Summary
In dieser Arbeit stellen wir ein Rattenmodell mit geschlossenem Schädel-Hirn-Trauma (mTBI) und dessen Validierung vor, das eine bemerkenswerte Ähnlichkeit mit dem menschlichen mSHT in Bezug auf Verhaltensmanifestationen während der akuten und subakuten Stadien aufweist.
Abstract
Tiermodelle sind von entscheidender Bedeutung, um unser Verständnis von leichten Schädel-Hirn-Traumata (mSHT) zu verbessern und die klinische Forschung zu leiten. Um aussagekräftige Erkenntnisse zu gewinnen, ist die Entwicklung eines stabilen und reproduzierbaren Tiermodells unerlässlich. In dieser Studie berichten wir über eine detaillierte Beschreibung eines Closed-Head-mTBI-Modells und eine repräsentative Validierungsmethode mit Sprague-Dawley-Ratten, um den Modellierungseffekt zu verifizieren. Bei dem Modell wird ein 550 g schweres Massengewicht aus einer Höhe von 100 cm direkt auf den Kopf einer Ratte auf einer zerstörbaren Oberfläche fallen gelassen und anschließend um 180 Grad gedreht. Um die Verletzung zu beurteilen, unterzogen sich die Ratten 10 Minuten nach der Verletzung einer Reihe von neurologischen Verhaltensuntersuchungen, einschließlich des Zeitpunkts des Bewusstseinsverlusts, der Zeit für das erste Suchverhalten, der Fluchtfähigkeit und des Tests der Balkenbalancefähigkeit. Während der akuten und subakuten Phasen nach der Verletzung wurden Verhaltenstests durchgeführt, um die motorische Koordinationsfähigkeit (Beam-Aufgabe), die Angst (Open-Field-Test) sowie die Lern- und Gedächtnisfähigkeiten (Morris-Water-Maze-Test) zu bewerten. Das Closed-Head-mTBI-Modell erzeugte eine konsistente Verletzungsreaktion mit minimaler Mortalität und replizierte reale Situationen. Die Validierungsmethode verifizierte effektiv die Modellentwicklung und stellte die Stabilität und Konsistenz des Modells sicher.
Introduction
Ein leichtes Schädel-Hirn-Trauma (mTBI) oder eine Gehirnerschütterung ist die häufigste Art von Verletzung und kann zu verschiedenen kurzzeitigen und chronischen Symptomen führen1. Zu diesen Symptomen können unter anderem Schwindel, Kopfschmerzen, Depressionen und Anhedonie gehören, die bei Personen, die von mSHT betroffen sind, zu erheblichem Leiden führen2. Da die meisten mSHTs durch stumpfe Gewalteinwirkung verursacht werden3, ist es unerlässlich, Tiermodelle zu entwickeln, die solche Verletzungen genau nachahmen. Diese Modelle sind unerlässlich, um ein besseres Verständnis der Verletzung und der zugrunde liegenden Mechanismen zu erlangen, und bieten eine kontrollierte Umgebung mit reduzierter Variabilität und Heterogenität im Vergleich zu Studien am Menschen.
Für Schädel-Hirn-Traumata (SHT) wurden zahlreiche etablierte Nagetiermodelle entwickelt, darunter Fluid Percussion Injury (FPI)4, Controlled Cortical Impact (CCI)5, Weight DropInjury 6, Blast-Traumatic Brain Injury7 und andere. Diese Modelle konzentrieren sich jedoch in erster Linie auf die Replikation von mittelschweren bis schweren SHT-Szenarien. Im Gegensatz dazu haben die experimentellen Modelle, die speziell für die Simulation von mTBI entwickelt wurden, relativ wenig Aufmerksamkeit erhalten und sind noch wenig erforscht8. Daher ist es dringend erforderlich, ein stabiles und reproduzierbares Tiermodell zu etablieren, das das mSHT genau abbildet. Ein solches Modell würde unser Verständnis der neurobiologischen und verhaltensbezogenen Folgen von mSHT erheblich verbessern.
Man kann die funktionellen Defizite bei mTBI-Ratten im Vergleich zu normalen Ratten nicht durch zufällige Beobachtung unterscheiden, nachdem die Wirkung der Anästhesie abgeklungen ist. Daher ist es notwendig, spezifische Tests durchzuführen. Beim Menschen wird ein breites Spektrum klinischer Beurteilungen verwendet, um Patienten zu beurteilen 9,10,11. In ähnlicher Weise erfordert die Etablierung eines erfolgreichen Modells im Rattenmodell auch den Einsatz von Schnellbewertungsinstrumenten, um seine Gültigkeit zu bestimmen.
In dieser Studie stellen wir ein geschlossenes mTBI-Rattenmodell vor, das die Untersuchung von mTBI in einer Weise ermöglicht, die dem menschlichen Zustand sehr ähnlich ist. Die detaillierte Beschreibung des Modells und seines Validierungsverfahrens vermittelt ein umfassendes Verständnis des experimentellen Ansatzes, der bei der Untersuchung von mTBI verwendet wird.
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Protocol
Die Tierversuche wurden vom Central South University Animal Care and Use Committee genehmigt. Alle Studien wurden im Einklang mit dem Wohlergehen und den ethischen Grundsätzen von Versuchstieren durchgeführt.
1. Fütterung und Betäubung der Tiere
- Halten Sie 280-320 g männliche Sprague-Dawley-Ratten in einer Gruppe und halten Sie sie in einem 12 h/12 h Hell/Dunkel-Zyklus mit Zugang zu Futter und Wasser ad libitum. Führen Sie die Studie durch, nachdem sich die Ratten 6 Tage lang akklimatisiert haben.
- Betäuben Sie die Ratte mit 3% Isofluran bei 0,6 l/min Luftstrom in einer Induktionsbox, bis sie nicht mehr auf Pfoten- oder Schwanzkneifen reagiert. Halten Sie die Durchflussrate für 30 Sekunden.
ANMERKUNG: Schmerzmittel wurden nicht verwendet, da sie die Reaktion der Ratte bei den neurologischen Verhaltensbeurteilungen beeinträchtigen würden.
2. Präoperativer Aufbau
- Positionieren Sie einen Schwamm mit einem Härtewert von 35D (Gewicht von 35 kg/m3 Schwamm) mit identischer Länge und Breite, aber einer Dicke von 12 cm, in einer Acrylbox (15 cm x 22 cm x 43 cm) ohne obere Abdeckung.
- Schneiden Sie eine Zinnfolie (20 μm dick) zu und befestigen Sie sie mit Klebeband auf der Acrylbox, um eine zerstörbare Oberfläche zu bilden, die das Gewicht einer Ratte tragen kann. Markieren Sie zusätzlich eine ca. 10 cm lange Schnittlinie, die als Position für die Positionierung des Rattenkopfes vorgesehen ist.
- Mit Hilfe eines Bügeleisenständers fixieren Sie das PVC-Rohr fest. Bereiten Sie ein perforiertes Gewicht von 550 Gramm mit einem Durchmesser von 18 Millimetern vor. Befestigen Sie das Gewicht an einer Angelschnur in einer Höhe von 1 Meter in einem Polyvinylchlorid- oder PVC-Schlauch. und stellen Sie die Position des Führungsrohrs 3 Zentimeter über der Zinnfolie ein.
- Bereiten Sie einen Helm und ein Kissen vor. Fertigen Sie einen Helm aus einer Edelstahlscheibe mit einem Durchmesser von 10 mm und einer Dicke von 3 mm. Bereite ein keilförmiges Schwammkissen vor, das du unter den Kopf der Ratte legst, und achte darauf, dass es senkrecht zur Schwerkraft steht.
ANMERKUNG: Ein schematisches Diagramm des Schlaggeräts ist in Abbildung 1 dargestellt. Der Helm dient dazu, den Aufprallort zu identifizieren und die Verteilung der äußeren Kräfte zu verbessern. Das Kissen wird verwendet, um eine gleichmäßige und stabile Beschädigung zu gewährleisten.
3. mTBI-Induktion
- Legen Sie die betäubte Ratte schnell auf die Brust auf die Alufolie.
HINWEIS: Für die mTBI-Induktion sind zwei Bediener erforderlich: einer für die Vorbereitung und der andere für die Überprüfung. - Vorbereitung: Legen Sie das Kissen unter die Ratte und achten Sie darauf, dass der Kopf parallel zum Folienpapier ist. Richten Sie den Helm an den Ohren der Ratte aus und befestigen Sie ihn.
- Überprüfung: Vergewissern Sie sich, dass das PVC-Rohr direkt über dem Helm positioniert ist. Sobald beide Bediener die korrekte Einrichtung bestätigt haben, fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort.
- Induktion der Kopfdrehung: Lassen Sie das Gewicht los, so dass es fallen und auf den Kopf der Ratte treffen kann, was einen Sturz auf den Schwamm und eine 180°-Drehung auslöst.
- Setze die Ratte auf den Rücken in einen sauberen Käfig.
4. Schein-Induktion
- Behandeln Sie die Ratte auf die gleiche Weise wie in der vorherigen Beschreibung der mTBI-Induktion, aber setzen Sie sie nicht dem Kopfaufprall aus.
5. Validierungsverfahren: Akute neurobehaviorale Beurteilungen
HINWEIS: Die folgenden Bewertungen wurden auf der Grundlage des Neurological Severity Scores9 und des Protokolls von Flierl et al.10 modifiziert. Alle diese Untersuchungen wurden 10 Minuten nach der Wiedererlangung des Aufrichtungsreflexes durchgeführt.
- Zeitpunkt des Bewusstseinsverlusts: Notieren Sie die Dauer von der Betäubung der Ratte bis zur Wiedererlangung des Aufrichtungsreflexes.
HINWEIS: Der Aufrichtungsreflex ist der Vorgang, bei dem sich die Ratte umdreht, wenn sie auf den Rücken gelegt wird. Der Verlust des Aufrichtungsreflexes ist als humaner Endpunkt zu betrachten, und das Tier muss gemäß den institutionellen Richtlinien eingeschläfert werden. - Zeit des ersten Suchverhaltens: Notieren Sie die Dauer von der Betäubung der Ratte bis zu dem Zeitpunkt, an dem sie das Suchverhalten zum ersten Mal zeigt.
ANMERKUNG: Das Suchen nach Verhalten ist ein Zeichen des Interesses an der Umwelt, eine physiologische Reaktion. - Fähigkeit zur Flucht
- Platzieren Sie die Ratte in der Mitte eines kreisförmigen Apparates (0,5 m Durchmesser und 0,3 m Höhe) mit einem Ausgang (12,5 cm lang und 9 cm breit).
- Notieren Sie die Zeit, die die Ratte braucht, um den Kreis zu verlassen.
HINWEIS: Wenn die Ratte den Kreis nicht innerhalb von 180 s verlässt, notieren Sie die Zeit mit 180 s.
- Balken-Gleichgewichts-Fähigkeitstest
- Legen Sie die Ratte entsprechend für 1 Minute auf einen 3 cm, 2 cm und 1,5 cm breiten Strahl.
- Wenn die Ratte das Gleichgewicht mit einer gleichmäßigen Haltung auf dem Balken beibehält, bewerten Sie sie mit 0.
- Wenn die Ratte die Seite des Balkens greift, geben Sie eine Punktzahl von 1. Wenn die Ratte den Balken umarmt und ein Glied von ihm abfällt, wird es mit 2 bewertet.
- Wenn die Ratte den Balken umarmt und die beiden Gliedmaßen von ihm herunterfallen oder sich auf ihm drehen (>60 s), wird sie mit 3 bewertet.
- Wenn die Ratte versucht, auf dem Balken zu balancieren, aber herunterfällt (> 40 s), wird sie mit 4 bewertet.
- Wenn die Ratte versucht, auf dem Balken zu balancieren, aber herunterfällt (>20 s), wird sie mit 5 bewertet.
- Wenn die Ratte nicht versucht, auf dem Balken zu balancieren oder zu hängen und innerhalb von 20 Sekunden herunterfällt, wird sie mit 6 bewertet.
HINWEIS: Für den Balkenauswuchttest ist kein Vorversuch erforderlich.
6. Validierungsverfahren: Bewertung des Neuroverhaltens
HINWEIS: Vor den Verhaltensexperimenten wurden die Ratten an 3 aufeinanderfolgenden Tagen täglich 2 Minuten lang behandelt, um Stress und Störungen der Neuheit zu minimieren. Alle Verhaltensexperimente wurden durchgeführt, indem die Tiere vor Beginn des Experiments für 60 Minuten in die Testumgebung gebracht wurden.
- Motorische Koordinationsfähigkeit (Beam-Aufgabe)
- Versuchsaufbau
- Setzen Sie die Ratten auf ein Ende des Schwebebalkens (1,5 m lang und 75 cm über dem Boden). Platzieren Sie eine Rettungsbox (einen schrägen Einstreukäfig) am anderen Ende.
- Positionieren Sie eine Schaumstoffpolsterung unter dem Balken, um das potenzielle Verletzungsrisiko für Ratten im Falle von Stürzen während des Tests zu verringern.
- Schalten Sie die Videokamera ein.
- Planen Sie Testtage zu bestimmten Zeitpunkten nach der Verletzung oder nach der Scheinbehandlung (z. B. Tag 1, Tag 3 und Tag 7).
- Einarbeitungsphase (2 Tage)
- Trainieren Sie die Ratten, den 4 cm breiten Balken 3 Mal hintereinander zu überqueren, gefolgt von zwei Versuchen auf dem 2 cm breiten Strahl.
- Führen Sie die Ratten während des Trainings vorsichtig über den Balken, bis sie ihn leicht und ohne Störung überqueren können.
- Schwebebalken-Experiment
- Setzen Sie die Ratten für 5 aufeinanderfolgende Versuche auf den 2 cm breiten Strahl.
- Notieren Sie den Beginn und das Ende jedes Versuchs, wenn die Nase der Ratte die Start- bzw. Ziellinie kreuzt.
- Bringen Sie die Ratten am Ende des Experiments in ihre Käfige zurück.
- Baseline-Tests
- Führen Sie das Schwebebalken-Experiment vor der Verletzung oder Behandlung durch.
- Berechnen Sie die Durchschnittswerte aus diesen 5 aufeinanderfolgenden Versuchen, um den Ausgangswert für jede Ratte festzulegen.
- Datenanalyse
- Analysieren Sie die Zeit, um den Strahl zu überqueren, und die Gesamtzahl der Ausrutscher des Rückfußes mithilfe von Videoanalysen von Forschern, die für die Versuchsbedingungen blind sind.
- Versuchsaufbau
- Angst (Offener Feldtest)
- Versuchsaufbau
- Bereiten Sie die Freifeldarena vor und stellen Sie sicher, dass sie sauber und frei von früheren Geruchsreizen ist. Unterteilen Sie die Arena in drei Zonen: eine mittlere Innenzone (33 cm x 33 cm), eine mittlere Zone (66 cm x 66 cm) und eine äußere Zone.
- Testphase
- Platziere eine Ratte in der Mitte der offenen Feldarena und starte den Timer. Erlaube der Ratte, die Arena 5 Minuten lang frei zu erkunden. Nach 5 Minuten bringen Sie die Ratte vorsichtig und vorsichtig in ihren Heimatkäfig zurück.
- Datensammlung
- Messen Sie die Gesamtstrecke, die die Ratte während der 5-minütigen Erkundungsphase zurückgelegt hat. Bestimme die Zeit, die die Ratte in der zentralen, inneren, mittleren und äußeren Zone verbringt.
- Datenanalyse
- Verwenden Sie die zurückgelegte Gesamtstrecke als Maß für das allgemeine Erkundungsverhalten und die Bewegungsfähigkeit. Berechnen Sie die Zeit, die Sie in der zentralen inneren Zone verbringen, als Indikator für angstähnliche Reaktionen.
- Versuchsaufbau
- Lern- und Gedächtnisfähigkeiten (Morris-Wasserlabyrinth-Test)
- Stellen Sie sicher, dass sich das Wasserlabyrinth-Gerät in einem ordnungsgemäßen Zustand befindet. Färben Sie das Wasser schwarz und platzieren Sie die Queues in den vier Himmelsrichtungen. Positionieren Sie die Plattform 2,5 cm unter der Wasseroberfläche.
- Richten Sie ein Überwachungssystem ein, um das Verhalten der Ratten aufzuzeichnen und zu beobachten.
- Trail-Tag
- Setze die Ratte schnell in das Wasserlabyrinth. Wenn die Ratte die Plattform nicht innerhalb von 2 Minuten erreicht, führen Sie sie vorsichtig mit dem Holzstab.
- Lassen Sie die Ratte sich mit der Umgebung des Labyrinths vertraut machen, während sie 20 Sekunden lang auf der Plattform steht, und entfernen Sie sie dann. Sobald sich die Ratte auf der Plattform befindet, lassen Sie sie 20 Sekunden lang stehen und entfernen Sie sie dann.
- Tägliche Wiederholung
- Wiederholen Sie die Prozedur des Trainingstages und setzen Sie die Ratte aus verschiedenen Quadranten ins Wasser. Wiederholen Sie Schritt 6.3.3. Setzen Sie das Training an 5 aufeinanderfolgenden Tagen fort.
- Sondentesttag: Entfernen Sie am 6. Tag die Plattform und legen Sie die Ratte für 2 Minuten in denselben Quadranten.
- Beobachtung und Aufzeichnung: Nutzen Sie das Überwachungssystem, um das Verhalten der Ratte an Versuchs- und Sondentesttagen zu überwachen.
- Reinigung: Nachdem Sie die Ratte aus dem Wasserlabyrinth entfernt haben, trocknen Sie sie mit einem Handtuch gründlich ab.
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Representative Results
Die in dieser Arbeit verwendete Apparatur war eine modifizierte Version des Kane-Modells und des pädiatrischen Modells11,12 von Richelle Mychasiuk. In dieser Studie wurden SD-Ratten Schein- und mTBI-Gruppen zugeordnet. Um die Reproduzierbarkeit dieses Modells zu demonstrieren, führten wir drei unabhängige Replikate dieses Modells zusammen mit der Bewertung des akuten neurologischen Verhaltens durch, wobei jedes Experiment 8-12 Ratten umfasste. In dieser Studie wurden mehr als 30 mTBI-Ratten verwendet, wobei 2 Ratten aufgrund der Anästhesie starben. Allerdings erlag während des Experiments keine Ratte einer Hirnverletzung. Die Ergebnisse dieser Experimente sind in Abbildung 2 dargestellt. Darüber hinaus wurden neurologische Verhaltensbeurteilungen während der akuten und subakuten Stadien durchgeführt (Abbildung 3, Abbildung 4 und Abbildung 5).
Ergebnisse der Beurteilung des akuten neurologischen Verhaltens
Alle diese Beurteilungen wurden nach Anästhesie/Aufprall 0 min (Zeitpunkt des Bewusstseinsverlusts und Zeit des ersten Suchverhaltens) bzw. 10 min (Kreisaustritt und Balkenbalance) durchgeführt.
Wie in Abbildung 2A gezeigt, verbrachten mTBI-Ratten signifikant mehr Zeit damit, sich von der Bewusstlosigkeit zu erholen, was mit den Ergebnissen früherer Studien übereinstimmt12,13. Das Suchverhalten bei Ratten, die als normale physiologische Aktivität angesehen wurden, zeigte eine statistisch signifikante Verlängerung der Erholungsphase innerhalb der mTBI-Gruppe (Abbildung 2B). Dieser Befund deutet darauf hin, dass die mTBI-Ratten eine längere Zeit benötigten, um ihre Fähigkeiten zur Fortbewegung, zum Riechen, zum taktilen Sondieren und zum Scannen der Umgebung wiederzuerlangen.
Der bestehende Kreistest hat die ursprünglichen sensorischen Tests im neurologischen Schweregrad ersetzt, die sich bisher auf subjektive Beobachtungen der Untersucher wie die Platzierungs- und propriozeptiven Tests stützten. Die mTBI-Ratten verbrachten im Vergleich zu den Scheinratten eine signifikant längere Zeit damit, den Kreis zu verlassen (Abbildung 2C). Die statistische Analyse mit einer Zwei-Wege-ANOVA für die Kreisaustrittszeit zeigte einen signifikanten Haupteffekt der Verletzung (F [1, 36] = 21,29, p < 0,0001), was auf einen Unterschied zwischen der mTBI- und der Scheingruppe hindeutet. Verschiedene Studien zeigten jedoch keinen signifikanten Effekt (F [2, 36] = 0,1396, p = 0,87).
Die Ergebnisse des Balkenbalance-Tests wurden mit einer Zwei-Wege-ANOVA analysiert, gefolgt von Bonferronis Mehrfachvergleichen für Unterschiede zwischen Gruppenmittelwerten (Abbildung 2D). Es gab einen signifikanten Gesamteffekt der Verletzung bei allen Breitstrahlaufgaben (3 cm: F = 13,89, p < 0,001; 2 cm: F = 42,7, p < 0,001; 1,5 cm: F = 27,25, p < 0,001), was darauf hindeutet, dass die mTBI-Ratten nach 10 Minuten nach dem Aufprall eine Gleichgewichtsstörung im Vergleich zu den Scheinratten aufwiesen. Nach drei unabhängigen wiederholten Experimenten zeigten der 2 cm und 1,5 cm breite Schwebebalken eine bessere Unterscheidung zwischen der Schein- und der mTBI-Gruppe als der 3 cm breite Balken.
Ergebnisse der Bewertung des Neuroverhaltens
Die motorische Koordinationsfähigkeit wurde mit Hilfe der Strahlaufgabe nach 1 Tag vor der Anästhesie/Verletzung und 1 Tag, 3 Tage und 7 Tage nach der Anästhesie/Verletzung beurteilt (Abbildung 3). Die Gesamtzahl der Ausrutscher der Hintergliedmaßen (Abbildung 3A) wurde durch wiederholte Messung der Zwei-Wege-ANOVA analysiert, und Bonferronis Mehrfachvergleiche ergaben, dass mTBI-Ratten am Tag 1 nach der Verletzung signifikant mehr Ausrutscher der Hintergliedmaßen aufwiesen als Scheinratten (Abbildung 3A; p < 0,01). Nach einer 2-tägigen Genesung wurden jedoch keine Veränderungen bei den Rückwärtsfehlern beobachtet, wobei sich die Gesamtzahl der Ausrutscher nach 7 Tagen wieder auf das Scheinniveau auflöste. Bemerkenswert ist, dass alle 6 mTBI-Ratten nach dem Aufprall mehr Ausrutscher der Hintergliedmaßen aufwiesen als ihre Ausgangsleistung. Das leicht erhöhte Ausrutschen der Hintergliedmaßen bei Scheinratten könnte mit der mangelnden Übung am Schwebebalken zusammenhängen. Nach 1 Tag und 3 Tagen nach der Verletzung verbrachten die mTBI-Ratten mehr Zeit damit, den 150-cm-Strahl zu durchqueren (39,8 s ± 3,79 s vs. 28,68 s ± 0,82 s, 37,06 s ± 4,06 s vs. 29,28 s ± 3,42 s), obwohl es keine Unterschiede zwischen mTBI-Ratten und Scheinratten in der Zeit gab, die benötigt wurde, um den Strahl zu allen Zeitpunkten zu durchlaufen (Abbildung 3B).
Es gab keine signifikanten Unterschiede in der zurückgelegten Strecke zwischen der Schein- und der mTBI-Gruppe (Abbildung 4A). Das angstähnliche Verhalten wurde durch die Messung der Zeit, die während des Freifeldtests in der mittleren Zone verbracht wurde, bewertet. Sowohl 3 Tage als auch 7 Tage nach der Verletzung zeigten die mTBI-Ratten im Vergleich zu den Scheinratten eine signifikante Verkürzung der Zeit, die sie in der mittleren Zone verbrachten. Dieser Befund deutet darauf hin, dass die mTBI-Ratten nach dem Aufprall innerhalb von 7 Tagen ein höheres Maß an angstähnlichem Verhalten zeigten (Abbildung 4B,C).
Die Ergebnisse der Morris Water Maze Learning Days zeigten, dass die mTBI-Ratten mehr Zeit benötigten, um die versteckte Plattform zu lokalisieren als die Scheinratten, was auf ein beeinträchtigtes räumliches Lernen und Gedächtnis in der mTBI-Gruppe hindeutet (Abbildung 5). Anschließend, während des Sondenversuchs, zeigten die mTBI-Ratten Defizite bei der Beibehaltung des räumlichen Gedächtnisses, was sich darin zeigte, dass sie weniger Zeit mit der Suche nach der entfernten Plattform verbrachten. Bemerkenswert ist, dass kein signifikanter Unterschied in der Schwimmgeschwindigkeit zwischen der Schein- und der mTBI-Gruppe beobachtet wurde, was die konsistenten Ergebnisse unterstützt, die in der im Freifeldtest durchgeführten Entfernungsanalyse beobachtet wurden. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass der Aufprall keinen erkennbaren Effekt auf die spontane Bewegungsfunktion hatte.
Abbildung 1: Aufprallgerät für mTBI bei Ratten. (A) Draufsicht und Seitenansicht des Kissens und des Helms in der relativen Position des Rattenkopfes. Die rot gestrichelte Linie zeigt die Helmposition an. (B) Ein Bild der gesamten Baugruppe, das ein vertikales Führungsrohr für das fallende Gewicht zeigt, das über dem Rattenstadium und dem Auffangschwamm positioniert ist. (C) Ein Standbild aus einem Aufprallvideo, das die 180°-Drehung der Ratte nach dem Kopfaufprall und die anschließende Beschleunigung/Drehung zeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Ergebnisse der akuten neurologischen Verhaltensbeurteilung nach Schein-, mTBI-Ratten, dreimal unabhängig voneinander wiederholt. (A) Signifikant verlängerte Zeit des Bewusstseinsverlusts nach Absetzen der Anästhesie bei Ratten, die ein mTBI erhielten, im Vergleich zu Scheinratten. Es gab einen signifikanten Gruppeneffekt (P < 0,0001, Zwei-Wege-ANOVA), aber keinen signifikanten Zeiteffekt (P = 0,6226) oder eine Gruppen-x-Zeit-Interaktion (P = 0,5803). (B) mTBI-Ratten zeigten ihr erstes Suchverhalten nach der Anästhesie. (C) Scheinratten verbrachten weniger Zeit damit, dem 60-cm-Kreis zu entkommen (*p < 0,01, **p < 0,001, ungepaarter t-Test). (D) Die Leistung im Balkengleichgewicht von 3 cm, 2 cm und 1,5 cm breitem Strahl. Die Ergebnisse der Mehrfachvergleiche von Bonferroni für jede Gruppe sind in den Abbildungen dargestellt. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts dargestellt. Pro Experiment wurden N = 8-12 Ratten verwendet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Die Leistung der Balkenaufgabe vor dem Aufprall und nach dem Aufprall an Tag 1, Tag 3 und Tag 7. (A) Die mTBI-Ratten machten am Tag 1 nach der Verletzung mehr Ausrutscher der Hintergliedmaßen (*p < 0,001, wiederholt gemessene 2-Wege-ANOVA). (B) Die durchschnittliche Durchlaufzeit von Scheinratten ist kürzer als die von mTBI-Ratten. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (N = 6/Gruppe) dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Die Leistung des Freifeldtests an Tag 1 vor und nach der Verletzung Tag 1, Tag 3, Tag 7 und Tag 14. (A) Es gab keinen Unterschied zwischen Schein- und mTBI-Ratten in der zurückgelegten Strecke. (B) mTBI-Ratten verbrachten an Tag 3 und Tag 7 weniger Zeit im Zentrum als Scheinratten (*p < 0,01, **p < 0,001, wiederholt gemessene 2-Wege-ANOVA), mit keinen offensichtlichen Unterschieden an Tag 1 vor der Verletzung und Tag 1 und Tag 14 nach der Verletzung. (C) Spurkarte von mTBI-Ratten an Tag 1, Tag 3, Tag 7 und Tag 14. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (N = 6-10/Gruppe) dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Die Leistung im Morris-Wasserlabyrinth . (A) Es gab keinen Unterschied in der Geschwindigkeit im Schwimmfähigkeitstest zwischen den Schein- und mSHT-Ratten. (B) Latenz zur verborgenen Plattform der Referenzspeicheraufgabe am Testtag. (C) Die Ratten überquerten die Plattform in der 2-minütigen Sondenteststudie nach 5 Versuchstagen mehrmals. Sham (5,14 ± 0,65) vs. mTBI (3,56 ± 0,6), (*p < 0,01, ungepaarter t-Test). Die Daten werden als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (N = 9/Gruppe) dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Dieses Modell simuliert erfolgreich ein mTBI mit geschlossenem Kopf, ohne dass ein Kopfhautschnitt oder eine Schädelöffnung erforderlich ist, und bietet eine genauere Darstellung des Aufprallszenarios, das beim Menschen beobachtet wird. Die Vermeidung von Kopfhautschnitten hilft, Entzündungsreaktionen zu verhindern, die möglicherweise nicht mit der tatsächlichen Situation übereinstimmen. Im Vergleich zum pädiatrischen Modell12 von Richelle Mychasiuk ist das in dieser Studie verwendete Modell speziell auf erwachsene Ratten mit einem Gewicht zwischen 280 und 320 g zugeschnitten und ermöglicht es uns, wertvolle Erkenntnisse über die Auswirkungen von mTBI auf erwachsene Individuen zu gewinnen. Darüber hinaus erleichtert die Integration von Schlüsselkomponenten wie einem Kissen und einem Helm die Bereitstellung einer gleichmäßigeren Aufprallkraft und unterstützt den Bediener bei der genauen Identifizierung des Zielbereichs für den Aufprall.
Es ist wichtig zu betonen, dass das Impaktverfahren bei Ratten ohne Anästhesieerhaltung durchgeführt wurde, so dass die Tiefe der Anästhesie vor Beginn des Aufpralls bestätigt wurde. Wir stellten sicher, dass die Ratten keine Reaktion zeigten, indem wir die Anästhesie-Induktionsbox vorsichtig schüttelten und die Anästhesiezeit um weitere 30 s verlängerten, um ein angemessenes Maß an Anästhesie zu gewährleisten. Es wird empfohlen, den gesamten Schlagvorgang innerhalb von 1 Minute abzuschließen.
Die in dieser Studie beschriebene Schlagvorrichtung ist relativ einfach zu konstruieren und kann in fast jedem Labor unter Verwendung der bereitgestellten Spezifikationen repliziert werden. Dies fördert eine stärkere Standardisierung und Vergleichbarkeit von experimentellen Daten über verschiedene Forschungsumgebungen hinweg. Darüber hinaus dienen die aus dieser Studie gewonnenen Validierungsdaten als wertvolle Ressource für Forschende bei der Beantwortung spezifischer wissenschaftlicher Fragestellungen. Durch die Analyse der in dieser Studie beobachteten neurologischen Verhaltensergebnisse können die Forscher fundierte Entscheidungen treffen und den experimentellen Ansatz an ihre spezifischen Forschungsziele anpassen. Dies verbessert die Gesamtqualität und Relevanz zukünftiger Studien zu mSHT und erleichtert Fortschritte in unserem Verständnis der zugrunde liegenden Mechanismen und der damit verbundenen Ergebnisse.
Diese Studie umfasste ausschließlich männliche Ratten für oder die Implementierung des Closed-Head-mTBI-Modells. Angesichts früherer Untersuchungen, die auf geschlechtsspezifische Variationen des angstähnlichen Verhaltens und anhaltende kognitive und somatische Symptome im Zusammenhang mit mTBIhindeuten 14,15, sollten zukünftige Studien an weiblichen Nagetieren durchgeführt werden.
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Disclosures
Die Autoren haben kein finanzielles Interesse an der Offenlegung.
Acknowledgments
Wir möchten uns bei allen Stipendiatinnen und Stipendiaten der Abteilung für Versuchstiere der Central South University bedanken. Diese Studie wurde von der National Natural Science Foundation of China (Nr. 81971791) unterstützt; Shanghai Key Lab of Forensic Medicine, Key Lab of Forensic Science, Ministry of Justice, China (Academy of Forensic Science) (No. KF202104).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acrylic box | In-house | N/A | 15 cm x 22 cm x 43 cm |
| Anesthesia Machine | RWD Life Science Co. | R540 Mice & Rat Animal Anesthesia Machine | |
| Helmet | In-house | N/A | Stainless-steel disk measuring 10 mm in diameter and 3 mm in thickness |
| Morris water maze | RWD Life Science Co. | Diameter 150 cm, height 50 cm,platform diameter 35 cm | |
| Open field | RWD Life Science Co. | 63007 | Width100 cm, height 40 cm |
| Panlab SMART V3.0 | RWD Life Science Co. | SMART v3.0 | |
| Perforated weight | In-house | N/A | Weight of 550 g and diameter of 18 mm |
| Pillow | In-house | N/A | Wedge-shaped sponge to place beneath the rat's head |
References
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