Summary
この論文では、偏光感受性2光子顕微鏡を使用して、ラベルフリーアミロイド上部構造-球晶体内の局所組織を特徴付ける方法について説明します。また、サンプルの調製と測定、必要なセットアップの組み立て、およびアミロイド線維の局所組織に関する情報を取得するためのデータの分析方法についても説明します。
Abstract
2光子励起は、1光子励起と比較して、光毒性が低く、組織への浸透が深く、高密度で密集したシステムでの効率的な操作が可能で、蛍光色素の光選択角度が小さくなるため、バイオイメージング実験に有益です。したがって、2光子蛍光顕微鏡(2PFM)における偏光分析の導入により、線形光学プロセスに基づく標準的なイメージング法と比較して、サンプル中の分子組織をより正確に決定することができます。本研究では、分極感受性2PFM(ps-2PFM)と、複雑な生体構造であるアミロイド球状突起内の分子秩序の決定への応用に焦点を当てています。アルツハイマー病やパーキンソン病などの神経変性疾患は、タンパク質のミスフォールディングプロセスの障害によって形成されるアミロイドタンパク質凝集体を検出することで診断されることがよくあります。その構造を探ることは、その生成経路をよりよく理解し、その結果、より感度の高い診断方法の開発につながります。本論文では、ウシインスリン球状物質および球状アミロイド原性タンパク質凝集体内の局所線維秩序の決定に適応したps-2PFMについて紹介する。さらに、提案手法により、球晶石内部のフィブリルの三次元組織化を解像できることを証明した。
Introduction
過去数十年にわたり、タンパク質とその凝集体のバイオイメージングのための多数の蛍光顕微鏡技術が大幅に開発されてきましたが1、サンプル内の局所的な秩序を解明するために使用されたのはごくわずかです2,3。蛍光寿命イメージング顕微鏡4は、アミロイド上部構造-球晶石の本質的な構造不均一性を研究するために使用されました。さらに、球晶石のような複雑で高密度に充填された生体構造内の局所秩序の定量的決定は、分極に敏感な方法を使用して解決することができました3。しかし、UV-VIS波長を使用してin vivoで蛍光色素を励起すると、組織の光散乱が大きくなるため、表在組織浸透を伴う標準的な蛍光技術には限界があります5。さらに、このようなイメージングでは、特定の蛍光プローブを設計し、標的とする生体分子に結合する必要があることが多く、イメージングを行うために必要なコストと作業量が増加します。
最近、これらの問題に対処するために、私たちのチームは、偏光感受性二光子励起蛍光顕微鏡(ps-2PFM)を適応させ、生体構造のラベルフリーイメージングに用いることにした6,7。Ps-2PFMは、励起ビームの直線偏光方向に対する2光子蛍光強度の依存性の測定と、放出された蛍光の偏光の分析を可能にする8。この技術を実装するには、標準的な多光子顕微鏡セットアップ励起経路(図1)に、光の偏光面を制御するための半波長板を追加する必要があります。次に、2つのアバランシェフォトダイオードによって収集された信号から、励起レーザービームの偏光に対する2光子励起蛍光強度の依存性を示す極性グラフが作成され、蛍光偏光の2つの相互に垂直な成分が収集されます。
最後のステップは、ダイクロイックミラーや高開口対物レンズなどの光学素子が偏光に与える影響を考慮したデータ解析プロセスです。2光子プロセスの性質上、焦点面外の蛍光色素の2光子励起は確率的に制限されるため、この方法では角度光選択の低減と軸方向分解能の向上の両方が得られます。また、深部組織イメージング用の近赤外プローブ(NIR)のin vivoイメージングにも同様の手法をうまく実装できることが証明されました9。Ps-2PFMは、細胞膜10やDNA11,12の蛍光色素や、金ナノ粒子13などの生体系の非標準蛍光マーカーのイメージングに応用されている。しかし、これらすべての例において、生体分子の組織に関する情報は間接的に得られたものであり、蛍光色素と生体分子の間にあらかじめ定義された相互配向を必要とした。
最近の論文では、ps-2PFMを応用して、アミロイド上部構造の自家蛍光と、球状突起中のアミロイド線維に結合したアミロイド特異的色素であるチオフラビンTの蛍光の局所偏光を解析できることを示しました6。さらに、別の研究では、ps-2PFMを利用して、アミロイドスフェルライト内のアミロイド線維配向をサブミクロンサイズで検出できることを証明し、透過型電子顕微鏡(TEM)イメージングとの相関関係で確認しました7。この成果の達成は、i)1つまたは2つの光子で励起されたときに、球晶アミロイドの固有の自家蛍光が、450〜500nmの範囲にある発光最大値と標準的な蛍光色素に匹敵する2光子吸収断面積を示す14、ii)生体膜およびDNA構造を標識する色素のps-2PEFをどのように適用できるかを説明するために以前に紹介した数理モデルのおかげで可能になりました球状物質とそれらに結合した染料によって示される蛍光8,11,15。したがって、分析を進める前に、このトピック6に関する最初の論文の本文と補足情報の両方に説明されている必要な理論に目を通すことを強くお勧めします。ここでは、ウシインスリン球状突起のラベルフリーアミロイド構造解析にps-2PFM法を適用する方法のプロトコルを紹介します。
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Protocol
1. 完全に成長した球状石を用いた顕微鏡スライドの準備
注:このプロトコルで使用されるすべての材料、試薬、および機器の詳細については、 材料表 を参照してください。すべての溶液は、浄水システムから得られた脱イオン水(25°Cで18.2MΩ・cm)で調製しました。
- 以下に説明するように、Krebsら16. によって記述されたプロトコルに基づいてアミロイドスフェルライトをインキュベートします。
- 1.5 mLチューブに10 mgのインスリン粉末を秤量します。
- 粉末を脱イオンH2O/HCl溶液(pH 1.5)の1 mLアリコートで溶解します。
- サンプルをテープで密封し、サーマルミキサーに入れて70°C(0rpm)で24時間インキュベートします。
注:アミロイドの天然(水和)環境でイメージングを行い、脱水によるサンプルの変形を防ぐには、以下の説明に従って顕微鏡スライドを準備する必要があります( 図2に示すスキーム)。
- 顕微鏡スライドガラスを水でよく洗います。
- スライドをメタノールに浸し、ほこりのないワイプで常温条件下で乾燥させます。
- 自動ピペット(ステップ1.1.2)でチューブから球状物質溶液100 μLのアリコートを取り出し、顕微鏡スライドの中央領域にあるウェルに加えます。
- 溶液をカバーガラスで覆い、気泡の形成を防ぎます。
- 自動ピペットを使用してスライド上のカバーガラスの端に沿って封入剤を堆積させ、球晶石の天然溶液を密封します。
注意: カバーガラスとスライド面の両方にスライド封入剤を堆積させることは非常に重要です。揮発性溶剤(キシレン)の毒性のため、発煙フードの下でこれを行ってください。 図 2 の挿入図を参照してください。 - 顕微鏡サンプルを周囲条件下に置いたままにして、封入剤を硬化させます。
注意: 硬化プロセスは温度と湿度に依存しますが、12時間以内に完了する必要があります。 - 交差偏光子を備えた偏光光学顕微鏡(POM)を使用して、インスリン球状物質が正しく形成されたかどうかを確認します。サンプルをスキャンして、マルタ十字と呼ばれる明るい領域の特徴的なパターンを探します( 図3を参照)。
注:アミロイド球状突起は、コアシェル構造を持つ不均一な形態を特徴とする球状の上部構造として定義できます。詳細には、それらは、アモルファスコアと放射状に成長するアミロイド線維16とから構成される。球晶石構造の異方性により、偏光(屈折など)と明確に相互作用し、位相を変化させることができ、交差偏光子を使用したPOMで容易に観察できます。この方法は、モデルのようなマルターゼ十字パターンを特徴とする完全に発達した球晶石のみを研究するために使用されました。その結果、凝集体または構造的に歪んだ球状石は、さらなる調査から除外されました。
2. システムの構築と調整
注:偏光感度型2光子顕微鏡の概略図を 図1に示します。
- 例えば、80 MHzの繰り返し周波数で~100fsのパルスを持つモードロックされたTi:サファイアレーザーで動作する、690-1,080 nmの範囲の出力波長調整可能なフェムト秒レーザーを設置します。
- 装置の励起経路に回転ステージに取り付けられた半波長板を追加し、XY顕微鏡試料面の入射光の偏光を制御します。
- ダイクロイックミラーを取り付けて、検出光学系からの励起ビームを遮断します。
注:ダイクロイックミラーの光学特性は、近赤外域の波長で励起ビームを(試料に)反射させると同時に、試料からの発光に対応する波長範囲で透明でなければなりません。 - 選択したZのXY平面内にラスタースキャン用の圧電スキャンステージを設置します。
- 高NA浸対物レンズ(例えば、アポクロマート油浸対物レンズ100倍/1.4 NA)を取り付けます。
注:セットアップ全体が落射蛍光モードで動作するため、入射信号と放出信号は同じ対物レンズを通過します。 - 放射経路に、2光子励起放出を2つの直交偏光成分(IX とIY)に分割する偏光ビームスプリッターを追加します
- 2つのフォトンカウンティングアバランシェフォトダイオード(APD)を、ビームスプリッタを使用して転送された光と反射された光をそれぞれ収集できる構成で設置します(図1)。
- 例えば、800 nmのロングパスフィルターを励起光路に直接、700のショートパスフィルターを発光路に取り付けるなど、波長依存のカットオフフィルターをシステムの励起光路と発光路に取り付けます。
注:球晶石からの発光スペクトルを分析して、正しい発光フィルターを使用して、第2高調波発生(SHG)またはレーザー光からの潜在的な寄与を除外できるようにします。また、このシステムにより、分極に敏感なSHGの測定も可能になり、サンプル内の生体分子の秩序を解明するために使用できることも注目に値します。しかし、SHGシグナルのデータ解析は、より詳細にAït-Belkacemらによって記述された蛍光とは異なる17。 - 両方のフォトダイオードを使用して同様の信号強度が収集されるまで、システム全体をアライメントします(多くのレーザーに組み込まれているアライメントモードを使用)。
- 高NA対物レンズで集光され、カメラで撮像された励起ビームが 、図4Aのように同心円状になっているか確認してください。
- スキャン時間と対応する出力を調整して、サンプルへの入射レーザーによって引き起こされる損傷を最小限に抑えます。例示的な点状燃焼が 図4Bに示されている。顕微鏡本体の入り口にあるフォトダイオードパワーセンサーに接続されたデジタルハンドヘルドパワーメーターを使用して、公称パワーを測定します。
注:生体試料はレーザー照射により簡単に燃やすことができます。この場合、100〜900μWの出力範囲(対物レンズの焦点)は、サンプルの安定性と強い発光の間の優れたトレードオフであることがわかりました。 - サンプル測定の前に、等方性参照サンプル(アモルファスポリマーに具現化されたフルオレセインなど)との光学系のアライメントの品質をテストします。キャリブレーションチェックを行うには、アミロイドサンプルの代わりに等方性リファレンスを使用して、セクション3で説明した手順に従います。
注:等方性特性を持つサンプルに対して顕微鏡のセットアップが理想的に調整されていると仮定すると、2 つの APD で検出された両方の 2P 発光成分(IX および IY)は、同じ強度で特性評価されるはずです(図 4C)。
3. ウシインスリン球体の測定
注:説明されているすべてのps-2PF測定を実行するために、圧電ステージと半波長板の位置を制御し、両方のフォトダイオードから信号を収集し、顕微鏡スライド上の選択した領域からのXYスキャン(ラスタースキャン)のプロットと、特定のサンプル座標からの極性グラフを可能にする手書きのソフトウェアを使用しました。また、プロトコルには注記が追加されており、半波長板を回転させるために使用されるピエゾステージと回転ステージの両方を独自のコントローラまたは対応するソフトウェアを使用して制御できるため、ユーザーはピエゾステージなしで測定を実行できます。それでも、半波長板の回転角と両方のフォトダイオードで収集された2PEF強度を組み合わせたアルゴリズムを作成することを強くお勧めします。
- 球状石の入った試料を圧電ステージに取り付けます(スライドガラスをテープで固定します)。高い数値対物レンズは作動距離が比較的短いという特徴があるため、薄いガラス面(カバーガラス)が対物レンズに面するように取り付けてください。
注:油浸を使用するため、試料の取り付けと焦点合わせの前に、少量の鉱物油を対物レンズに塗布する必要があります。 - 顕微鏡のノブを使用してXY位置とZ位置を変更し、溶液中に見つかった球状突起の1つに対物レンズの焦点を合わせますが、球晶石の直径は通常数十μmの範囲であるため、構造全体の中央領域に焦点を合わせることに注意してください。特定の球状突起の周りの黒と白のハローを、それぞれ焦点不足と上焦点の兆候として探します。「Z」軸をこれらの両極端の間になるように調整します。
注:構造上の欠陥のない単離されたサンプルを見つけることが重要です。非常に小さな球晶は、対物レンズによってもたらされる材料応力によって漂流する可能性がありますが、最大の構造はおそらく凝集しているか、大きく歪んでいます。 - 観察された微視的平面の視野に球状突起を中央に配置し、構造全体の領域をカバーするために必要なX方向とY方向のピエゾステージステップ数(ピエゾステージコントローラーまたはそのソフトウェアに表示される)を見て、XYスキャンのサイズを決定します。
注:XYスキャンの開始が球晶石の角の1つの近くにあり、ステージのゼロ位置(XおよびY = 0)と一致するようにシステムを設定することをお勧めします - 次のスキャンパラメータを調整します。
- 励起ビームの偏光を調整し、半波長板を回転させて、顕微鏡試料面の「X」軸と「Y」軸に対応する偏光を得る。
注:これは、フルオレセインなどの等方性蛍光媒体の極性グラフを測定することによって行うことができます。このような材料の場合、最大蛍光強度は励起ビーム偏光に平行です。このように、半波長板を回転させると、 図4Cのように極性グラフ上ではX軸とY軸とも表記される観察面上のX軸とY軸で偏光度が調整される。半波長板を180°回転(励起光偏光を360°回転)して両方のフォトダイオードで測定した2PEF強度を収集し、その強度を励起光偏光角と相関させることで、完全な極性グラフを測定できました。これは、半波長板の角度ごとに発光強度を個別に測定し、データ解析ソフトウェアで極性グラフに組み立てることによって手動で行うか、専用または自作のソフトウェアを使用して自動的に行うことができます。 - 圧電段パラメータ(スキャン速度、ステップ、範囲)を調整して、球状石全体の領域をカバーします。
注: ラスター スキャン内で上部構造全体を完全にフレームに収めるには、スキャン範囲を球状突起の直径よりも大きくする必要があります。スキャン速度とステップが遅いため、ユーザーは高品質の画像を取得できます。ただし、これによりサンプルが焼ける可能性があります。したがって、球晶石のサイズに依存するトレードオフが必要です。これらのパラメータは、普遍的に適用できるわけではありません。 図5Aで用いられる例示的なパラメータは、走査範囲45×45μm、走査ステップ1μm、および走査速度2μm/sである。
- 励起ビームの偏光を調整し、半波長板を回転させて、顕微鏡試料面の「X」軸と「Y」軸に対応する偏光を得る。
- シャッターを開き、フォトダイオードをオンにして、選択したスキャン領域のすべてのステップの2P発光成分を収集し
、X軸とY軸に対応して偏光された励起ビームについて。インスリンスフェルライトの例示的な2光子励起自家蛍光(2PAF)ラスタースキャンを図5Aに示します。
注:ラスタースキャンを測定するには、ピエゾステージ座標を収集された発光成分と相関させる必要がありますが、これは、選択した領域のすべてのポイントで強度を測定し、それを2Dマトリックスに組み立てるか、自作のソフトウェアを介して自動的に組み立てることによって手動で行うことができます。ラスタースキャンは、発光成分の強度の合計として、または特定の発光成分に対して個別に表示できます。球状突起は構造依存性が高いため、球晶石内の構造的な歪みが容易に観察できます。ただし、顕微鏡ステージの移動により、一部のサンプルが視野から外れる場合があります。したがって、画像にアーティファクトがないかスクリーニングする必要があります。スキャンの前後に球状突起の位置を確認する必要があります。 - サンプル上の特定のスポットから完全な偏光分析を実行するには、励起ビームをオフにします。
- 続いて、分子の配向に関する情報が必要な球状突起上の選択した位置に対応するピエゾステージの特定の座標をサブμmの分解能で選択します。
- 圧電ステージを調整して、指定された(X、Y)の視野を中央に配置します。
- 励起ビームをONにし、半波長板の回転(180°回転)をONにして、発光の完全(360°)偏光解析を行います。2PF、Ix、およびIy成分を極性グラフの形で提示します(図5Bに示すように)。
注: この手順をサンプル内のさまざまな場所で繰り返して、十分な量のデータを収集できます。
4. ウシインスリン球状物質内部の局所線維秩序の決定
注:データ分析に関連するすべての数値計算は、Pythonプログラミング言語を使用して、ライブラリNumPyおよびSciPyで利用可能な関数に基づいて行われました。データをプロットするには、Matplotlib ライブラリが必要です。すべての計算は、Obstarczyk et al.6 の論文の裏付け情報に示されている式に基づいています。
- 入射光偏光の選択方向( α)
注:提示された式は、蛍光色素の平行吸収および発光双極子モーメントの仮定に基づいています。他のケース(例えば、吸収と発光の双極子モーメントの異なる方向、蛍光色素間のエネルギー移動)については、Le Floc'hらの論文を参照してください8.- セットアップに取り付けられたダイクロイックミラーによって引き起こされる偏光混合と脱分極効果による電界の変動を説明するパラメータを見つけます。
- γ は、ダイクロイックミラーからの反射率
と 
偏光の間の振幅係数を表します。 - δは偏光との間の位相シフト(楕円率)を表します。
注:これら2つのパラメータは、測定された極地グラフ11,18の形状に強い影響を与えるため、構造特性評価を成功させるためには非常に重要です。提示されたシステムの場合、両方のパラメータは、システムに適用されたダイクロイックミラーのエリプソメトリー測定中に決定されました。
- γ は、ダイクロイックミラーからの反射率
- 式(1-5)を用いて、ps-TPFM測定中に測定した各角度のX軸とY軸に伝搬する入射電界ベクトルを計算します。
(1)
(2)
(3)
(4)
(5)
注意: ステップ360°で1°全体で強度を測定する場合は、360°すべての電界ベクトルを計算します。すべての角度はラジアンで表す必要があります。 ρ パラメータは、シミュレートされた電場の光周波数 ω (ρ=ω·t)を使用し、ps-TPFM測定中に測定されたすべての角度について、X軸とY軸に伝搬する入射電界ベクトルの計算中に0から2πまで積分 α 使用しました。 - 式 (6-8) に従って、デカルト系の 3 つの軸の方向における遷移双極子モーメントの関数を定義します。
(6)
(7)
(8)
注:φは、XYサンプルフレームにおけるアミロイド線維長軸の配向角です。θ角と φ 角は、蛍光色素の遷移双極子モーメント配向を定義するために使用される極角と方位角です。 - 手順4.1.3で定義した関数を使用します。式(9, 10)を用いて、X方向とY方向の蛍光偏光検出に対する高開口数対物レンズによるタイトな光集束の寄与を説明するJ x (Φ,θ,φ)およびJY(Φ,θ,φ)の関数を定義する。
(9)
(10)
注:K1、K2、K3の因子は、ps-TPFM測定中に使用される顕微鏡対物レンズに関連しています。これらの実験では、アポクロマート油浸対物レンズ100倍/1.4NAを使用し、K1、K2、K3因子はそれぞれ2.945、0.069、および1.016でした。 - 蛍光色素錐体 Ψ の半開口に依存する分子角度分布である f(Ω) の関数を、可変の厚さ ΔΨ で定義します。式 (11) を使用します。アミロイド線維に関する3つの角度すべてを図 6に示します。
(11)
注:指数を書くときは注意してください-2の累乗は、関数全体ではなく、関数の引数に作用します。 - 式 (12-21) に示すように、すべての fWWIJKL 係数を定義します。
(12)
(13)
(14)
(15)
(16)
(17)
(18)
(19)
(20)
(21) - 式(22、23)を使用して、2光子励起蛍光強度
を、測定された角度ごとに(ポイント4.1.2と同様に)計算します。
= 
(22)
= 
(23) - 以下の変数値(図7の凡例に配置)を使用してシミュレーションが正しく機能しているかどうかを確認し、得られた結果を図7A-Cと比較します。
注:すべての度はラジアンで記述する必要があります。
- セットアップに取り付けられたダイクロイックミラーによって引き起こされる偏光混合と脱分極効果による電界の変動を説明するパラメータを見つけます。
- シミュレートされた強度を、ps-2PFM測定中に収集されたウシインスリン球状物質の2光子励起自家蛍光の強度に当てはめます。
注:ps-2PFM測定に基づいて球状突起構造を分解するには、プロトコルに記述された式を使用して、2光子励起蛍光の理論的強度をシミュレートし、分子蛍光色素の順序に関連するすべてのパラメーターを適合させる必要があります。XY顕微鏡試料中のフィブリルの回転を表す角度であるΦのさまざまな値、および固定Ψのフィラメント内の分子回転による発光双極子Ψの円錐分布の収差を、測定中に収集された正規化された2光子励起蛍光シグナル強度とに従ってシミュレートされた正規化された強度との間の可能な限り高いR2係数に達するまで、複数回の反復が必要です。プロトコルのステップ4.1。- Ψ 半角を決定します。
注:ウシインスリン球晶の場合、 Ψ = 29°6に等しくなければなりません。 - フィッティングワークフロー:
- Φの値を0°から180°まで選択します( 図8A と8Bでは、それぞれΦ = 16°と127°)。
- ΔΨの値を0°から90°まで選択します(図8A、Bでは、ΔΨ = それぞれ24°と1°)。
- 選択したΦとΔΨの値を使用して、θ角度の測定範囲全体について(式22)と(式23)を計算します。
- シミュレーション中に計算された強度を比較します(どちらも
- ) を 100 未満の正規化された強度で計算します。
- ps-2PFM測定中に計算 し、 (どちらもの 最大値に正規化)測定します。
注: 提示された実験では、NumPy Python ライブラリの "corrcoef" 関数を使用して Pearson 積率相関係数が計算されました。
- 最後に、図8に示すように、ΦとΔΨの値を選択し、相関係数が最大になり、シミュレートされた強度と測定信号の間に収束します。
- Ψ 半角を決定します。
と 
偏光の間の振幅係数を表します。
(1)
(2)
(3)
(4)
(5)
(6)
(7)
(8)
(9)
(10)
(11)
(12)
(13)
(14)
(15)
(16)
(17)
(18)
(19)
(20)
(21)
を、測定された角度ごとに(ポイント4.1.2と同様に)計算します。
= 
(22)
= 
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Representative Results
提示されたプロトコルは、ps-2PFMで検査するためのアミロイド上部構造の準備、顕微鏡システムの構築、および適切なサンプルの測定を通じて、段階的なガイダンスを提供します。ただし、最終的な測定セットの前に、APDを等方性リファレンスに適切に位置合わせすることが不可欠であり、これにより、両方の検出器で同様の形状と強度の対称信号が収集される必要があります(図4C)。検出器で測定されたX軸とY軸の強度の差が最小であっても、その後の測定、特に分析中に適切な補正係数として考慮する必要があります。取り付け後、単一の球晶石を含むサンプルは、図2BのようにPOM上に特徴的なマルタ十字を与え、2PFMラスタースキャンを実行した後、画像は図5Aに示されているものと同様になり、これはスフェルライト6,7および異なる組織化された生体分子11,12の報告された2PFMラスタースキャンと一致します.蛍光シグナルの強度が励起ビームの偏光に強く依存するという事実に関連して、最も明るい軸の位置にいくつかの変化が見られることがあります。したがって、半波長板のどの位置がX軸(図5A、上)とY軸(図5A、下)に沿ったサンプルの励起に対応するかを検証する必要があります。また、選択したさまざまなスポットから完全な偏光解析を実行する際に極性グラフがどのように変化するかにも注目に値します。球晶石の外側では、極座標グラフはアーチファクトとランダムな信号ノイズスパイクの集まりのように見えます(図5B、I)。このようなグラフは、測定間の球状突起のドリフトを示す場合もあり、別の2PFラスタースキャンによって構造全体の新しい座標を見つける必要があります。X軸とY軸に沿ったインスリン球状突起の高秩序な位置から適切に測定された極性グラフをそれぞれ図5B IIおよびIIIに示します。それらは、選択されたスポット7から測定された蛍光色素の局所的な配向および組織に応じて、異なる形状および幾何学的形状を有することができる。
プロトコールの最後のステップは、XY平面Φにおけるアミロイド線維の配向、関連する蛍光色素の過渡双極子モーメントΨ、およびそれらの収差ΔΨ(図6)と強度
および
2光子誘起蛍光を組み合わせた数学的モデルに基づくアルゴリズムを使用して、得られたデータの解析に焦点を当てています。プロトコルに正しく実装された関数は、適切な入力データを入力した後(プロトコルのステップ4.9)、図7に示されているものと同じ極性グラフを生成する必要があります。偏差 - シミュレートされた
データの向き、強度、または形状が異なる場合は、
コード内のエラーを示します。モデルがうまくいけば、シミュレーションデータをps-2PFM測定から得られた実際のデータにプロトコルフィッティングする最後のステップに進むことができます。ΦとΔΨの値を選択すると、相関係数が最大になり、シミュレートされた強度と測定信号の間に収束すると、図8に示すような画像が得られます。と の全体的な配向と形状に と の関数が最適に適合し、Φ と ΔΨ の値は、スフェルライト上の測定スポットにおけるフィブリルと蛍光色素の局所的な配向に対応する必要があります。同様のモデルとフィッティング法は、DNA11のような他の生体分子の局所的な組織化の決定にも使用できます。
図1:2光子偏光に敏感な顕微鏡のセットアップ。 ウシインスリン球晶石の偏光感受性2光子励起蛍光測定に使用される2光子顕微鏡のセットアップを示す図。水平偏光と垂直偏光(顕微鏡試料面)の2光子励起放出成分は、それぞれIXとIYで描かれています。略語: SP = サンプル平面;O =目的;DM = ダイクロイックミラー;λ/2 = 半波長板;LPF = ロングパスフィルター;BE = ビームエキスパンダー;P =亀頭偏光子;Ti:Sa = Titan:サファイアレーザー光源;M = ミラー;SPF = ショートパスフィルター;PBS = 偏光ビームスプリッター;L =光学レンズ;APD = アバランシェフォトダイオード この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図2:スライド調製/写真を示すスキーム。 (a)密封されたサンプル調製物を示すスキーム;(B)試料封止のその後の工程の写真。I:ウェルを備えた顕微鏡スライド上の球状突起溶液の100μLアリコート、II:溶液の上にカバーガラスを滴下。III:堆積したポリマー(封入剤)から形成されたタイトシール。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図3:偏光顕微鏡下でのインスリンスフェルライトの品質管理。 (A1、B1)明視野モード、および(A2、B2)交差偏光子の下。特徴的なマルタ十字パターンは、交差偏光子で撮影された対応する画像で観察できます。(A)構造歪みのある球晶石凝集体、(B)高品質の孤立した球晶石。スケールバー = 5 μm。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図4:ps-2PFMシステムのアライメントのテスト。 (A)(A1)ダイクロイックミラーなしおよび(A2)ダイクロイックミラーありで見たフルオレセイン蛍光の同心円状の焦点ぼけ画像、 (B)x方向とy方向に沿って選択された点で細長い偏光分析によって発生した焼け穴を伴う光損傷球状突起、(C)等方性サンプル(フルオレセイン溶液)に登録された入射光偏光角に依存する2光子励起発光成分。は、XおよびYの発光偏光軸をそれぞれ測定するアバランシェフォトダイオードによって測定された発光成分を示す。スケールバー = 5 μm (A1,A2)、10 μm (B)。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図5:ラベルフリーインスリンスフェライトからの例示的な2PFMラスタースキャンおよび極性グラフ。 (A)ラベルフリーインスリン球状突起の2PF強度ラスタースキャン:励起光の偏光:(A1)水平偏光、(A2)垂直偏光、および発光は白い矢印で示され、挿入図は交差偏光子を備えた標準偏光顕微鏡で画像化された同じ球晶石を示しています。(B)A1スキャンで示された3つのスポットから得られた極性グラフ(B1、I;B2、II;B3、IIIなど)。IxおよびIyは、それぞれXおよびYの発光偏光軸を測定するアバランシェフォトダイオードによって測定された発光成分を示す。略語:2PF = 2光子蛍光。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図6:長フィブリル軸に対する色素の発光双極子(半値角、Ψ)の円錐分布。 破線は長フィブリル軸を示す。XY顕微鏡試料面におけるフィブリルの回転は、角度によって記述される。フィラメントの分子回転によるΨの収差はΔΨで表されます。この図は Obstarczyk et al6 によるものです。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図7:偏光2光子励起蛍光のシミュレーション強度。(A) Φ = 1°、Ψ = 1°、ΔΨ = 1°で計算した蛍光。(b)Φ= 1°、Ψ= 30°、ΔΨ= 1°;(c)φ=1°、ψ=30°、δψ=60°。赤、青、黄色の線は、それぞれ、 他のすべてのパラメータは、K1 = 2.945、K2 = 0.069、K3 = 1.016、γ = 0.01、δ = 0.98845 と、すべてのケースで同一でした。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図8:実験データセットの極座標グラフ。 (A,B)ウシインスリン球状物質のps−TPFM測定中に収集された2つの実験データセットをフィッティングした後の例示的な極地グラフ。XおよびY発光偏光軸の測定および2光子励起発光成分は、それぞれ赤と青の点で示され、一方、実線は、XおよびY発光偏光軸およびに対応するシミュレートされた2光子励起蛍光発光成分を示す。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
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Discussion
偏光感受性2光子顕微鏡は、アミロイド上部構造内のフィブリルの局所的な秩序を研究するための貴重なツールであり、標準的な多光子セットアップを少し変更するだけで済みます。非線形光学現象を操作するため、1光子励起蛍光顕微鏡法と比較して、角度による光選択の低減と軸方向分解能の向上を達成できます。さらに、1光子励起蛍光顕微鏡技術と比較して、光散乱が少なく、光毒性が低く、サンプルの浸透が深くなります19,20。すでに証明したように、球晶石などのタンパク質の高密度凝集体の測定に適しており、ラベルフリーの方法で実行できます21。
ただし、ここで説明する方法を効果的に使用するには、いくつかの重要な問題に注意を払う必要があります。サンプルの調製とその品質、つまりインキュベーションから始めて、アミロイドの上部構造が正しく増殖していることを常に確認してください。球晶石の場合、偏光光学顕微鏡と交差偏光子を用いて、特徴的なマルタの十字パターンを与え、半径が~5μmの成熟球状球状突起を局在化させた16。しかし、球状突起は不均一であり、試料内に特徴的な構造が観察されます。したがって、分離された歪みのない種を選ぶことが重要です。測定システム自体に関しては、入射光の偏光を制御して、顕微鏡本体への入り口でのビームの偏光を正確に決定し、使用する光学素子によってもたらされる偏光を最小限に抑えなければならないことが重要です22。最高の性能を保証するために、励起波長と蛍光発光波長に適合した高品質の銀ミラーと光学フィルターを使用することをお勧めします。光の偏光は発光経路でも重要な役割を果たすため、実際の測定の前に等方性参照サンプルを測定することが不可欠です。励起光路とAPD検出器が正しく位置合わせされていれば、 図4Cに示すように、両方の検出器で同じ強度の信号が見られるはずです。リファレンスは、光退色を避けるために、比較的低いレーザー出力で強力な2光子励起蛍光を生成する必要があります。フルオレセインを用いたのは、異なる波長の2光子吸収断面積が文献23ですでに報告されているからである。
球状突起内部の構造の配置を正しく決定するためには、データ解析にも多くの注意を払う必要があります。このモデルの基本的な仮定は、光の吸収と放出の遷移双極子モーメントの共線性です。この仮定の下では、分子の遷移双極子モーメントを入射光の偏光と平行に揃えることで、試験したサンプルの内部構造と組み合わせることができ、最高の発光強度が得られます。所与のモデルは、2つの双極子モーメント 8間の角度の小さな差に対する良い近似としても用いることができるが、大きな偏差に対してはさらなる修正を必要とする。したがって、説明したように、サンプルに関するいくつかの仮定は、イメージングおよびデータ 分析に先立って考慮 に入れる必要があります。シミュレーションとこの方法で使用される方程式のベースとなるモデルケースでは、システム内の脱分極の主な原因はダイクロイックミラーです。したがって、データ分析を進める前に、収集された極性グラフの形状への影響によりダイクロイックミラーによって導入される脱分極の原因となるパラメータを決定し、その結果、フィッティング中に検査された構造内の分子の組織を正しく決定する必要があります18.これは、特に複数の波長の測定の場合、ダイクロイックミラーの楕円率の変化が明確に波長に依存するため、重要な問題になります12。脱分極の誘導は、収集された信号11の特性に強く影響し得る。最後になりましたが、データ分析用のスクリプトを作成するときは、プロトコルの最後の部分で提示されている数学関数と変数を紹介する際に注意を払う必要があります。エラーを回避するには、複数の関数呼び出しやグローバル パラメーターなどの機能に重点を置くと、分析時間も大幅に短縮されます。
また、説明されている方法を使用するときに発生する可能性のある最も一般的な問題についても言及する必要があります。サンプル調製時間は、封入剤の硬化速度に大きく依存します。これをスピードアップするために、サンプルを暖かく乾燥した場所で調製し、球状物質溶液を密封してから顕微鏡に取り付けることをお勧めします。測定が早すぎると、スライドの密封が外れたり、使用済みの対物レンズが破壊されたりする可能性があります。さらに、適切なサンプル前処理を行っても、対物レンズによってもたらされる材料応力により、測定中に小さな球状物質が溶液中に浮遊することがあります。これを回避するには、最大の構造は一般的に凝集体であるため、孤立した中規模の構造をスキャンすることをお勧めします。測定を開始する前に、データ取得後にスキャンした球状突起が画像と比較して移動したかどうかを確認することをお勧めします。さらに、ps-2PFMの測定に使用したすべての光学素子と検出器が正しくアライメントされているにもかかわらず、測定された強度と等方性基準の強度は依然としてわずかに異なる場合があります。このような場合、サンプル測定のデータを分析する際には、基準測定時に決定された補正係数に強度の1つを掛けて分析する必要があります。最後になりましたが、フィット手順中に、スクリプトがΦとΔΨの一致する値を見つけることができない可能性があります。これは、いくつかの要因が原因である可能性があります-データは、サンプル上の無秩序なスポット、たとえば、スフェルライトのコアから収集されました。研究された構造は、インキュベーション中に完全に形成されませんでした。と のシミュレーションが正しくない。 誤ったダイクロイックミラーパラメータγとδを使用している。 フィット中の各反復間のΦとΔΨの角度に設定されたステップが大きすぎます。無秩序なスポットの場合は、調査対象の構造物の周囲に近いポイントからデータを収集することをお勧めします。不完全な構造の場合は、インキュベーションを繰り返すか、スライドで他の構造を探します。シミュレーションが正しくない場合は、パラメーター Φ、Ψ、および ΔΨ を変更して、シミュレートされた強度を手動で確認し、コード内のエラーを変更して修正します。ダイクロイックミラーのパラメータが正しくない場合は、測定時に使用したダイクロイックミラーのγとδのパラメータを注意深く確認してください。フィット中の角度に大きなステップを設定する場合は、連続する反復間のステップを2°または1°に減らします。また、構造の局所的な混乱が強い場合、R2は常に低く、しばしば0.5〜0.6の範囲になることも覚えておく必要があります。これは、提示されたモデルが、過渡双極子モーメントのほとんどが同様の方向に整列している高秩序分子を記述しているためです。したがって、アモルファス構造や高度に無秩序な構造を一致させると、相関係数が低くなります。したがって、得られたデータを正しく分析するには、測定前にサンプルの少なくともいくつかの構造情報を所有することが重要です。
また、提示された方法にはいくつかの制限があることも注目に値します。データ解析により、Φ角とΔ角 のいくつかの値が十分に高い相関係数が得られることがあり、実験者は知識と経験を駆使して適切な値を選択する必要があります。この場合、蛍光色素錐の半角 Ψ は常に収差ΔΨよりも大きくなければならないなどの境界条件を考慮する必要があります。さらに、私たちのデータを文献と比較すると、いくつかの論文では Ψ を全円錐角として記述しているのに対し、私たちは半円錐角で操作していることは注目に値します。もう一つの制限は、サブミクロン分解能に制限された測定分解能です。そのため、システムの光選択性と結果として生じる局所組織の決定は、単一の構造ではなく、焦点で励起されたフィブリルからの平均化されたシグナルに基づいています。さらに、極性グラフのデータを取得するために必要なfs入射レーザー出力下での長時間の露光は破壊的であり、結果に影響を与える可能性があるため、サンプル自体が十分な蛍光量子収率を持っている必要があります。
これらの困難にもかかわらず、この論文で提示された方法は、水和した複雑な環境における生体構造のラベルベースおよびラベルフリーイメージングに幅広い応用があると考えています。我々は以前、ps-2PEFデータから計算された局所的なフィブリル秩序が、透過型電子顕微鏡から得られる情報と相関することを示した7。そこで、バイオイメージングにおけるps-2PEFの妥当性を確認し、アミロイド上部構造の構造秩序に関する知見をさらに広げました。この方法は、タンパク質凝集体(アミロイド)の自家蛍光など、生体試料のさまざまな成分で観察される内因性蛍光の起源を知るために適用できます。アミロイド線維の長軸に対する吸収/発光双極子モーメント方向の配向に関する関連データが与えられると、フィブリルの光学特性はそれらの構造と相関させることができる6。我々は、すでに決定された Ψ 角を持つ構造に対して、この手法により、アミロイド上部構造の明確な構造的特徴とインスリン上部構造の多形をそれらの組織レベルに基づいて検出できることを示しました7。プロトコルで前述したように、提示されたセットアップは、ラベルフリーの2光子顕微鏡技術である偏光感受性第2高調波発生測定にも適用できる24。これには、異なる光学フィルターを取り付けるだけでなく、データ分析に使用される式を変更することも必要になります25。さらに、適切にアライメントされた1/4波長板を追加することで、円偏光でサンプルを励起するために使用でき、アミロイドは強いキラル光学特性が確認されたキラルな生体高分子であるため、アミロイドのキラル非線形光学特性の生成につながる可能性があります26。しかし、そのような場合、常に回転する電気ベクトルは励起放出の方向を絶えず変化させることになり、この原稿で提示された方程式を使用して構造情報を決定することは不可能です。全体として、ps-2PEFは、タンパク質凝集体、DNA、組織などの規則的な発光双極子を持つ多数の複雑な生体構造内の構成を非侵襲的に決定するための有望なツールです。
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Disclosures
著者には開示すべき利益相反はありません。
Acknowledgments
この研究は、ポーランドの国立科学センターの資金提供を受けたSonata Bis 9プロジェクト(2019/34/E/ST5/00276)の支援を受けました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sample preparation | |||
| Coverslips, 24 x 24 mm | Chemland | 04-298.202.04 | |
| DPX mountant for histology | Sigma-Aldrich | 6522 | Slide mountant |
| Eppendorf Safe-Lock tubes, 1.5 mL, polypropylene | Chemland | 02-63102 | |
| Eppendorf ThermoMixer C | Eppendorf | Used for spherulite incubation | |
| HLP 5UV Water purification system | Hydrolab | Source of dionized water used in sample preparation | |
| Hydrochloric acid (≥37%, APHA ≤10), | Sigma-Aldrich | 30721-M | |
| Insulin powder from the bovine pancreas (≥25 units/mg (HPLC)) | Sigma-Aldrich | I5500 | |
| Methanol (HPLC grade) | Sigma-Aldrich | 270474 | |
| Microscope slides with a concave, 76 x 26 x 1 mm | Chemland | 04-296.202.09 | |
| Olympus BX60 | Olympus | Polarized Optical Microscope used in Figure 2 | |
| PTFE thread seal tape, 12 mm x 12 mm x 0.1 mm, 60 gm2 | Chemland | VIT131097 | |
| Microscope ps-2PFM setup | |||
| Chameleon Ultra II | Coherent | ||
| FELH0800 - Ø25.0 mm Longpass Filter | Thorlabs | ||
| FESH0700 - Ø25.0 mm Shortpass Filter | Thorlabs | ||
| IDQ100 photon-counting avalanche photodiodes | ID Quantique | ||
| Multiphoton short-pass emission filter 720 nm | Semrock | ||
| Mounted Achromatic Half-Wave Plate, 690-1200 nm | Thorlabs | ||
| Nikon Plan Apo Oil Immersion 100x/1.4 NA | Nikon | ||
| piezo 3D stage | Piezosystem Jena | ||
| Polarizing Beamsplitter | Thorlabs | ||
| S130C - Slim Photodiode Power Sensor, Si, 400 - 1100 nm, 500 mW | Thorlabs | ||
| Software | |||
| LabView 2018 | National Instruments | Version 18.0.1f2 | |
| Matplotlib library | Version 3.3.2 | ||
| NumPy library | Version 1.19.2 | ||
| SciPy library | Version 1.5.2 | ||
| Spyder Python 3 IDE | Version 4.1.5 |
References
- Petazzi, R. A., Aji, A. K., Chiantia, S. Progress in Molecular Biology and Translational Science. Giraldo, J., Ciruela, F. 169, Academic Press. 1-41 (2020).
- Kress, A., et al. Probing orientational behavior of MHC class I protein and lipid probes in cell membranes by fluorescence polarization-resolved imaging. Biophysical Journal. 101 (2), 468-476 (2011).
- Duboisset, J., et al. Thioflavine-T and Congo Red reveal the polymorphism of insulin amyloid fibrils when probed by polarization-resolved fluorescence microscopy. The Journal of Physical Chemistry B. 117 (3), 784-788 (2013).
- De Luca, G., et al. Probing ensemble polymorphism and single aggregate structural heterogeneity in insulin amyloid self-assembly. Journal of Colloid and Interface Science. 574, 229-240 (2020).
- Helmchen, F., Denk, W.
- Obstarczyk, P., Lipok, M., Grelich-Mucha, M., Samoć, M., Olesiak-Bańska, J. Two-photon excited polarization-dependent autofluorescence of amyloids as a label-free method of fibril organization imaging. The Journal of Physical Chemistry Letters. 12 (5), 1432-1437 (2021).
- Obstarczyk, P., Lipok, M., Żak, A., Cwynar, P., Olesiak-Bańska, J. Amyloid fibrils in superstructures - local ordering revealed by polarization analysis of two-photon excited autofluorescence. Biomaterials Science. 10 (6), 1554-1561 (2022).
- Le Floc'h, V., Brasselet, S., Roch, J. -F., Zyss, J. Monitoring of orientation in molecular ensembles by polarization sensitive nonlinear microscopy. The Journal of Physical Chemistry B. 107 (45), 12403-12410 (2003).
- Chen, C., et al. In vivo near-infrared two-photon imaging of amyloid plaques in deep brain of Alzheimer's disease mouse model. ACS Chemical Neuroscience. 9 (12), 3128-3136 (2018).
- Gasecka, P., Balla, N. K., Sison, M., Brasselet, S. Lipids-fluorophores interactions probed by combined nonlinear polarized microscopy. The Journal of Physical Chemistry B. 125 (50), 13718-13729 (2021).
- Mojzisova, H., et al. Polarization-sensitive two-photon microscopy study of the organization of liquid-crystalline DNA. Biophysical Journal. 97 (8), 2348-2357 (2009).
- Olesiak-Banska, J., et al. Liquid crystal phases of DNA: Evaluation of DNA organization by two-photon fluorescence microscopy and polarization analysis. Biopolymers. 95 (6), 365-375 (2011).
- Olesiak-Banska, J., et al. Gold nanorods as multifunctional probes in a liquid crystalline DNA matrix. Nanoscale. 5 (22), 10975-10981 (2013).
- Grelich-Mucha, M., Lipok, M., Różycka, M., Samoć, M., Olesiak-Bańska, J. One- and two-photon excited autofluorescence of lysozyme amyloids. The Journal of Physical Chemistry Letters. 13 (21), 4673-4681 (2022).
- Brasselet, S., et al. Fluorescent Methods to Study Biological Membranes. Mély, Y., Duportail, G. , Springer. Berlin Heidelberg. 311-337 (2013).
- Krebs, M. R., et al. The formation of spherulites by amyloid fibrils of bovine insulin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (40), 14420-14424 (2004).
- Aït-Belkacem, D., Gasecka, A., Munhoz, F., Brustlein, S., Brasselet, S. Influence of birefringence on polarization resolved nonlinear microscopy and collagen SHG structural imaging. Optics Express. 18 (14), 14859-14870 (2010).
- Schön, P., Munhoz, F., Gasecka, A., Brustlein, S., Brasselet, S. Polarization distortion effects in polarimetric two-photon microscopy. Optics Express. 16 (25), 20891-20901 (2008).
- Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron. 50 (6), 823-839 (2006).
- Zipfel, W. R., Williams, R. M., Webb, W. W. Nonlinear magic: multiphoton microscopy in the biosciences. Nature Biotechnology. 21 (11), 1369-1377 (2003).
- Ferrand, P., et al. Ultimate use of two-photon fluorescence microscopy to map orientational behavior of fluorophores. Biophysical Journal. 106 (11), 2330-2339 (2014).
- Chipman, R. A. Depolarization index and the average degree of polarization. Applied Optics. 44 (13), 2490-2495 (2005).
- de Reguardati, S., Pahapill, J., Mikhailov, A., Stepanenko, Y., Rebane, A. High-accuracy reference standards for two-photon absorption in the 680–1050 nm wavelength range. Optics Express. 24 (8), 9053-9066 (2016).
- Mansfield, J. C., Mandalia, V., Toms, A., Winlove, C. P., Brasselet, S. Collagen reorganization in cartilage under strain probed by polarization sensitive second harmonic generation microscopy. Journal of The Royal Society Interface. 16 (150), 20180611 (2019).
- Duboisset, J., Aït-Belkacem, D., Roche, M., Rigneault, H., Brasselet, S. Generic model of the molecular orientational distribution probed by polarization-resolved second-harmonic generation. Physical Review A. 85 (4), 043829 (2012).
- Loksztejn, A., Dzwolak, W. Chiral Bifurcation in aggregating insulin: an induced circular dichroism study. Journal of Molecular Biology. 379 (1), 9-16 (2008).
