Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Polarisationskänslig tvåfotonmikroskopi för en etikettfri amyloidstrukturell karakterisering

Published: September 8, 2023 doi: 10.3791/65670
Automatic Translation
1, 1, 1
1Institute of Advanced Materials, Wrocław University of Science and Technology

Summary

Denna artikel beskriver hur polarisationskänslig tvåfotonmikroskopi kan användas för att karakterisera den lokala organisationen inom etikettfria amyloida suprastrukturer-sfäruliter. Den beskriver också hur man förbereder och mäter provet, sätter ihop den nödvändiga installationen och analyserar data för att få information om den lokala organisationen av amyloidfibriller.

Abstract

Jämfört med sin motsvarighet med en foton är tvåfotonexcitation fördelaktig för bioavbildningsexperiment på grund av dess lägre fototoxicitet, djupare vävnadspenetration, effektiva drift i tätt packade system och minskat vinkelfotourval av fluoroforer. Således ger introduktionen av polarisationsanalys i tvåfotonfluorescensmikroskopi (2PFM) en mer exakt bestämning av molekylär organisation i ett prov jämfört med standardavbildningsmetoder baserade på linjära optiska processer. I detta arbete fokuserar vi på polarisationskänslig 2PFM (ps-2PFM) och dess tillämpning vid bestämning av molekylär ordning inom komplexa biostrukturer-amyloidsfäruliter. Neurodegenerativa sjukdomar som Alzheimers eller Parkinsons diagnostiseras ofta genom detektion av amyloid-proteinaggregat som bildats på grund av en försämrad proteinfelveckningsprocess. Att utforska deras struktur leder till en bättre förståelse av deras skapandeväg och följaktligen till att utveckla känsligare diagnostiska metoder. Denna artikel presenterar ps-2PFM anpassad för bestämning av lokal fibrillordning inuti bovina insulinsfäruliter och sfäriska amyloidogena proteinaggregat. Dessutom bevisar vi att den föreslagna tekniken kan lösa den tredimensionella organisationen av fibriller inuti sfäreliten.

Introduction

Under de senaste decennierna, även om det har skett en betydande utveckling av många fluorescensmikroskopitekniker för bioavbildning av proteiner och deras aggregat1, har endast ett fåtal använts för att bestämma deras lokala ordning inom provet 2,3. Fluorescenslivstidsmikroskopi4 användes för att studera den inneboende strukturella heterogeniteten hos amyloida suprastrukturer-sfäruliter. Dessutom kunde kvantitativ bestämning av den lokala ordningen inuti komplexa och tätt packade biostrukturer såsom sfäruliter lösas med hjälp av polarisationskänsliga metoder3. Standardfluorescenstekniker med ytlig vävnadspenetration är dock begränsade eftersom användning av UV-VIS-våglängder för att excitera fluoroforer in vivo leder till hög vävnadsljusspridning5. Dessutom kräver sådan avbildning ofta att man designar och binder specifika fluorescerande sonder till en riktad biomolekyl, vilket ökar kostnaden och mängden arbete som krävs för att utföra avbildning.

Nyligen, för att ta itu med dessa problem, har vårt team anpassat polarisationskänslig tvåfotonexciterad fluorescensmikroskopi (ps-2PFM) för etikettfri avbildning av biologiska strukturer 6,7. Ps-2PFM möjliggör mätning av beroendet av tvåfotonfluorescensintensitet på excitationsstrålens linjära polarisationsriktning och analys av polarisationen av den emitterade fluorescensen8. Implementeringen av denna teknik kräver komplettering av den vanliga excitationsvägen för multifotonmikroskop (figur 1) med en halvvågsplatta för att styra ljusets polarisationsplan. Sedan skapas polära grafer, som visar beroendet av tvåfotonexciterad fluorescensintensitet på polarisationen av excitationslaserstrålen, från signaler som samlats in av två lavinfotodioder, och samlar på så sätt de två, ömsesidigt vinkelräta komponenterna av fluorescenspolarisation.

Det sista steget är dataanalysprocessen, som tar hänsyn till effekten av de optiska elementen, såsom dikroiska speglar eller ett högt numeriskt bländarobjektiv, på polarisationen. På grund av tvåfotonprocessens natur ger denna metod både reducerad vinkelfotoselektion och förbättrad axiell upplösning, eftersom tvåfotonexcitation av fluoroforer utanför fokalplanet är probabilistiskt begränsad. Det visade sig också att liknande metoder framgångsrikt kunde implementeras för in vivo-avbildning av nära-infraröda prober (NIR) för djupvävnadsavbildning9. Ps-2PFM har tidigare tillämpats på avbildningsfluoroforer i cellmembran10 och DNA11,12, samt icke-standardiserade fluorescerande markörer för biologiska system, såsom guldnanopartiklar13. Men i alla dessa exempel erhölls informationen om organisationen av biomolekyler indirekt och krävde en fördefinierad ömsesidig orientering mellan en fluorofor och en biomolekyl.

I en av våra senaste artiklar har vi visat att ps-2PFM framgångsrikt kan användas för att bestämma den lokala polarisationen av autofluorescensen hos amyloidsuprastrukturer och fluorescens från tioflavin T, ett amyloidspecifikt färgämne, bundet till amyloidfibriller i sfäruliter6. I en annan studie har vi dessutom bevisat att ps-2PFM kan användas för att detektera amyloidfibrillernas orientering inuti amyloidsfäruliter i en submikronstorleksregim, vilket bekräftades genom att korrelera den med transmissionselektronmikroskopi (TEM) avbildning7. Uppnåendet av detta resultat var möjligt tack vare i) inneboende autofluorescens av sfäruliter-amyloider, när de exciteras med antingen en eller två fotoner, uppvisar inneboende autofluorescens med emissionsmaxima belägna i ett område från 450 till 500 nm och två fotonabsorptionstvärsnitt jämförbara med standardfluorescerande färgämnen14, ii) matematiska modeller som introducerats tidigare för att beskriva hur ps-2PEF av färgämnen som märker biologiska membran och DNA-strukturer kan tillämpas på fluorescens som uppvisas av sfäruliter och färgämnen bundna till dem 8,11,15. Således, innan vi fortsätter med analysen, rekommenderar vi starkt att du tittar igenom den nödvändiga teorin som beskrivs i både huvudtexten och stödinformationen i vår första artikel om detta ämne6. Här presenterar vi protokollet för hur man kan tillämpa ps-2PFM-tekniken för en etikettfri amyloid strukturell karakterisering av bovina insulinsfäruliter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Förbereda objektglasen med fullvuxna sfäruliter

OBS: Se materialtabellen för detaljer om alla material, reagenser och utrustning som används i detta protokoll. Alla lösningar bereddes med avjoniserat vatten (18,2 MΩ·cm vid 25 °C) erhållet från vattenreningssystemet.

  1. Inkubera amyloidsfäruliter baserat på det protokoll som beskrivs av Krebs et al16. med vissa modifieringar, som beskrivs nedan.
    1. Väg upp 10 mg insulinpulver i en 1,5 ml tub.
    2. Lös upp pulvret med en alikvot på 1 ml av den avjoniserade H2O/HCl-lösningen (pH 1,5).
    3. Försegla provet med tejp och lägg det i en termomixer för att inkubera i 24 timmar vid 70 °C (0 rpm).
      OBS: För att utföra avbildning av amyloider i deras ursprungliga (dvs. hydratiserade) miljö och förhindra sample deformation på grund av uttorkning, är det nödvändigt att förbereda mikroskopglas enligt följande beskrivning (schema visas i figur 2).
  2. Tvätta mikroskopglaset noggrant med vatten.
  3. Doppa objektglasen i metanol och låt dem torka under omgivningsförhållanden på en dammfri torkduk.
  4. Ta en alikvot på 100 μl av sfärulitlösningen från röret med en automatisk pipett (punkt 1.1.2) och tillsätt den till brunnen i mitten av objektglaset.
  5. Täck lösningen med ett täckglas och undvik att luftbubblor bildas.
  6. Placera monteringsmedel längs kanterna på täckglaset på objektglaset med en automatisk pipett för att försegla sfäruliternas ursprungliga lösning.
    OBS: Det är av stor vikt att deponera glidmontermedel på både täckglaset och glidytorna. Gör detta under rykande huva på grund av toxiciteten hos det flyktiga lösningsmedlet (xylen). Se den infällda bilden i figur 2.
  7. Lämna mikroskopet sample under omgivande förhållanden för att monteringsanten ska härda.
    OBS: Härdningsprocessen är temperatur- och luftfuktighetsberoende men bör slutföras inom 12 timmar.
  8. Kontrollera om insulinsfäruliter bildades korrekt med hjälp av ett polariserat optiskt mikroskop (POM) med korsade polarisatorer. Skanna igenom provet och leta efter ett karakteristiskt mönster av ljusa områden, ett så kallat malteserkors, som visas i figur 3.
    OBS: Amyloidsfäruliter kan definieras som sfäriska överbyggnader som kännetecknas av en heterogen morfologi med en kärnskalstruktur. I detalj består de av en amorf kärna och radiellt växande amyloidfibriller16. På grund av den anisotropa karaktären hos sfärulitstrukturer kan de distinkt interagera med polariserat ljus (t.ex. genom refraktion) och ändra sin fas, vilket lätt kan observeras under POM med korsade polarisatorer. Denna metod användes för att studera endast fullt utvecklade sfäruliter som karakteriserades av ett modellliknande malteskorsmönster. Ballast eller strukturellt snedvridna sfäruliter uteslöts därför från ytterligare undersökningar.

2. Bygga och anpassa systemet

OBS: En schematisk representation av ett polarisationskänsligt tvåfotonmikroskop finns i figur 1.

  1. Installera en femtosekundlaser med utgångsvåglängdsavstämbarheten i intervallet 690-1 080 nm, t.ex.ample, som arbetar på en lägeslåst Ti: Sapphire-laser med ~100 fs pulser med 80 MHz repetitionshastighet.
  2. Lägg till en halvvågsplatta monterad på ett rotationssteg till excitationsvägen för uppställningen för att kontrollera polarisationen av det infallande ljuset i XY-mikroskopets provplan.
  3. Installera dikrospegeln för att skära av excitationsstrålen från detekteringsoptiken.
    OBS: De optiska egenskaperna hos en dikroisk spegel bör göra det möjligt att reflektera excitationsstrålen (till provet) i NIR-våglängdsområdet och samtidigt vara transparent för det våglängdsområde som motsvarar emissionen från proverna.
  4. Installera ett piezoelektriskt skanningssteg för rasterskanningar inom XY-planet för en vald Z.
  5. Montera det höga NA-nedsänkningsobjektivet, till exempel ett apokromatiskt oljenedsänkningsobjektiv 100x/1.4 NA.
    OBS: Eftersom hela installationen fungerar i ett epi-fluorescensläge, passerar de infallande och utsända signalerna samma mål.
  6. I emissionsvägen lägger du till en polariserande stråldelare som delar upp tvåfotonexciterad emission i två ortogonalt polariserade komponenter (I, X och I, Y)
  7. Installera två fotonräknande lavinfotodioder (APD) i en konfiguration som gör det möjligt för dem att samla in ljus som överförs respektive reflekteras med hjälp av stråldelaren (figur 1).
  8. Montera korrekta våglängdsberoende cut-off-filter på systemets excitations- och emissionsväg, t.ex. ett 800 nm långpassfilter direkt i den optiska excitationsvägen och ett 700 kortpassfilter i emissionsbanan.
    OBS: Analysera emissionsspektra från sfärulit så att eventuella bidrag från andra övertonsgenereringen (SHG) eller laserljus kan uteslutas med hjälp av rätt emissionsfilter. Det är också värt att notera att detta system också bör tillåta mätningar av polarisationskänslig SHG, som kan användas för att bestämma ordningen på biomolekyler i proverna. Dataanalysen av SHG-signalen skiljer sig dock från fluorescens, som mer detaljerat beskrevs av Aït-Belkacem et al.17.
  9. Rikta in hela systemet (med hjälp av det justeringsläge som är inbyggt i många lasrar) tills liknande signalintensiteter samlas in med båda fotodioderna.
  10. Kontrollera om excitationsstrålen som fokuseras av det höga NA-objektivet och avbildas på en kamera har en koncentrisk cirkulär form som visas i figur 4A.
  11. Justera skanningstiden och motsvarande effekt för att minimera skadan som induceras av den infallande lasern på sample. Exemplarisk punktliknande bränning visas i figur 4B. Mät den nominella effekten med hjälp av en digital handhållen effektmätare ansluten till en fotodiodeffektsensor placerad vid ingången till mikroskopets kropp.
    OBS: Biologiska prover kan lätt brännas på grund av laserbelysning. I det här fallet visade sig effektområdet 100–900 μW (vid objektivlinsens brännpunkt) vara en utmärkt kompromiss mellan provstabilitet och intensiv emission.
  12. Före provmätningen, testa kvaliteten på inriktningen av optiken med ett isotropt referensprov (t.ex. fluorescein inbäddat i den amorfa polymeren). För att utföra kalibreringskontrollen, följ proceduren som beskrivs i avsnitt 3 med en isotrop referens istället för ett amyloidprov.
    OBS: Med ett antagande om att mikroskopiuppställningen är idealiskt justerad för provet med isotropa egenskaper, bör båda 2P-emissionskomponenterna (IX och IY) detekterade med två APD karakteriseras av samma intensitet (Figur 4C).

3. Mätning av bovint insulinsfäruliter

OBS: För att utföra alla beskrivna ps-2PF-mätningar användes handskriven programvara, som styr positionerna för det piezoelektriska steget och halvvågplattan och samlar in signalen från båda fotodioderna, vilket möjliggör plottning av XY-skanningar (rasterskanningar) från utvalda områden på mikroskopglas samt polära grafer från specifika provkoordinater. Ytterligare anmärkningar har också lagts till i protokollet, vilket gör det möjligt för användare att utföra mätningen utan det, eftersom både piezosteget och rotationssteget som används för att rotera halvvågsplattan kan styras med hjälp av deras egna styrenheter eller motsvarande programvara. Ändå rekommenderas det starkt att skriva en algoritm som kombinerar rotationsvinkeln för en halvvågsplatta med 2PEF-intensitet som samlas in med båda fotodioderna eftersom denna korrelation (polära grafer) är avgörande för korrekt dataanalys som resulterar i strukturell information.

  1. Montera provet med sfäruliter på det piezoelektriska steget (immobilisera glasglaset med tejp). Var noga med att montera den på ett sätt där en tunn glassida (täckglas) är vänd mot objektivet eftersom höga numeriska mål kännetecknas av relativt korta arbetsavstånd.
    OBS: Eftersom nedsänkning i olja används bör en liten droppe mineralolja appliceras på objektivet innan provmontering och fokusering.
  2. Genom att ändra XY- och Z-positioner med hjälp av mikroskoprattar, fokusera objektivet på en av sfäruliter som finns i lösningen, men var medveten om att eftersom sfärulitdiametrar vanligtvis ligger i intervallet tiotals μm, fokusera inom det centrala området av hela strukturen. Leta efter svarta och vita halos runt den specifika sfäruliten som tecken på under- respektive övre fokus. Justera "Z"-axeln så att den ligger mellan dessa ytterligheter.
    OBS: Det är viktigt att hitta ett isolerat prov utan strukturella defekter. Extremt små sfäruliter kan glida av på grund av den materialspänning som objektivet medför, medan de största strukturerna troligen är aggregerade eller mycket förvrängda.
  3. Centrera sfäruliten i synfältet för det observerade mikroskopiska planet och bestäm storleken på XY-skanningen genom att titta på hur många piezostagesteg i X- och Y-riktningarna (visas på piezostage-styrenheten eller i dess programvara) som behövs för att täcka hela strukturens yta.
    OBS: Det rekommenderas att ställa in systemet på ett sådant sätt att början av XY-skanningen är placerad nära ett av sfärulitens hörn och sammanfaller med nollpositionen för stage (X och Y = 0)
  4. Justera följande skanningsparametrar:
    1. Justera polarisationen av excitationsstrålen och rotera halvvågsplattan för att erhålla polarisationen som motsvarar "X" och "Y" -axlarna i mikroskopet sample plan.
      OBS: Detta kan göras genom att mäta de polära graferna för isotropt fluorescerande medium som fluorescein. För sådana material är den maximala fluorescensintensiteten parallell med excitationsstrålens polarisation; Att rotera halvvågsplattan justerar således polarisationen med X- och Y-axeln på observationsplanet, även betecknad som X- och Y-axeln på polära grafer som i figur 4C. Fullständiga polära grafer kan mätas genom att samla in den uppmätta 2PEF-intensiteten på båda fotodioderna för 180° rotation av halvvågsplattan (360° rotation av excitationsljuspolarisation) och korrelera intensiteten med excitationsljusets polarisationsvinkel. Det kan göras manuellt, genom att mäta emissionsintensiteten för varje halvvågsplattvinkel separat och sedan sätta ihop den till en polär graf i dataanalysprogramvara eller automatiskt, med hjälp av dedikerad eller egenskriven programvara.
    2. Justera piezostageparametrarna: skanningshastighet, steg och intervall för att täcka hela sfäreliten.
      OBS: Skanningsområdet måste vara högre än sfärulitdiametern för att helt rama in hela överbyggnaden inom rasterskanningen. Låg skanningshastighet och steg gör det möjligt för användare att få bilder av hög kvalitet; Detta kan dock leda till att provet bränns. Därför är en avvägning beroende på sfärulitstorleken nödvändig. Dessa parametrar kan inte tillämpas universellt. Exempel på parametrar som används i figur 5A: skanningsområde 45 x 45 μm, skanningssteg 1 μm och skanningshastighet 2 μm/s.
  5. Öppna slutaren, slå på fotodioderna och samla in Equation 1 och Equation 2 2P-emissionskomponenter för varje enskilt steg i det valda skanningsområdet - för excitationsstrålen polariserad på motsvarande X och sedan Y-axlarna. Exempel på tvåfotonexciterad autofluorescens (2PAF) rasterskanning av insulinsfäruliter presenteras i figur 5A.
    OBS: Mätning av rasterskanningar kräver korrelering av piezostegskoordinater med Equation 1 och Equation 2 insamlade emissionskomponenter, vilket kan göras manuellt, genom att mäta intensiteten i varje enskild punkt i det valda området och sedan sätta ihop den till en 2D-matris, eller automatiskt, via egenskriven programvara. Rasterskanningar kan presenteras som en summering av Equation 1 och Equation 2 utsläppskomponenternas intensitet eller särskiljande för en specifik emissionskomponent. Eftersom de är mycket strukturberoende är strukturella förvrängningar i sfäruliter lätta att se. Men på grund av mikroskopets rörelse stage kan vissa samples glida av från synfältet. Därför måste bilder screenas för artefakter. Det är nödvändigt att kontrollera sfärulitens position före och efter skanningen.
  6. För att utföra fullständig polarisationsanalys från den specifika platsen på sample, stäng av excitationsstrålen.
  7. Välj sedan specifika koordinater för piezostage som motsvarar den valda platsen på sfäruliten där informationen om molekylernas orientering krävs med upplösningen under μm.
  8. Justera den piezoelektriska entage för att centrera fältet på indikerat (X, Y).
  9. Slå på excitationsstrålen och utför full (360°) polarisationsanalys av Equation 1 och Equation 2 emission genom att slå på halvvågsplattans rotation (180° rotation). Presentera 2PF Ix- och Iy-komponenter i form av en polär graf (som visas i figur 5B).
    OBS: Detta steg kan upprepas på olika platser i sample för att samla in en tillräcklig mängd data.

4. Bestämning av lokal fibrillordning inuti bovina insulinsfäruliter

OBS: Alla numeriska beräkningar kopplade till dataanalysen gjordes med hjälp av programmeringsspråket Python och baserat på de funktioner som finns tillgängliga i biblioteken NumPy och SciPy. För att rita data krävs Matplotlib-biblioteket. Alla beräkningar är baserade på formler som presenteras i underlaget i en av artiklarna av Obstarczyk et al.6.

  1. Simulering av intensiteten hos tvåfotonfluorescens exciterad för den specificerade fördelningen av molekyler med en vald riktning för den infallande ljuspolarisationen (betecknad med α)
    OBS: De presenterade formlerna är baserade på antagandet om parallella absorptions- och emissionsdipolmoment för en fluorofor. För en diskussion om andra fall (t.ex. olika riktningar för absorptions- och emissionsdipolmomenten, energiöverföring mellan fluoroforerna), se artikeln av Le Floc'h et al8.
    1. Hitta de parametrar som tar hänsyn till variationen av det elektriska fältet genom polarisationsblandning och depolarisationseffekter som orsakas av den dikroiska spegeln monterad i en uppställning:
      1. γ representerar amplitudfaktorn mellan reflektiviteten Equation 3 hos och Equation 4 polariserat ljus från en dikroisk spegel.
      2. δ representerar fasförskjutningen (ellipticiteten) mellan Equation 3 och Equation 4 polariserat ljus.
        OBS: Att korrekt definiera dessa två parametrar är avgörande för framgångsrik strukturell karakterisering på grund av deras starka inflytande på formen på uppmätta polära grafer11,18. I fallet med det presenterade systemet bestämdes båda parametrarna under ellipsometrimätningar av en dikroisk spegel applicerad i ett system.
    2. Beräkna de infallande elektriska fältvektorerna som utbreder sig i X- och Y-axlarna för varje vinkel som mäts under ps-TPFM-mätningen med hjälp av ekvationer (1-5).
      Equation 5 Nej (1)
      Equation 6 Nej (2)
      Equation 7 Nej (3)
      Equation 8 Nej (4)
      Equation 9 Nej (5)
      OBS Om intensiteten mäts över hela 360° med steg 1°, beräkna elektriska fältvektorer för alla 360°. Alla vinklar ska vara i radianer. ρ parametern är ansluten till den optiska frekvensen ω för det simulerade elektriska fältet (ρ=ω·t) och används integrerat från 0 till 2π under beräkningarna av de infallande elektriska fältvektorerna som utbreder sig i X- och Y-axeln för varje vinkel som α uppmätt under ps-TPFM-mätningen.
    3. Definiera funktionerna för övergångsdipolmoment i treaxlar i ett kartesiskt system enligt ekvationerna (6-8):
      Equation 10 Nej (6)
      Equation 11 Nej (7)
      Equation 12 (8)
      OBS: φ är orienteringsvinkeln för den långa axeln för amyloidfibriller i XY-provramen. θ- och φ vinklar är de polära och azimutala vinklar som används för att definiera övergångsdipolmomentorienteringen för en fluorofor.
    4. Använd de funktioner som definieras i steg 4.1.3. att definiera funktioner för Jx (Φ,θ,φ) och JY(Φ,θ,φ), som står för bidraget från fokusering i tätt ljus med högt numeriskt bländarobjektiv till fluorescenspolarisationsdetektionen i X- och Y-riktning med hjälp av ekvationer (9, 10).
      Equation 13 (9)
      Equation 14 (10)
      OBS: K1, K2, K3 faktorer är relaterade till mikroskopobjektivet som används under ps-TPFM-mätningen. I dessa experiment användes ett apokromatiskt oljenedsänkningsmål 100x/1,4 NA och faktorerna K1, K2 och K3 var 2,945, 0,069 respektive 1,016.
    5. Definiera en funktion för f(Ω), som är en molekylär vinkelfördelning, beroende på halvöppningen av en fluoroforkon Ψ, med en variabel tjocklek ΔΨ; Använd ekvation (11). Den grafiska representationen av alla tre vinklarna avseende amyloidfibriller presenteras i figur 6.
      Equation 15(11)
      OBS: Var försiktig när du skriver exponenten - potensen av 2 fungerar på funktionsargumentet, inte hela funktionen!
    6. Definiera alla fWWIJKL-faktorer som visas i ekvationerna (12-21).
      Equation 16 (12)
      Equation 17 (13)
      Equation 18 (14)
      Equation 19 (15)
      Equation 20 (16)
      Equation 21 (17)
      Equation 22 (18)
      Equation 23 (19)
      Equation 24 (20)
      Equation 25 (21)
    7. Beräkna tvåfotonexciterade fluorescensintensiteter Equation 26 och Equation 27 för varje uppmätt vinkel (på samma sätt som i punkt 4.1.2) med hjälp av ekvationer (22, 23).
      Equation 28Equation 29 = (22)
      Equation 30Equation 31 = (23)
    8. Kontrollera om simuleringen fungerar korrekt med hjälp av följande variabelvärden (placerade i förklaringen till figur 7) och jämför de erhållna resultaten med figur 7A-C.
      OBS: Alla examina ska skrivas i radianer.
  2. Anpassa de simulerade intensiteterna till intensiteten av tvåfotonexciterad autofluorescens av bovina insulinsfäruliter som samlats in under ps-2PFM-mätningar.
    OBS: Att lösa sfärulitstrukturen baserat på ps-2PFM-mätningar kräver att man använder ekvationerna skrivna i protokollet för att simulera den teoretiska intensiteten av tvåfotonexciterad fluorescens och passar alla parametrar som är kopplade till ordningen av molekylär fluorofor. Det kräver flera iterationer över de olika värdena på Φ, en vinkel som beskriver fibrillernas rotation i XY-mikroskopprovet, och ΔΨ, aberrationer av den koniska fördelningen av emissionsdipolen Ψ på grund av de molekylära rotationerna i filament för fast Ψ tills den når högsta möjliga R2-koefficient mellan normaliserad tvåfotonexciterad fluorescenssignalintensitet som samlas in under mätningen och normaliserade intensiteter som simuleras enligt Steg 4.1 i protokollet.
    1. Bestäm Ψ-halvvinkeln.
      OBS: För bovina insulinsfäruliter ska det vara lika med Ψ = 29°6.
    2. Arbetsflöde för anpassning:
      1. Välj värdet på Φ från 0° till 180° (i figur 8A och 8B Φ = 16° respektive 127°).
      2. Välj värdet på ΔΨ från 0° till 90° (i figur 8A,B, ΔΨ = 24° respektive 1°).
      3. Beräkna Equation 28 (ekvation 22) och Equation 30(ekvation 23) för hela det uppmätta området av θ-vinklar med hjälp av de valda värdena Φ och ΔΨ.
      4. Jämför de intensiteter som beräknats under simuleringar (båda normaliserade till det maximala värdet för
      5. Beräkna Equation 28) med normaliserade intensiteter på
      6. Beräkna Equation 1 och Equation 2 (båda normaliserade till maxvärdet på Equation 1) mätt under ps-2PFM-mätning.
        OBS: I de presenterade experimenten beräknades Pearsons korrelationskoefficienter för produktmoment med hjälp av funktionen "corrcoef" från NumPy Python-biblioteket.
    3. I slutändan, välj värdena Φ och ΔΨ som leder till de högsta korrelationskoefficienterna och konvergensen mellan de simulerade intensiteterna och den uppmätta signalen liknande vad som visas i figur 8.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Det presenterade protokollet ger steg-för-steg-vägledning genom beredning av amyloid-suprastrukturer för testning med ps-2PFM, konstruktion av det mikroskopiska systemet och mätningar av rätt prov. Innan den slutliga uppsättningen mätningar är det dock viktigt att rikta in APD:erna korrekt med en isotrop referens, vilket bör resultera i att en symmetrisk signal med liknande form och intensitet samlas in på båda detektorerna (figur 4C). Även minimala skillnader mellan de intensiteter som uppmäts på detektorerna i X- och Y-axlarna bör beaktas vid ytterligare mätningar och särskilt under analysen som en lämplig korrektionsfaktor. Efter montering, provet som innehåller enstaka sfäruliter, vilket ger ett karakteristiskt malteserkors på POM som i figur 2B, och efter att ha utfört en 2PFM-rasterskanning, bör bilden likna det som visas i figur 5A, vilket överensstämmer med rapporterade 2PFM-rasterskanningar av sfäruliter 6,7 och olika organiserade biomolekyler11,12. Man kan observera vissa förändringar i placeringen av axeln med högst ljusstyrka, vilket är relaterat till det faktum att fluorescenssignalens intensitet starkt beror på polarisationen av excitationsstrålen. Det är därför nödvändigt att kontrollera vilken position på halvvågplattan som motsvarar excitationen av provet längs X-axeln (figur 5A, överst) och Y-axeln (figur 5A, nederst). Det är också värt att notera hur polära grafer förändras när man utför en fullständig polarisationsanalys från olika valda platser. Utanför sfärulit ser den polära grafen ut som en samling artefakter och slumpmässiga signalbrusspikar (figur 5B, I). En sådan graf kan också indikera sfärulitens drift mellan mätningarna och kräva att man hittar nya koordinater för hela strukturen genom en annan 2PF-rasterskanning. Korrekt uppmätta polära grafer från högt ordnade platser för insulinsfärulit längs X- och Y-axlarna visas i figur 5B II respektive III. De kan ha olika former och geometrier, beroende på den lokala orienteringen och organisationen av fluoroforer mätt från den valda punkten7.

Det sista steget i protokollet är inriktat på analys av erhållna data med hjälp av en algoritm baserad på en matematisk modell som kombinerar orienteringen av amyloidfibrer i XY-planet Φ, de associerade fluorofortransienta dipolmomenten Ψ och deras aberrationer ΔΨ (figur 6) med intensitet Equation 1 och Equation 2 tvåfotoninducerad fluorescens. Korrekt implementerade funktioner som presenteras i protokollet bör, efter inmatning av lämpliga indata (protokollsteg 4.9), ge identiska polära diagram som de som presenteras i figur 7. Eventuella avvikelser – olika dataorientering, intensiteter eller former av simulerade Equation 26 fel och Equation 32– indikerar fel i koden. Om modellen fungerar kan man gå vidare till det sista steget i protokollet – att anpassa den simulerade datan till verkliga data som erhållits från ps-2PFM-mätningen. Valda värden på Φ och ΔΨ med de högsta korrelationskoefficienterna och konvergensen mellan de simulerade intensiteterna och den uppmätta signalen bör leda till liknande bilder som visas i figur 8. Det bör finnas bästa möjliga anpassning av Equation 26 och Equation 32 funktioner till den övergripande orienteringen och formen av Equation 1 och Equation 2 värdena på Φ och ΔΨ bör motsvara den lokala orienteringen av fibriller och fluoroforer i den uppmätta punkten på sfärolit. Liknande modeller och anpassningsmetoder kan också användas för att bestämma den lokala organisationen av andra biomolekyler som DNA11.

Figure 1
Figur 1: Mikroskopi med inriktning på polarisationskänslighet med två fotoner. Schema som visar den tvåfotonmikroskopuppställning som används för polarisationskänsliga tvåfotonexciterade fluorescensmätningar av bovina insulinsfäruliter. Tvåfotonexciterad emission horisontellt och vertikalt polariserade (till mikroskopprovplan) komponenter avbildas med IX respektive IY. Förkortningar: SP = provplan; O = mål, DM = dikroisk spegel; λ/2 = halvvågsplatta, LPF = långpassfilter; BE = strålexpander; P = Glan polarisator; Ti: Sa = Titan: safirlaserljuskälla; M = Spegel; SPF = kortpassfilter; PBS = polarisationsstråledelare; L = optisk lins; APD = lavinfotodiod. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: Schema som visar prepareringen/fotot. A) Schema som visar beredningen av det förseglade provet. B) Fotografier av de efterföljande stegen för försegling av provet. I: en alikvot på 100 μl av sfärulitlösningen på objektglaset med en brunn, II: täckglas som tappas ovanpå lösningen; III: tät tätning formad av deponerad polymer (monteringsmedel). Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3: Kvalitetskontroll av insulinsfäruliter i ett polariserat ljusmikroskop. (A1,B1) Brightfield-läge såväl som under (A2,B2) korsade polarisatorer. Karakteristiskt maltesiskt korsmönster kan observeras på motsvarande bilder tagna med korsade polarisatorer. A) Sfäruliter med strukturella snedvridningar. B) Isolerad sfärulit av hög kvalitet. Skalstaplar = 5 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 4
Figur 4: Testa inriktningen av ps-2PFM-systemet. (A) Koncentrisk bild av fluoresceinfluorescensen sedd utan (A1) och med (A2) dikroisk spegel, (B) fotoskadad sfärulit med brända hål som uppstår på grund av den långsträckta polarisationsanalysen i utvalda punkter längs x- och y-leden, (C) Tvåfotonexciterade emissionskomponenter beroende på infallande ljuspolarisationsvinkel som registrerats för ett isotropt prov (fluoresceinlösning). och betecknar emissionskomponenter mätta med lavinfotodioder som mäter X- respektive Y-emissionspolarisationsaxeln. Skalstreck = 5 μm (A1,A2), 10 μm (B). Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 5
Figur 5: Exempel på 2PFM-rasterskanningar och polära grafer från etikettfri insulinsfärulit. (A) 2PF-intensitetsrasterskanningar av etikettfria insulinsfäruliter: polarisering av excitationsljus: (A1) horisontell polarisering, (A2) vertikal polarisering och emission betecknas med vita pilar, och den infällda visar samma sfärulit avbildad under ett vanligt polariserat ljusmikroskop med korsade polarisatorer. (B) Polära diagram härledda från tre punkter markerade på A1-skanningen (B1, I; B2 och II; B3 och III). Ixoch Iybetecknar emissionskomponenter mätta med lavinfotodioder som mäter X- respektive Y-emissionspolarisationsaxeln. Förkortning: 2PF = tvåfotonfluorescens. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 6
Figur 6: Konisk fördelning av färgämnets emissionsdipol (halv vinkel, Ψ) i förhållande till den långa fibrillaxeln. Den streckade linjen visar den långa fibrillaxeln. Rotationen av fibrillen i XY-mikroskopets provplan beskrivs av vinkeln. Aberrationer av Ψ på grund av molekylrotationerna i filament beskrivs av ΔΨ. Denna siffra är från Obstarczyk et al6. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 7
Figur 7: Simulerad intensitet av polariserad tvåfotonexciterad fluorescens. Fluorescens beräknad för (A) Φ = 1°, Ψ = 1°, ΔΨ = 1°; b) φ = 1°, ψ = 30°, δψ = 1°, (c) Φ = 1°, ψ = 30°, δψ = 60°. Röda, blå och gula linjer motsvarar Equation 26, Equation 32, respektive Equation 26 + Equation 32. Φ-vinkeln beskriver fibrillens rotation i XY-mikroskopets provplan, Ψ - konisk fördelning av emissionsdipolen och ΔΨ- aberrationer av Ψ på grund av molekylrotationerna i filamenten. Alla andra parametrar var identiska i samtliga fall: K1 = 2,945, K2 = 0,069, K3 = 1,016, γ = 0,01 och δ = 0,98845. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 8
Figur 8: Polära grafer över experimentella datamängder. (A,B) Exemplariska polära grafer efter anpassning av två experimentella dataset som samlats in under ps-TPFM-mätningar av bovina insulinsfäruliter. Uppmätta Equation 1 och Equation 2 tvåfotonexciterade emissionskomponenter för X- och Y-emissionspolarisationsaxeln presenteras med röda respektive blå prickar; medan heldragna linjer presenterar motsvarande simulerade två-foton-exciterade fluorescensemissionskomponenter för X- och Y-emissionspolarisationsaxeln Equation 26 och Equation 32. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Polarisationskänslig tvåfotonmikroskopi är ett värdefullt verktyg för att studera den lokala ordningen av fibriller inuti amyloidsuprastrukturerna, vilket endast kräver små modifieringar av den vanliga multifotonuppsättningen. Eftersom den opererar på icke-linjära optiska fenomen kan reducerad vinkelfotoselektion och förbättrad axiell upplösning uppnås jämfört med enfotonexciterade fluorescensmikroskopimetoder. Dessutom leder det till lägre ljusspridning, lägre fototoxicitet och djupare provpenetration jämfört med en-foton-excitationsfluorescensmikroskopiteknikerna19,20. Som vi redan har visat är den väl lämpad för mätningar av tätt packade aggregat av proteiner som sfäruliter, vilket kan utföras på ett etikettfritt sätt21.

För att effektivt kunna använda den metod som beskrivs här bör man dock vara uppmärksam på flera viktiga frågor. Börja med provberedning och dess kvalitet, det vill säga inkubation, se alltid till att amyloidöverbyggnaderna har vuxit korrekt. När det gäller sfäruliter använde vi ett polariserat optiskt mikroskop med korsade polarisatorer för att lokalisera mogna sfäruliter, som ger ett karakteristiskt maltesiskt korsmönster och har en radie på ~5 μm16. Sfäruliter är dock heterogena och distinkta strukturer kan observeras i provet. Därför är det viktigt att välja separerade och icke-förvrängda arter. När det gäller själva mätsystemet är det avgörande att kontrollera polarisationen av infallande ljus så att polarisationen av strålen vid ingången till mikroskopkroppen ska bestämmas exakt och depolarisationen som introduceras av de optiska elementen som används ska minimeras22. För att säkerställa bästa prestanda rekommenderar vi att du använder silverspeglar av hög kvalitet och optiska filter som är anpassade till excitations- och fluorescensemissionsvåglängderna. På grund av den viktiga roll som ljuspolarisering spelar även i emissionsbanan är det viktigt att mäta ett isotropt referensprov före den faktiska mätningen. Om excitationsvägen och APD-detektorerna är korrekt inriktade bör man se en lika intensiv signal på båda detektorerna som presenteras i figur 4C. Referensen bör generera en stark tvåfotonexciterad fluorescens vid relativt låg lasereffekt för att undvika fotoblekning. Vi använde fluorescein eftersom dess två fotonabsorptionstvärsnitt för olika våglängder redan rapporterades i litteraturen23.

För att korrekt bestämma arrangemanget av strukturer inuti sfäruliterna bör mycket uppmärksamhet också ägnas åt dataanalys. Det grundläggande antagandet för denna modell är kolinjäriteten hos övergångsdipolmomentet för ljusabsorption och emission. Under det antagandet, genom att rikta in molekylens övergångsdipolmoment parallellt med polarisationen av det infallande ljuset, möjliggörs dess kombination med den inre strukturen hos det testade provet, vilket ger den högsta emissionsintensiteten. Den givna modellen kan också användas som en bra approximation för små skillnader i vinkeln mellan de två dipolmomenten8 men kräver ytterligare modifieringar för stora avvikelser. Därför, som beskrivits, måste vissa antaganden om urvalet beaktas a priori för avbildning och dataanalys. I modellfallet som simuleringen och ekvationerna som används i denna metod är baserad, är den huvudsakliga källan till depolarisering i systemet den dikroiska spegeln. Därför, innan du fortsätter med dataanalysen, är det nödvändigt att bestämma de parametrar som är ansvariga för depolarisationen som introduceras av den dikroiska spegeln på grund av deras inverkan på formen på de insamlade polära graferna och följaktligen den korrekta bestämningen av molekylernas organisation inom den undersökta strukturen under anpassning18. Detta blir ett nyckelproblem, särskilt när det gäller mätningar för flera våglängder, eftersom förändringen i ellipticiteten hos den dikroiska spegeln är distinkt våglängdsberoende12. Induktion av depolarisering kan starkt påverka egenskaperna hos den insamlade signalen11. Sist men inte minst, när man skapar skriptet för dataanalys, bör man vara uppmärksam när man introducerar matematiska funktioner och variabler som presenteras i den sista delen av protokollet. För att undvika fel bör du fokusera på funktioner som flera funktionsanrop och globala parametrar, vilket också påskyndar analystiden avsevärt.

Vi bör också nämna de vanligaste problemen man kan stöta på när man använder den beskrivna metoden. Provberedningstiden är mycket beroende av hastigheten för härdning av monteringsmedel. För att påskynda detta rekommenderar vi att proverna bereds på en varm, torr plats och att sfärulitlösningen förseglas innan den monteras i ett mikroskop. Mätningar som utförs för tidigt kan leda till att glaset lossnar och att den använda objektivlinsen förstörs. Dessutom, trots korrekt provberedning, kan små sfäruliter flyta i lösningen under mätningen på grund av den materialspänning som objektivet medför. För att undvika detta rekommenderar vi att du skannar isolerade medelstora strukturer eftersom de största vanligtvis är aggregat. Det rekommenderas att kontrollera om den skannade sfäruliten har rört sig efter datainsamlingen, i jämförelse med bilden innan mätningen påbörjas. Dessutom, trots den korrekta inriktningen av alla optiska element och detektorer som används för att mäta ps-2PFM, kan de uppmätta intensiteterna Equation 1 och Equation 2 den isotropa referensen fortfarande skilja sig något i intensitet. I ett sådant fall är det nödvändigt att ta hänsyn till detta när man analyserar data från provmätningarna genom att multiplicera en av intensiteterna med den korrektionsfaktor som bestämts under referensmätningarna. Sist men inte minst är det möjligt att skriptet under anpassningsproceduren inte kommer att kunna hitta några matchande värden på Φ och ΔΨ. Detta kan bero på flera faktorer - data samlades in från en oorganiserad plats på ett prov, till exempel kärnan i en sfärulit; Den studerade strukturen var inte helt utvecklad under inkubationen; felaktig simulering av och Equation 32; med hjälp av Equation 26 felaktiga dikroiska spegelparametrar γ och δ; för stor steguppsättning för Φ- och ΔΨ-vinklar mellan varje iteration under anpassningen. I fallet med en oorganiserad plats rekommenderar vi att du försöker samla in data från punkter som ligger närmare omkretsen av den undersökta strukturen. Om det rör sig om en ofullständigt formad struktur, upprepa inkubationen eller sök efter andra strukturer på objektglaset. Vid felaktiga simuleringar, kontrollera manuellt om parametrarna Equation 26 Φ, Ψ och ΔΨ ändras och Equation 32 korrigeras eventuella fel i koden. Vid felaktiga dikroiska spegelparametrar, kontrollera noggrant γ- och δ parametrarna för den dikroiska spegeln som används under mätningarna. Om det finns en stor steginställning för vinklarna under monteringen, minska steget mellan på varandra följande iterationer till 2º eller 1º. Man bör också komma ihåg att vid stark lokal desorganisation av strukturen kommer R2 alltid att vara lägre, ofta i intervallet 0,5–0,6. Detta beror på att den presenterade modellen beskriver mycket ordnade molekyler där de flesta av de transienta dipolmomenten är inriktade i en liknande riktning; Därför leder matchning av amorfa eller mycket oordnade strukturer till lägre korrelationskoefficienter. Därför är det avgörande att ha åtminstone viss strukturell information om provet före mätningen för att korrekt analysera den erhållna datan.

Det är också värt att notera att den presenterade metoden har flera begränsningar. Dataanalys kan resultera i flera värden på Φ- och ΔΨ-vinklar med tillräckligt höga korrelationsfaktorer, vilket kräver att experimentatorn använder sin kunskap och erfarenhet för att välja lämpliga värden. I detta fall måste randvillkoren beaktas, såsom att fluoroforkonens halvvinkel Ψ alltid måste vara större än dess aberration ΔΨ. Dessutom, när vi jämför våra data med litteraturen, är det värt att notera att vissa artiklar beskriver Ψ som en fullkonvinkel, medan vi arbetar med en halvkonvinkel. En annan begränsning är mätupplösningen, som är begränsad till en upplösning på under mikrometer. På grund av detta baseras systemets fotoselektivitet och den resulterande lokala organisationsbestämningen på den genomsnittliga signalen från fibriller som exciteras i brännpunkten snarare än enskilda strukturer. Dessutom måste provet i sig ha tillräckligt fluorescenskvantutbyte, eftersom lång exponering under fs infallande laserkraft (nödvändig för att samla in data för polära grafer) kan vara destruktiv och påverka resultaten.

Trots dessa svårigheter tror vi att metoden som presenteras i denna artikel har ett brett användningsområde, för etikettbaserad och etikettfri avbildning av biostrukturer i hydratiserade och komplexa miljöer. Vi har tidigare visat att lokal fibrillordning beräknad från ps-2PEF-data korrelerar med information som härrör från transmissionselektronmikroskopi7. Därför bekräftade vi validiteten av ps-2PEF i bioavbildning och utökade kunskapen ytterligare om den strukturella ordningen hos amyloidsuprastrukturer. Denna metod kan användas för att lära sig om ursprunget till inneboende fluorescens som observerats i fallet med olika komponenter i biologiska prover, såsom autofluorescens av proteinaggregat - amyloider. Givet relevanta data om orienteringen av absorptions-/emissionsdipolmomentriktningarna med avseende på den långa axeln av amyloidfibriller, kan fibrillernas optiska egenskaper korreleras med deras struktur6. Vi indikerade att för strukturer med en redan bestämd Ψ-vinkel möjliggör denna teknik detektion av distinkta strukturella egenskaper hos amyloid-överbyggnader och polymorfer av insulin-överbyggnader baserat på nivån på deras organisation7. Som tidigare noterats i protokollet kan den presenterade uppställningen även användas för polarisationskänsliga mätningar av andra övertonsgenerationen, vilket också är en etikettfri tvåfotonmikroskopiteknik24. Detta kommer inte bara att kräva montering av olika optiska filter utan också ändring av de formler som används för dataanalyser25. Dessutom, med tillägg av en korrekt inriktad kvartsvågplatta, kan den användas för att excitera provet med cirkulärt polariserat ljus, vilket kan leda till generering av kirala icke-linjära optiska egenskaper hos amyloider eftersom de är kirala biopolymerer med bekräftade starka kiroptiska egenskaper26. Men i ett sådant fall skulle den ständigt roterande elektriska vektorn leda till den ständigt föränderliga riktningen på den exciterade emissionen, vilket gör det omöjligt att bestämma någon strukturell information med hjälp av ekvationerna som presenteras i detta manuskript. Sammantaget är ps-2PEF ett lovande verktyg för bestämning av organisationen inom många komplexa biostrukturer med ordnade emissionsdipoler, såsom proteinaggregat, DNA eller vävnader på ett icke-invasivt sätt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inga intressekonflikter att redovisa.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av Sonata Bis 9-projektet (2019/34/E/ST5/00276) finansierat av National Science Centre i Polen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sample preparation
Coverslips, 24 x 24 mm Chemland 04-298.202.04
DPX mountant for histology Sigma-Aldrich 6522 Slide mountant
Eppendorf Safe-Lock tubes, 1.5 mL, polypropylene Chemland 02-63102
Eppendorf ThermoMixer C Eppendorf Used for spherulite incubation
HLP 5UV Water purification system Hydrolab Source of dionized water used in sample preparation
Hydrochloric acid (≥37%, APHA ≤10), Sigma-Aldrich 30721-M
Insulin powder from the bovine pancreas (≥25 units/mg (HPLC)) Sigma-Aldrich I5500
Methanol (HPLC grade) Sigma-Aldrich 270474
Microscope slides with a concave, 76 x 26 x 1 mm Chemland 04-296.202.09
Olympus BX60 Olympus Polarized Optical Microscope used in Figure 2
PTFE thread seal tape, 12 mm x 12 mm x 0.1 mm, 60 gm2 Chemland VIT131097
Microscope ps-2PFM setup
Chameleon Ultra II Coherent
FELH0800 - Ø25.0 mm Longpass Filter Thorlabs
FESH0700 - Ø25.0 mm Shortpass Filter Thorlabs
IDQ100 photon-counting avalanche photodiodes  ID Quantique
Multiphoton short-pass emission filter 720 nm  Semrock
Mounted Achromatic Half-Wave Plate, 690-1200 nm Thorlabs
Nikon Plan Apo Oil Immersion 100x/1.4 NA Nikon
piezo 3D stage Piezosystem Jena
Polarizing Beamsplitter Thorlabs
S130C - Slim Photodiode Power Sensor, Si, 400 - 1100 nm, 500 mW Thorlabs
Software
LabView 2018 National Instruments Version 18.0.1f2
Matplotlib library Version 3.3.2
NumPy library Version 1.19.2
SciPy library Version 1.5.2
Spyder Python 3 IDE Version 4.1.5

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Petazzi, R. A., Aji, A. K., Chiantia, S. Progress in Molecular Biology and Translational Science. Giraldo, J., Ciruela, F. 169, Academic Press. 1-41 (2020).
  2. Kress, A., et al. Probing orientational behavior of MHC class I protein and lipid probes in cell membranes by fluorescence polarization-resolved imaging. Biophysical Journal. 101 (2), 468-476 (2011).
  3. Duboisset, J., et al. Thioflavine-T and Congo Red reveal the polymorphism of insulin amyloid fibrils when probed by polarization-resolved fluorescence microscopy. The Journal of Physical Chemistry B. 117 (3), 784-788 (2013).
  4. De Luca, G., et al. Probing ensemble polymorphism and single aggregate structural heterogeneity in insulin amyloid self-assembly. Journal of Colloid and Interface Science. 574, 229-240 (2020).
  5. Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
  6. Obstarczyk, P., Lipok, M., Grelich-Mucha, M., Samoć, M., Olesiak-Bańska, J. Two-photon excited polarization-dependent autofluorescence of amyloids as a label-free method of fibril organization imaging. The Journal of Physical Chemistry Letters. 12 (5), 1432-1437 (2021).
  7. Obstarczyk, P., Lipok, M., Żak, A., Cwynar, P., Olesiak-Bańska, J. Amyloid fibrils in superstructures - local ordering revealed by polarization analysis of two-photon excited autofluorescence. Biomaterials Science. 10 (6), 1554-1561 (2022).
  8. Le Floc'h, V., Brasselet, S., Roch, J. -F., Zyss, J. Monitoring of orientation in molecular ensembles by polarization sensitive nonlinear microscopy. The Journal of Physical Chemistry B. 107 (45), 12403-12410 (2003).
  9. Chen, C., et al. In vivo near-infrared two-photon imaging of amyloid plaques in deep brain of Alzheimer's disease mouse model. ACS Chemical Neuroscience. 9 (12), 3128-3136 (2018).
  10. Gasecka, P., Balla, N. K., Sison, M., Brasselet, S. Lipids-fluorophores interactions probed by combined nonlinear polarized microscopy. The Journal of Physical Chemistry B. 125 (50), 13718-13729 (2021).
  11. Mojzisova, H., et al. Polarization-sensitive two-photon microscopy study of the organization of liquid-crystalline DNA. Biophysical Journal. 97 (8), 2348-2357 (2009).
  12. Olesiak-Banska, J., et al. Liquid crystal phases of DNA: Evaluation of DNA organization by two-photon fluorescence microscopy and polarization analysis. Biopolymers. 95 (6), 365-375 (2011).
  13. Olesiak-Banska, J., et al. Gold nanorods as multifunctional probes in a liquid crystalline DNA matrix. Nanoscale. 5 (22), 10975-10981 (2013).
  14. Grelich-Mucha, M., Lipok, M., Różycka, M., Samoć, M., Olesiak-Bańska, J. One- and two-photon excited autofluorescence of lysozyme amyloids. The Journal of Physical Chemistry Letters. 13 (21), 4673-4681 (2022).
  15. Brasselet, S., et al. Fluorescent Methods to Study Biological Membranes. Mély, Y., Duportail, G. , Springer. Berlin Heidelberg. 311-337 (2013).
  16. Krebs, M. R., et al. The formation of spherulites by amyloid fibrils of bovine insulin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (40), 14420-14424 (2004).
  17. Aït-Belkacem, D., Gasecka, A., Munhoz, F., Brustlein, S., Brasselet, S. Influence of birefringence on polarization resolved nonlinear microscopy and collagen SHG structural imaging. Optics Express. 18 (14), 14859-14870 (2010).
  18. Schön, P., Munhoz, F., Gasecka, A., Brustlein, S., Brasselet, S. Polarization distortion effects in polarimetric two-photon microscopy. Optics Express. 16 (25), 20891-20901 (2008).
  19. Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron. 50 (6), 823-839 (2006).
  20. Zipfel, W. R., Williams, R. M., Webb, W. W. Nonlinear magic: multiphoton microscopy in the biosciences. Nature Biotechnology. 21 (11), 1369-1377 (2003).
  21. Ferrand, P., et al. Ultimate use of two-photon fluorescence microscopy to map orientational behavior of fluorophores. Biophysical Journal. 106 (11), 2330-2339 (2014).
  22. Chipman, R. A. Depolarization index and the average degree of polarization. Applied Optics. 44 (13), 2490-2495 (2005).
  23. de Reguardati, S., Pahapill, J., Mikhailov, A., Stepanenko, Y., Rebane, A. High-accuracy reference standards for two-photon absorption in the 680–1050 nm wavelength range. Optics Express. 24 (8), 9053-9066 (2016).
  24. Mansfield, J. C., Mandalia, V., Toms, A., Winlove, C. P., Brasselet, S. Collagen reorganization in cartilage under strain probed by polarization sensitive second harmonic generation microscopy. Journal of The Royal Society Interface. 16 (150), 20180611 (2019).
  25. Duboisset, J., Aït-Belkacem, D., Roche, M., Rigneault, H., Brasselet, S. Generic model of the molecular orientational distribution probed by polarization-resolved second-harmonic generation. Physical Review A. 85 (4), 043829 (2012).
  26. Loksztejn, A., Dzwolak, W. Chiral Bifurcation in aggregating insulin: an induced circular dichroism study. Journal of Molecular Biology. 379 (1), 9-16 (2008).

Tags

Polarisationskänslig Tvåfotonmikroskopi Etikettfri Amyloidstrukturell karakterisering Bioavbildningsexperiment Fototoxicitet Vävnadspenetration Tätt packade system Vinkelfotoselektion Fluoroforer Polarisationsanalys Tvåfotonfluorescensmikroskopi (2PFM) Molekylär organisation Standardavbildningsmetoder Linjära optiska processer Polarisationskänslig 2PFM (ps-2PFM) Molekylär ordning Komplexa biostrukturer Amyloidsfäruliter Neurodegenerativa sjukdomar Alzheimers Parkinsons amyloid-proteinaggregat försämrad proteinfelveckningsprocess diagnostiska metoder lokal fibrillordning bovina insulinsfäruliter
Polarisationskänslig tvåfotonmikroskopi för en etikettfri amyloidstrukturell karakterisering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lipok, M., Obstarczyk, P.,… More

Lipok, M., Obstarczyk, P., Olesiak-Bańska, J. Polarization-Sensitive Two-Photon Microscopy for a Label-Free Amyloid Structural Characterization. J. Vis. Exp. (199), e65670, doi:10.3791/65670 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter