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Chemistry

Polarisationsempfindliche Zwei-Photonen-Mikroskopie zur markierungsfreien Amyloid-Strukturcharakterisierung

Published: September 8, 2023 doi: 10.3791/65670
Automatic Translation
1, 1, 1
1Institute of Advanced Materials, Wrocław University of Science and Technology

Summary

In dieser Arbeit wird beschrieben, wie polarisationsempfindliche Zwei-Photonen-Mikroskopie angewendet werden kann, um die lokale Organisation in markierungsfreien Amyloid-Superstrukturen-Sphäroliten zu charakterisieren. Außerdem wird beschrieben, wie die Probe vorbereitet und gemessen, der erforderliche Aufbau zusammengestellt und die Daten analysiert werden, um Informationen über die lokale Organisation von Amyloidfibrillen zu erhalten.

Abstract

Im Vergleich zu ihrem Ein-Photonen-Gegenstück ist die Zwei-Photonen-Anregung für Bioimaging-Experimente von Vorteil, da sie eine geringere Phototoxizität, ein tieferes Eindringen in das Gewebe, einen effizienten Betrieb in dicht gepackten Systemen und eine reduzierte Winkelphotoselektion von Fluorophoren bietet. Die Einführung der Polarisationsanalyse in der Zwei-Photonen-Fluoreszenzmikroskopie (2PFM) ermöglicht somit eine präzisere Bestimmung der molekularen Organisation in einer Probe im Vergleich zu Standard-Bildgebungsverfahren, die auf linearen optischen Verfahren basieren. In dieser Arbeit konzentrieren wir uns auf polarisationsempfindliches 2PFM (ps-2PFM) und seine Anwendung bei der Bestimmung der molekularen Ordnung in komplexen Biostrukturen-Amyloid-Sphäroliten. Neurodegenerative Erkrankungen wie Alzheimer oder Parkinson werden häufig durch den Nachweis von Amyloid-Protein-Aggregaten diagnostiziert, die aufgrund eines gestörten Proteinfehlfaltungsprozesses gebildet werden. Die Erforschung ihrer Struktur führt zu einem besseren Verständnis ihres Entstehungsweges und folglich zur Entwicklung empfindlicherer diagnostischer Methoden. In dieser Arbeit wird das ps-2PFM vorgestellt, das für die Bestimmung der lokalen Fibrillenordnung in den bovinen Insulinsphäroliten und sphärischen amyloidogenen Proteinaggregaten geeignet ist. Darüber hinaus zeigen wir, dass die vorgeschlagene Technik die dreidimensionale Organisation von Fibrillen im Inneren des Sphäruliths auflösen kann.

Introduction

In den letzten Jahrzehnten wurden zwar zahlreiche fluoreszenzmikroskopische Techniken für die Biobildgebung von Proteinen und ihren Aggregatenentwickelt 1, aber nur wenige wurden verwendet, um ihre lokale Ordnung innerhalb der Probe aufzulösen 2,3. Die Fluoreszenzlebensdauer-Bildgebungsmikroskopie4 wurde verwendet, um die intrinsische strukturelle Heterogenität von Amyloid-Superstrukturen-Sphäroliten zu untersuchen. Darüber hinaus konnte die quantitative Bestimmung der lokalen Ordnung in komplexen und dicht gepackten Biostrukturen wie Sphäroliten mit polarisationssensitiven Methodenaufgelöst werden 3. Standard-Fluoreszenztechniken mit oberflächlicher Gewebepenetration sind jedoch begrenzt, da die Verwendung von UV-VIS-Wellenlängen zur Anregung von Fluorophoren in vivo zu einer hohen Gewebelichtstreuung führt5. Darüber hinaus erfordert eine solche Bildgebung häufig die Entwicklung und Bindung spezifischer Fluoreszenzsonden an ein Zielbiomolekül, wodurch die Kosten und der Arbeitsaufwand für die Durchführung der Bildgebung erhöht werden.

Um diese Probleme anzugehen, hat unser Team kürzlich die polarisationsempfindliche Zwei-Photonen-angeregte Fluoreszenzmikroskopie (ps-2PFM) für die markierungsfreie Abbildung biologischer Strukturen angepasst 6,7. Ps-2PFM ermöglicht die Messung der Abhängigkeit der Zwei-Photonen-Fluoreszenzintensität von der Richtung der linearen Polarisation des Anregungsstrahls und die Analyse der Polarisation der emittierten Fluoreszenz8. Die Implementierung dieser Technik erfordert die Ergänzung des Standard-Multiphotonenmikroskop-Anregungspfads (Abbildung 1) um eine Halbwellenplatte zur Steuerung der Lichtpolarisationsebene. Dann werden Polargraphen, die die Abhängigkeit der Zwei-Photonen-angeregten Fluoreszenzintensität von der Polarisation des Anregungslaserstrahls darstellen, aus Signalen erstellt, die von zwei Avalanche-Photodioden gesammelt werden, und so die beiden zueinander senkrechten Komponenten der Fluoreszenzpolarisation sammeln.

Der letzte Schritt ist der Datenanalyseprozess, bei dem der Einfluss der optischen Elemente, wie z. B. dichroitische Spiegel oder ein Objektiv mit hoher numerischer Apertur, auf die Polarisation berücksichtigt wird. Aufgrund der Beschaffenheit des Zwei-Photonen-Prozesses bietet diese Methode sowohl eine reduzierte Winkel-Photoselektion als auch eine verbesserte axiale Auflösung, da die Zwei-Photonen-Anregung von Fluorophoren außerhalb der Fokusebene probabilistisch begrenzt ist. Es konnte auch nachgewiesen werden, dass ähnliche Methoden erfolgreich für die In-vivo-Bildgebung von Nahinfrarot-Sonden (NIR) für die Tiefengewebebildgebung eingesetzt werden können9. Ps-2PFM wurde zuvor zur Abbildung von Fluorophoren in Zellmembranen10 und DNA11,12 sowie von Nicht-Standard-Fluoreszenzmarkern biologischer Systeme, wie z. B. Goldnanopartikeln13, eingesetzt. In all diesen Beispielen wurde die Information über die Organisation von Biomolekülen jedoch indirekt gewonnen und erforderte eine vordefinierte gegenseitige Orientierung zwischen einem Fluorophor und einem Biomolekül.

In einer unserer jüngsten Arbeiten haben wir gezeigt, dass ps-2PFM erfolgreich zur Bestimmung der lokalen Polarisation der Autofluoreszenz von Amyloid-Überstrukturen und der Fluoreszenz von Thioflavin T, einem Amyloid-spezifischen Farbstoff, der an Amyloidfibrillen in Sphäroliten gebunden ist, eingesetzt werden kann6. Darüber hinaus haben wir in einer anderen Studie bewiesen, dass ps-2PFM verwendet werden kann, um die Orientierung von Amyloidfibrillen in Amyloid-Sphäroliten in einem Submikrometer-Größenbereich zu detektieren, was durch Korrelation mit der Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) bestätigt wurde7. Das Erreichen dieses Ergebnisses war möglich dank i) der intrinsischen Autofluoreszenz von Sphärolith-Amyloiden, die mit einem oder zwei Photonen angeregt werden, eine intrinsische Autofluoreszenz mit Emissionsmaxima in einem Bereich von 450 bis 500 nm und Zwei-Photonen-Absorptionsquerschnitten aufweisen, die mit Standard-Fluoreszenzfarbstoffen vergleichbar sind14, ii) mathematische Modelle, die zuvor eingeführt wurden, um zu beschreiben, wie ps-2PEF von Farbstoffen, die biologische Membranen und DNA-Strukturen markieren, angewendet werden könnte Fluoreszenz von Sphäroliten und an sie gebundenen Farbstoffen 8,11,15. Bevor wir mit der Analyse fortfahren, empfehlen wir daher dringend, die erforderliche Theorie durchzusehen, die sowohl im Haupttext als auch in den unterstützenden Informationen unseres ersten Artikels zu diesem Themabeschrieben ist 6. In dieser Arbeit stellen wir das Protokoll zur Anwendung der ps-2PFM-Technik für eine markierungsfreie Amyloid-Strukturcharakterisierung von bovinen Insulinsphäroliten vor.

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Protocol

1. Präparation der Objektträger mit ausgewachsenen Sphäroliten

HINWEIS: In der Materialtabelle finden Sie Details zu allen Materialien, Reagenzien und Geräten, die in diesem Protokoll verwendet werden. Alle Lösungen wurden mit deionisiertem Wasser (18,2 MΩ·cm bei 25 °C) hergestellt, das aus dem Wasseraufbereitungssystem gewonnen wurde.

  1. Inkubieren Sie die Amyloid-Sphärulite auf der Grundlage des von Krebs et al.16. beschriebenen Protokolls mit einigen Modifikationen, wie unten beschrieben.
    1. Wiegen Sie 10 mg Insulinpulver in einem 1,5-ml-Röhrchen.
    2. Lösen Sie das Pulver mit einem 1 ml Aliquot der deionisiertenH2O/HCl-Lösung (pH 1,5) auf.
    3. Versiegeln Sie die Probe mit dem Klebeband und geben Sie sie in einen thermischen Mischer, um sie 24 Stunden lang bei 70 °C (0 U/min) zu inkubieren.
      ANMERKUNG: Um die Bildgebung von Amyloiden in ihrer nativen (d. h. hydratisierten) Umgebung durchzuführen und eine Verformung der Probe aufgrund von Dehydrierung zu verhindern, ist es erforderlich, Objektträger gemäß der folgenden Beschreibung vorzubereiten (Schema in Abbildung 2).
  2. Waschen Sie den Objektträger gründlich mit Wasser.
  3. Tauchen Sie die Objektträger in Methanol und lassen Sie sie unter Umgebungsbedingungen auf einem staubfreien Tuch trocknen.
  4. Entnehmen Sie mit einer automatischen Pipette (Schritt 1.1.2) ein 100-μl-Aliquot der Sphärolithlösung aus dem Röhrchen und geben Sie es in die Vertiefung im mittleren Bereich des Objektträgers.
  5. Decken Sie die Lösung mit einem Deckglas ab, um die Bildung von Luftblasen zu vermeiden.
  6. Geben Sie das Eindeckmittel mit einer automatischen Pipette entlang der Ränder des Deckglases auf den Objektträger, um die native Lösung der Sphärolithen zu versiegeln.
    HINWEIS: Es ist von großer Bedeutung, Objektträgereindeckmasse sowohl auf dem Deckglas als auch auf der Objektträgeroberfläche zu deponieren. Tun Sie dies unter der Abzugshaube wegen der Toxizität des flüchtigen Lösungsmittels (Xylol). Siehe Einschub in Abbildung 2.
  7. Lassen Sie die Mikroskopprobe unter Umgebungsbedingungen, damit das Eindeckmittel aushärten kann.
    HINWEIS: Der Aushärtungsprozess ist temperatur- und feuchtigkeitsabhängig, sollte aber innerhalb von 12 h abgeschlossen sein.
  8. Überprüfen Sie, ob Insulinsphärolite korrekt gebildet wurden, indem Sie ein polarisiertes optisches Mikroskop (POM) mit gekreuzten Polarisatoren verwenden. Durchsuchen Sie die Probe und suchen Sie nach einem charakteristischen Muster aus hellen Bereichen, das als Malteserkreuz bezeichnet wird, wie in Abbildung 3 dargestellt.
    ANMERKUNG: Die Amyloid-Sphärolite können als kugelförmige Überstrukturen definiert werden, die durch eine heterogene Morphologie mit einer Kern-Schale-Struktur gekennzeichnet sind. Im Detail bestehen sie aus einem amorphen Kern und radial wachsenden Amyloidfibrillen16. Aufgrund des anisotropen Charakters von Sphärolithstrukturen können sie deutlich mit polarisiertem Licht wechselwirken (z. B. durch Brechung) und ihre Phase ändern, was unter POM mit gekreuzten Polarisatoren leicht beobachtet werden kann. Diese Methode wurde verwendet, um nur voll entwickelte Sphärolite zu untersuchen, die durch ein modellähnliches Maltase-Kreuzmuster gekennzeichnet sind. Folglich wurden Aggregate oder strukturell verzerrte Sphärulite von weiteren Untersuchungen ausgeschlossen.

2. Aufbau und Ausrichtung des Systems

HINWEIS: Eine schematische Darstellung eines polarisationsempfindlichen Zwei-Photonen-Mikroskops finden Sie in Abbildung 1.

  1. Installieren Sie beispielsweise einen Femtosekundenlaser mit einer Abstimmbarkeit der Ausgangswellenlänge im Bereich von 690-1.080 nm, der mit einem modengekoppelten Ti:Saphir-Laser mit ~100 fs-Pulsen mit einer Wiederholrate von 80 MHz arbeitet.
  2. Fügen Sie dem Anregungspfad des Aufbaus eine Halbwellenplatte hinzu, die auf einem Rotationstisch montiert ist, um die Polarisation des einfallenden Lichts in der Probenebene des XY-Mikroskops zu steuern.
  3. Montieren Sie den dichroitischen Spiegel, um den Anregungsstrahl von der Detektionsoptik abzuschneiden.
    ANMERKUNG: Die optischen Eigenschaften eines dichroitischen Spiegels sollten es ermöglichen, den Anregungsstrahl (zur Probe) im NIR-Wellenlängenbereich zu reflektieren und gleichzeitig für den Wellenlängenbereich, der der Emission der Proben entspricht, transparent zu sein.
  4. Installieren Sie einen piezoelektrischen Scantisch für Rasterscans innerhalb der XY-Ebene für ein ausgewähltes Z.
  5. Montieren Sie das Immersionsobjektiv mit hoher NA, z. B. ein apochromatisches Ölimmersionsobjektiv 100x/1,4 NA.
    HINWEIS: Da der gesamte Aufbau in einem Epi-Fluoreszenz-Modus arbeitet, passieren die einfallenden und emittierten Signale dasselbe Objektiv.
  6. Fügen Sie im Emissionspfad einen polarisierenden Strahlteiler hinzu, der die mit zwei Photonen angeregte Emission in zwei orthogonal polarisierte Komponenten (I, X und I, Y) aufteilt
  7. Installieren Sie zwei photonenzählende Avalanche-Photodioden (APDs) in einer Konfiguration, die es ihnen ermöglicht, das übertragene bzw. reflektierte Licht mit dem Strahlteiler zu sammeln (Abbildung 1).
  8. Montieren Sie korrekte wellenlängenabhängige Sperrfilter auf dem Anregungs- und Emissionspfad des Systems, z. B. einen 800-nm-Langpassfilter direkt im Anregungsstrahlengang und einen 700-Kurzpassfilter im Emissionspfad.
    HINWEIS: Analysieren Sie die Emissionsspektren von Sphärolith, so dass ein potenzieller Beitrag von Second Harmonic Generation (SHG) oder Laserlicht mit den richtigen Emissionsfiltern ausgeschlossen werden kann. Es ist auch erwähnenswert, dass dieses System auch Messungen von polarisationsempfindlichem SHG ermöglichen sollte, mit dem die Reihenfolge der Biomoleküle in den Proben aufgelöst werden könnte. Die Datenanalyse des SHG-Signals unterscheidet sich jedoch von der Fluoreszenz, die von Aït-Belkacem et al.17 genauer beschrieben wurde.
  9. Richten Sie das gesamte System aus (mit dem in vielen Lasern eingebauten Ausrichtungsmodus), bis mit beiden Fotodioden ähnliche Signalintensitäten erfasst werden.
  10. Prüfen Sie, ob der Anregungsstrahl, der durch das Objektiv mit hoher NA fokussiert und auf einer Kamera abgebildet wird, eine konzentrische Kreisform aufweist, wie in Abbildung 4A dargestellt.
  11. Passen Sie die Scanzeit und die entsprechende Leistung an, um die durch den einfallenden Laser verursachten Schäden an der Probe zu minimieren. Ein beispielhaftes punktförmiges Brennen ist in Abbildung 4B dargestellt. Messen Sie die Nennleistung mit einem digitalen Handleistungsmesser, der an einen Fotodioden-Leistungssensor angeschlossen ist, der sich am Eingang des Mikroskopgehäuses befindet.
    HINWEIS: Biologische Proben können aufgrund der Laserbeleuchtung leicht verbrannt werden. In diesem Fall erwies sich der Leistungsbereich von 100 bis 900 μW (im Brennpunkt der Objektivscheibe) als hervorragender Kompromiss zwischen Probenstabilität und intensiver Emission.
  12. Vor der Probenmessung ist die Qualität der Ausrichtung der Optik mit einer isotropen Referenzprobe (z. B. Fluorescein, das im amorphen Polymer enthalten ist) zu testen. Um die Kalibrierungsprüfung durchzuführen, befolgen Sie das in Abschnitt 3 beschriebene Verfahren mit einer isotropen Referenz anstelle einer Amyloidprobe.
    ANMERKUNG: Unter der Annahme, dass der Mikroskopieaufbau ideal auf die Probe mit isotropen Eigenschaften abgestimmt ist, sollten beide mit zwei APDs detektierten 2P-Emissionskomponenten (IX und IY) mit der gleichen Intensität charakterisiert werden (Abbildung 4C).

3. Messung der bovinen Insulinsphärolite

HINWEIS: Um alle beschriebenen ps-2PF-Messungen durchzuführen, wurde eine handgeschriebene Software verwendet, die die Positionen des piezoelektrischen Tisches und der Halbwellenplatte steuert und das Signal von beiden Fotodioden sammelt, was das Plotten der XY-Scans (Rasterscans) aus ausgewählten Bereichen auf Objektträgern sowie Polardiagramme aus bestimmten Probenkoordinaten ermöglicht. Das Protokoll wurde auch um zusätzliche Hinweise erweitert, die es dem Benutzer ermöglichen, die Messung ohne dieses Protokoll durchzuführen, da sowohl der Piezotisch als auch der Rotationstisch, der zum Drehen der Halbwellenplatte verwendet wird, mit eigenen Controllern oder entsprechender Software gesteuert werden können. Dennoch wird dringend empfohlen, einen Algorithmus zu schreiben, der den Drehwinkel einer Halbwellenplatte mit der 2PEF-Intensität kombiniert, die mit beiden Photodioden gesammelt wurde, da diese Korrelation (polare Graphen) entscheidend für eine korrekte Datenanalyse ist, die zu strukturellen Informationen führt.

  1. Montieren Sie die Probe mit den Sphäruliten auf dem piezoelektrischen Tisch (fixieren Sie den Objektträger mit Klebeband). Achten Sie darauf, dass Sie es so montieren, dass eine dünne Glasseite (Deckglas) dem Objektiv zugewandt ist, da sich hohe numerische Objektive durch relativ kurze Arbeitsabstände auszeichnen.
    HINWEIS: Da die Ölimmersion verwendet wird, sollte ein kleiner Tropfen Mineralöl auf das Objektiv aufgetragen werden, bevor die Probe montiert und fokussiert wird.
  2. Durch Ändern der XY- und Z-Positionen mit Hilfe von Mikroskopknöpfen fokussieren Sie das Objektiv auf einen der Sphärolite, die sich in der Lösung befinden, aber beachten Sie, dass Sphärolithdurchmesser in der Regel im Bereich von zehn μm liegen und innerhalb des zentralen Bereichs der gesamten Struktur fokussiert werden sollten. Achten Sie auf schwarze und weiße Halos um den spezifischen Sphärulit als Anzeichen für einen Unter- bzw. Oberfokus. Passen Sie die "Z"-Achse so an, dass sie zwischen diesen Extremen liegt.
    HINWEIS: Es ist wichtig, eine isolierte Probe ohne strukturelle Defekte zu finden. Extrem kleine Sphärolite können aufgrund der Materialspannung, die durch das Objektiv entsteht, abdriften, während die größten Strukturen wahrscheinlich aggregiert oder stark verzerrt sind.
  3. Zentrieren Sie den Sphärulit im Sichtfeld der beobachteten mikroskopischen Ebene und bestimmen Sie die Größe des XY-Scans, indem Sie sich ansehen, wie viele Piezotischschritte in X- und Y-Richtung (angezeigt auf dem Piezotisch-Controller oder in seiner Software) erforderlich sind, um die Fläche der gesamten Struktur abzudecken.
    HINWEIS: Es wird empfohlen, das System so einzustellen, dass sich der Beginn des XY-Scans in der Nähe einer der Ecken des Sphäroliths befindet und mit der Nullposition des Tisches übereinstimmt (X und Y = 0)
  4. Passen Sie die folgenden Scanparameter an:
    1. Stellen Sie die Polarisation des Anregungsstrahls ein, und drehen Sie die Halbwellenplatte, um die Polarisation zu erhalten, die der "X"- und "Y"-Achse der Mikroskop-Probenebene entspricht.
      HINWEIS: Dies kann durch Messung der Polarkurven von isotropem fluoreszierendem Medium wie Fluorescein erfolgen. Bei solchen Materialien verläuft die maximale Fluoreszenzintensität parallel zur Polarisation des Anregungsstrahls; Daher wird durch Drehen der Halbwellenplatte die Polarisation mit der X- und Y-Achse auf der Beobachtungsebene eingestellt, die auf polaren Graphen auch als X- und Y-Achse bezeichnet wird, wie in Abbildung 4C. Vollständige Polarkurven konnten gemessen werden, indem die gemessene 2PEF-Intensität an beiden Photodioden für eine 180°-Drehung der Halbwellenplatte (360°-Drehung der Anregungslichtpolarisation) gesammelt und die Intensität mit dem Polarisationswinkel des Anregungslichts korreliert wurde. Dies kann manuell erfolgen, indem die Emissionsintensität für jeden Halbwellenplattenwinkel separat gemessen und dann in einer Datenanalysesoftware oder automatisch mit spezieller oder selbst geschriebener Software zu einem Polardiagramm zusammengesetzt wird.
    2. Passen Sie die Parameter des Piezotisches an: Scangeschwindigkeit, Schritt und Bereich, um den Bereich des gesamten Sphäruliths abzudecken.
      HINWEIS: Der Scanbereich muss größer als der Sphärolithdurchmesser sein, um den gesamten Überbau innerhalb des Rasterscans vollständig einzurahmen. Niedrige Scangeschwindigkeit und -schritt ermöglichen es dem Benutzer, qualitativ hochwertige Bilder zu erhalten. Dies kann jedoch dazu führen, dass die Probe verbrannt wird. Daher ist ein Kompromiss in Abhängigkeit von der Sphärolithgröße erforderlich. Diese Parameter können nicht universell angewendet werden. Beispielhafte Parameter in Abbildung 5A: Scanbereich 45 x 45 μm, Scanschritt 1 μm und Scangeschwindigkeit 2 μm/s.
  5. Öffnen Sie den Verschluss, schalten Sie die Fotodioden ein und sammeln Sie Equation 1 2P-Emissionskomponenten Equation 2 für jeden einzelnen Schritt des ausgewählten Scanbereichs - für den Anregungsstrahl, der entsprechend der X- und dann der Y-Achse polarisiert. Beispielhafte Zwei-Photonen-angeregte Autofluoreszenz (2PAF)-Rasterscans von Insulinsphäroliten sind in Abbildung 5A dargestellt.
    HINWEIS: Die Messung von Rasterscans erfordert die Korrelation von Piezo-Tischkoordinaten mit Equation 1 und Equation 2 erfassten Emissionskomponenten, was manuell erfolgen kann, indem die Intensität in jedem einzelnen Punkt des ausgewählten Bereichs gemessen und dann zu einer 2D-Matrix zusammengesetzt wird, oder automatisch über eine selbst geschriebene Software. Raster-Scans können als Summe der Intensität und Equation 2 der Intensität der Equation 1 Emissionskomponenten oder eindeutig für eine bestimmte Emissionskomponente dargestellt werden. Da sie stark strukturabhängig sind, sind strukturelle Verzerrungen innerhalb von Sphäroliten leicht sichtbar. Aufgrund der Bewegung des Mikroskoptisches können jedoch einige Proben aus dem Sichtfeld abweichen. Daher müssen Bilder auf Artefakte untersucht werden. Es ist notwendig, die Position des Sphäroliths vor und nach dem Scan zu überprüfen.
  6. Um eine vollständige Polarisationsanalyse von der spezifischen Stelle der Probe aus durchzuführen, schalten Sie den Anregungsstrahl aus.
  7. Anschließend werden spezifische Koordinaten des Piezotisches ausgewählt, die der gewählten Stelle auf dem Sphärolith entsprechen, an der die Informationen über die Ausrichtung der Moleküle mit einer Auflösung von weniger als einem μm benötigt werden.
  8. Stellen Sie den piezoelektrischen Tisch so ein, dass das Sichtfeld auf dem angezeigten (X, Y) zentriert ist.
  9. Schalten Sie den Anregungsstrahl ein und führen Sie eine vollständige Polarisationsanalyse (360°) der Equation 1 Emission durch Equation 2 , indem Sie die Drehung der Halbwellenplatte (180°-Drehung) aktivieren. Die Komponenten 2PF Ix und Iy werden in Form eines polaren Diagramms dargestellt (wie in Abbildung 5B dargestellt).
    Hinweis: Dieser Schritt kann an verschiedenen Stellen in der Stichprobe wiederholt werden, um eine ausreichende Datenmenge zu erfassen.

4. Bestimmung der lokalen Fibrillenordnung in den bovinen Insulinsphäroliten

HINWEIS: Alle numerischen Berechnungen, die mit der Datenanalyse verbunden sind, wurden mit der Programmiersprache Python durchgeführt und basieren auf den Funktionen, die in den Bibliotheken NumPy und SciPy verfügbar sind. Zum Plotten der Daten ist die Matplotlib-Bibliothek erforderlich. Alle Berechnungen basieren auf Formeln, die in einer der Arbeiten von Obstarczyk et al.6 in unterstützenden Informationen dargestellt sind.

  1. Simulieren der Intensität von Zwei-Photonen-Fluoreszenz, die für die spezifizierte Verteilung von Molekülen mit einer ausgewählten Richtung der einfallenden Lichtpolarisation angeregt wird (bezeichnet durch α)
    ANMERKUNG: Die vorgestellten Formeln basieren auf der Annahme paralleler Absorptions- und Emissionsdipolmomente eines Fluorophors. Für eine Diskussion anderer Fälle (z.B. unterschiedliche Richtungen der Absorptions- und Emissionsdipolmomente, Energietransfer zwischen den Fluorophoren) siehe die Arbeit von Le Floc'h et al.8.
    1. Finde die Parameter, die die Variation des elektrischen Feldes durch Polarisationsmischung und Depolarisationseffekte berücksichtigen, die durch den dichroitischen Spiegel verursacht werden, der in einem Aufbau montiert ist:
      1. γ stellt den Amplitudenfaktor zwischen dem Reflexionsvermögen und Equation 3 Equation 4 dem polarisierten Licht eines dichroitischen Spiegels dar.
      2. δ stellt die Phasenverschiebung (Elliptizität) zwischen Equation 3 Equation 4 polarisiertem und polarisiertem Licht dar.
        ANMERKUNG: Die korrekte Definition dieser beiden Parameter ist für eine erfolgreiche strukturelle Charakterisierung von entscheidender Bedeutung, da sie einen starken Einfluss auf die Form der gemessenen polaren Graphenhaben 11,18. Im Falle des vorgestellten Systems wurden beide Parameter durch ellipsometrische Messungen eines dichroitischen Spiegels bestimmt, der in einem System angelegt wurde.
    2. Berechnen Sie die einfallenden elektrischen Feldvektoren, die sich in der X- und Y-Achse jedes während der ps-TPFM-Messung gemessenen Winkels ausbreiten, unter Verwendung der Gleichungen (1-5).
      Equation 5 (1)
      Equation 6 (2)
      Equation 7 (3)
      Equation 8 (4)
      Equation 9 (5)
      HINWEIS Wenn die Intensität über die gesamten 360° mit Schritt 1° gemessen wird, berechnen Sie die elektrischen Feldvektoren für alle 360°. Alle Winkel sollten im Bogenmaß angegeben werden. ρ-Parameter ist mit der optischen Frequenz ω des simulierten elektrischen Feldes verbunden (ρ=ω·t) und verwendet integriert von 0 bis 2π während der Berechnung der einfallenden elektrischen Feldvektoren, die sich in der X- und Y-Achse ausbreiten, für jeden Winkel, den α während der ps-TPFM-Messung gemessen wird.
    3. Definieren Sie die Funktionen für Übergangsdipolmomente in Richtungen dreier Achsen eines kartesischen Systems nach den Gleichungen (6-8):
      Equation 10 (6)
      Equation 11 (7)
      Equation 12 (8)
      HINWEIS: φ ist der Ausrichtungswinkel der Längsachse der Amyloidfibrille im XY-Probenrahmen. θ- und φ-Winkel sind die polaren und azimutalen Winkel, die verwendet werden, um die Orientierung des Übergangsdipolmoments eines Fluorophors zu definieren.
    4. Verwenden Sie die in Schritt 4.1.3 definierten Funktionen. Funktionen für Jx (Φ,θ,φ) und JY(Φ,θ,φ) zu definieren, die den Beitrag der Englichtfokussierung mit Objektiv mit hoher numerischer Apertur zur Fluoreszenzpolarisationsdetektion in X- und Y-Richtung unter Verwendung der Gleichungen (9, 10) erklären.
      Equation 13 (9)
      Equation 14 (10)
      HINWEIS: Die Faktoren K1, K2 und K3 beziehen sich auf das Mikroskopobjektiv, das während der ps-TPFM-Messung verwendet wird. In diesen Experimenten wurde ein apochromatisches Ölimmersionsobjektiv 100x/1,4 NA verwendet und dieK1-, K2- und K3-Faktoren betrugen 2,945, 0,069 bzw. 1,016.
    5. Definieren Sie eine Funktion für f(Ω), die eine molekulare Winkelverteilung ist, abhängig von der halben Apertur eines Fluorophorkegels Ψ, mit einer variablen Dicke ΔΨ; Gleichung (11) verwenden. Die grafische Darstellung aller drei Blickwinkel auf die Amyloidfibrille ist in Abbildung 6 dargestellt.
      Equation 15(11)
      HINWEIS: Seien Sie vorsichtig, wenn Sie den Exponenten schreiben - die Potenz von 2 wirkt auf das Funktionsargument, nicht auf die gesamte Funktion!
    6. Definieren Sie alle fWWIJKL-Faktoren wie in den Gleichungen (12-21) gezeigt.
      Equation 16 (12)
      Equation 17 (13)
      Equation 18 (14)
      Equation 19 (15 Stück)
      Equation 20 (16)
      Equation 21 (17 Stück)
      Equation 22 (18 Stück)
      Equation 23 (19)
      Equation 24 (20)
      Equation 25 (21)
    7. Die Intensitäten Equation 26 der angeregten Zwei-Photonen-Fluoreszenz werden Equation 27 für jeden gemessenen Winkel (ähnlich wie in Nummer 4.1.2) unter Verwendung der Gleichungen (22, 23) berechnet.
      Equation 28Equation 29 = (22)
      Equation 30Equation 31 = (23)
    8. Überprüfen Sie anhand der folgenden Variablenwerte (in der Legende zu Abbildung 7), ob die Simulation ordnungsgemäß funktioniert, und vergleichen Sie die erhaltenen Ergebnisse mit Abbildung 7A-C.
      HINWEIS: Alle Grade sollten im Bogenmaß geschrieben werden.
  2. Passen Sie die simulierten Intensitäten an die Intensität der Zwei-Photonen-angeregten Autofluoreszenz von bovinen Insulinsphäroliten an, die während ps-2PFM-Messungen gesammelt wurden.
    HINWEIS: Die Auflösung der Sphärolithstruktur auf der Grundlage von ps-2PFM-Messungen erfordert die Verwendung der im Protokoll geschriebenen Gleichungen, um die theoretische Intensität der Zwei-Photonen-angeregten Fluoreszenz zu simulieren und alle Parameter anzupassen, die mit der Ordnung des molekularen Fluorophors verbunden sind. Es erfordert mehrere Iterationen über die verschiedenen Werte von Φ, einem Winkel, der die Drehung der Fibrille in der XY-Mikroskopprobe beschreibt, und ΔΨ, Aberrationen der konischen Verteilung des Emissionsdipols Ψ aufgrund der molekularen Rotationen in Filamenten für festes Ψ , bis der höchstmöglicheR2-Koeffizient zwischen normalisierter Zwei-Photonen-angeregter Fluoreszenzsignalintensität, die während der Messung gesammelt wird, und normalisierten Intensitäten, die gemäß Schritt 4.1 des Protokolls.
    1. Bestimmen Sie den Ψ-Halbwinkel .
      HINWEIS: Für bovine Insulinsphärolite sollte sie gleich Ψ = 29°6 sein.
    2. Arbeitsablauf bei der Anprobe:
      1. Wählen Sie den Wert von Φ von 0° bis 180° (in Abbildung 8A und 8B Φ = 16° bzw. 127°).
      2. Wählen Sie den Wert von ΔΨ von 0° bis 90° (in Abbildung 8A, B, ΔΨ = 24° bzw. 1°).
      3. Berechnen Sie Equation 28 (Gleichung 22) und Equation 30(Gleichung 23) für den gesamten gemessenen Bereich der θ-Winkel mit den gewählten Werten von Φ und ΔΨ.
      4. Vergleichen Sie die während der Simulationen berechneten Intensitäten (beide normiert auf den Maximalwert von
      5. Berechnen ) mit normierten Intensitäten Equation 28von
      6. Berechnen Equation 1 und Equation 2 (beide normiert auf den Maximalwert von Equation 1) gemessen während der ps-2PFM-Messung.
        HINWEIS: In den vorgestellten Experimenten wurden die Pearson-Produkt-Moment-Korrelationskoeffizienten mit der Funktion "corrcoef" aus der NumPy-Python-Bibliothek berechnet.
    3. Wählen Sie am Ende die Werte von Φ und ΔΨ , die zu den höchsten Korrelationskoeffizienten und Konvergenz zwischen den simulierten Intensitäten und dem gemessenen Signal führen, ähnlich wie in Abbildung 8 gezeigt.

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Representative Results

Das vorgestellte Protokoll bietet eine Schritt-für-Schritt-Anleitung durch die Vorbereitung von Amyloid-Suprastrukturen für Tests mit ps-2PFM, den Aufbau des mikroskopischen Systems und die Messungen der richtigen Probe. Vor den endgültigen Messungen ist es jedoch wichtig, die APDs richtig auf eine isotrope Referenz auszurichten, was dazu führen sollte, dass auf beiden Detektoren ein symmetrisches Signal ähnlicher Form und Intensität gesammelt wird (Abbildung 4C). Selbst minimale Unterschiede zwischen den an den Detektoren gemessenen Intensitäten in der X- und Y-Achse sollten bei weiteren Messungen und insbesondere bei der Analyse als geeigneter Korrekturfaktor berücksichtigt werden. Nach dem Einbetten der Probe, die einzelne Sphärolite enthält, die ein charakteristisches Malteserkreuz auf dem POM wie in Abbildung 2B ergeben, und nach der Durchführung eines 2PFM-Rasterscans sollte das Bild ähnlich aussehen wie in Abbildung 5A, was mit den berichteten 2PFM-Rasterscans von Sphäroliten 6,7 und verschiedenen organisierten Biomolekülenübereinstimmt 11,12. Man kann einige Veränderungen in der Lage der Achse mit der höchsten Helligkeit beobachten, was damit zusammenhängt, dass die Intensität des Fluoreszenzsignals stark von der Polarisation des Anregungsstrahls abhängt. Daher ist es notwendig zu überprüfen, welche Position der Halbwellenplatte der Anregung der Probe entlang der X- (Abbildung 5A, oben) und Y-Achse (Abbildung 5A, unten) entspricht. Es ist auch erwähnenswert, wie sich Polardiagramme ändern, wenn eine vollständige Polarisationsanalyse von verschiedenen ausgewählten Punkten durchgeführt wird. Außerhalb des Sphäruliths sieht der Polargraph wie eine Ansammlung von Artefakten und zufälligen Signalrauschspitzen aus (Abbildung 5B, I). Ein solches Diagramm kann auch die Drift des Sphäroliths zwischen den Messungen anzeigen und erfordert das Auffinden neuer Koordinaten der gesamten Struktur durch einen weiteren 2PF-Rasterscan. Richtig gemessene Polargraphen von hochgeordneten Positionen von Insulinsphärolith entlang der X- und Y-Achse sind in Abbildung 5B, II bzw. III dargestellt. Sie können unterschiedliche Formen und Geometrien aufweisen, abhängig von der lokalen Orientierung und Organisation der Fluorophore, die von dem ausgewählten Punkt7 aus gemessen werden.

Der letzte Schritt des Protokolls konzentriert sich auf die Analyse der erhaltenen Daten mit Hilfe eines Algorithmus, der auf einem mathematischen Modell basiert, das die Orientierung der Amyloidfasern in der XY-Ebene Φ, die zugehörigen transienten Dipolmomente Ψ und ihre Aberrationen ΔΨ (Abbildung 6) mit der Intensität Equation 1 und Equation 2 der Zwei-Photonen-induzierten Fluoreszenz kombiniert. Korrekt implementierte Funktionen, die im Protokoll dargestellt sind, sollten nach Eingabe der entsprechenden Eingabedaten (Protokollschritt 4.9) identische Polardiagramme wie die in Abbildung 7 dargestellten erzeugen. Alle Abweichungen – unterschiedliche Datenausrichtungen, Intensitäten oder Formen von simulierten Equation 26 und Equation 32– weisen auf Fehler im Code hin. Wenn das Modell funktioniert, kann man mit dem letzten Schritt des Protokolls fortfahren, indem man die simulierten Daten an reale Daten anpasst, die aus der ps-2PFM-Messung gewonnen wurden. Die gewählten Werte von Φ und ΔΨ mit den höchsten Korrelationskoeffizienten und der höchsten Konvergenz zwischen den simulierten Intensitäten und dem gemessenen Signal sollten zu ähnlichen Bildern führen, wie in Abbildung 8 gezeigt. Die Werte von Φ und ΔΨ sollten der lokalen Orientierung und den Fluorophoren Equation 26 Equation 32 an der gemessenen Equation 1 Equation 2 Stelle auf Sphärulith entsprechen. Ähnliche Modelle und Anpassungsmethoden könnten auch für die Bestimmung der lokalen Organisation anderer Biomoleküle wie DNA11 verwendet werden.

Figure 1
Abbildung 1: Zwei-Photonen-polarisationsempfindlicher Mikroskopie-Aufbau. Das Schema zeigt den Zwei-Photonen-Mikroskop-Aufbau, der für die polarisationsempfindlichen Zwei-Photonen-angeregten Fluoreszenzmessungen von bovinen Insulinsphäroliten verwendet wurde. Zwei-Photonen-angeregte Emission horizontal und vertikal polarisiert (zur Mikroskop-Probenebene) Komponenten werden mit IX bzw. IY dargestellt. Abkürzungen: SP = Sample Plane; O = Ziel; DM = dichroitischer Spiegel; λ/2 = Halbwellenplatte; LPF = Langpassfilter; BE = Strahlaufweiter; P = Glan-Polarisator; Ti: Sa = Titan: Saphir-Laserlichtquelle; M = Spiegel; SPF = Kurzpassfilter; PBS = Polarisationsstrahlteiler; L = optische Linse; APD = Avalanche-Photodiode. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Schema mit der Objektträgerpräparation/dem Foto. (A) Schema mit der versiegelten Probenvorbereitung; (B) Fotografien der nachfolgenden Schritte zur Versiegelung der Probe. I: ein 100 μl Aliquot der Sphärolithlösung auf dem Objektträger mit einer Vertiefung, II: Deckglas, das auf die Lösung fällt; III: dichte Abdichtung aus abgeschiedenem Polymer (Eindeckmittel). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Qualitätskontrolle der Insulin-Sphärolite unter dem Polarisationsmikroskop (A1,B1) im Hellfeldmodus sowie unter (A2,B2) gekreuzten Polarisatoren. Das charakteristische Malteserkreuzmuster kann auf den entsprechenden Bildern beobachtet werden, die mit gekreuzten Polarisatoren aufgenommen wurden. (A) Sphärolite-Aggregate mit strukturellen Verzerrungen, (B) hochwertiger isolierter Sphärulith. Maßstabsbalken = 5 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4: Testen der Ausrichtung des ps-2PFM-Systems. (A) Konzentrisches defokussiertes Bild der Fluoreszenzfluoreszenz, wie sie ohne (A1) und mit (A2) dichroitischem Spiegel zu sehen ist, (B) lichtgeschädigter Sphärulit mit verbrannten Löchern, die aufgrund der länglichen Polarisationsanalyse in ausgewählten Punkten entlang der x- und y-Richtung entstehen, (C) Zwei-Photonen-angeregte Emissionskomponenten in Abhängigkeit vom Polarisationswinkel des einfallenden Lichts, wie er für eine isotrope Probe (Fluorescein-Lösung) registriert ist. und bezeichnen Emissionskomponenten, die von Avalanche-Photodioden gemessen werden, die die X- bzw. Y-Emissionspolarisationsachse messen. Maßstabsbalken = 5 μm (A1,A2), 10 μm (B). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 5
Abbildung 5: Beispielhafte 2PFM-Rasterscans und Polardiagramme von markierungsfreiem Insulinsphärulith. (A) 2PF-Intensitätsrasterscans von markierungsfreien Insulinsphäroliten: Polarisation des Anregungslichts: (A1) horizontale Polarisation, (A2) vertikale Polarisation und Emission sind mit weißen Pfeilen gekennzeichnet, und der Einschub zeigt den gleichen Sphärolith, der unter einem Standardmikroskop für polarisiertes Licht mit gekreuzten Polarisatoren abgebildet wurde. (B) Polardiagramme, die von drei Punkten abgeleitet wurden, die auf dem A1-Scan (B1, I; B2, II; B3, III). Ixund Iybezeichnen Emissionskomponenten, die von Avalanche-Photodioden gemessen werden, die die X- bzw. Y-Emissionspolarisationsachse messen. Abkürzung: 2PF = Zwei-Photonen-Fluoreszenz. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 6
Abbildung 6: Kegelförmige Verteilung des Emissionsdipols des Farbstoffs (Halbwinkel, Ψ) in Bezug auf die lange Fibrillenachse. Die gestrichelte Linie zeigt die lange Fibrillenachse. Die Drehung der Fibrille in der XY-Mikroskop-Probenebene wird durch den Winkel beschrieben. Aberrationen von Ψ aufgrund der Molekülrotationen in Filamenten werden durch ΔΨ beschrieben. Diese Abbildung stammt aus Obstarczyk et al.6. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 7
Abbildung 7: Simulierte Intensität der polarisierten Zwei-Photonen-angeregten Fluoreszenz. Fluoreszenz berechnet für (A) Φ = 1°, Ψ = 1°, ΔΨ = 1°; b) φ = 1°, ψ = 30°, δψ = 1°; (C) Φ = 1°, Ψ = 30°, ΔΨ = 60°. Rote, blaue und gelbe Linien entsprechen Equation 26, Equation 32bzw. + Equation 32. Der Equation 26 Φ-Winkel beschreibt die Rotation der Fibrille in der XY-Mikroskop-Probenebene, Ψ - konische Verteilung des Emissionsdipols und ΔΨ- Aberrationen von Ψ aufgrund der molekularen Rotationen in Filamenten. Alle anderen Parameter waren in allen Fällen identisch: K1 = 2,945, K2 = 0,069, K3 = 1,016, γ = 0,01 und δ = 0,98845. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 8
Abbildung 8: Polare Graphen von experimentellen Datensätzen. (A,B) Beispielhafte Polargraphen nach Anpassung von zwei experimentellen Datensätzen, die während ps-TPFM-Messungen von bovinen Insulinsphärulithen gesammelt wurden. Gemessene Equation 1 und Equation 2 zweiphotonenangeregte Emissionskomponenten für die X- und Y-Emissionspolarisationsachse sind mit roten bzw. blauen Punkten dargestellt; während durchgezogene Linien die entsprechenden simulierten Zwei-Photonen-angeregten Fluoreszenzemissionskomponenten für die X- und Y-Emissionspolarisationsachse Equation 26 und Equation 32darstellen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Discussion

Die polarisationsempfindliche Zwei-Photonen-Mikroskopie ist ein wertvolles Werkzeug zur Untersuchung der lokalen Anordnung von Fibrillen innerhalb der Amyloid-Überstrukturen, das nur kleine Modifikationen des Standard-Multiphotonen-Aufbaus erfordert. Da sie mit nichtlinearen optischen Phänomenen arbeitet, können im Vergleich zu Methoden der einphotonenangeregten Fluoreszenzmikroskopie eine reduzierte Winkelphotoselektion und eine verbesserte axiale Auflösung erreicht werden. Darüber hinaus führt es zu einer geringeren Lichtstreuung, einer geringeren Phototoxizität und einer tieferen Probendurchdringung im Vergleich zu den Ein-Photonen-Anregungsfluoreszenzmikroskopie-Techniken19,20. Wie wir bereits bewiesen haben, eignet es sich gut für Messungen von dicht gepackten Aggregaten von Proteinen wie Sphärolithen, die markierungsfrei durchgeführt werden können21.

Um die hier beschriebene Methode effektiv nutzen zu können, sollten jedoch einige Schlüsselaspekte beachtet werden. Beginnend mit der Probenvorbereitung und deren Qualität, nämlich der Inkubation, stellen Sie immer sicher, dass Amyloid-Überstrukturen korrekt gewachsen sind. Im Fall von Sphäroliten haben wir ein polarisiertes optisches Mikroskop mit gekreuzten Polarisatoren verwendet, um reife Sphärolite zu lokalisieren, die ein charakteristisches Malteserkreuzmuster ergeben und einen Radius von ~5 μm16 haben. Sphärolite sind jedoch heterogen und es können unterschiedliche Strukturen innerhalb der Probe beobachtet werden. Daher ist es wichtig, getrennte und nicht verzerrte Arten zu wählen. Was das Messsystem selbst betrifft, so ist es von entscheidender Bedeutung, die Polarisation des einfallenden Lichts so zu steuern, dass die Polarisation des Strahls am Eingang des Mikroskopkörpers genau bestimmt und die durch die verwendeten optischen Elemente verursachte Depolarisation minimiert werdensollte 22. Um die beste Leistung zu gewährleisten, empfehlen wir die Verwendung hochwertiger Silberspiegel und optischer Filter, die auf die Anregungs- und Fluoreszenzemissionswellenlängen abgestimmt sind. Aufgrund der Schlüsselrolle der Lichtpolarisation auch im Emissionspfad ist es unerlässlich, vor der eigentlichen Messung eine isotrope Referenzprobe zu messen. Wenn der Anregungspfad und die APD-Detektoren korrekt ausgerichtet sind, sollte man auf beiden Detektoren ein gleich intensives Signal sehen, wie in Abbildung 4C dargestellt. Die Referenz sollte eine starke Zwei-Photonen-angeregte Fluoreszenz bei relativ geringer Laserleistung erzeugen, um Photobleaching zu vermeiden. Wir haben Fluorescein verwendet, da seine Zwei-Photonen-Absorptionsquerschnitte für verschiedene Wellenlängen bereits in der Literatur beschrieben wurden23.

Um die Anordnung der Strukturen im Inneren der Sphärolite korrekt zu bestimmen, sollte auch der Datenanalyse viel Aufmerksamkeit gewidmet werden. Die Grundannahme dieses Modells ist die Kollinearität des Übergangsdipolmoments der Lichtabsorption und -emission. Unter dieser Annahme ermöglicht die Ausrichtung des Übergangsdipolmoments des Moleküls parallel zur Polarisation des einfallenden Lichts eine Kombination mit der inneren Struktur der getesteten Probe, wodurch die höchste Emissionsintensität erzielt wird. Das gegebene Modell kann auch als gute Näherung für kleine Differenzen im Winkel zwischen den beiden Dipolmomenten8 verwendet werden, erfordert aber weitere Modifikationen für große Abweichungen. Daher müssen, wie beschrieben, einige Annahmen bezüglich der Probe a priori bei der Bildgebung und Datenanalyse berücksichtigt werden. In dem Modellfall, auf dem die Simulation und die in dieser Methode verwendeten Gleichungen basieren, ist die Hauptquelle der Depolarisation im System der dichroitische Spiegel. Daher ist es, bevor mit der Datenanalyse fortgefahren wird, notwendig, die Parameter zu bestimmen, die für die Depolarisation verantwortlich sind, die durch den dichroitischen Spiegel aufgrund ihres Einflusses auf die Form der gesammelten polaren Graphen und folglich für die korrekte Bestimmung der Organisation der Moleküle innerhalb der untersuchten Struktur während der Anpassung18 verantwortlich ist. Dies wird insbesondere bei Messungen für mehrere Wellenlängen zu einem Schlüsselproblem, da die Änderung der Elliptizität des dichroitischen Spiegels deutlich wellenlängenabhängig ist12. Die Induktion der Depolarisation kann die Eigenschaften des gesammelten Signals11 stark beeinflussen. Zu guter Letzt sollte man bei der Erstellung des Skripts für die Datenanalyse darauf achten, mathematische Funktionen und Variablen einzuführen, die im letzten Teil des Protokolls vorgestellt werden. Um Fehler zu vermeiden, sollten Sie sich auf Funktionen wie mehrere Funktionsaufrufe und globale Parameter konzentrieren, die auch die Analysezeit erheblich beschleunigen.

Wir sollten auch die häufigsten Probleme erwähnen, auf die man bei der Verwendung der beschriebenen Methode stoßen kann. Die Probenvorbereitungszeit hängt sehr stark von der Geschwindigkeit der Eindeckmittelhärtung ab. Um dies zu beschleunigen, empfehlen wir, die Proben an einem warmen, trockenen Ort vorzubereiten und die Sphärolithlösung vor dem Einbetten in ein Mikroskop zu versiegeln. Zu früh durchgeführte Messungen können zur Entsiegelung des Objektträgers und zur Zerstörung der verwendeten Objektivlinse führen. Darüber hinaus können trotz ordnungsgemäßer Probenvorbereitung aufgrund der Materialspannung, die durch das Objektiv entsteht, während der Messung kleine Sphärolite in der Lösung schwimmen. Um dies zu vermeiden, empfehlen wir, isolierte mittelgroße Strukturen zu scannen, da die größten in der Regel Aggregate sind. Es wird empfohlen, vor Beginn der Messung zu überprüfen, ob sich der gescannte Sphärulit nach der Datenaufnahme im Vergleich zum Bild bewegt hat. Darüber hinaus können trotz der korrekten Ausrichtung aller optischen Elemente und Detektoren, die zur Messung des ps-2PFM verwendet werden, die gemessenen Intensitäten Equation 1 und Equation 2 der isotropen Referenz immer noch geringfügig in der Intensität abweichen. In einem solchen Fall ist es notwendig, dies bei der Analyse der Daten aus den Stichprobenmessungen zu berücksichtigen, indem eine der Intensitäten mit dem während der Referenzmessungen ermittelten Korrekturfaktor multipliziert wird. Zu guter Letzt ist es möglich, dass das Skript während des Anpassungsvorgangs keine übereinstimmenden Werte von Φ und ΔΨ findet. Dies kann auf mehrere Faktoren zurückzuführen sein: Die Daten wurden von einer unorganisierten Stelle auf einer Probe gesammelt, z. B. dem Kern eines Sphäruliths; Die untersuchte Struktur war während der Inkubation nicht vollständig ausgebildet; fehlerhafte Simulation von Equation 26 und Equation 32; mit falschen dichroitischen Spiegelparametern γ und δ; zu große Stufeneinstellung für Φ und ΔΨ Winkel zwischen jeder Iteration während der Anpassung. Im Falle einer unorganisierten Stelle empfehlen wir, Daten von Punkten zu sammeln, die näher am Umfang der untersuchten Struktur liegen. Im Falle einer unvollständig ausgebildeten Struktur wiederholen Sie die Inkubation oder suchen Sie den Objektträger nach anderen Strukturen. Bei fehlerhaften Simulationen ist manuell zu prüfen, ob durch Änderung der Parameter Φ, Ψ und Δ Ψ die simuliertenIntensitätenEquation 26 und Equation 32 Fehler im Code geändert und korrigiert werden. Bei falschen dichroitischen Spiegelparametern sind die γ und δ Parameter des dichroitischen Spiegels, der während der Messungen verwendet wird, sorgfältig zu überprüfen. Bei einem großen Stufensatz für die Winkel während der Anpassung reduzieren Sie den Abstand zwischen aufeinanderfolgenden Iterationen auf 2º oder 1º. Es sollte auch daran erinnert werden, dass im Falle einer starken lokalen Desorganisation der StrukturR2 immer niedriger ist, oft im Bereich von 0,5–0,6. Dies liegt daran, dass das vorgestellte Modell hochgeordnete Moleküle beschreibt, bei denen die meisten transienten Dipolmomente in eine ähnliche Richtung ausgerichtet sind. Daher führt die Anpassung amorpher oder stark ungeordneter Strukturen zu niedrigeren Korrelationskoeffizienten. Daher ist es wichtig, vor der Messung zumindest einige strukturelle Informationen über die Probe zu besitzen, um die gewonnenen Daten korrekt analysieren zu können.

Es ist auch erwähnenswert, dass die vorgestellte Methode mehrere Einschränkungen aufweist. Die Datenanalyse könnte zu mehreren Werten von Φ- undΔ-Ψ-Winkeln mit ausreichend hohen Korrelationsfaktoren führen, so dass der Experimentator sein Wissen und seine Erfahrung einsetzen muss, um geeignete Werte auszuwählen. In diesem Fall müssen die Randbedingungen berücksichtigt werden, wie z.B. dass der Halbwinkel des Fluorophorkegels Ψ immer größer sein muss als seine Aberration ΔΨ. Darüber hinaus ist es beim Vergleich unserer Daten mit der Literatur erwähnenswert, dass einige Arbeiten Ψ als Vollkegelwinkel beschreiben, während wir mit einem Halbkegelwinkel arbeiten. Eine weitere Einschränkung ist die Messauflösung, die auf eine Auflösung im Submikrometerbereich begrenzt ist. Aus diesem Grund basieren die Photoselektivität des Systems und die daraus resultierende Bestimmung der lokalen Organisation auf dem gemittelten Signal von Fibrillen, die im Brennfleck angeregt werden, und nicht auf einzelnen Strukturen. Darüber hinaus muss die Probe selbst eine ausreichende Fluoreszenzquantenausbeute aufweisen, da eine lange Belichtung unter einfallender Laserleistung von fs (die für die Erfassung von Daten für Polargraphen erforderlich ist) zerstörerisch sein und die Ergebnisse beeinträchtigen kann.

Trotz dieser Schwierigkeiten glauben wir, dass die in dieser Arbeit vorgestellte Methode ein breites Anwendungsspektrum für die markierungsbasierte und markierungsfreie Abbildung von Biostrukturen in hydratisierten und komplexen Umgebungen hat. Wir hatten zuvor gezeigt, dass die lokale Fibrillenordnung, die aus ps-2PEF-Daten berechnet wurde, mit Informationen korreliert, die aus der Transmissionselektronenmikroskopie abgeleitet wurden7. Daher haben wir die Validität von ps-2PEF in der Biobildgebung bestätigt und das Wissen über die strukturelle Ordnung von Amyloid-Superstrukturen weiter erweitert. Diese Methode kann angewendet werden, um mehr über den Ursprung der intrinsischen Fluoreszenz zu erfahren, die bei verschiedenen Bestandteilen biologischer Proben beobachtet wird, wie z. B. der Autofluoreszenz von Proteinaggregaten – Amyloiden. Anhand relevanter Daten über die Orientierung der Absorptions-/Emissions-Dipolmomentrichtungen in Bezug auf die Längsachse von Amyloidfibrillen können die optischen Eigenschaften der Fibrillen mit ihrer Struktur korreliertwerden 6. Wir wiesen darauf hin, dass diese Technik für Strukturen mit einem bereits bestimmten Ψ-Winkel die Detektion unterschiedlicher struktureller Merkmale von Amyloid-Überstrukturen und Polymorphen von Insulin-Überstrukturen auf der Grundlage des Niveaus ihrer Organisation ermöglicht7. Wie bereits in dem Protokoll erwähnt, könnte der vorgestellte Aufbau auch für polarisationsempfindliche Messungen der zweiten Harmonischen angewendet werden, bei denen es sich ebenfalls um eine markierungsfreie Zwei-Photonen-Mikroskopietechnik24 handelt. Dies erfordert nicht nur den Einbau verschiedener optischer Filter, sondern auch eine Änderung der Formeln, die für die Datenanalyse verwendet werden25. Darüber hinaus könnte es unter Zugabe einer richtig ausgerichteten Viertelwellenplatte verwendet werden, um die Probe mit zirkular polarisiertem Licht anzuregen, was zur Erzeugung chiraler nichtlinearer optischer Eigenschaften von Amyloiden führen könnte, da es sich um chirale Biopolymere mit bestätigten starken chiroptischen Eigenschaftenhandelt 26. In einem solchen Fall würde der ständig rotierende elektrische Vektor jedoch zu einer sich ständig ändernden Richtung der angeregten Emission führen, so dass es unmöglich wäre, mit den in diesem Manuskript vorgestellten Gleichungen strukturelle Informationen zu bestimmen. Alles in allem ist ps-2PEF ein vielversprechendes Werkzeug für die nicht-invasive Bestimmung der Organisation in zahlreichen komplexen Biostrukturen mit geordneten Emissionsdipolen, wie z.B. Proteinaggregaten, DNA oder Geweben.

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Disclosures

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde durch das Projekt Sonata Bis 9 (2019/34/E/ST5/00276) unterstützt, das vom Nationalen Wissenschaftszentrum in Polen finanziert wird.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sample preparation
Coverslips, 24 x 24 mm Chemland 04-298.202.04
DPX mountant for histology Sigma-Aldrich 6522 Slide mountant
Eppendorf Safe-Lock tubes, 1.5 mL, polypropylene Chemland 02-63102
Eppendorf ThermoMixer C Eppendorf Used for spherulite incubation
HLP 5UV Water purification system Hydrolab Source of dionized water used in sample preparation
Hydrochloric acid (≥37%, APHA ≤10), Sigma-Aldrich 30721-M
Insulin powder from the bovine pancreas (≥25 units/mg (HPLC)) Sigma-Aldrich I5500
Methanol (HPLC grade) Sigma-Aldrich 270474
Microscope slides with a concave, 76 x 26 x 1 mm Chemland 04-296.202.09
Olympus BX60 Olympus Polarized Optical Microscope used in Figure 2
PTFE thread seal tape, 12 mm x 12 mm x 0.1 mm, 60 gm2 Chemland VIT131097
Microscope ps-2PFM setup
Chameleon Ultra II Coherent
FELH0800 - Ø25.0 mm Longpass Filter Thorlabs
FESH0700 - Ø25.0 mm Shortpass Filter Thorlabs
IDQ100 photon-counting avalanche photodiodes  ID Quantique
Multiphoton short-pass emission filter 720 nm  Semrock
Mounted Achromatic Half-Wave Plate, 690-1200 nm Thorlabs
Nikon Plan Apo Oil Immersion 100x/1.4 NA Nikon
piezo 3D stage Piezosystem Jena
Polarizing Beamsplitter Thorlabs
S130C - Slim Photodiode Power Sensor, Si, 400 - 1100 nm, 500 mW Thorlabs
Software
LabView 2018 National Instruments Version 18.0.1f2
Matplotlib library Version 3.3.2
NumPy library Version 1.19.2
SciPy library Version 1.5.2
Spyder Python 3 IDE Version 4.1.5

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References

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