Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Поляризационно-чувствительная двухфотонная микроскопия для определения структуры амилоида без меток

Published: September 8, 2023 doi: 10.3791/65670
Automatic Translation
1, 1, 1
1Institute of Advanced Materials, Wrocław University of Science and Technology

Summary

В данной работе описывается, как поляризационно-чувствительная двухфотонная микроскопия может быть применена для характеристики локальной организации в безметочных амилоидных суперструктурах-сферулитах. В нем также описывается, как подготовить и измерить образец, собрать необходимую установку и проанализировать данные для получения информации о локальной организации амилоидных фибрилл.

Abstract

По сравнению со своим однофотонным аналогом, двухфотонное возбуждение выгодно для экспериментов по биовизуализации из-за его меньшей фототоксичности, более глубокого проникновения в ткани, эффективной работы в плотно упакованных системах и уменьшенной угловой фотоселекции флуорофоров. Таким образом, внедрение поляризационного анализа в двухфотонную флуоресцентную микроскопию (2ПФМ) обеспечивает более точное определение молекулярной организации в образце по сравнению со стандартными методами визуализации, основанными на линейно-оптических процессах. В данной работе мы сосредоточимся на поляризационно-чувствительном 2PFM (ps-2PFM) и его применении при определении молекулярного упорядочения в сложных биоструктурах-амилоидных сферулитах. Нейродегенеративные заболевания, такие как болезнь Альцгеймера или Паркинсона, часто диагностируются путем обнаружения амилоидно-белковых агрегатов, образующихся из-за нарушенного процесса неправильного сворачивания белка. Изучение их структуры приводит к лучшему пониманию пути их создания и, следовательно, к разработке более чувствительных методов диагностики. В данной работе представлен ps-2PFM, адаптированный для определения локального порядка фибрилл внутри сферолитов инсулина крупного рогатого скота и сферических амилоидогенных белковых агрегатов. Более того, мы доказываем, что предложенная методика может разрешить трехмерную организацию фибрилл внутри сферулита.

Introduction

За последние десятилетия, несмотря на значительное развитие многочисленных методов флуоресцентной микроскопии для биовизуализации белков и их агрегатов1, лишь немногие из них были использованы для разрешения их локального упорядочения в образце 2,3. Методом флуоресцентной пожизненной визуализационной микроскопии4 изучена внутренняя структурная гетерогенность амилоидных суперструктур-сферолитов. Кроме того, количественное определение локального упорядочения внутри сложных и плотно упакованных биоструктур, таких как сферолиты, может быть решено с помощью поляризационно-чувствительных методов3. Однако стандартные методы флуоресценции с проникновением в поверхностные ткани ограничены, поскольку использование длин волн УФ-ВИД для возбуждения флуорофоров in vivo приводит к высокомурассеянию света в тканях. Кроме того, такая визуализация часто требует разработки и привязки специфических флуоресцентных зондов к целевой биомолекуле, тем самым увеличивая стоимость и объем работы, необходимой для выполнения визуализации.

Недавно, для решения этих проблем, наша команда адаптировала поляризационно-чувствительную двухфотонную возбужденную флуоресцентную микроскопию (ps-2PFM) для безметочной визуализации биологических структур 6,7. Ps-2PFM позволяет измерять зависимость интенсивности двухфотонной флуоресценции от направления линейной поляризации пучка возбуждения и анализировать поляризацию излучаемой флуоресценции8. Реализация данной методики требует дополнения стандартного тракта возбуждения многофотонной установки микроскопа (рис. 1) полуволновой пластиной для управления плоскостью поляризации света. Затем из сигналов, собранных двумя лавинными фотодами, создаются полярные графики, изображающие зависимость интенсивности двухфотонной возбужденной флуоресценции от поляризации возбуждающего лазерного пучка, собирая таким образом две, взаимно перпендикулярные составляющие поляризации флуоресценции.

Последним этапом является процесс анализа данных с учетом влияния оптических элементов, таких как дихроичные зеркала или объектив с высокой числовой апертурой, на поляризацию. Из-за природы двухфотонного процесса этот метод обеспечивает как уменьшенный угловой фотоотбор, так и повышенное осевое разрешение, так как двухфотонное возбуждение флуорофоров вне фокальной плоскости вероятностно ограничено. Также было доказано, что аналогичные методы могут быть успешно реализованы для визуализации in vivo зондов ближнего инфракрасного диапазона (NIR) для визуализации глубоких тканей9. Ранее Ps-2PFM применялся для изображения флуорофоров в клеточных мембранах10 и ДНК11,12, а также в качестве нестандартных флуоресцентных маркеров биологических систем, таких как наночастицы золота13. Однако во всех этих примерах информация об организации биомолекул была получена опосредованно и требовала заранее определенной взаимной ориентации между флуорофором и биомолекулой.

В одной из наших недавних работ мы показали, что ps-2PFM может быть успешно применен для определения локальной поляризации автофлуоресценции амилоидных суперструктур и флуоресценции тиофлавина Т, амилоид-специфического красителя, связанного с амилоидными фибриллами в сферулитах6. Кроме того, в другом исследовании мы доказали, что ps-2PFM может быть использован для определения ориентации амилоидных фибрилл внутри амилоидных сферолитов в субмикронном режиме, что было подтверждено путем корреляции с изображениями просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ)7. Достижение этого результата стало возможным благодаря i) собственной автофлуоресценции сферолитов-амилоидов при возбуждении одним или двумя фотонами проявлять собственную автофлуоресценцию с максимумами излучения, расположенными в диапазоне от 450 до 500 нм, и сечениями поглощения двух фотонов, сопоставимыми со стандартными флуоресцентными красителями14, ii) математическими моделями, введенными ранее для описания того, как ps-2PEF красителей, мечущих биологические мембраны и структуры ДНК, могут быть применены для Флуоресценция проявляется сферолитами и связанными с ними красителями 8,11,15. Таким образом, прежде чем приступить к анализу, мы настоятельно рекомендуем ознакомиться с необходимой теорией, описанной как в основном тексте, так и в вспомогательной информации нашей первой статьи поэтой теме6. Здесь мы представляем протокол применения метода ps-2PFM для структурной характеристики амилоида бычьих инсулиновых сферолитов без меток.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Подготовка предметных стекол микроскопа с полностью выращенными сферулитами

ПРИМЕЧАНИЕ: См. Таблицу материалов для получения подробной информации обо всех материалах, реагентах и оборудовании, используемых в этом протоколе. Все растворы готовили на деионизированной воде (18,2 МОм·см при 25 °С), полученной из системы очистки воды.

  1. Инкубируют амилоидные сферолиты на основе протокола, описанного Krebs et al16. с некоторыми модификациями, как описано ниже.
    1. Взвесьте 10 мг инсулинового порошка в пробирке объемом 1,5 мл.
    2. Растворяют порошок 1 мл аликвоты деионизированного раствора H2O/HCl (рН 1,5).
    3. Заклейте образец лентой и поместите его в термомиксер для инкубации в течение 24 ч при 70 °C (0 об/мин).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для проведения визуализации амилоидов в их нативной (т.е. гидратированной) среде и предотвращения деформации образца из-за обезвоживания необходимо подготовить предметные стекла микроскопа в соответствии со следующим описанием (схема приведена на рисунке 2).
  2. Тщательно промойте предметное стекло микроскопа водой.
  3. Окуните предметные стекла в метанол и дайте им высохнуть в условиях окружающей среды на беспыльной салфетке.
  4. Берут из пробирки с автоматической пипеткой 100 мкл аликвоту раствора сферолита (шаг 1.1.2) и добавляют в лунку, расположенную в центральной области предметного стекла микроскопа.
  5. Накройте раствор покровным покрывалом, избегая образования пузырьков воздуха.
  6. Нанесите крепление по краям покровного стекла на предметное стекло с помощью автоматической пипетки для запечатывания нативного раствора сферолитов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Очень важно наносить скользящее крепление как на покровный щиток, так и на поверхности скольжения. Делайте это под дымящимся колпаком из-за токсичности летучего растворителя (ксилола). Смотрите врезку на рисунке 2.
  7. Оставьте образец микроскопа при комнатных условиях, чтобы крепление затвердело.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Процесс затвердевания зависит от температуры и влажности, но должен быть завершен в течение 12 часов.
  8. Проверьте правильность образования сферолитов инсулина с помощью поляризационного оптического микроскопа (ПОМ) со скрещенными поляризаторами. Просканируйте образец в поисках характерного узора из светлых областей, называемых мальтийским крестом, как показано на рисунке 3.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Амилоидные сферолиты можно определить как сферические надструктуры, характеризующиеся гетерогенной морфологией со структурой ядро-оболочка. В частности, они состоят из аморфного ядра и радиально растущих амилоидных фибрилл16. Из-за анизотропного характера сферолитовых структур они могут отчетливо взаимодействовать с поляризованным светом (например, за счет преломления) и изменять свою фазу, что можно легко наблюдать при ПОМ со скрещенными поляризаторами. Этот метод был использован для изучения только полностью развитых сферолитов, характеризующихся модельным паттерном мальтийского креста. Следовательно, агрегаты или структурно деформированные сферолиты были исключены из дальнейших исследований.

2. Построение и выравнивание системы

ПРИМЕЧАНИЕ: Схематическое изображение поляризационно-чувствительного двухфотонного микроскопа можно найти на рисунке 1.

  1. Установить фемтосекундный лазер с перестройкой длины волны на выходе в диапазоне 690-1080 нм, например, работающий на лазере Ti:Sapphire с синхронизацией мод с импульсами ~100 фс и частотой повторения 80 МГц.
  2. Добавьте полуволновую пластину, установленную на вращающемся столике, в тракт возбуждения установки для управления поляризацией падающего света в плоскости образца XY-микроскопа.
  3. Установите дихроичное зеркало, чтобы отсечь луч возбуждения от детектирующей оптики.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Оптические характеристики дихроичного зеркала должны позволять отражать пучок возбуждения (к образцу) в ближнем ИК-диапазоне длин волн и быть одновременно прозрачными для диапазона длин волн, соответствующего излучению от образцов.
  4. Установите пьезоэлектрический сканирующий столик для растрового сканирования в плоскости XY для выбранной Z.
  5. Установите иммерсионный объектив с высоким значением NA, например, апохроматический объектив для погружения в масло 100x/1,4 NA.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку вся установка работает в режиме эпифлуоресценции, падающий и излучаемый сигналы проходят мимо одной и той же цели.
  6. На пути излучения добавьте поляризационный светоделитель, который расщепляет двухфотонное возбужденное излучение на две ортогонально поляризованные составляющие (IX иI Y)
  7. Установите два лавинных фотодиода со счетом фотонов (APD) в конфигурации, позволяющей им собирать свет, передаваемый и отраженный с помощью светоделителя соответственно (рис. 1).
  8. Установите на тракте возбуждения и излучения системы правильные фильтры отсечки, зависящие от длины волны, например, длиннопроходный фильтр 800 нм непосредственно в оптическом тракте возбуждения и короткочастотный фильтр 700 в тракте излучения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Проанализируйте спектры излучения сферолита, чтобы исключить любой потенциальный вклад от генерации второй гармоники (ГВГ) или лазерного излучения с помощью правильных эмиссионных фильтров. Стоит также отметить, что эта система также должна позволять измерять чувствительный к поляризации ГВГ, что может быть использовано для определения порядка биомолекул в образцах. Однако анализ данных сигнала ГВГ отличается от флуоресценции, которая более подробно была описана Aït-Belkacem et al.17.
  9. Выровняйте всю систему (используя режим юстировки, встроенный во многие лазеры) до тех пор, пока не будут собраны сигналы одинаковой интенсивности с помощью обоих фотодиодов.
  10. Проверьте, имеет ли луч возбуждения, сфокусированный объективом с высоким значением NA и изображенный на камере, концентрическую круглую форму, как показано на рисунке 4A.
  11. Отрегулируйте время сканирования и соответствующую мощность, чтобы свести к минимуму повреждения, вызванные падением лазера на образец. Пример точечного горения представлен на рисунке 4Б. Измерьте номинальную мощность с помощью цифрового портативного измерителя мощности, подключенного к датчику мощности фотодиода, расположенному на входе в корпус микроскопа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Биологические образцы могут быть легко сожжены из-за лазерной подсветки. В этом случае диапазон мощности 100 -900 мкВт (в фокусной точке объектива) является отличным компромиссом между стабильностью образца и интенсивным излучением.
  12. Перед измерением образца проверяют качество юстировки оптики с изотропным эталонным образцом (например, флуоресцеином, воплощенным в аморфном полимере). Чтобы выполнить калибровочную проверку, следуйте процедуре, описанной в разделе 3, используя изотропный эталон вместо амилоидного образца.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При условии, что установка микроскопии идеально приспособлена для образца с изотропными свойствами, обе составляющие излучения 2P (IX иI Y), обнаруженные с помощью двух APD, должны характеризоваться одинаковой интенсивностью (рис. 4C).

3. Измерение сферолитов бычьего инсулина

ПРИМЕЧАНИЕ: Для выполнения всех описанных измерений ps-2PF использовалось написанное вручную программное обеспечение, которое контролирует положение пьезоэлектрического столика и полуволновой пластины и собирает сигнал с обоих фотодиодов, позволяя строить графики XY (растровые сканы) из выбранных областей на предметных стеклах микроскопа, а также полярные графики по конкретным координатам образца. В протокол также были добавлены дополнительные примечания, которые позволят пользователям выполнять измерения без него, поскольку и пьезостоликом, и вращательным каскадом, используемым для вращения полуволновой пластины, можно управлять с помощью собственных контроллеров или соответствующего программного обеспечения. Тем не менее, настоятельно рекомендуется написать алгоритм, сочетающий угол поворота полуволновой пластины с интенсивностью 2PEF, собранной обоими фотодиодами, поскольку эта корреляция (полярные графики) имеет решающее значение для правильного анализа данных, приводящих к получению структурной информации.

  1. Установите образец со сферолитами на пьезоэлектрический столик (обездвижьте предметное стекло скотчем). Убедитесь, что он установлен таким образом, чтобы тонкая стеклянная сторона (защитное стекло) была обращена к объективу, так как объективы с большим числом характеризуются относительно коротким рабочим расстоянием.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании масляной иммерсии перед установкой и фокусировкой образца на объектив следует нанести небольшую каплю минерального масла.
  2. Изменяя положения XY и Z с помощью ручек микроскопа, сфокусируйте объектив на одном из сферолитов, найденных в растворе, но имейте в виду, что, поскольку диаметры сферолитов обычно находятся в диапазоне десятков мкм, фокусируйтесь в центральной области всей структуры. Обратите внимание на черные и белые ореолы вокруг конкретного сферолита как признаки недостаточного и верхнего фокуса соответственно. Отрегулируйте ось "Z" так, чтобы она находилась между этими крайностями.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Важно найти изолированный образец без структурных дефектов. Очень маленькие сферолиты могут дрейфовать из-за материального напряжения, создаваемого объективом, в то время как самые большие структуры, вероятно, агрегированы или сильно искажены.
  3. Центрируем сферулит в поле зрения наблюдаемой микроскопической плоскости и определяем размер развертки XY, смотря, сколько шагов пьезостадии в направлениях X и Y (отображается на контроллере пьезосцены или в его программном обеспечении) необходимо для покрытия площади всей конструкции.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется настраивать систему таким образом, чтобы начало развертки XY находилось возле одного из углов сферолита и совпадало с нулевым положением столика (X и Y = 0)
  4. Настройте следующие параметры сканирования:
    1. Отрегулируйте поляризацию пучка возбуждения и поверните полуволновую пластину, чтобы получить поляризацию, соответствующую осям «X» и «Y» плоскости образца микроскопа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это можно сделать, измерив полярные графики изотропной флуоресцентной среды, такой как флуоресцеин. Для таких материалов максимальная интенсивность флуоресценции параллельна поляризации пучка возбуждения; таким образом, вращение полуволновой пластинки регулирует поляризацию с осями X и Y на плоскости наблюдения, также обозначаемыми осями X и Y на полярных графиках, как на рисунке 4C. Полные полярные графики можно измерить, собрав измеренную интенсивность 2PEF на обоих фотодиодах для поворота полуволновой пластины на 180° (вращение поляризации света возбуждения на 360°) и соотнеся интенсивность с углом поляризации света возбуждения. Это можно сделать вручную, измерив интенсивность излучения для каждого угла полуволновой пластины отдельно, а затем собрав его в полярный график в программном обеспечении для анализа данных или автоматически, используя специальное или самописное программное обеспечение.
    2. Настройте параметры пьезостадии: скорость сканирования, шаг и дальность, чтобы охватить площадь всего сферулита.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Диапазон сканирования должен быть больше, чем диаметр сферолита, чтобы полностью обрамить всю надстройку в растровом сканировании. Низкая скорость и шаг сканирования позволяют пользователям получать изображения высокого качества; Однако это может привести к возгоранию образца. Поэтому необходим компромисс, зависящий от размера сферолита. Эти параметры не могут быть применены повсеместно. Примерные параметры, используемые на рисунке 5A: диапазон сканирования 45 x 45 мкм, шаг сканирования 1 мкм и скорость сканирования 2 мкм/с.
  5. Откройте затвор, включите фотодиоды и соберите Equation 1 компоненты излучения Equation 2 2P для каждого шага выбранной области сканирования — для пучка возбуждения, поляризованного соответственно осям X, а затем и Y. Примеры двухфотонного возбужденного автофлуоресцентного (2PAF) растрового сканирования сферолитов инсулина представлены на рисунке 5А.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Измерение растровых сканов требует сопоставления координат пьезокаскада с Equation 1 Equation 2 собранными компонентами излучения, что может быть сделано вручную, путем измерения интенсивности в каждой отдельной точке выбранной области, а затем сборки ее в 2D-матрицу, или автоматически, с помощью самописного программного обеспечения. Растровое сканирование может быть представлено в виде суммирования Equation 1 Equation 2 и интенсивности компонентов излучения или отдельно для конкретного компонента излучения. Поскольку они сильно зависят от структуры, структурные искажения внутри сферолитов легко видны. Однако из-за движения предметного столика микроскопа некоторые образцы могут уходить из поля зрения. Поэтому изображения необходимо проверять на наличие артефактов. Необходимо проверить положение сферолита до и после сканирования.
  6. Чтобы выполнить полный поляризационный анализ из определенной точки на образце, выключите пучок возбуждения.
  7. Затем подбирают конкретные координаты пьезостадии, соответствующие выбранному месту на сферолите, где требуется информация об ориентации молекул с разрешением менее мкм.
  8. Отрегулируйте пьезоэлектрический столик так, чтобы поле зрения центрировалось в указанной точке (X, Y).
  9. Включите луч возбуждения и выполните полный (360°) поляризационный Equation 1 анализ и Equation 2 излучение, включив вращение полуволновой пластины (вращение на 180°). Представьте 2PF Ix и Iy компоненты в виде полярного графа (как показано на рисунке 5B).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг можно повторить в разных местах выборки, чтобы собрать достаточное количество данных.

4. Определение локального порядка фибрилл внутри сферолитов инсулина крупного рогатого скота

ПРИМЕЧАНИЕ: Все численные расчеты, связанные с анализом данных, выполнялись с использованием языка программирования Python и на основе функций, доступных в библиотеках NumPy и SciPy. Для построения графика данных требуется библиотека Matplotlib. Все расчеты основаны на формулах, представленных в сопроводительной информации в одной из работ Obstarczyk et al.6.

  1. Моделирование интенсивности двухфотонной флуоресценции, возбуждаемой при заданном распределении молекул с выбранным направлением поляризации падающего света (обозначается как α)
    ПРИМЕЧАНИЕ: Представленные формулы основаны на предположении о параллельных дипольных моментах поглощения и излучения флуорофора. Обсуждение других случаев (например, различные направления дипольных моментов поглощения и излучения, перенос энергии между флуорофорами) см. в статье Le Floc'h et al8.
    1. Найдите параметры, учитывающие изменение электрического поля поляризационными эффектами смешения и деполяризации, вызванными дихроичным зеркалом, установленным в установке:
      1. γ представляет собой амплитудный коэффициент между отражательной способностью дихроичного зеркала Equation 3 и Equation 4 поляризованным светом.
      2. δ представляет собой фазовый сдвиг (эллиптизм) между Equation 3 поляризованным Equation 4 и поляризованным светом.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Правильное определение этих двух параметров имеет решающее значение для успешного определения структурных характеристик из-за их сильного влияния на форму измеренных полярных графиков 11,18. В случае представленной системы оба параметра были определены при эллипсометрических измерениях дихроичного зеркала, применяемого в системе.
    2. Рассчитайте векторы падающего электрического поля, распространяющиеся по осям X и Y каждого угла, измеренного во время измерения ps-TPFM, используя уравнения (1-5).
      Equation 5 (1)
      Equation 6 (2) См.
      Equation 7 (3) См.
      Equation 8 (4) См.
      Equation 9 (5) См.
      ПРИМЕЧАНИЕ Если интенсивность измеряется на всех 360° с шагом 1°, рассчитайте векторы электрического поля для всех 360°. Все углы должны быть в радианах. ρ параметр связан с оптической частотой ω моделируемого электрического поля (ρ=ω·t) и используется интегрированным от 0 до 2π при расчете векторов падающего электрического поля, распространяющихся по осям X и Y для каждого угла , α измерен при измерении ps-TPFM.
    3. Определим функции для переходных дипольных моментов в направлениях трех осей декартовой системы по уравнениям (6-8):
      Equation 10 (6) См.
      Equation 11 (7)
      Equation 12 (8) См.
      ПРИМЕЧАНИЕ: φ - угол ориентации длинной оси амилоидной фибриллы в рамке образца XY. Углы θ и φ — полярные и азимутальные углы, используемые для определения ориентации переходного дипольного момента флуорофора.
    4. Используйте функции, определенные в шаге 4.1.3. определить функции для Jx (Φ,θ,φ) и JY(Φ,θ,φ), которые учитывают вклад фокусировки света с объективом с высокой числовой апертурой в детектирование поляризации флуоресценции в направлениях X и Y с помощью уравнений (9, 10).
      Equation 13 (9) См.
      Equation 14 (10) См.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Факторы K1, K2, K3 связаны с объективом микроскопа, используемым при измерении ps-TPFM. В этих экспериментах использовался апохроматический масляный иммерсионный объектив 100x/1,4 NA с коэффициентами К1, К2, К3 2,945, 0,069 и 1,016 соответственно.
    5. Определим функцию для f(Ω), которая представляет собой молекулярное угловое распределение, зависящее от половины апертуры конуса флуорофора Ψ с переменной толщиной ΔΨ; Используйте уравнение (11). Графическое представление всех трех углов относительно амилоидной фибриллы представлено на рисунке 6.
      Equation 15(11) См.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте внимательны при написании экспоненты - степень 2 работает с аргументом функции, а не со всей функцией!
    6. Определите все коэффициенты fWWIJKL , как показано в уравнениях (12-21).
      Equation 16 (12) См.
      Equation 17 (13)
      Equation 18 (14) См.
      Equation 19 (15) См.
      Equation 20 (16)
      Equation 21 (17)
      Equation 22 (18)
      Equation 23 (19)
      Equation 24 (20) См.
      Equation 25 (21) См.
    7. Рассчитайте интенсивности Equation 26 двухфотонной возбужденной флуоресценции и Equation 27 для каждого измеренного угла (аналогично пункту 4.1.2) с помощью уравнений (22, 23).
      Equation 28Equation 29 = (22)
      Equation 30Equation 31 = (23)
    8. Проверьте, правильно ли работает моделирование, используя следующие значения переменных (размещены в легенде на рисунке 7) и сравните полученные результаты с рисунком 7A-C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Все градусы должны быть записаны в радианах.
  2. Подгонка смоделированных интенсивностей в интенсивность автофлуоресценции с двухфотонным возбуждением сферолитов бычьего инсулина, собранных во время измерений ps-2PFM.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Разрешение структуры сферолита на основе измерений ps-2PFM требует использования уравнений, записанных в протоколе, для моделирования теоретической интенсивности двухфотонной возбужденной флуоресценции и аппроксимации всех параметров, связанных с упорядочением молекулярного флуорофора. Для этого требуется многократное перебор различных значений Φ – угла, описывающего вращение фибриллы в образце XY-микроскопа, и ΔΨ – аберраций конического распределения эмиссионного диполя Ψ из-за вращения молекул в нитях накаливания для фиксированного Ψ до достижения максимально возможного коэффициентаR2 между нормированной интенсивностью двухфотонного сигнала возбужденной флуоресценции, собранной во время измерения, и нормированными интенсивностями, смоделированными в соответствии с Шаг 4.1 протокола.
    1. Определите полуугол Ψ .
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для сферолитов бычьего инсулина она должна быть равна Ψ = 29°6.
    2. Рабочий процесс примерки:
      1. Выберите значение Φ от 0° до 180° (на рисунке 8A и 8B Φ = 16° и 127° соответственно).
      2. Выберите значение ΔΨ от 0° до 90° (на рисунке 8A,B, ΔΨ = 24° и 1° соответственно).
      3. Вычислите Equation 28 (уравнение 22) и Equation 30(уравнение 23) для всего измеренного диапазона углов θ , используя выбранные значения Φ и ΔΨ.
      4. Сравните интенсивности, рассчитанные во время моделирования (обе нормированы до максимального значения
      5. Вычислить Equation 28) с нормированными интенсивностями
      6. Рассчитать Equation 1 и (оба нормированы до максимального значения ), измеренные при измерении Equation 2 Equation 1ps-2PFM.
        ПРИМЕЧАНИЕ: В представленных экспериментах коэффициенты корреляции произведения и момента Пирсона рассчитывались с помощью функции "corrcoef" из библиотеки NumPy Python.
    3. В конце выбираем значения Φ и ΔΨ , приводящие к наибольшим коэффициентам корреляции и сходимости между моделируемыми интенсивностями и измеренным сигналом, аналогично тому, что показано на рисунке 8.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Представленный протокол содержит пошаговое руководство по подготовке амилоидных суперструктур для испытаний с помощью ps-2PFM, построению микроскопической системы и измерениям соответствующего образца. Тем не менее, перед окончательным набором измерений необходимо правильно выровнять APD с изотропным эталоном, что должно привести к сбору симметричного сигнала одинаковой формы и интенсивности на обоих детекторах (рис. 4C). Даже минимальные различия между интенсивностями, измеренными на детекторах по осям X и Y, должны учитываться при дальнейших измерениях и особенно при анализе в качестве соответствующего поправочного коэффициента. После установки образца, содержащего одиночные сферолиты, дающие характерный мальтийский крест на ПОМ, как показано на рисунке 2B, и после выполнения растрового сканирования 2PFM, изображение должно выглядеть примерно так, как показано на рисунке 5A, что согласуется с данными растровых сканирований сферолитов 6,7 и различных организованных биомолекул 11,12 с помощью 2PFM. Можно наблюдать некоторые изменения в расположении оси с наибольшей яркостью, что связано с тем, что интенсивность флуоресцентного сигнала сильно зависит от поляризации пучка возбуждения. Поэтому необходимо проверить, какое положение полуволновой пластины соответствует возбуждению образца по осям X (рис. 5А, вверху) и Y (рис. 5А, внизу). Также стоит обратить внимание на то, как изменяются полярные графики при выполнении полного поляризационного анализа из разных выбранных точек. За пределами сферолита полярный граф выглядит как набор артефактов и случайных всплесков шума сигнала (рис. 5B, I). Такой график также может указывать на дрейф сферолита между измерениями и требовать нахождения новых координат всей структуры с помощью еще одного растрового сканирования 2PF. Правильно измеренные полярные графики из высокоупорядоченных местоположений сферолита инсулина вдоль осей X и Y показаны на рисунке 5B II и III соответственно. Они могут иметь различную форму и геометрию, в зависимости от локальной ориентации и организации флуорофоров, измеренных от выбранной точки7.

Последний шаг протокола ориентирован на анализ полученных данных с помощью алгоритма, основанного на математической модели, объединяющей ориентацию амилоидных волокон в плоскости XY Φ, связанные с ними переходные дипольные моменты флуорофора Ψ и их аберрации ΔΨ (рис. 6) с интенсивностью Equation 1 и Equation 2 двухфотонной индуцированной флуоресценцией. Правильно реализованные функции, представленные в протоколе, должны, после ввода соответствующих входных данных (шаг протокола 4.9), выдавать полярные графы, идентичные представленным на рисунке 7. Любые отклонения — различная ориентация данных, интенсивность или форма моделируемых Equation 26 и Equation 32— указывают на ошибки в коде. Если модель работает, можно переходить к последнему шагу протокола – подгонке смоделированных данных к реальным данным, полученным при измерении ps-2PFM. Выбранные значения Φ и ΔΨ с наибольшими коэффициентами корреляции и сходимостью между моделируемыми интенсивностями и измеренным сигналом должны приводить к аналогичным изображениям, как показано на рисунке 8. Должно быть максимально возможное соответствие Equation 26 Equation 32 функций общей ориентации и форме Equation 1 и Equation 2 а значения Φ и ΔΨ должны соответствовать локальной ориентации фибрилл и флуорофоров в измеренном месте на сферулите. Подобные модели и методы подгонки могут быть использованы и для определения локальной организации других биомолекул, таких какДНК-11.

Figure 1
Рисунок 1: Установка двухфотонной поляризационно-чувствительной микроскопии. Схема, показывающая установку двухфотонного микроскопа, используемую для измерения поляризационно-чувствительной двухфотонной возбужденной флуоресценции сферолитов инсулина крупного рогатого скота. Двухфотонные компоненты возбужденного излучения с горизонтальной и вертикальной поляризацией (в плоскости образца микроскопа) изображаются с помощью IX иI Y соответственно. Сокращения: SP = плоскость выборки; O = цель; DM = дихроичное зеркало; λ/2 = полуволновая пластина; ФНЧ = длинночастотный фильтр; BE = расширитель луча; P = Головной поляризатор; Ti: Sa = Titan: сапфировый лазерный источник света; M = Зеркало; SPF = короткопроходный фильтр; PBS = делитель поляризационного луча; L = оптическая линза; APD = лавинный фотодиод. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Схема, показывающая подготовку предметного стекла/фото. (A) схема, показывающая запечатанную пробоподготовку; (B) фотографии последующих этапов запечатывания образца. I: 100 мкл аликвоты раствора сферолита на предметном стекле микроскопии с лункой, II: покровное стекло, оставленное поверх раствора; III: герметичное уплотнение, образованное из наплавленного полимера (монтировочное). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Контроль качества сферолитов инсулина под поляризованным световым микроскопом. (A1,B1) Светлопольная мода, а также под (A2,B2) скрещенные поляризаторы. Характерный рисунок мальтийского креста можно наблюдать на соответствующих изображениях, сделанных с помощью скрещенных поляризаторов. (А) агрегаты сферолитов со структурными искажениями, (Б) высококачественный изолированный сферулит. Масштабные линейки = 5 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Проверка юстировки системы ps-2PFM. (A) Концентрическое расфокусированное изображение флуоресцеиновой флуоресценции без (A1) и с (A2) дихроичным зеркалом, (B) фотоповрежденный сферулит с выжженными отверстиями, возникающими из-за анализа удлиненной поляризации в выбранных точках вдоль направлений x и y, (C) двухфотонные компоненты возбужденного излучения в зависимости от угла поляризации падающего света, зарегистрированного для изотропного образца (раствора флуоресцеина). и обозначают компоненты излучения, измеренные лавинными фотодиодами, измеряющими оси поляризации излучения X и Y соответственно. Масштабные линейки = 5 мкм (A1,A2), 10 мкм (B). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 5
Рисунок 5: Примеры растровых сканов 2PFM и полярных графиков из безметочного инсулинового сферолита. (A) Растровое сканирование безметочных инсулиновых сферолитов интенсивностью 2PF: поляризация возбуждающего света: (A1) горизонтальная поляризация, (A2) вертикальная поляризация и излучение обозначены белыми стрелками, а на врезке показан тот же сферолит, изображенный под стандартным поляризованным световым микроскопом со скрещенными поляризаторами. (B) Полярные графики, полученные из трех точек, обозначенных на скане А1 (B1, I; В2, II; В3, III). Ixи Iyобозначают компоненты излучения, измеренные лавинными фотодиодами, измеряющими оси поляризации излучения X и Y соответственно. Аббревиатура: 2PF = двухфотонная флуоресценция. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 6
Рисунок 6: Коническое распределение эмиссионного диполя красителя (полуугол, Ψ) по отношению к длинной оси фибриллы. Пунктирной линией показана длинная ось фибриллы. Вращение фибриллы в плоскости образца XY-микроскопа описывается углом. Аберрации Ψ, обусловленные вращением молекул в нитях, описываются выражением ΔΨ. Эта цифра взята из Obstarczyk et al6. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 7
Рисунок 7: Смоделированная интенсивность поляризованной двухфотонной возбужденной флуоресценции. Флуоресценция, рассчитанная для (A) Φ = 1°, Ψ = 1°, ΔΨ = 1°; (Б) Φ = 1°, Ψ = 30°, ΔΨ = 1°; (C) Φ = 1°, Ψ = 30°, ΔΨ = 60°. Красная, синяя и желтая линии соответствуют Equation 26, Equation 32, и Equation 26 + Equation 32, соответственно. Φ угол описывает вращение фибриллы в плоскости образца XY-микроскопа, Ψ - коническое распределение эмиссионного диполя, а ΔΨ - аберрации Ψ из-за молекулярных вращений в нитях. Все остальные параметры во всех случаях были идентичны: К1 = 2,945, К2 = 0,069, К3 = 1,016, γ = 0,01 и δ = 0,98845. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 8
Рисунок 8: Полярные графики экспериментальных наборов данных. (A,B) Примерные полярные графики после аппроксимации двух экспериментальных наборов данных, собранных во время измерений сферолитов бычьего инсулина с помощью ps-TPFM. Измеренная Equation 1 и Equation 2 двухфотонная компоненты возбужденного излучения для осей поляризации излучения X и Y представлены красными и синими точками соответственно, в то время как сплошные линии представляют соответствующие смоделированные компоненты двухфотонного возбужденного флуоресцентного излучения для осей Equation 26 поляризации излучения X и Y и Equation 32. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Поляризационно-чувствительная двухфотонная микроскопия является ценным инструментом для изучения локального упорядочения фибрилл внутри амилоидных суперструктур, требуя лишь небольших модификаций стандартной многофотонной установки. Поскольку он работает с нелинейно-оптическими явлениями, по сравнению с методами однофотонной флуоресцентной микроскопии может быть достигнут меньший угловой фотоотбор и повышенное осевое разрешение. Кроме того, это приводит к меньшему рассеянию света, меньшей фототоксичности и более глубокому проникновению в образец по сравнению с методами флуоресцентной микроскопии с однофотонным возбуждением19,20. Как мы уже доказали, он хорошо подходит для измерений плотно упакованных агрегатов белков, таких как сферолиты, которые могут быть выполнены без меток21.

Однако для эффективного использования описанного здесь метода следует обратить внимание на несколько ключевых моментов. Начиная с пробоподготовки и ее качества, а именно инкубации, всегда следите за тем, чтобы амилоидные суперструктуры росли правильно. В случае сферолитов мы использовали поляризационный оптический микроскоп со скрещенными поляризаторами для локализации зрелых сферолитов, которые дают характерный мальтийский рисунок креста, и имеют радиус ~5 мкм16. Однако сферолиты неоднородны, и в образце можно наблюдать характерные структуры. Поэтому очень важно подбирать отдельные и неискаженные виды. Что касается самой измерительной системы, то крайне важно контролировать поляризацию падающего света, чтобы поляризация луча на входе в корпус микроскопа была точно определена, а деполяризация, вносимая используемыми оптическими элементами, была сведена к минимуму22. Чтобы обеспечить наилучшую производительность, мы рекомендуем использовать высококачественные серебряные зеркала и оптические фильтры, подобранные к длинам волн возбуждения и флуоресцентного излучения. В связи с тем, что поляризация света играет ключевую роль в траектории излучения, важно измерить изотропный эталонный образец перед фактическим измерением. Если тракт возбуждения и детекторы APD выровнены правильно, то на обоих детекторах должен быть одинаково интенсивный сигнал, как показано на рисунке 4C. Эталон должен генерировать сильную двухфотонную возбужденную флуоресценцию при относительно низкой мощности лазера, чтобы избежать фотообесцвечивания; Мы использовали флуоресцеин, так как его двухфотонные сечения поглощения для разных длин волн уже были описаны в литературе23.

Чтобы правильно определить расположение структур внутри сферолитов, большое внимание следует уделить и анализу данных. Основным предположением этой модели является коллинеарность переходного дипольного момента поглощения и излучения света. При таком предположении выравнивание переходного дипольного момента молекулы параллельно поляризации падающего света позволяет сочетать его с внутренней структурой испытуемого образца, что дает наибольшую интенсивность излучения. Данная модель также может быть использована в качестве хорошего приближения для малых различий в углах между двумя дипольными моментами8 , но требует дальнейших модификаций для больших отклонений. Поэтому, как описано, некоторые предположения относительно образца должны быть приняты во внимание априори при визуализации и анализе данных. В модельном случае, на котором основано моделирование и уравнения, используемые в этом методе, основным источником деполяризации в системе является дихроичное зеркало. Поэтому, прежде чем приступить к анализу данных, необходимо определить параметры, ответственные за деполяризацию, вносимую дихроичным зеркалом из-за их влияния на форму собранных полярных графов и, следовательно, правильное определение организации молекул внутри исследуемой структуры при подгонке18. Это становится ключевой проблемой, особенно в случае измерений для нескольких длин волн, поскольку изменение эллиптичности дихроичного зеркала отчетливо зависит от длины волны12. Индукция деполяризации может сильно повлиять на характеристики собранного сигнала11. И последнее, но не менее важное: при создании скрипта для анализа данных следует обратить внимание на введение математических функций и переменных, представленных в последней части протокола. Чтобы избежать ошибок, сосредоточьтесь на таких возможностях, как вызов нескольких функций и глобальные параметры, что также значительно ускорит время анализа.

Отдельно стоит упомянуть о наиболее распространенных проблемах, с которыми можно столкнуться при использовании описанного метода. Время подготовки образца очень сильно зависит от скорости упрочнения монтажа. Чтобы ускорить этот процесс, мы рекомендуем подготовить образцы в теплом, сухом месте, а раствор сферолита запечатать перед установкой в микроскоп. Слишком ранние измерения могут привести к распломбированию предметного стекла и разрушению использованной линзы объектива. Кроме того, несмотря на надлежащую подготовку образца, мелкие сферолиты могут плавать в растворе во время измерения из-за напряжения материала, создаваемого объективом. Чтобы этого избежать, мы советуем сканировать изолированные структуры среднего размера, так как самые крупные из них обычно являются агрегатами. Перед началом измерения рекомендуется проверить, переместился ли сканируемый сферулит после получения данных по сравнению с изображением. Кроме того, несмотря на правильное выравнивание всех оптических элементов и детекторов, используемых для измерения ps-2PFM, измеренные интенсивности Equation 1 и Equation 2 изотропный эталон все еще могут незначительно отличаться по интенсивности. В таком случае это необходимо учитывать при анализе данных выборочных измерений путем умножения одной из интенсивностей на поправочный коэффициент, определенный при эталонных измерениях. И последнее, но не менее важное: возможно, что во время процедуры аппроксимации скрипт не сможет найти совпадающие значения Φ и ΔΨ. Это может быть связано с несколькими факторами – данные были собраны из неорганизованного места на образце, например, ядра сферолита; исследуемая структура не была полностью сформирована в процессе инкубации; некорректное моделирование и Equation 32; использование некорректных параметров дихроичного зеркала Equation 26 γ и δ; слишком большой шаг для углов Φ иΔ Ψ между каждой итерацией при подгонке. В случае неорганизованного пятна мы рекомендуем попробовать собрать данные с точек, лежащих ближе к периметру исследуемого сооружения. В случае не до конца сформировавшейся структуры повторите инкубацию или поищите на слайде другие структуры. В случае некорректного моделирования вручную проверьте, изменяются ли смоделированные интенсивностиEquation 26, изменяя параметры Φ, Ψ и ΔΨ и Equation 32 исправляйте ошибки в коде. В случае неправильных параметров дихроичного зеркала внимательно проверьте γ и δ параметры дихроичного зеркала, используемого во время измерений. В случае большого шага, установленного для углов во время подгонки, уменьшите шаг между последовательными итерациями до 2º или 1º. Следует также помнить, что в случае сильной локальной дезорганизации структурыR2 всегда будет ниже, часто в пределах 0,5–0,6. Это связано с тем, что представленная модель описывает высокоупорядоченные молекулы, в которых большинство переходных дипольных моментов выровнены в одном направлении; Следовательно, сопоставление аморфных или сильно неупорядоченных структур приводит к более низким коэффициентам корреляции. Поэтому крайне важно обладать хотя бы некоторой структурной информацией об образце перед измерением, чтобы правильно проанализировать полученные данные.

Также стоит отметить, что представленный метод обладает рядом ограничений. Анализ данных может привести к получению нескольких значений углов Φ иΔ Ψ с достаточно высокими коэффициентами корреляции, что потребует от экспериментатора использования своих знаний и опыта для выбора соответствующих значений. При этом должны быть учтены граничные условия, такие как то, что полуугол конуса флуорофора Ψ всегда должен быть больше его аберрации ΔΨ. Кроме того, сравнивая наши данные с литературой, стоит отметить, что в некоторых работах Ψ описывается как угол полного конуса, в то время как мы оперируем углом полуконуса. Еще одним ограничением является разрешение измерений, ограниченное субмикронным разрешением. В связи с этим фотоселективность системы и результирующее определение локальной организации основываются на усредненном сигнале от фибрилл, возбужденных в фокальном пятне, а не на отдельных структурах. Кроме того, сам образец должен обладать достаточным квантовым выходом флуоресценции, так как длительное воздействие падающей лазерной мощности (необходимое для получения данных для полярных графиков) может быть деструктивным и повлиять на результаты.

Несмотря на эти трудности, мы считаем, что метод, представленный в этой статье, имеет широкий спектр применений для визуализации биоструктур на основе меток и без меток в гидратированных и сложных средах. Ранее мы показали, что локальный порядок фибрилл, рассчитанный по данным ps-2PEF, коррелирует с информацией, полученной с помощью просвечивающей электронной микроскопии7. Таким образом, мы подтвердили валидность ps-2PEF в биовизуализации и еще больше расширили знания о структурном упорядочении амилоидных суперструктур. Этот метод может быть применен для изучения происхождения собственной флуоресценции, наблюдаемой в случае различных компонентов биологических образцов, таких как автофлуоресценция белковых агрегатов — амилоидов. Имея соответствующие данные об ориентации направлений дипольного момента поглощения/излучения относительно длинной оси амилоидных фибрилл, оптические свойства фибрилл могут быть соотнесены с их структурой6. Мы указали, что для структур с уже определенным углом Ψ данная методика позволяет выявлять отчетливые структурные особенности амилоидных суперструктур и полиморфы инсулиновых суперструктур по уровню их организации7. Как отмечалось ранее в протоколе, представленная установка может быть также применена для измерений генерации второй гармоники, чувствительной к поляризации, которая также является методом двухфотонной микроскопии без меток24. Это потребует не только установки различных оптических фильтров, но и изменения формул, используемых для анализа данных25. Более того, с добавлением правильно выровненной четвертьволновой пластины его можно было бы использовать для возбуждения образца циркулярно поляризованным светом, что может привести к генерации хиральных нелинейно-оптических свойств амилоидов, поскольку они являются хиральными биополимерами с подтвержденными сильными хирооптическими свойствами26. Однако в таком случае постоянно вращающийся электрический вектор привел бы к постоянному изменению направления возбужденного излучения, что сделало бы невозможным определение какой-либо структурной информации с помощью уравнений, представленных в данной рукописи. В целом, ps-2PEF является многообещающим инструментом для неинвазивного определения организации в многочисленных сложных биоструктурах с упорядоченными эмиссионными диполиями, таких как белковые агрегаты, ДНК или ткани.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.

Acknowledgments

Работа выполнена при поддержке проекта Sonata Bis 9 (2019/34/E/ST5/00276), финансируемого Национальным научным центром Польши.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sample preparation
Coverslips, 24 x 24 mm Chemland 04-298.202.04
DPX mountant for histology Sigma-Aldrich 6522 Slide mountant
Eppendorf Safe-Lock tubes, 1.5 mL, polypropylene Chemland 02-63102
Eppendorf ThermoMixer C Eppendorf Used for spherulite incubation
HLP 5UV Water purification system Hydrolab Source of dionized water used in sample preparation
Hydrochloric acid (≥37%, APHA ≤10), Sigma-Aldrich 30721-M
Insulin powder from the bovine pancreas (≥25 units/mg (HPLC)) Sigma-Aldrich I5500
Methanol (HPLC grade) Sigma-Aldrich 270474
Microscope slides with a concave, 76 x 26 x 1 mm Chemland 04-296.202.09
Olympus BX60 Olympus Polarized Optical Microscope used in Figure 2
PTFE thread seal tape, 12 mm x 12 mm x 0.1 mm, 60 gm2 Chemland VIT131097
Microscope ps-2PFM setup
Chameleon Ultra II Coherent
FELH0800 - Ø25.0 mm Longpass Filter Thorlabs
FESH0700 - Ø25.0 mm Shortpass Filter Thorlabs
IDQ100 photon-counting avalanche photodiodes  ID Quantique
Multiphoton short-pass emission filter 720 nm  Semrock
Mounted Achromatic Half-Wave Plate, 690-1200 nm Thorlabs
Nikon Plan Apo Oil Immersion 100x/1.4 NA Nikon
piezo 3D stage Piezosystem Jena
Polarizing Beamsplitter Thorlabs
S130C - Slim Photodiode Power Sensor, Si, 400 - 1100 nm, 500 mW Thorlabs
Software
LabView 2018 National Instruments Version 18.0.1f2
Matplotlib library Version 3.3.2
NumPy library Version 1.19.2
SciPy library Version 1.5.2
Spyder Python 3 IDE Version 4.1.5

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Petazzi, R. A., Aji, A. K., Chiantia, S. Progress in Molecular Biology and Translational Science. Giraldo, J., Ciruela, F. 169, Academic Press. 1-41 (2020).
  2. Kress, A., et al. Probing orientational behavior of MHC class I protein and lipid probes in cell membranes by fluorescence polarization-resolved imaging. Biophysical Journal. 101 (2), 468-476 (2011).
  3. Duboisset, J., et al. Thioflavine-T and Congo Red reveal the polymorphism of insulin amyloid fibrils when probed by polarization-resolved fluorescence microscopy. The Journal of Physical Chemistry B. 117 (3), 784-788 (2013).
  4. De Luca, G., et al. Probing ensemble polymorphism and single aggregate structural heterogeneity in insulin amyloid self-assembly. Journal of Colloid and Interface Science. 574, 229-240 (2020).
  5. Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
  6. Obstarczyk, P., Lipok, M., Grelich-Mucha, M., Samoć, M., Olesiak-Bańska, J. Two-photon excited polarization-dependent autofluorescence of amyloids as a label-free method of fibril organization imaging. The Journal of Physical Chemistry Letters. 12 (5), 1432-1437 (2021).
  7. Obstarczyk, P., Lipok, M., Żak, A., Cwynar, P., Olesiak-Bańska, J. Amyloid fibrils in superstructures - local ordering revealed by polarization analysis of two-photon excited autofluorescence. Biomaterials Science. 10 (6), 1554-1561 (2022).
  8. Le Floc'h, V., Brasselet, S., Roch, J. -F., Zyss, J. Monitoring of orientation in molecular ensembles by polarization sensitive nonlinear microscopy. The Journal of Physical Chemistry B. 107 (45), 12403-12410 (2003).
  9. Chen, C., et al. In vivo near-infrared two-photon imaging of amyloid plaques in deep brain of Alzheimer's disease mouse model. ACS Chemical Neuroscience. 9 (12), 3128-3136 (2018).
  10. Gasecka, P., Balla, N. K., Sison, M., Brasselet, S. Lipids-fluorophores interactions probed by combined nonlinear polarized microscopy. The Journal of Physical Chemistry B. 125 (50), 13718-13729 (2021).
  11. Mojzisova, H., et al. Polarization-sensitive two-photon microscopy study of the organization of liquid-crystalline DNA. Biophysical Journal. 97 (8), 2348-2357 (2009).
  12. Olesiak-Banska, J., et al. Liquid crystal phases of DNA: Evaluation of DNA organization by two-photon fluorescence microscopy and polarization analysis. Biopolymers. 95 (6), 365-375 (2011).
  13. Olesiak-Banska, J., et al. Gold nanorods as multifunctional probes in a liquid crystalline DNA matrix. Nanoscale. 5 (22), 10975-10981 (2013).
  14. Grelich-Mucha, M., Lipok, M., Różycka, M., Samoć, M., Olesiak-Bańska, J. One- and two-photon excited autofluorescence of lysozyme amyloids. The Journal of Physical Chemistry Letters. 13 (21), 4673-4681 (2022).
  15. Brasselet, S., et al. Fluorescent Methods to Study Biological Membranes. Mély, Y., Duportail, G. , Springer. Berlin Heidelberg. 311-337 (2013).
  16. Krebs, M. R., et al. The formation of spherulites by amyloid fibrils of bovine insulin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (40), 14420-14424 (2004).
  17. Aït-Belkacem, D., Gasecka, A., Munhoz, F., Brustlein, S., Brasselet, S. Influence of birefringence on polarization resolved nonlinear microscopy and collagen SHG structural imaging. Optics Express. 18 (14), 14859-14870 (2010).
  18. Schön, P., Munhoz, F., Gasecka, A., Brustlein, S., Brasselet, S. Polarization distortion effects in polarimetric two-photon microscopy. Optics Express. 16 (25), 20891-20901 (2008).
  19. Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron. 50 (6), 823-839 (2006).
  20. Zipfel, W. R., Williams, R. M., Webb, W. W. Nonlinear magic: multiphoton microscopy in the biosciences. Nature Biotechnology. 21 (11), 1369-1377 (2003).
  21. Ferrand, P., et al. Ultimate use of two-photon fluorescence microscopy to map orientational behavior of fluorophores. Biophysical Journal. 106 (11), 2330-2339 (2014).
  22. Chipman, R. A. Depolarization index and the average degree of polarization. Applied Optics. 44 (13), 2490-2495 (2005).
  23. de Reguardati, S., Pahapill, J., Mikhailov, A., Stepanenko, Y., Rebane, A. High-accuracy reference standards for two-photon absorption in the 680–1050 nm wavelength range. Optics Express. 24 (8), 9053-9066 (2016).
  24. Mansfield, J. C., Mandalia, V., Toms, A., Winlove, C. P., Brasselet, S. Collagen reorganization in cartilage under strain probed by polarization sensitive second harmonic generation microscopy. Journal of The Royal Society Interface. 16 (150), 20180611 (2019).
  25. Duboisset, J., Aït-Belkacem, D., Roche, M., Rigneault, H., Brasselet, S. Generic model of the molecular orientational distribution probed by polarization-resolved second-harmonic generation. Physical Review A. 85 (4), 043829 (2012).
  26. Loksztejn, A., Dzwolak, W. Chiral Bifurcation in aggregating insulin: an induced circular dichroism study. Journal of Molecular Biology. 379 (1), 9-16 (2008).

Tags

Поляризационно-чувствительная Двухфотонная микроскопия Безметочная структурная характеристика амилоида Эксперименты по биовизуализации Фототоксичность Проникновение в ткани Плотно упакованные системы Угловая фотоселекция Флуорофоры Поляризационный анализ Двухфотонная флуоресцентная микроскопия (2PFM) Молекулярная организация Стандартные методы визуализации Линейные оптические процессы Поляризационно-чувствительный 2PFM (ps-2PFM) Молекулярный порядок Сложные биоструктуры Амилоидные сферулы Нейродегенеративные заболевания Болезнь Альцгеймера Паркинсона белковые агрегаты амилоидов нарушение процесса неправильного сворачивания белков методы диагностики локальный порядок фибрилл сферолиты инсулина крупного рогатого скота
Поляризационно-чувствительная двухфотонная микроскопия для определения структуры амилоида без меток
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lipok, M., Obstarczyk, P.,… More

Lipok, M., Obstarczyk, P., Olesiak-Bańska, J. Polarization-Sensitive Two-Photon Microscopy for a Label-Free Amyloid Structural Characterization. J. Vis. Exp. (199), e65670, doi:10.3791/65670 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter