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Chemistry

Microscopia de dois fótons sensível à polarização para caracterização estrutural amiloide livre de marcação

Published: September 8, 2023 doi: 10.3791/65670
Automatic Translation
1, 1, 1
1Institute of Advanced Materials, Wrocław University of Science and Technology

Summary

Este trabalho descreve como a microscopia de dois fótons sensível à polarização pode ser aplicada para caracterizar a organização local dentro de superestruturas-esferulitos amiloides livres de marcação. Também descreve como preparar e medir a amostra, montar a configuração necessária e analisar os dados para obter informações sobre a organização local das fibrilas amiloides.

Abstract

Em comparação com sua contraparte de um fóton, a excitação de dois fótons é benéfica para experimentos de bioimagem devido à sua menor fototoxicidade, penetração mais profunda do tecido, operação eficiente em sistemas densamente compactados e fotoseleção angular reduzida de fluoróforos. Assim, a introdução da análise de polarização em microscopia de fluorescência de dois fótons (MAP2) fornece uma determinação mais precisa da organização molecular em uma amostra em comparação com métodos de imagem padrão baseados em processos ópticos lineares. Neste trabalho, enfocamos a 2PFM sensível à polarização (ps-2PFM) e sua aplicação na determinação da ordenação molecular dentro de bioestruturas complexas-esferulitos amiloides. Doenças neurodegenerativas como Alzheimer ou Parkinson são frequentemente diagnosticadas através da detecção de agregados de proteínas amiloides-formadas devido a um processo de enovelamento incorreto de proteínas. A exploração de sua estrutura leva a uma melhor compreensão de seu caminho de criação e, consequentemente, ao desenvolvimento de métodos diagnósticos mais sensíveis. Este trabalho apresenta os ps-2PFM adaptados para a determinação da ordenação de fibrilas locais no interior de esferulitos insulínicos bovinos e agregados proteicos amiloidogênicos esféricos. Além disso, comprovamos que a técnica proposta pode resolver a organização tridimensional das fibrilas no interior da esferulite.

Introduction

Nas últimas décadas, embora tenha havido um desenvolvimento significativo de inúmeras técnicas de microscopia de fluorescência para bioimagem de proteínas e seusagregados1, poucas têm sido utilizadas para resolver sua ordenação local dentro da amostra 2,3. A microscopia de imagem de tempo de vida de fluorescência4 foi usada para estudar a heterogeneidade estrutural intrínseca de superestruturas-esferulitos amiloides. Além disso, a determinação quantitativa da ordenação local dentro de bioestruturas complexas e densamente compactadas, como esferulitos, poderia ser resolvida usando métodos sensíveis à polarização3. No entanto, as técnicas padrão de fluorescência com penetração de tecido superficial são limitadas, uma vez que o uso de comprimentos de onda UV-VIS para excitar fluoróforos in vivo leva a um alto espalhamento de luz tecidual5. Além disso, essas imagens geralmente requerem o projeto e a ligação de sondas fluorescentes específicas a uma biomolécula alvo, aumentando assim o custo e a quantidade de trabalho necessário para realizar imagens.

Recentemente, para abordar essas questões, nossa equipe adaptou microscopia de fluorescência excitada de dois fótons sensível à polarização (ps-2PFM) para imagens livres de marcação de estruturas biológicas 6,7. A MAPP Ps-2 permite medir a dependência da intensidade de fluorescência de dois fótons na direção de polarização linear do feixe de excitação e analisar a polarização da fluorescência emitida8. A implementação desta técnica requer a complementação do caminho de excitação padrão do microscópio multifóton (Figura 1) com uma placa de meia-onda para controlar o plano de polarização da luz. Em seguida, gráficos polares, retratando a dependência da intensidade de fluorescência excitada de dois fótons na polarização do feixe de laser de excitação, são criados a partir de sinais coletados por dois fotodiodos de avalanche, coletando assim os dois componentes mutuamente perpendiculares da polarização de fluorescência.

A última etapa é o processo de análise dos dados, levando em conta o impacto dos elementos ópticos, como espelhos dicroicos ou uma objetiva de alta abertura numérica, na polarização. Devido à natureza do processo de dois fótons, este método fornece tanto uma foto-seleção angular reduzida quanto uma resolução axial aprimorada, já que a excitação de dois fótons de fluoróforos fora do plano focal é probabilisticamente limitada. Também foi comprovado que métodos semelhantes poderiam ser implementados com sucesso para imagens in vivo de sondas de infravermelho próximo (NIR) para imagens de tecidos profundos9. A Ps-2PFM foi previamente aplicada em fluoróforos de imagem em membranas celulares10 e DNA11,12, bem como marcadores fluorescentes não padronizados de sistemas biológicos, como nanopartículas de ouro13. No entanto, em todos esses exemplos, as informações sobre a organização de biomoléculas foram obtidas indiretamente e exigiram uma orientação mútua pré-definida entre um fluoróforo e uma biomolécula.

Em um de nossos trabalhos recentes, mostramos que a ps-2PFM pode ser aplicada com sucesso para determinar a polarização local da autofluorescência de superestruturas amiloides e fluorescência a partir de tioflavina T, um corante amilóide-específico, ligado a fibrilas amiloides em esferulitos6. Além disso, em outro, comprovamos que a ps-2PFM poderia ser utilizada para detectar a orientação da fibrila amiloide dentro de esferulitos amiloides em um regime de tamanho sub-mícron, o que foi confirmado pela correlação com imagens de microscopia eletrônica de transmissão (MET)7. A obtenção deste resultado foi possível graças a i) autofluorescência intrínseca de esferulitos-amiloides, quando excitadas com um ou dois fótons, exibem autofluorescência intrínseca com máximos de emissão localizados em uma faixa de 450 a 500 nm e seções transversais de absorção de dois fótons comparáveis com corantes fluorescentes padrão14, ii) modelos matemáticos introduzidos anteriormente para descrever como ps-2PEF de corantes marcando membranas biológicas e estruturas de DNA poderiam ser aplicados a fluorescência exibida por esferulitos e corantes a eles ligados 8,11,15. Assim, antes de prosseguir com a análise, é altamente recomendável examinar a teoria necessária descrita no texto principal e nas informações de apoio de nosso primeiro artigo sobre este tópico6. Apresentamos aqui o protocolo de aplicação da técnica de ps-2PFM para a caracterização estrutural amiloide livre de rótulos de esferulitos de insulina bovina.

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Protocol

1. Preparar as lâminas do microscópio com esferulites totalmente crescidos

NOTA: Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes sobre todos os materiais, reagentes e equipamentos usados neste protocolo. Todas as soluções foram preparadas com água deionizada (18,2 MΩ·cm a 25 °C) obtida do sistema de purificação de água.

  1. Incubar os esferulitos amiloides com base no protocolo descrito por Krebs e cols.16, com algumas modificações, conforme descrito a seguir.
    1. Pesar 10 mg de insulina em pó num tubo de 1,5 ml.
    2. Dissolver o pó com uma alíquota de 1 ml da solução deionizada de H2O/HCl (pH 1,5).
    3. Selar a amostra com a fita adesiva e colocá-la em um misturador térmico para incubar por 24 h a 70 °C (0 rpm).
      NOTA: Para realizar imagens de amiloides em seu ambiente nativo (isto é, hidratado) e evitar a deformação da amostra devido à desidratação, é necessário preparar lâminas de microscópio de acordo com a seguinte descrição (esquema mostrado na Figura 2).
  2. Lave bem a lâmina de vidro do microscópio com água.
  3. Mergulhe as lâminas em metanol e deixe-as secar em condições ambientais em um lenço sem poeira.
  4. Retirar uma alíquota de 100 μL da solução de esferulito do tubo com uma pipeta automática (passo 1.1.2) e adicioná-la ao poço localizado na área central da lâmina do microscópio.
  5. Cubra a solução com uma lamínula, evitando a formação de bolhas de ar.
  6. Deposite o suporte ao longo das bordas da tampa na corrediça com uma pipeta automática para selar a solução nativa dos esferulitos.
    NOTA: É de grande importância depositar o suporte deslizante tanto na tampa como nas superfícies deslizantes. Faça isso sob o capô de fumo por causa da toxicidade do solvente volátil (xileno). Veja o inset na Figura 2.
  7. Deixe a amostra do microscópio em condições ambientais para que o suporte endureça.
    NOTA: O processo de endurecimento depende da temperatura e umidade, mas deve ser concluído dentro de 12 h.
  8. Verifique se os esferulitos de insulina foram formados corretamente usando um microscópio óptico polarizado (POM) com polarizadores cruzados. Examine a amostra procurando um padrão característico de áreas brilhantes, chamado de cruz de Malta, como mostrado na Figura 3.
    NOTA: Os esferulitos amiloides podem ser definidos como superestruturas esféricas caracterizadas por uma morfologia heterogênea com uma estrutura núcleo-casca. Em detalhes, são compostos por núcleo amorfo e fibrilas amiloides de crescimento radial16. Devido ao caráter anisotrópico das estruturas esferulitas, elas podem interagir distintamente com a luz polarizada (por exemplo, por refração) e alterar sua fase, o que pode ser facilmente observado sob POM com polarizadores cruzados. Este método foi usado para estudar apenas esferulitos completamente desenvolvidos caracterizados por um padrão cruzado Maltase semelhante ao modelo. Consequentemente, agregados ou esferulitos estruturalmente distorcidos foram excluídos de investigações posteriores.

2. Construção e alinhamento do sistema

NOTA: Uma representação esquemática de um microscópio de dois fótons sensível à polarização pode ser encontrada na Figura 1.

  1. Instale um laser de femtossegundo com a sintonia de comprimento de onda de saída na faixa de 690-1.080 nm, por exemplo, operando em um laser Ti: Safira bloqueado por modo com pulsos de ~100 fs de taxa de repetição de 80 MHz.
  2. Adicione uma placa de meia-onda montada em um estágio de rotação ao caminho de excitação do setup para controlar a polarização da luz incidente no plano de amostra do microscópio XY.
  3. Instale o espelho dicroico para cortar o feixe de excitação da óptica de detecção.
    NOTA: As características ópticas de um espelho dicroico devem permitir reflectir o feixe de excitação (para a amostra) na gama de comprimentos de onda NIR e ser simultaneamente transparentes para a gama de comprimentos de onda correspondente à emissão das amostras.
  4. Instale um estágio de varredura piezoelétrica para varreduras raster dentro do plano XY para um Z escolhido.
  5. Monte a objetiva de imersão de alto NA, por exemplo, uma objetiva de imersão em óleo apocromático 100x/1,4 NA.
    NOTA: Como toda a configuração opera em um modo de epifluorescência, os sinais incidentes e emitidos estão passando pelo mesmo objetivo.
  6. No caminho de emissão, adicione um divisor de feixe polarizante que divide a emissão excitada de dois fótons em dois componentes ortogonalmente polarizados (I,X e I,Y)
  7. Instalar dois fotodiodos de avalanche (APDs) de contagem de fótons em uma configuração que permita coletar a luz transferida e refletida usando o divisor de feixes, respectivamente (Figura 1).
  8. Monte filtros de corte dependentes do comprimento de onda corretos no caminho de excitação e emissão do sistema, por exemplo, um filtro passa-longa de 800 nm diretamente no caminho óptico de excitação e um filtro passa-curta de 700 no caminho de emissão.
    NOTA: Analisar os espectros de emissão da esferulita para que qualquer contribuição potencial da segunda geração harmônica (SHG) ou da luz laser possa ser excluída usando os filtros de emissão corretos. Também é importante notar que este sistema também deve permitir medições de SHG sensível à polarização, que poderia ser usada para resolver a ordenação de biomoléculas dentro das amostras. No entanto, a análise dos dados do sinal de SHG difere da fluorescência, que, mais detalhadamente, foi descrita por Aït-Belkacem et al.17.
  9. Alinhe todo o sistema (usando o modo de alinhamento construído em muitos lasers) até que intensidades de sinal semelhantes sejam coletadas usando ambos os fotodiodos.
  10. Verifique se o feixe de excitação focalizado pela objetiva alta do NA e fotografado em uma câmera tem uma forma circular concêntrica, conforme apresentado na Figura 4A.
  11. Ajuste o tempo de varredura e a potência correspondente para minimizar o dano induzido pelo laser incidente na amostra. A queima pontual exemplar é apresentada na Figura 4B. Meça a potência nominal usando um medidor de potência portátil digital conectado a um sensor de potência de fotodiodo localizado na entrada do corpo do microscópio.
    NOTA: Espécimes biológicos podem ser facilmente queimados devido à iluminação a laser. Neste caso, a faixa de potência de 100 -900 μW (no ponto focal da lente objetiva) mostrou-se um excelente trade-off entre estabilidade da amostra e emissão intensa.
  12. Antes da medição da amostra, teste a qualidade do alinhamento da óptica com uma amostra de referência isotrópica (por exemplo, fluoresceína incorporada no polímero amorfo). Para efectuar a verificação da calibração, siga o procedimento descrito na secção 3 utilizando uma referência isotrópica em vez de uma amostra amiloide.
    NOTA: Partindo do pressuposto de que o arranjo da microscopia é idealmente ajustado para a amostra com propriedades isotrópicas, ambos os componentes de emissão de 2P (I, X eI, Y) detectados com duas DPAs devem ser caracterizados pela mesma intensidade (Figura 4C).

3. Medição dos esferulitos de insulina bovina

OBS: Para realizar todas as medidas descritas do ps-2PF, foi utilizado um software manuscrito, que controla as posições do estágio piezelétrico e da placa de meia-onda e coleta o sinal de ambos os fotodiodos, permitindo a plotagem dos scans XY (varreduras raster) de áreas selecionadas em lâminas de microscópio, bem como gráficos polares a partir de coordenadas específicas da amostra. Notas adicionais também foram adicionadas ao protocolo, o que permitirá que os usuários realizem a medição sem ele, uma vez que tanto o estágio piezo-estágio quanto o estágio de rotação usados para girar a placa de meia-onda podem ser controlados usando seus próprios controladores ou software correspondente. Ainda assim, é altamente recomendável escrever um algoritmo combinando o ângulo de rotação de uma placa de meia-onda com a intensidade de 2PEF coletada com ambos os fotodiodos, uma vez que essa correlação (gráficos polares) é crucial para a análise adequada dos dados, resultando em informações estruturais.

  1. Monte o espécime com os esferulitos no palco piezoelétrico (imobilize a lâmina de vidro com fita adesiva). Certifique-se de montá-lo de forma que um lado de vidro fino (lamínula) esteja voltado para o objetivo, pois objetivos numéricos altos são caracterizados por distâncias de trabalho relativamente curtas.
    NOTA: Como a imersão em óleo é usada, uma pequena gota de óleo mineral deve ser aplicada na objetiva antes da montagem e focalização do espécime.
  2. Ao mudar as posições XY e Z usando botões de microscópio, concentre a objetiva em um dos esferulitos encontrados na solução, mas esteja ciente de que, como os diâmetros da esferulita estão tipicamente na faixa de dezenas de μm, concentre-se dentro da área central de toda a estrutura. Procure halos pretos e brancos ao redor da esferulita específica como sinais de foco inferior e superior, respectivamente. Ajuste o eixo "Z" para estar entre esses extremos.
    OBS: É importante encontrar uma amostra isolada sem defeitos estruturais. Esferulitos extremamente pequenos podem se afastar devido à tensão do material introduzida pelo objetivo, enquanto as maiores estruturas são provavelmente agregadas ou altamente distorcidas.
  3. Centralize a esferulito no campo de visão do plano microscópico observado e determine o tamanho da varredura XY observando quantos passos de piezoestágio nas direções X e Y (exibidos no controlador de piezoestágio ou em seu software) são necessários para cobrir a área de toda a estrutura.
    NOTA: Recomenda-se configurar o sistema de tal forma que o início da varredura XY esteja localizado perto de um dos cantos da esferulito e coincida com a posição zero do estágio (X e Y = 0)
  4. Ajuste os seguintes parâmetros de varredura:
    1. Ajustar a polarização do feixe de excitação e girar a placa de meia-onda para obter a polarização correspondente aos eixos "X" e "Y" do plano da amostra do microscópio.
      NOTA: Isso pode ser feito medindo os gráficos polares de meio fluorescente isotrópico, como a fluoresceína. Para tais materiais, a intensidade máxima de fluorescência é paralela à polarização do feixe de excitação; assim, a rotação da placa de meia-onda ajusta a polarização com os eixos X e Y no plano de observação, também denotados como eixo X e Y em gráficos polares como na Figura 4C. Gráficos polares completos podem ser medidos coletando a intensidade medida de 2PEF em ambos os fotodiodos para rotação de 180° da placa de meia-onda (rotação de 360° da polarização da luz de excitação) e correlacionando a intensidade com o ângulo de polarização da luz de excitação. Isso pode ser feito manualmente, medindo a intensidade de emissão para cada ângulo de placa de meia-onda separadamente e, em seguida, montando-o em um gráfico polar em um software de análise de dados ou automaticamente, usando software dedicado ou auto-escrito.
    2. Ajuste os parâmetros do piezoestágio: velocidade de varredura, passo e alcance para cobrir a área de todo o esferulito.
      NOTA: O intervalo de varredura deve ser maior do que o diâmetro da esferulita para enquadrar totalmente toda a superestrutura dentro da varredura raster. Baixa velocidade de digitalização e passo permitem que os usuários obtenham imagens de alta qualidade; no entanto, isso pode resultar na queima da amostra. Portanto, um trade-off dependente do tamanho da esferulita é necessário. Esses parâmetros não podem ser aplicados universalmente. Parâmetros exemplares usados na Figura 5A: faixa de varredura 45 x 45 μm, etapa de varredura de 1 μm e velocidade de varredura de 2 μm/s.
  5. Abra o obturador, ligue os fotodiodos e colete Equation 1 componentes Equation 2 de emissão 2P para cada passo da área de varredura selecionada - para o feixe de excitação polarizado correspondentemente ao X e, em seguida, aos eixos Y. Imagens exemplares de esferulitos de insulina por autofluorescência excitada de dois fótons (2PAF) são apresentadas na Figura 5A.
    NOTA: A medição de varreduras raster requer a correlação das coordenadas do estágio piezo com Equation 1 os componentes de emissão coletados e Equation 2 coletados, o que pode ser feito manualmente, medindo a intensidade em cada ponto da área selecionada e, em seguida, montando-a em uma matriz 2D, ou automaticamente, através de um software auto-escrito. As varreduras raster podem ser apresentadas como uma soma da intensidade e dos componentes de Equation 1 Equation 2 emissão ou distintamente para um componente de emissão específico. Como são altamente dependentes da estrutura, distorções estruturais dentro dos esferulitos são facilmente visíveis. No entanto, devido ao movimento do estágio do microscópio, algumas amostras podem se afastar do campo de visão. Portanto, as imagens precisam ser rastreadas em busca de artefatos. É necessário verificar a posição da esferulita antes e depois da varredura.
  6. Para realizar a análise de polarização total a partir do ponto específico da amostra, desligue o feixe de excitação.
  7. Posteriormente, escolher coordenadas específicas de piezoestágio correspondentes ao local escolhido na esferulito onde a informação sobre a orientação das moléculas é requerida com a resolução sub-μm.
  8. Ajuste o estágio piezoelétrico para centralizar o campo de visão no indicado (X, Y).
  9. Ligue o feixe de excitação e realize a análise completa (360°) da Equation 1 polarização e Equation 2 da emissão ligando a rotação da placa de meia-onda (rotação de 180°). Apresentar componentes 2PF Ix e Iy na forma de um gráfico polar (como mostrado na Figura 5B).
    Observação : esta etapa pode ser repetida em locais diferentes na amostra para coletar uma quantidade suficiente de dados.

4. Determinação da ordenação local de fibrilas no interior dos esferulitos de insulina bovina

NOTA: Todos os cálculos numéricos ligados à análise dos dados foram feitos utilizando a linguagem de programação Python e baseados nas funções disponíveis nas bibliotecas NumPy e SciPy. A plotagem dos dados requer a biblioteca Matplotlib. Todos os cálculos são baseados em fórmulas apresentadas em informações de apoio em um dos artigos de Obstarczyk et al.6.

  1. Simulando a intensidade da fluorescência de dois fótons excitada para a distribuição especificada de moléculas com uma direção selecionada da polarização da luz incidente (denotada por α)
    NOTA: As fórmulas apresentadas baseiam-se na suposição de momentos dipolares paralelos de absorção e emissão de um fluoróforo. Para uma discussão de outros casos (por exemplo, diferentes direções dos momentos dipolares de absorção e emissão, transferência de energia entre os fluoróforos), ver o artigo de Le Floc'h et al8.
    1. Encontre os parâmetros que explicam a variação do campo elétrico por polarização, mistura e efeitos de despolarização causados pelo espelho dicroico montado em uma configuração:
      1. γ representa o fator de amplitude entre a refletividade Equation 3 e Equation 4 a luz polarizada de um espelho dicroico.
      2. δ representa o deslocamento de fase (elipse) entre Equation 3 a luz polarizada e Equation 4 a luz.
        NOTA: A definição correta desses dois parâmetros é crucial para o sucesso da caracterização estrutural devido à sua forte influência na forma dos gráficos polares medidos11,18. No caso do sistema apresentado, ambos os parâmetros foram determinados durante medidas de elipsometria de um espelho dicroico aplicado em um sistema.
    2. Calcular os vetores de campo elétrico incidentes que se propagam nos eixos X e Y de cada ângulo medido durante a medição do ps-TPFM usando equações (1-5).
      Equation 5 (1º)
      Equation 6 (2º)
      Equation 7 (3º)
      Equation 8 (4º)
      Equation 9 (5º)
      NOTA Se a intensidade for medida ao longo de todo o 360° com o passo 1°, calcule os vetores de campo elétrico para todos os 360°. Todos os ângulos devem ser em radianos. O parâmetro ρ está ligado à frequência óptica ω do campo elétrico simulado (ρ=ω·t) e utilizados integrados de 0 a 2π durante os cálculos dos vetores de campo elétrico incidentes que se propagam nos eixos X e Y para cada ângulo α medido durante a medição do ps-TPFM.
    3. Definir as funções para momentos dipolares de transição em direções de três eixos de um sistema cartesiano de acordo com equações (6-8):
      Equation 10 (6)
      Equation 11 (7º)
      Equation 12 (8º)
      NOTA: φ é o ângulo de orientação do eixo longo da fibrila amiloide no quadro de amostra XY. θ e φ ângulos são os ângulos polar e azimutal usados para definir a orientação do momento dipolar de transição de um fluoróforo.
    4. Use as funções definidas na etapa 4.1.3. definir funções para Jx (Φ,θ,φ) e JY(Φ,θ,φ), que explicam a contribuição da focalização apertada da luz com objetivo de abertura numérica alta para a detecção da polarização da fluorescência na direção X e Y usando equações (9, 10).
      Equation 13 (9º)
      Equation 14 (10)
      NOTA: Os fatores K1, K2, K3 estão relacionados com a objetiva do microscópio usada durante a medição do ps-TPFM. Nesses experimentos, utilizou-se objetiva de imersão em óleo apocromático de 100x/1,4 NA e os fatores K1, K2, K3 foram 2,945, 0,069 e 1,016, respectivamente.
    5. Definir uma função para f(Ω), que é uma distribuição angular molecular, dependendo da meia abertura de um cone de fluoróforo Ψ, com uma espessura variável ΔΨ; Use a equação (11). A representação gráfica dos três ângulos em relação à fibrila amiloide é apresentada na Figura 6.
      Equation 15(11)
      NOTA: Tenha cuidado ao escrever o expoente - o poder de 2 funciona no argumento da função, não na função inteira!
    6. Defina todos os fatores fWWIJKL como mostrado nas equações (12-21).
      Equation 16 (12)
      Equation 17 (13)
      Equation 18 (14)
      Equation 19 (15)
      Equation 20 (16)
      Equation 21 (17)
      Equation 22 (18)
      Equation 23 (19)
      Equation 24 (20)
      Equation 25 (21)
    7. Calcular as intensidades Equation 26 de fluorescência excitada de dois fótons e Equation 27 para cada ângulo medido (da mesma forma que no ponto 4.1.2) utilizando equações (22, 23).
      Equation 28 = Equation 29 (22)
      Equation 30 = Equation 31 (23)
    8. Verifique se a simulação está funcionando corretamente utilizando os seguintes valores de variáveis (colocados na legenda da Figura 7) e compare os resultados obtidos com a Figura 7A-C.
      NOTA: Todos os graus devem ser escritos em radianos.
  2. Ajustar as intensidades simuladas à intensidade de autofluorescência excitada por dois fótons de esferulitos de insulina bovina coletados durante as medições de ps-2PFM.
    NOTA: A resolução da estrutura esferulítica baseada em medidas de ps-2PFM requer o uso das equações escritas no protocolo para simular a intensidade teórica da fluorescência excitada de dois fótons e o ajuste de todos os parâmetros ligados à ordenação do fluoróforo molecular. Requer múltiplas iterações sobre os vários valores de Φ, um ângulo descrevendo a rotação da fibrila na amostra do microscópio XY, e ΔΨ, aberrações da distribuição cônica do dipolo de emissão Ψ devido às rotações moleculares em filamentos para Ψ fixo até atingir o maior coeficiente R2 possível entre a intensidade de sinal de fluorescência excitada de dois fótons normalizada coletada durante a medição e intensidades normalizadas simuladas de acordo com Etapa 4.1 do protocolo.
    1. Determine o meio-ângulo Ψ .
      NOTA: Para os esferulitos de insulina bovina, deve ser igual a Ψ = 29°6.
    2. Fluxo de trabalho de ajuste:
      1. Escolha o valor de Φ de 0° a 180° (nas Figuras 8A e 8B Φ = 16° e 127°, respectivamente).
      2. Escolha o valor de ΔΨ de 0° a 90° (na Figura 8A,B, ΔΨ = 24° e 1°, respectivamente).
      3. Calcular Equation 28 (equação 22) e Equation 30(equação 23) para toda a faixa medida de ângulos θ usando os valores escolhidos de Φ e ΔΨ.
      4. Comparar as intensidades calculadas durante as simulações (ambas normalizadas para o valor máximo de
      5. Calcular Equation 28) com intensidades normalizadas de
      6. Calcular Equation 1 e Equation 2 (ambos normalizados para o valor máximo de ) medidos durante a medição da Equation 1MAPP ps-2.
        NOTA: Nos experimentos apresentados, os coeficientes de correlação produto-momento de Pearson foram calculados usando a função "corrcoef" da biblioteca NumPy Python.
    3. Ao final, escolha os valores de Φ e ΔΨ levando aos maiores coeficientes de correlação e convergência entre as intensidades simuladas e o sinal medido semelhante ao que é mostrado na Figura 8.

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Representative Results

O protocolo apresentado fornece orientação passo a passo através da preparação de superestruturas amiloides para testes com ps-2PFM, construção do sistema microscópico e medidas da amostra adequada. No entanto, antes do conjunto final de medidas, é vital alinhar adequadamente as DPAs com uma referência isotrópica, o que deve resultar na coleta de um sinal simétrico de forma e intensidade semelhantes em ambos os detectores (Figura 4C). Mesmo diferenças mínimas entre as intensidades medidas nos detectores nos eixos X e Y devem ser levadas em conta em medições posteriores e, especialmente, durante a análise como um fator de correção apropriado. Após a montagem, a amostra contendo esferulitos simples, dando uma cruz de Malta característica no MOP como na Figura 2B, e após a realização de um varredura raster de 2PFM, a imagem deve ficar semelhante ao que é mostrado na Figura 5A, o que é consistente com os relatos de varreduras raster de 2PFM de esferulitos 6,7 e diferentes biomoléculas organizadas11,12. Pode-se observar algumas mudanças na localização do eixo de maior brilho, o que está relacionado ao fato de que a intensidade do sinal de fluorescência depende fortemente da polarização do feixe de excitação. Portanto, é necessário verificar qual posição da meia-placa corresponde à excitação da amostra ao longo dos eixos X (Figura 5A, superior) e Y (Figura 5A, inferior). Também vale a pena notar como os gráficos polares mudam ao realizar uma análise de polarização completa a partir de diferentes pontos selecionados. Fora do esferulito, o gráfico polar parece uma coleção de artefatos e picos de ruído de sinal aleatórios (Figura 5B, I). Tal gráfico também pode indicar a deriva da esferulita entre as medições e exigir a descoberta de novas coordenadas de toda a estrutura por outra varredura raster de 2PF. Gráficos polares adequadamente medidos a partir de locais altamente ordenados de esferulito de insulina ao longo dos eixos X e Y são mostrados na Figura 5B II e III, respectivamente. Podem ter diferentes formas e geometrias, dependendo da orientação local e organização dos fluoróforos medidos a partir do pontoselecionado7.

A última etapa do protocolo está focada na análise dos dados obtidos utilizando um algoritmo baseado em um modelo matemático combinando a orientação das fibras amiloides no plano XY Φ, os momentos dipolares transitórios do fluoróforo associados Ψ, e suas aberrações ΔΨ (Figura 6) com intensidade Equation 1 e Equation 2 fluorescência induzida por dois fótons. As funções corretamente implementadas apresentadas no protocolo devem, após a inserção dos dados de entrada apropriados (etapa do protocolo 4.9), produzir gráficos polares idênticos aos apresentados na Figura 7. Quaisquer desvios - orientação de dados diferente, intensidades ou formas de simulados Equation 26 e Equation 32-indicam erros no código. Se o modelo funcionar, pode-se prosseguir para a última etapa do protocolo - ajustando os dados simulados aos dados reais obtidos a partir da medição da ps-2PFM. Os valores escolhidos de Φ e ΔΨ com os maiores coeficientes de correlação e convergência entre as intensidades simuladas e o sinal medido devem levar a imagens semelhantes como mostra a Figura 8. Deve haver o melhor ajuste possível de Equation 26 e Equation 32 funções à orientação geral e forma de Equation 1 e Equation 2 e os valores de Φ e ΔΨ devem corresponder à orientação local de fibrilas e fluoróforos no ponto medido na esferulite. Modelos similares e métodos de ajuste também podem ser usados para a determinação da organização local de outras biomoléculas como o DNA11.

Figure 1
Figura 1: Configuração da microscopia sensível à polarização de dois fótons. Esquema mostrando o arranjo do microscópio de dois fótons usado para as medidas de fluorescência excitada de dois fótons sensíveis à polarização de esferulitos de insulina bovina. Componentes de emissão excitados de dois fótons horizontalmente e verticalmente polarizados (para o plano de amostra do microscópio) são representados com IX eI Y, respectivamente. Abreviaturas: SP = plano amostral; O = objetivo; DM = espelho dicroico; λ/2 = placa de meia-onda; LPF = filtro passa-longa; BE = expansor de feixe; P = polarizador Glan; Ti: Sa = Titã: fonte de luz laser de safira; M = Espelho; FPS = filtro passa-curta; PBS = divisor de feixe de polarização; L = lente óptica; DPA = fotodiodo de avalanche. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Esquema mostrando a preparação do slide/foto. (A) Esquema mostrando a preparação da amostra selada; (B) fotografias das etapas subsequentes para a selagem da amostra. I: alíquota de 100 μL da solução de esferulito na lâmina de microscopia com um poço, II: lamínula caída sobre a solução; III: vedação hermética formada a partir de polímero depositado (montante). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Controle de qualidade dos esferulitos de insulina em microscópio de luz polarizada. (A1,B1) Modo de campo brilhante, bem como sob (A2,B2) polarizadores cruzados. O padrão característico da cruz de Malta pode ser observado nas imagens correspondentes tiradas com polarizadores cruzados. (A) Agregados de esferulitos com distorções estruturais, (B) esferulitos isolados de alta qualidade. Barras de escala = 5 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Testando o alinhamento do sistema ps-2PFM. (A) Imagem concêntrica desfocada da fluorescência da fluoresceína vista sem (A1) e com (A2) espelho dicroico, (B) esferulito fotodanificado com orifícios queimados surgindo devido à análise de polarização alongada em pontos selecionados ao longo das direções x e y, (C) componentes de emissão excitada de dois fótons na dependência do ângulo de polarização da luz incidente, conforme registrado para uma amostra isotrópica (solução de fluoresceína). e denotam componentes de emissão medidos por fotodiodos de avalanche medindo o eixo de polarização de emissão X e Y, respectivamente. Barras de escala = 5 μm (A1,A2), 10 μm (B). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: Varreduras raster exemplares de 2PFM e gráficos polares a partir de esferulito de insulina sem rótulo. (A) Varreduras raster de intensidade 2PF de esferulitos de insulina sem rótulo: polarização da luz de excitação: (A1) polarização horizontal, (A2) polarização vertical e emissão são denotados com setas brancas, e o inset mostra a mesma esferulita fotografada sob um microscópio de luz polarizada padrão com polarizadores cruzados. (B) Gráficos polares derivados de três pontos indicados na varredura A1 (B1, I; B2, II; B3, III). Ixe Iydenotam componentes de emissão medidos por fotodiodos de avalanche medindo o eixo de polarização de emissão X e Y, respectivamente. Abreviação: 2PF = fluorescência de dois fótons. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6: Distribuição cônica do dipolo de emissão do corante (meio ângulo, Ψ) em relação ao longo eixo fibrilar. A linha tracejada mostra o longo eixo da fibrila. A rotação da fibrila no plano da amostra do microscópio XY é descrita pelo ângulo. Aberrações de Ψ devido às rotações moleculares em filamentos são descritas por ΔΨ. Este número é de Obstarczyk et al6. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 7
Figura 7: Intensidade simulada de fluorescência polarizada de dois fótons excitada. Fluorescência calculada para (A) Φ = 1°, Ψ = 1°, ΔΨ = 1°; (B) Φ = 1°, Ψ = 30°, ΔΨ = 1°; (C) Φ = 1°, Ψ = 30°, ΔΨ = 60°. As linhas vermelha, azul e amarela correspondem a Equation 26, Equation 32e Equation 26 + Equation 32, respectivamente. O ângulo Φ descreve a rotação da fibrila no plano da amostra do microscópio XY, Ψ - distribuição cônica do dipolo de emissão, e ΔΨ- aberrações de Ψ devido às rotações moleculares nos filamentos. Todos os outros parâmetros foram idênticos em todos os casos: K1 = 2,945, K2 = 0,069, K3 = 1,016, γ = 0,01 e δ = 0,98845. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 8
Figura 8: Gráficos polares de conjuntos de dados experimentais. (A,B) Gráficos polares exemplares após ajuste de dois conjuntos de dados experimentais coletados durante medições de ps-TPFM de esferulitos de insulina bovina. Os componentes de emissão excitados de dois fótons medidos Equation 1 e Equation 2 de dois fótons para os eixos de polarização de emissão X e Y são apresentados com pontos vermelhos e azuis, respectivamente, enquanto as linhas sólidas apresentam os componentes de emissão de fluorescência excitada de dois fótons simulados correspondentes para os eixos Equation 26 de polarização de emissão X e Y e Equation 32. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

A microscopia de dois fótons sensível à polarização é uma ferramenta valiosa para estudar a ordenação local de fibrilas dentro das superestruturas amiloides, exigindo apenas pequenas modificações na configuração padrão de multifótons. Uma vez que opera em fenômenos ópticos não lineares, a foto-seleção angular reduzida e a resolução axial aprimorada podem ser obtidas em comparação com métodos de microscopia de fluorescência excitada de um fóton. Além disso, leva a menor espalhamento de luz, menor fototoxicidade e penetração mais profunda da amostra quando comparada às técnicas de microscopia de fluorescência por excitação de um fóton 19,20. Como já provamos, é bem adequado para medidas de agregados densamente embalados de proteínas, como esferulitos, que podem ser realizadas de forma livre de rótulos21.

No entanto, para usar efetivamente o método aqui descrito, deve-se prestar atenção a várias questões fundamentais. Começando com a preparação da amostra e sua qualidade, ou seja, incubação, sempre garantir que as superestruturas amiloides tenham crescido corretamente. No caso dos esferulitos, usamos um microscópio óptico polarizado com polarizadores cruzados para localizar esferulitos maduros, que dão um padrão característico de cruz de Malta, e têm um raio de ~5 μm16. No entanto, os esferulitos são heterogêneos, e estruturas distintas podem ser observadas dentro da amostra. Portanto, é crucial escolher espécies separadas e não distorcidas. Quanto ao sistema de medição propriamente dito, é fundamental controlar a polarização da luz incidente para que a polarização do feixe na entrada do corpo do microscópio seja determinada com precisão e a despolarização introduzida pelos elementos ópticos utilizados seja minimizada22. Para garantir o melhor desempenho, recomendamos o uso de espelhos prateados de alta qualidade e filtros ópticos compatíveis com os comprimentos de onda de excitação e emissão de fluorescência. Devido ao papel fundamental da polarização da luz também na trajetória de emissão, é essencial medir uma amostra de referência isotrópica antes da medição real. Se o caminho de excitação e os detectores APD estiverem alinhados corretamente, deve-se ver um sinal igualmente intenso em ambos os detectores, como apresentado na Figura 4C. A referência deve gerar uma fluorescência forte excitada de dois fótons com potência de laser relativamente baixa para evitar o fotoclareamento; Utilizamos fluoresceína uma vez que suas seções transversais de absorção de dois fótons para diferentes comprimentos de onda já foram relatadas na literatura23.

Para determinar corretamente a disposição das estruturas dentro dos esferulitos, muita atenção também deve ser dedicada à análise dos dados. O pressuposto básico deste modelo é a colinearidade do momento dipolar de transição de absorção e emissão de luz. Sob esse pressuposto, o alinhamento do momento dipolar de transição da molécula paralelamente à polarização da luz incidente permite sua combinação com a estrutura interna da amostra testada, produzindo a maior intensidade de emissão. O modelo dado também pode ser usado como uma boa aproximação para pequenas diferenças no ângulo entre os dois momentos dipolares8 , mas requer modificações adicionais para grandes desvios. Portanto, como descrito, algumas premissas em relação à amostra devem ser levadas em consideração a priori para a análise de imagens e dados. No caso do modelo em que se baseia a simulação e as equações utilizadas neste método, a principal fonte de despolarização no sistema é o espelho dicroico. Portanto, antes de prosseguir com a análise dos dados, é necessário determinar os parâmetros responsáveis pela despolarização introduzida pelo espelho dicroico devido ao seu impacto na forma dos gráficos polares coletados e, consequentemente, a correta determinação da organização das moléculas dentro da estrutura examinada durante o ajuste18. Isso se torna um problema chave, especialmente no caso de medidas para vários comprimentos de onda, uma vez que a mudança na elipse do espelho dicroico é distintamente dependente do comprimento de onda12. A indução de despolarização pode afetar fortemente as características do sinal coletado11. Por último, mas não menos importante, ao criar o script para análise de dados, deve-se prestar atenção ao introduzir funções matemáticas e variáveis apresentadas na última parte do protocolo. Para evitar erros, concentre-se em recursos como chamadas de várias funções e parâmetros globais, que também acelerarão significativamente o tempo de análise.

Devemos também mencionar os problemas mais comuns que se pode encontrar ao usar o método descrito. O tempo de preparação da amostra é muito dependente da velocidade de endurecimento do montante. Para acelerar isso, recomendamos que as amostras sejam preparadas em um local quente e seco e a solução de esferulito seja selada antes de montá-la em um microscópio. Medições realizadas muito cedo podem levar ao desselamento da lâmina e à destruição da lente objetiva utilizada. Além disso, apesar da preparação adequada da amostra, pequenos esferulitos podem flutuar na solução durante a medição devido à tensão do material introduzida pela objetiva. Para evitar isso, aconselhamos a varredura de estruturas isoladas de tamanho médio, uma vez que as maiores são comumente agregados. Recomenda-se verificar se a esferulita digitalizada se moveu após a aquisição dos dados, em comparação com a imagem, antes de iniciar a medição. Além disso, apesar do correto alinhamento de todos os elementos ópticos e detectores utilizados para medir a ps-2PFM, as intensidades Equation 1 medidas e Equation 2 da referência isotrópica ainda podem diferir ligeiramente em intensidade. Nesse caso, é necessário levar isso em conta ao analisar os dados das medidas amostrais, multiplicando uma das intensidades pelo fator de correção determinado durante as medidas de referência. Por último, mas não menos importante, é possível que, durante o procedimento de ajuste, o script não consiga encontrar valores correspondentes de Φ e ΔΨ. Isso pode ser devido a vários fatores - os dados foram coletados de um ponto desorganizado em uma amostra, por exemplo, o núcleo de um esferulito; a estrutura estudada não foi totalmente formada durante a incubação; simulação incorreta de Equation 26 e Equation 32; usando parâmetros de espelho dicroico incorretos γ e δ; passo muito grande definido para ângulos Φ e ΔΨ entre cada iteração durante o ajuste. No caso de um ponto desorganizado, recomenda-se tentar coletar dados de pontos mais próximos ao perímetro da estrutura examinada. No caso de uma estrutura incompletamente formada, repita a incubação ou procure outras estruturas na lâmina. No caso de simulações incorretas, verifique manualmente se alterando os parâmetros Φ, Ψ e ΔΨ, as intensidades Equation 26 simuladas e altere Equation 32 e corrija eventuais erros no código. No caso de parâmetros incorretos do espelho dicroico, verifique cuidadosamente os parâmetros γ e δ do espelho dicroico usado durante as medições. No caso de um grande degrau definido para os ângulos durante o ajuste, reduza o passo entre iterações sucessivas para 2º ou 1º. Deve-se lembrar também que, no caso de forte desorganização local da estrutura, R2 será sempre menor, muitas vezes na faixa de 0,5-0,6. Isso ocorre porque o modelo apresentado descreve moléculas altamente ordenadas onde a maioria dos momentos dipolares transitórios estão alinhados em uma direção semelhante; Assim, o pareamento de estruturas amorfas ou altamente desordenadas leva a menores coeficientes de correlação. Portanto, é fundamental possuir pelo menos algumas informações estruturais sobre a amostra antes da medição para analisar corretamente os dados obtidos.

Vale ressaltar também que o método apresentado possui várias limitações. A análise dos dados pode resultar em vários valores de ângulos Φ e ΔΨ com fatores de correlação suficientemente altos, exigindo que o experimentador use seu conhecimento e experiência para selecionar valores apropriados. Neste caso, as condições de contorno devem ser levadas em conta, como que o cone de fluoróforo de meio ângulo Ψ deve ser sempre maior do que sua aberração ΔΨ. Além disso, ao compararmos nossos dados com a literatura, vale ressaltar que alguns trabalhos descrevem Ψ como um ângulo de cone completo, enquanto nós operamos em um ângulo de meio cone. Outra limitação é a resolução de medição, limitada a uma resolução sub-mícron. Devido a isso, a foto-seletividade do sistema e a determinação da organização local resultante são baseadas no sinal médio das fibrilas excitadas no ponto focal em vez de estruturas únicas. Além disso, a amostra em si precisa possuir rendimento quântico de fluorescência suficiente, pois a longa exposição sob a potência do laser incidente fs (necessária para adquirir dados para gráficos polares) pode ser destrutiva e impactar os resultados.

Apesar dessas dificuldades, acreditamos que o método apresentado neste trabalho tem uma ampla gama de aplicações, para imagens de bioestruturas baseadas e label-free em ambientes hidratados e complexos. Demonstramos anteriormente que a ordenação local de fibrilas calculada a partir dos dados do PS-2PFE correlaciona-se com informações derivadas da microscopia eletrônica de transmissão7. Portanto, confirmamos a validade do ps-2PEF em bioimagem e ampliamos ainda mais o conhecimento sobre a ordenação estrutural de superestruturas amiloides. Esse método pode ser aplicado para aprender sobre a origem da fluorescência intrínseca observada no caso de vários componentes de amostras biológicas, como a autofluorescência de agregados proteicos – amiloides. Diante de dados relevantes sobre a orientação das direções do momento dipolar de absorção/emissão em relação ao longo eixo das fibrilas amiloides, as propriedades ópticas das fibrilas podem ser correlacionadas com suaestrutura6. Indicamos que, para estruturas com ângulo Ψ já determinado, essa técnica permite a detecção de características estruturais distintas de superestruturas amiloides e polimorfos de superestruturas insulínicas com base no nível de sua organização7. Como observado anteriormente no protocolo, o arranjo apresentado também pode ser aplicado para medidas de segunda geração harmônica sensíveis à polarização, que também é uma técnica de microscopia de dois fótons livre de marcação24. Isso exigirá não apenas a montagem de diferentes filtros ópticos, mas também a alteração das fórmulas usadas para a análise dos dados25. Além disso, com a adição de uma placa de quarto de onda devidamente alinhada, ela poderia ser usada para excitar a amostra com luz polarizada circularmente, o que poderia levar à geração de propriedades ópticas quirais não lineares de amiloides, uma vez que são biopolímeros quirais com fortes propriedades quiroópticas confirmadas26. No entanto, nesse caso, o vetor elétrico em constante rotação levaria à constante mudança de direção da emissão excitada, tornando impossível determinar qualquer informação estrutural usando as equações apresentadas neste manuscrito. Em suma, o ps-2PEF é uma ferramenta promissora para a determinação da organização dentro de inúmeras bioestruturas complexas com dipolos de emissão ordenados, como agregados proteicos, DNA ou tecidos de forma não invasiva.

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Disclosures

Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado pelo projeto Sonata Bis 9 (2019/34/E/ST5/00276) financiado pelo Centro Nacional de Ciência da Polónia.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sample preparation
Coverslips, 24 x 24 mm Chemland 04-298.202.04
DPX mountant for histology Sigma-Aldrich 6522 Slide mountant
Eppendorf Safe-Lock tubes, 1.5 mL, polypropylene Chemland 02-63102
Eppendorf ThermoMixer C Eppendorf Used for spherulite incubation
HLP 5UV Water purification system Hydrolab Source of dionized water used in sample preparation
Hydrochloric acid (≥37%, APHA ≤10), Sigma-Aldrich 30721-M
Insulin powder from the bovine pancreas (≥25 units/mg (HPLC)) Sigma-Aldrich I5500
Methanol (HPLC grade) Sigma-Aldrich 270474
Microscope slides with a concave, 76 x 26 x 1 mm Chemland 04-296.202.09
Olympus BX60 Olympus Polarized Optical Microscope used in Figure 2
PTFE thread seal tape, 12 mm x 12 mm x 0.1 mm, 60 gm2 Chemland VIT131097
Microscope ps-2PFM setup
Chameleon Ultra II Coherent
FELH0800 - Ø25.0 mm Longpass Filter Thorlabs
FESH0700 - Ø25.0 mm Shortpass Filter Thorlabs
IDQ100 photon-counting avalanche photodiodes  ID Quantique
Multiphoton short-pass emission filter 720 nm  Semrock
Mounted Achromatic Half-Wave Plate, 690-1200 nm Thorlabs
Nikon Plan Apo Oil Immersion 100x/1.4 NA Nikon
piezo 3D stage Piezosystem Jena
Polarizing Beamsplitter Thorlabs
S130C - Slim Photodiode Power Sensor, Si, 400 - 1100 nm, 500 mW Thorlabs
Software
LabView 2018 National Instruments Version 18.0.1f2
Matplotlib library Version 3.3.2
NumPy library Version 1.19.2
SciPy library Version 1.5.2
Spyder Python 3 IDE Version 4.1.5

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References

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