved analyse av dataene fra prøvemålingene ved å multiplisere en av intensitetene med korreksjonsfaktoren bestemt under referansemålingene. Sist, men ikke minst, er det mulig at skriptet under tilpasningsprosedyren ikke vil kunne finne noen samsvarende verdier av Φ og ΔΨ. Dette kan skyldes flere faktorer-data ble samlet inn fra et uorganisert sted på en prøve, for eksempel kjernen i en sfærulitt; den studerte strukturen ble ikke fullt dannet under inkubasjon; feil simulering av og Equation 32; bruk av Equation 26 feil dikroiske speilparametere γ og δ; for stort trinnsett for Φ- og Δ Ψ-vinkler mellom hver iterasjon under tilpasning. I tilfelle av et uorganisert sted, anbefaler vi å prøve å samle inn data fra punkter som ligger nærmere omkretsen av den undersøkte strukturen. I tilfelle av en ufullstendig dannet struktur, gjenta inkubasjonen eller søk lysbildet etter andre strukturer. Ved feilsimuleringer, kontroller manuelt om ved å endre parametrene Φ, Ψ og ΔΨ, de simulerte intensitetene Equation 26 og Equation 32 endre og korrigere eventuelle feil i koden. Ved feil dikroiske speilparametere, kontroller nøye γ og δ parametrene til det dikroiske speilet som ble brukt under målingene. Hvis du angir et stort trinn for vinklene under tilpasning, reduserer du trinnet mellom påfølgende iterasjoner til 2º eller 1º. Det skal også huskes at i tilfelle sterk lokal uorganisering av strukturen, vil R2 alltid være lavere, ofte i området 0, 5-0, 6. Dette skyldes at den presenterte modellen beskriver høyt ordnede molekyler der de fleste av de forbigående dipolmomentene er justert i en lignende retning; Derfor fører matchende amorfe eller svært uordnede strukturer til lavere korrelasjonskoeffisienter. Derfor er det avgjørende å ha minst litt strukturell informasjon om prøven før målingen for å analysere de oppnådde dataene riktig.

Det er også verdt å merke seg at den presenterte metoden har flere begrensninger. Dataanalyse kan resultere i flere verdier av Φ og ΔΨ vinkler med høye nok korrelasjonsfaktorer, noe som krever at eksperimentøren bruker sin kunnskap og erfaring til å velge passende verdier. I dette tilfellet må grensebetingelsene tas i betraktning, for eksempel at fluoroforkeglehalvvinkelen Ψ alltid må være større enn dens aberrasjon ΔΨ. I tillegg, når vi sammenligner våre data med litteraturen, er det verdt å merke seg at noen papirer beskriver Ψ som en fullkjeglevinkel, mens vi opererer på en halvkeglevinkel. En annen begrensning er måleoppløsningen, begrenset til en submikronoppløsning. På grunn av dette er fotoselektiviteten til systemet og den resulterende lokale organisasjonsbestemmelsen basert på det gjennomsnittlige signalet fra fibriller eksitert i fokuspunktet i stedet for enkeltstrukturer. Videre må prøven selv ha tilstrekkelig fluorescens kvanteutbytte, så lenge eksponering under fs innfallende laserkraft (nødvendig for å skaffe data for polare grafer) kan være ødeleggende og påvirke resultatene.

Til tross for disse vanskelighetene tror vi at metoden som presenteres i dette papiret har et bredt spekter av applikasjoner, for etikettbasert og etikettfri avbildning av biostrukturer i hydrerte og komplekse miljøer. Vi hadde tidligere vist at lokal fibrilbestilling beregnet ut fra ps-2PEF-data korrelerer med informasjon fra transmisjonselektronmikroskopi7. Derfor bekreftet vi gyldigheten av ps-2PEF i bioavbildning og utvidet kunnskapen om strukturell rekkefølge av amyloidoverbygninger. Denne metoden kan brukes til å lære om opprinnelsen til inneboende fluorescens observert i tilfelle av forskjellige komponenter i biologiske prøver, for eksempel autofluorescens av proteinaggregater-amyloider. Gitt relevante data om orienteringen av absorpsjons-/emisjonsdipolmomentretninger med hensyn til amyloidfibrillers lange akse, kan fibrillenes optiske egenskaper korreleres med deres struktur6. Vi indikerte at for strukturer med en allerede bestemt Ψ-vinkel , tillater denne teknikken deteksjon av forskjellige strukturelle trekk ved amyloidoverbygninger og polymorfer av insulinoverbygninger basert på organisasjonsnivået7. Som tidligere nevnt i protokollen, kan det presenterte oppsettet også brukes for polarisasjonsfølsomme andre harmoniske generasjonsmålinger, som også er en etikettfri to-foton mikroskopiteknikk24. Dette vil kreve ikke bare montering av forskjellige optiske filtre, men også endring av formlene som brukes til dataanalyser25. Videre, med tillegg av en riktig justert kvartbølgeplate, kan den brukes til å opphisse prøven med sirkulært polarisert lys, noe som kan føre til generering av kirale ikke-lineære optiske egenskaper av amyloider siden de er kirale biopolymerer med bekreftede sterke chiroptiske egenskaper26. I et slikt tilfelle vil imidlertid den konstant roterende elektriske vektoren føre til den stadig skiftende retningen av den opphissede utslippet, noe som gjør det umulig å bestemme strukturell informasjon ved hjelp av ligningene som presenteres i dette manuskriptet. Alt i alt er ps-2PEF et lovende verktøy for bestemmelse av organisasjonen innenfor mange komplekse biostrukturer med bestilte utslippsdipoler, for eksempel proteinaggregater, DNA eller vev på en ikke-invasiv måte.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter å opplyse.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av Sonata Bis 9-prosjektet (2019/34/E/ST5/00276) finansiert av National Science Centre i Polen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sample preparation
Coverslips, 24 x 24 mm Chemland 04-298.202.04
DPX mountant for histology Sigma-Aldrich 6522 Slide mountant
Eppendorf Safe-Lock tubes, 1.5 mL, polypropylene Chemland 02-63102
Eppendorf ThermoMixer C Eppendorf Used for spherulite incubation
HLP 5UV Water purification system Hydrolab Source of dionized water used in sample preparation
Hydrochloric acid (≥37%, APHA ≤10), Sigma-Aldrich 30721-M
Insulin powder from the bovine pancreas (≥25 units/mg (HPLC)) Sigma-Aldrich I5500
Methanol (HPLC grade) Sigma-Aldrich 270474
Microscope slides with a concave, 76 x 26 x 1 mm Chemland 04-296.202.09
Olympus BX60 Olympus Polarized Optical Microscope used in Figure 2
PTFE thread seal tape, 12 mm x 12 mm x 0.1 mm, 60 gm2 Chemland VIT131097
Microscope ps-2PFM setup
Chameleon Ultra II Coherent
FELH0800 - Ø25.0 mm Longpass Filter Thorlabs
FESH0700 - Ø25.0 mm Shortpass Filter Thorlabs
IDQ100 photon-counting avalanche photodiodes  ID Quantique
Multiphoton short-pass emission filter 720 nm  Semrock
Mounted Achromatic Half-Wave Plate, 690-1200 nm Thorlabs
Nikon Plan Apo Oil Immersion 100x/1.4 NA Nikon
piezo 3D stage Piezosystem Jena
Polarizing Beamsplitter Thorlabs
S130C - Slim Photodiode Power Sensor, Si, 400 - 1100 nm, 500 mW Thorlabs
Software
LabView 2018 National Instruments Version 18.0.1f2
Matplotlib library Version 3.3.2
NumPy library Version 1.19.2
SciPy library Version 1.5.2
Spyder Python 3 IDE Version 4.1.5

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Petazzi, R. A., Aji, A. K., Chiantia, S. Progress in Molecular Biology and Translational Science. Giraldo, J., Ciruela, F. 169, Academic Press. 1-41 (2020).
  2. Kress, A., et al. Probing orientational behavior of MHC class I protein and lipid probes in cell membranes by fluorescence polarization-resolved imaging. Biophysical Journal. 101 (2), 468-476 (2011).
  3. Duboisset, J., et al. Thioflavine-T and Congo Red reveal the polymorphism of insulin amyloid fibrils when probed by polarization-resolved fluorescence microscopy. The Journal of Physical Chemistry B. 117 (3), 784-788 (2013).
  4. De Luca, G., et al. Probing ensemble polymorphism and single aggregate structural heterogeneity in insulin amyloid self-assembly. Journal of Colloid and Interface Science. 574, 229-240 (2020).
  5. Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
  6. Obstarczyk, P., Lipok, M., Grelich-Mucha, M., Samoć, M., Olesiak-Bańska, J. Two-photon excited polarization-dependent autofluorescence of amyloids as a label-free method of fibril organization imaging. The Journal of Physical Chemistry Letters. 12 (5), 1432-1437 (2021).
  7. Obstarczyk, P., Lipok, M., Żak, A., Cwynar, P., Olesiak-Bańska, J. Amyloid fibrils in superstructures - local ordering revealed by polarization analysis of two-photon excited autofluorescence. Biomaterials Science. 10 (6), 1554-1561 (2022).
  8. Le Floc'h, V., Brasselet, S., Roch, J. -F., Zyss, J. Monitoring of orientation in molecular ensembles by polarization sensitive nonlinear microscopy. The Journal of Physical Chemistry B. 107 (45), 12403-12410 (2003).
  9. Chen, C., et al. In vivo near-infrared two-photon imaging of amyloid plaques in deep brain of Alzheimer's disease mouse model. ACS Chemical Neuroscience. 9 (12), 3128-3136 (2018).
  10. Gasecka, P., Balla, N. K., Sison, M., Brasselet, S. Lipids-fluorophores interactions probed by combined nonlinear polarized microscopy. The Journal of Physical Chemistry B. 125 (50), 13718-13729 (2021).
  11. Mojzisova, H., et al. Polarization-sensitive two-photon microscopy study of the organization of liquid-crystalline DNA. Biophysical Journal. 97 (8), 2348-2357 (2009).
  12. Olesiak-Banska, J., et al. Liquid crystal phases of DNA: Evaluation of DNA organization by two-photon fluorescence microscopy and polarization analysis. Biopolymers. 95 (6), 365-375 (2011).
  13. Olesiak-Banska, J., et al. Gold nanorods as multifunctional probes in a liquid crystalline DNA matrix. Nanoscale. 5 (22), 10975-10981 (2013).
  14. Grelich-Mucha, M., Lipok, M., Różycka, M., Samoć, M., Olesiak-Bańska, J. One- and two-photon excited autofluorescence of lysozyme amyloids. The Journal of Physical Chemistry Letters. 13 (21), 4673-4681 (2022).
  15. Brasselet, S., et al. Fluorescent Methods to Study Biological Membranes. Mély, Y., Duportail, G. , Springer. Berlin Heidelberg. 311-337 (2013).
  16. Krebs, M. R., et al. The formation of spherulites by amyloid fibrils of bovine insulin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (40), 14420-14424 (2004).
  17. Aït-Belkacem, D., Gasecka, A., Munhoz, F., Brustlein, S., Brasselet, S. Influence of birefringence on polarization resolved nonlinear microscopy and collagen SHG structural imaging. Optics Express. 18 (14), 14859-14870 (2010).
  18. Schön, P., Munhoz, F., Gasecka, A., Brustlein, S., Brasselet, S. Polarization distortion effects in polarimetric two-photon microscopy. Optics Express. 16 (25), 20891-20901 (2008).
  19. Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron. 50 (6), 823-839 (2006).
  20. Zipfel, W. R., Williams, R. M., Webb, W. W. Nonlinear magic: multiphoton microscopy in the biosciences. Nature Biotechnology. 21 (11), 1369-1377 (2003).
  21. Ferrand, P., et al. Ultimate use of two-photon fluorescence microscopy to map orientational behavior of fluorophores. Biophysical Journal. 106 (11), 2330-2339 (2014).
  22. Chipman, R. A. Depolarization index and the average degree of polarization. Applied Optics. 44 (13), 2490-2495 (2005).
  23. de Reguardati, S., Pahapill, J., Mikhailov, A., Stepanenko, Y., Rebane, A. High-accuracy reference standards for two-photon absorption in the 680–1050 nm wavelength range. Optics Express. 24 (8), 9053-9066 (2016).
  24. Mansfield, J. C., Mandalia, V., Toms, A., Winlove, C. P., Brasselet, S. Collagen reorganization in cartilage under strain probed by polarization sensitive second harmonic generation microscopy. Journal of The Royal Society Interface. 16 (150), 20180611 (2019).
  25. Duboisset, J., Aït-Belkacem, D., Roche, M., Rigneault, H., Brasselet, S. Generic model of the molecular orientational distribution probed by polarization-resolved second-harmonic generation. Physical Review A. 85 (4), 043829 (2012).
  26. Loksztejn, A., Dzwolak, W. Chiral Bifurcation in aggregating insulin: an induced circular dichroism study. Journal of Molecular Biology. 379 (1), 9-16 (2008).

Tags

Polarisasjonsfølsom to-foton mikroskopi etikettfri amyloid strukturell karakterisering bioimaging eksperimenter fototoksisitet vevspenetrasjon tettpakkede systemer vinkelfotovalg fluoroforer polarisasjonsanalyse to-foton fluorescensmikroskopi (2PFM) molekylær organisasjon standard bildebehandlingsmetoder lineære optiske prosesser polarisasjonsfølsom 2PFM (ps-2PFM) molekylær bestilling komplekse biostrukturer amyloid sfærulitter neurodegenerative sykdommer Alzheimers Parkinsons amyloider-protein aggregater nedsatt protein misfolding prosess diagnostiske metoder lokal fibril bestilling storfe insulin sfærulitter
Polarisasjonsfølsom to-foton mikroskopi for en etikettfri amyloid strukturell karakterisering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lipok, M., Obstarczyk, P.,… More

Lipok, M., Obstarczyk, P., Olesiak-Bańska, J. Polarization-Sensitive Two-Photon Microscopy for a Label-Free Amyloid Structural Characterization. J. Vis. Exp. (199), e65670, doi:10.3791/65670 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter