Summary
במאמר זה אנו מציגים מודל של פגיעה מוחית טראומטית קלה (mTBI) בראש סגור, ואת התיקוף שלו המציג דמיון יוצא דופן ל-mTBI האנושי בנוגע לביטויים התנהגותיים במהלך השלבים החריפים והתת-חריפים.
Abstract
מודלים של בעלי חיים חיוניים לקידום ההבנה שלנו של פגיעה מוחית טראומטית קלה (mTBI) ולהנחיית מחקרים קליניים. כדי להגיע לתובנות משמעותיות, פיתוח מודל יציב וניתן לשחזור של בעלי חיים הוא חיוני. במחקר זה אנו מדווחים על תיאור מפורט של מודל mTBI עם ראש סגור ועל שיטת אימות מייצגת באמצעות חולדות Sprague-Dawley כדי לאמת את אפקט המידול. המודל כולל הטלת משקל מסה של 550 גרם מגובה של 100 ס"מ ישירות על ראשה של חולדה על משטח הניתן להריסה, ואחריו סיבוב של 180 מעלות. כדי להעריך את הפגיעה, חולדות עברו סדרה של הערכות נוירו-התנהגותיות 10 דקות לאחר הפציעה, כולל זמן איבוד הכרה, זמן חיפוש התנהגות ראשון, יכולת בריחה ומבחן יכולת שיווי משקל קרן. בשלבים החריפים והתת-חריפים שלאחר הפציעה נערכו מבחנים התנהגותיים להערכת יכולת קואורדינציה מוטורית (משימת קרן), חרדה (מבחן שדה פתוח) ויכולות למידה וזיכרון (מבחן מוריס מבוך מים). מודל mTBI עם ראש סגור יצר תגובת פציעה עקבית עם תמותה מינימלית ושוכפל מצבים בחיים האמיתיים. שיטת התיקוף אימתה ביעילות את התפתחות המודל והבטיחה את יציבות ועקביות המודל.
Introduction
פגיעה מוחית טראומטית קלה (mTBI), או זעזוע מוח, היא סוג הפגיעה השכיח ביותר ויכולה להוביל לתסמינים שונים לטווח קצר וכרוניים1. תסמינים אלה עשויים לכלול סחרחורת, כאבי ראש, דיכאון ואנהדוניה, בין היתר, מה שמוביל לסבל משמעותי עבור אנשים הסובלים מ-mTBI2. מאחר שרוב ה-mTBIs נגרמים על-ידי טראומת כוח קהה3, הכרחי לפתח מודלים של בעלי חיים שמחקים במדויק פציעות כאלה. מודלים אלה חיוניים להשגת הבנה טובה יותר של הפציעה והמנגנונים העומדים בבסיסה, ומציעים סביבה מבוקרת עם שונות והטרוגניות מופחתות בהשוואה למחקרים בבני אדם.
מודלים מבוססים רבים של מכרסמים פותחו עבור פגיעה מוחית טראומטית (TBI), כולל פגיעה בכלי הקשה בנוזלים (FPI)4, פגיעה מבוקרת בקליפת המוח (CCI)5, פגיעה בירידה במשקל6, פגיעה מוחית טראומטית בפיצוץ7 ועוד. עם זאת, מודלים אלה מתמקדים בעיקר בשכפול תרחישי TBI בינוניים עד חמורים. לעומת זאת, המודלים הניסיוניים שתוכננו במיוחד כדי לדמות mTBI קיבלו פחות תשומת לב באופן יחסי ועדיין לא נחקרומספיק 8. לכן, יש צורך קריטי לבסס מודל יציב וניתן לשחזור של בעלי חיים שמייצג במדויק mTBI. מודל כזה ישפר באופן משמעותי את הבנתנו את ההשלכות הנוירוביולוגיות וההתנהגותיות הקשורות ל-mTBI.
לא ניתן להבחין בין הליקויים התפקודיים בחולדות mTBI בהשוואה לחולדות רגילות באמצעות תצפית מזדמנת לאחר שהשפעות ההרדמה פגו. לכן, יש צורך לנהל בדיקות ספציפיות. בבני אדם, מגוון רחב של הערכות קליניות משמשות להערכת חולים 9,10,11. באופן דומה, גם ביסוס מודל מוצלח במודל החולדות מחייב שימוש בכלי הערכה מהירים כדי לקבוע את תקפותו.
במחקר זה אנו מציגים מודל של חולדות mTBI בעלות ראש סגור, המאפשר לחקור mTBI באופן דומה מאוד למצב האנושי. התיאור המפורט של המודל ותהליך התיקוף שלו מספק הבנה מקיפה של הגישה הניסויית המשמשת בחקר mTBI.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ניסויים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת מרכז דרום. כל המחקרים נערכו בהתאם לעקרונות הרווחה והאתיקה של חיות המעבדה.
1. הליך האכלה והרדמה של בעלי חיים
- הקבוצה מאכלסת 280-320 גרם חולדות זכרים של Sprague-Dawley ומתחזקת אותן במחזור אור/חושך של 12 שעות/12 שעות עם גישה למזון ומים עד לליביטום. בצעו את המחקר לאחר שהחולדות התאקלמו במשך 6 ימים.
- הרדימו את החולדה עם איזופלורן 3% בזרימת אוויר של 0.6 ליטר/דקה בקופסת אינדוקציה עד שהיא אינה מגיבה לצביטת כף או זנב. לשמור על קצב זרימה במשך 30 שניות.
הערה: לא נעשה שימוש במשככי כאבים מכיוון שהם יפריעו לתגובת החולדה בהערכות הנוירו-התנהגותיות.
2. התקנה טרום ניתוחית
- מקמו ספוג בעל ערך קשיות של 35D (משקל של 35 ק"ג/מ"ק ספוג), באורך ורוחב זהים אך בעובי של 12 ס"מ, בתוך קופסה אקרילית (15 ס"מ x 22 ס"מ x 43 ס"מ) ללא כיסוי עליון.
- חותכים רדיד אלומיניום (בעובי של 20 מיקרומטר) ומדביקים אותו על קופסת האקריליק באמצעות סרט הדבקה ליצירת משטח הרסני המסוגל לתמוך במשקל של חולדה. בנוסף, סמנו קו חיתוך בגודל של כ-10 ס"מ כמיקום המיועד למיקום ראש החולדה.
- בעזרת מעמד ברזל, הדקו היטב את צינור ה-PVC למקומו. מכינים משקל מחורר, במשקל 550 גרם בקוטר 18 מ"מ. חבר את המשקולת לקו דיג בגובה של מטר אחד בתוך צינור פוליוויניל כלוריד או PVC. ולהתאים את מיקום צינור ההנחיה 3 ס"מ מעל רדיד הפח.
- הכינו קסדה וכרית. הכינו קסדה באמצעות דיסק נירוסטה בקוטר 10 מ"מ ובעובי 3 מ"מ. הכינו כרית ספוג בצורת טריז שתניח מתחת לראשה של החולדה, ותבטיחו שהיא מאונכת לכיוון הכבידה.
הערה: תרשים סכמטי של מנגנון ההשפעה מוצג באיור 1. מטרת הקסדה היא לזהות את מיקום הפגיעה ולהגביר את פיזור הכוח החיצוני. הכרית מנוצלת להבטחת נזק אחיד ויציב.
3. השראת mTBI
- הניחו במהירות את החולדה המורדמת על חזה על נייר הכסף.
הערה: שני מפעילים נדרשים להשראת mTBI – אחד להכנה והשני לאימות. - אופן ההכנה: הניחו את הכרית מתחת לחולדה, וודאו שראשה מקביל לנייר הכסף. יישרו את הקסדה עם אוזני החולדה ואבטחו אותה במקומה.
- אימות: ודא שצינור ה-PVC ממוקם ישירות מעל הקסדה. לאחר ששני המפעילים מאשרים את ההגדרה הנכונה, המשך לשלב הבא.
- השראת סיבוב ראש: שחררו את המשקולת, אפשרו לה ליפול ולפגוע בראשה של החולדה, מה שגרם לנפילה על הספוג ולסיבוב של 180 מעלות.
- הניחו את החולדה על גבה בכלוב נקי.
4. אינדוקציה מזויפת
- התייחסו לחולדה באותו אופן כמו בתיאור הקודם של השראת mTBI, אך אל תחשפו אותה לפגיעת ראש.
5. הליך תיקוף: הערכות נוירו-התנהגותיות חריפות
הערה: ההערכות הבאות שונו בהתבסס על ציוני החומרה הנוירולוגית9 והפרוטוקול של Flierl et al.10. כל ההערכות הללו בוצעו 10 דקות לאחר שהחולדה התאוששה מרפלקס הימין.
- זמן איבוד ההכרה: רשמו את משך הזמן מהרגע שבו החולדה מורדמת ועד שהיא משחזרת את רפלקס הימין.
הערה: רפלקס הימין הוא התהליך שבו החולדה מתהפכת כשהיא מונחת על גבה. אובדן רפלקס התיקון ייחשב כנקודת קצה הומנית, ויש להרדים את בעל החיים בהתאם להנחיות המוסדיות. - זמן חיפוש התנהגות ראשון: רשמו את משך הזמן מהרגע שבו החולדה מורדמת ועד שהיא מראה את התנהגות החיפוש בפעם הראשונה.
הערה: חיפוש התנהגות הוא סימן להתעניינות בסביבה, תגובה פיזיולוגית. - יכולת בריחה
- הניחו את החולדה באמצע מנגנון עגול (0.5 מ' קוטר ו-0.3 מ' גובה) עם יציאה (12.5 ס"מ אורך ו-9 ס"מ רוחב).
- רשמו את הזמן שלוקח לחולדה לצאת מהעיגול.
הערה: אם החולדה לא יוצאת מהעיגול בתוך 180 שניות, רשום את הזמן כ- 180 שניות.
- בדיקת יכולת איזון קרן
- הניחו את החולדה על קורה ברוחב 3 ס"מ, 2 ס"מ ו-1.5 ס"מ למשך דקה אחת בהתאם.
- אם החולדה שומרת על שיווי משקל עם יציבה יציבה על הקורה, ציון זה 0.
- אם החולדה תופסת את צד הקורה, תנו ציון 1. אם החולדה מחבקת את הקרן ואיבר אחד נופל ממנה, ציון 2.
- אם החולדה מחבקת את הקרן ושתי הגפיים נופלות ממנה או מסתובבות עליה (>60 שניות), הניחו לה ציון 3.
- אם החולדה מנסה לאזן את הקרן אך נופלת (> 40 שניות), הניקוד הוא 4.
- אם החולדה מנסה לאזן את הקרן אך נופלת (>20 שניות), הניחו לה ציון 5.
- אם החולדה לא מנסה לאזן או להיתלות על הקרן ונופלת תוך 20 שניות, הניקוד הוא 6.
הערה: מבחן איזון הקרן אינו דורש קדם-משפט.
6. הליך תיקוף: הערכת נוירו-התנהגות
הערה: לפני הניסויים ההתנהגותיים, החולדות טופלו במשך 2 דקות ביום במשך 3 ימים רצופים כדי למזער מתח ושיבוש חידושים. כל הניסויים ההתנהגותיים בוצעו על ידי הצבת בעלי החיים בסביבת הניסוי למשך 60 דקות לפני תחילת הניסוי.
- יכולת קואורדינציה מוטורית (משימת קרן)
- מערך ניסיוני
- הניחו את החולדות בקצה אחד של קרן שיווי המשקל (1.5 מ' אורך ו-75 ס"מ מעל הרצפה). הניחו ארגז מילוט (כלוב ביתי משופע) בצד השני.
- מקמו ריפוד קצף מתחת לקורה כדי להפחית את הסיכון הפוטנציאלי לפגיעה בחולדות במקרה של נפילה במהלך הבדיקה.
- הפעל את מצלמת הווידאו.
- קבעו ימי בדיקה בנקודות זמן ספציפיות לאחר הפציעה או לאחר טיפול דמה (למשל, יום 1, יום 3 ויום 7).
- שלב האימון (יומיים)
- אמן את החולדות לחצות את הקרן ברוחב 4 ס"מ 3 פעמים ברציפות, ולאחר מכן שני ניסויים על הקרן ברוחב 2 ס"מ.
- במהלך האימון, הדריכו בעדינות את החולדות על פני הקרן עד שהן יכולות לחצות אותן בקלות ללא הפרעה.
- ניסוי קרן איזון
- הניחו את החולדות על קורה ברוחב 2 ס"מ במשך 5 ניסויים רצופים.
- תעד את ההתחלה והסיום של כל ניסוי כאשר אפה של החולדה חוצה את קווי ההתחלה והסיום, בהתאמה.
- החזירו את החולדות לכלובים בתום הניסוי.
- בדיקות בסיסיות
- בצע את ניסוי קרן האיזון לפני הפציעה או הטיפול.
- חשב את הערכים הממוצעים של 5 ניסויים רצופים אלה כדי לקבוע את קו הבסיס עבור כל חולדה.
- ניתוח נתונים
- נתח את זמן חציית הקרן ואת המספר הכולל של החלקות רגליים אחוריות באמצעות ניתוח וידאו על ידי חוקרים עיוורים לתנאי הניסוי.
- מערך ניסיוני
- חרדה (מבחן שדה פתוח)
- מערך ניסיוני
- הכינו את זירת השדה הפתוח, וודאו שהיא נקייה ונטולת רמזי ריח קודמים. חלקו את הזירה לשלושה אזורים: אזור פנימי מרכזי (33X33 ס"מ), אזור אמצעי (66X66 ס"מ) ואזור חיצוני.
- שלב הבדיקה
- הניחו חולדה במרכז זירת השדה הפתוח והפעילו את שעון העצר. אפשרו לחולדה לחקור את הזירה במשך 5 דקות בחופשיות. לאחר 5 דקות, החזירו בזהירות ובעדינות את החולדה לכלוב הביתי שלה.
- איסוף נתונים
- מדדו את המרחק הכולל שעברה החולדה במהלך 5 דקות החיפוש. קבעו את הזמן שהחולדה מבלה באזור הפנימי, האמצעי והחיצוני המרכזי.
- ניתוח נתונים
- השתמש במרחק הכולל שעבר כמדד להתנהגות גישושית כוללת ויכולת מוטורית. חשב את הזמן המושקע באזור הפנימי המרכזי כאינדיקטור לתגובות דמויות חרדה.
- מערך ניסיוני
- יכולות למידה וזיכרון (מבחן מבוך מים מוריס)
- ודא שמנגנון מבוך המים במצב תקין. צבעו את המים בשחור והניחו רמזים בארבעת הכיוונים הקרדינליים. מקמו את הפלטפורמה 2.5 ס"מ מתחת לפני המים.
- הגדירו מערכת ניטור כדי לתעד ולצפות בהתנהגות החולדות.
- יום שביל
- הכניסו במהירות את החולדה למבוך המים. אם החולדה לא מצליחה להגיע לרציף תוך 2 דקות, הנחו אותה בעדינות באמצעות מקל העץ.
- אפשרו לחולדה להכיר את סביבת המבוך בעודה עומדת על הרציף במשך 20 שניות, ואז הסירו אותה. ברגע שהחולדה נמצאת על הרציף, תנו לה להישאר 20 שניות, ואז הסירו אותה.
- חזרה יומית
- חזור על הליך יום האימון, והצבת החולדה במים מרבעים שונים. חזור על שלב 6.3.3. המשך את האימונים במשך 5 ימים רצופים.
- יום מבחן בדיקה: ביוםהשישי , הסירו את הפלטפורמה והניחו את החולדה באותו רביע למשך 2 דקות.
- תצפית והקלטה: השתמשו במערכת הניטור כדי לעקוב אחר התנהגות החולדה בימי ניסוי ובדיקה.
- ניקוי: לאחר הוצאת החולדה ממבוך המים, השתמשו במגבת כדי לייבש אותה היטב.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
המנגנון ששימש בעבודה זו היה גרסה שונה של מודל קיין ומודל הילדים11,12 של ריצ'ל מיצ'סיוק. במחקר זה, חולדות SD חולקו לקבוצות דמה ו-mTBI. כדי להדגים את יכולת השחזור של המודל הזה, ערכנו שלושה שכפולים עצמאיים של המודל הזה יחד עם הערכה נוירו-התנהגותית חריפה, כאשר כל ניסוי כלל 8-12 חולדות. במחקר הזה השתמשנו ביותר מ-30 חולדות mTBI עם 2 חולדות שחוו תמותה כתוצאה מהרדמה. עם זאת, אף חולדה לא נכנעה לפגיעה מוחית במהלך הניסוי. תוצאות הניסויים האלה מוצגות באיור 2. נוסף על כך, הערכות נוירו-התנהגותיות בוצעו בשלבים החריפים והתת-חריפים (איור 3, איור 4 ואיור 5).
תוצאות הערכה נוירו-התנהגותית חריפה
כל ההערכות הללו בוצעו לאחר הרדמה/פגיעה 0 דקות (זמן איבוד הכרה וזמן חיפוש התנהגות ראשון) או 10 דקות (יציאה מעגלית ואיזון קרן), בהתאמה.
כפי שניתן לראות באיור 2A, חולדות mTBI בילו זמן רב יותר באופן משמעותי בהתאוששות מחוסר הכרה, וזה תואם את התוצאות שהתקבלו במחקרים קודמים12,13. התנהגות החיפוש בחולדות שנחשבת לפעילות פיזיולוגית נורמלית, הראתה עלייה מובהקת סטטיסטית בתקופת ההחלמה בקבוצת mTBI (איור 2B). ממצא זה מצביע על כך שלחולדות mTBI נדרשו משך זמן ארוך יותר כדי להחזיר לעצמן את יכולות התנועה, חוש הריח, חיטוט המישוש והסריקה הסביבתית שלהן.
המבחן הקיים במעגל החליף את המבחנים החושיים המקוריים בציון החומרה הנוירולוגית, שהסתמכו בעבר על תצפיות סובייקטיביות של הבוחנים כגון מבחני מיקום ובדיקות פרופריוצפטיביות. חולדות mTBI בילו זמן רב יותר באופן משמעותי ביציאה מהמעגל בהשוואה לחולדות דמה (איור 2C). הניתוח הסטטיסטי באמצעות ANOVA דו-כיווני עבור זמן יציאה ממעגל הראה השפעה עיקרית משמעותית של פציעה (F [1, 36] = 21.29, p < 0.0001), מה שמצביע על הבדל בין קבוצות mTBI וקבוצות דמה. עם זאת, לניסויים שונים לא הייתה השפעה משמעותית (F [2, 36] = 0.1396, p = 0.87).
תוצאות מבחן איזון הקרן נותחו באמצעות ANOVA דו-כיוונית, ואחריה השוואות מרובות של בונפרוני להבדלים בין אמצעים קבוצתיים (איור 2D). נמצאה השפעה כוללת משמעותית של פציעה בכל משימות הקרן הרחבה (3 ס"מ: F = 13.89, p < 0.001; 2 ס"מ: F = 42.7, p < 0.001; 1.5 ס"מ: F = 27.25, p < 0.001), דבר המצביע על כך שחולדות mTBI הפגינו פגיעה בשיווי משקל בהשוואה לחולדות הדמה לאחר 10 דקות לאחר הפגיעה. על פי שלושה ניסויים חוזרים ונשנים בלתי תלויים, קרן שיווי המשקל ברוחב 2 ס"מ ו-1.5 ס"מ הראתה הבחנה טובה יותר בין קבוצות ה-Sham וה-mTBI מאשר הקרן ברוחב 3 ס"מ.
תוצאות הערכה נוירו-התנהגותית
יכולת הקואורדינציה המוטורית הוערכה באמצעות מטלת הקרן ביום אחד לפני הרדמה/פציעה ויום, 3 ימים ו-7 ימים לאחר הרדמה/פציעה (איור 3). המספר הכולל של החלקות גפיים אחוריות (איור 3A) נותח על-ידי ANOVA דו-כיווני שנמדד שוב ושוב, וההשוואות המרובות של בונפרוני מצאו שחולדות mTBI הציגו הרבה יותר החלקות גפיים אחוריות ביום הראשון שלאחר הפציעה בהשוואה לחולדות דמה (איור 3A; p < 0.01). עם זאת, לאחר התאוששות של יומיים, לא נצפו שינויים בטעויות האחוריות, עם מספר כולל של החלקות שנפתרו חזרה לרמות דמה לאחר 7 ימים. יש לציין כי לכל 6 חולדות mTBI היו יותר החלקות גפיים אחוריות לאחר הפגיעה מאשר הביצועים הבסיסיים שלהן. החלקות הגפיים האחוריות המוגברות מעט בחולדות דמה עשויות להיות קשורות לחוסר קרן שיווי משקל בפועל. יום ושלושה ימים לאחר הפציעה, חולדות mTBI בילו זמן רב יותר בחציית קרן של 150 ס"מ (39.8 שניות ± 3.79 שניות לעומת 28.68 שניות ± 0.82 שניות, 37.06 שניות ± 4.06 שניות לעומת 29.28 שניות ±-3.42 שניות), אף על פי שלא היו הבדלים בין חולדות mTBI לחולדות דמה בזמן שלקח להן לחצות את הקרן בכל נקודות הזמן (איור 3B).
לא היו הבדלים משמעותיים במרחק שעבר בין קבוצות דמה ו-mTBI (איור 4A). התנהגות דמוית חרדה הוערכה על ידי מדידת הזמן שבילה באזור המרכז במהלך מבחן השדה הפתוח. גם ב-3 ימים וגם ב-7 ימים לאחר הפציעה, חולדות mTBI הראו ירידה משמעותית בזמן השהייה באזור המרכז בהשוואה לחולדות דמה. הממצא הזה מצביע על כך שחולדות mTBI הציגו רמות גבוהות יותר של התנהגות דמוית חרדה בעקבות ההשפעה בתוך 7 ימים (איור 4B,C).
תוצאות ימי הלמידה של מבוך המים מוריס גילו שלחולדות mTBI נדרש זמן רב יותר כדי לאתר את המצע הנסתר מאשר לחולדות דמה, מה שמצביע על למידה מרחבית וזיכרון לקויים בקבוצת mTBI (איור 5). לאחר מכן, במהלך ניסוי הגשושית, חולדות mTBI הפגינו ליקויים בשמירה על זיכרון מרחבי, כפי שניתן לראות בכך שבילו פחות זמן בחיפוש אחר הפלטפורמה שהוסרה. יש לציין כי לא נצפה הבדל משמעותי במהירות השחייה בין קבוצות ה-Sham וה-mTBI, מה שתומך בממצאים העקביים שנצפו בניתוח המרחק שעבר במבחן השדה הפתוח. תוצאות אלה מצביעות על כך שלהשפעה לא הייתה השפעה ניכרת על תפקוד הלוקומוטורי הספונטני.
איור 1: מנגנון פגיעה ב-mTBI בחולדות. (A) מבט מלמעלה ומבט צדדי על הכרית והקסדה במיקום היחסי של ראש החולדה. הקו המקווקו האדום מראה את מיקום הקסדה. (B) תמונה של כל המכלול המציגה צינור מנחה אנכי למשקל שנפל הממוקם מעל שלב החולדה ואוסף ספוג. (C) תמונת סטילס שצולמה מסרטון פגיעה המתאר את סיבוב החולדה ב-180° לאחר פגיעת הראש והתאוצה/סיבוב שלאחר מכן. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: תוצאות אקוטיות של הערכה נוירו-התנהגותית בעקבות חולדות דמה, mTBI שחזרו על עצמן שלוש פעמים באופן בלתי תלוי. (A) זמן מוגבר משמעותית של אובדן הכרה לאחר הפסקת ההרדמה בחולדות שקיבלו mTBI לעומת חולדות דמה. הייתה השפעה קבוצתית משמעותית (P < 0.0001, ANOVA דו-כיוונית) אך לא הייתה השפעה משמעותית של זמן (P = 0.6226) או אינטראקציה של קבוצה x זמן (P = 0.5803). (B) חולדות mTBI הראו את ההתנהגות הראשונה שלהן לאחר הרדמה. (C) חולדות דאם בילו פחות זמן בבריחה מהעיגול של 60 ס"מ (*p < 0.01, **p < 0.001, מבחן t לא מזווג). (D) ציון איזון הקרן בביצועים של 3 ס"מ, 2 ס"מ ו-1.5 ס"מ רוחב. תוצאות ההשוואות המרובות של בונפרוני לכל קבוצה מוצגות באיורים. נתונים המוצגים כממוצע ± שגיאת תקן של הממוצע. N = 8-12 חולדות שימשו בכל ניסוי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: ביצועי מטלת הקרן לפני הפגיעה ואחריה ביום 1, ביום 3 וביום 7. (A) חולדות mTBI החליקו יותר בגפיים האחוריות ביום 1 שלאחר הפציעה (*p < 0.001, שנמדד שוב ושוב ANOVA דו-כיווני). (B) זמן המעבר הממוצע של חולדות דמה קטן מזה של חולדות mTBI. הנתונים המוצגים כממוצע ± שגיאת תקן של הממוצע (N = 6/group). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: ביצועי מבחן השדה הפתוח ביום 1 שלפני הפציעה וביום 1 שלאחר הפציעה, ביום 3, ביום 7 וביום ה-14. (A) לא היה הבדל בין חולדות דמה וחולדות mTBI במרחק שעברו. (B) חולדות mTBI בילו פחות זמן במרכז מאשר חולדות דמה ביום 3 וביום 7 (*p < 0.01, **p < 0.001, שנמדד שוב ושוב ANOVA דו-כיווני), ללא הבדלים נראים לעין ביום 1 שלפני הפציעה וביום 1 וביום 14 שלאחר הפציעה. (C) עקוב אחר מפה של חולדות mTBI ביום 1, ביום 3, ביום 7 וביום ה-14 שלאחר ה-mTBI. הנתונים המוצגים כממוצע ± שגיאת תקן של הממוצע (N = 6-10/group). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: הביצועים במבוך המים מוריס. (A) לא היה הבדל במהירות במבחן יכולת השחייה בין חולדות דמה וחולדות mTBI. (B) השהיה לפלטפורמה הנסתרת של משימת זיכרון הייחוס ביום הניסיון. (C) החולדות חצו את הרציף יותר פעמים בניסוי בדיקה בן 2 דקות לאחר 5 ימי ניסיון. Sham (5.14 ± 0.65) לעומת mTBI (3.56 ± 0.6), (*p < 0.01, מבחן t לא מזווג). נתונים המוצגים כממוצע ± שגיאת תקן של הממוצע (N = 9/group). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מודל זה מדמה בהצלחה mTBI עם ראש סגור ללא צורך בחתך בקרקפת או בפתיחת גולגולת, ומספק ייצוג מדויק יותר של תרחיש הפגיעה שנצפה במקרים אנושיים. הימנעות מחתך בקרקפת מסייעת למנוע תגובות דלקתיות שעלולות שלא להתאים למצב בפועל. בהשוואה למודל12 לילדים של ריצ'ל מיצ'סיוק, המודל ששימש במחקר זה מותאם במיוחד לחולדות בוגרות השוקלות בין 280 ל-320 גרם, מה שמאפשר לנו לקבל תובנות חשובות לגבי ההשפעות של mTBI על אנשים בוגרים. בנוסף, שילוב רכיבי מפתח כגון כרית וקסדה מאפשר העברת כוח פגיעה אחיד יותר ומסייע למפעיל לזהות במדויק את אזור היעד לפגיעה.
חשוב להדגיש כי הליך הפגיעה בחולדות בוצע ללא תחזוקת הרדמה, ולכן עומק ההרדמה אושר לפני תחילת הפגיעה. וידאנו שלחולדות לא תהיה תגובה על ידי ניעור עדין של קופסת השראת ההרדמה והארכת זמן ההרדמה ב-30 שניות נוספות כדי להבטיח רמת הרדמה נאותה. מומלץ להשלים את כל תהליך ההשפעה תוך דקה.
מנגנון ההשפעה המתואר במחקר זה קל יחסית לבנייה וניתן לשכפל אותו כמעט בכל מעבדה באמצעות המפרטים שסופקו. זה מקדם סטנדרטיזציה גדולה יותר ויכולת השוואה של נתונים ניסיוניים על פני הגדרות מחקר שונות. יתר על כן, נתוני התיקוף המתקבלים ממחקר זה משמשים משאב רב ערך לחוקרים בהתמודדות עם שאלות מדעיות ספציפיות. על ידי ניתוח התוצאות הנוירו-התנהגותיות שנצפו במחקר זה, החוקרים יכולים לקבל החלטות מושכלות ולהתאים את הגישה הניסויית כך שתתאים למטרות המחקר הספציפיות שלהם. זה משפר את האיכות והרלוונטיות הכוללת של מחקרים עתידיים על mTBI ומאפשר התקדמות בהבנה שלנו של המנגנונים הבסיסיים שלה והתוצאות הקשורות אליה.
מחקר זה כלל באופן בלעדי חולדות זכרים עבור מודל mTBI עם ראש סגור או יישום שלו. בהתחשב במחקרים קודמים שהצביעו על שינויים ספציפיים למין בהתנהגות דמוית חרדה ותסמינים קוגניטיביים וסומטיים מתמשכים הקשורים ל-mTBI14,15, יש לבצע מחקרים עתידיים על נקבות מכרסמים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין אינטרס כלכלי לחשוף.
Acknowledgments
אנו רוצים להודות לכל עמיתי המחלקה לחיות מעבדה באוניברסיטת מרכז דרום. מחקר זה נתמך על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מס '81971791); מעבדת המפתח של שנגחאי לרפואה משפטית, מעבדת מפתח למדע פורנזי, משרד המשפטים, סין (האקדמיה למדע פורנזי) (לא. KF202104).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acrylic box | In-house | N/A | 15 cm x 22 cm x 43 cm |
| Anesthesia Machine | RWD Life Science Co. | R540 Mice & Rat Animal Anesthesia Machine | |
| Helmet | In-house | N/A | Stainless-steel disk measuring 10 mm in diameter and 3 mm in thickness |
| Morris water maze | RWD Life Science Co. | Diameter 150 cm, height 50 cm,platform diameter 35 cm | |
| Open field | RWD Life Science Co. | 63007 | Width100 cm, height 40 cm |
| Panlab SMART V3.0 | RWD Life Science Co. | SMART v3.0 | |
| Perforated weight | In-house | N/A | Weight of 550 g and diameter of 18 mm |
| Pillow | In-house | N/A | Wedge-shaped sponge to place beneath the rat's head |
References
- Silverberg, N. D., Duhaime, A. C., Iaccarino, M. A.
- Kim, K., Priefer, R.
- Peeters, W., et al.
- Kabadi, S. V., Hilton, G. D., Stoica, B. A., Zapple, D. N., Faden, A. I. Fluid-percussion-induced traumatic brain injury model in rats. Nature Protocols. 5 (9), 1552-1563 (2010).
- Smith, D. H., et al. A model of parasagittal controlled cortical impact in the mouse: cognitive and histopathologic effects. Journal of Neurotrauma. 12 (2), 169-178 (1995).
- Feeney, D. M., Boyeson, M. G., Linn, R. T., Murray, H. M., Dail, W. G. Responses to cortical injury: I. Methodology and local effects of contusions in the rat. Brain Research. 211 (1), 67-77 (1981).
- Cernak, I., et al. The pathobiology of blast injuries and blast-induced neurotrauma as identified using a new experimental model of injury in mice. Neurobiology of Disease. 41 (2), 538-551 (2011).
- Shultz, S. R., et al. The potential for animal models to provide insight into mild traumatic brain injury: Translational challenges and strategies. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 76 (Pt B), 396-414 (2017).
- Chen, J., et al. Therapeutic benefit of intravenous administration of bone marrow stromal cells after cerebral ischemia in rats. Stroke. 32 (4), 1005-1011 (2001).
- Flierl, M. A., et al. Mouse closed head injury model induced by a weight-drop device. Nature Protocols. 4 (9), 1328-1337 (2009).
- Kane, M. J., et al. A mouse model of human repetitive mild traumatic brain injury. J Neuroscience Methods. 203 (1), 41-49 (2012).
- Mychasiuk, R., Farran, A., Esser, M. J. Assessment of an experimental rodent model of pediatric mild traumatic brain injury. Journal of Neurotrauma. 31 (8), 749-757 (2014).
- Pham, L., et al. Mild closed-head injury in conscious rats causes transient neurobehavioral and glial disturbances: A novel experimental model of concussion. Journal of Neurotrauma. 36 (14), 2260-2271 (2019).
- Jacotte-Simancas, A., Molina, P., Gilpin, N. W. Repeated mild traumatic brain injury and JZL184 produce sex-specific increases in anxiety-like behavior and alcohol consumption in Wistar rats. Journal of Neurotrauma. , (2023).
- Levin, H. S., et al. Association of sex and age with mild traumatic brain injury-related symptoms: A TRACK-TBI study. JAMA Network Open. 4 (4), e213046 (2021).
