Summary
在这里，我们提出了一个闭合式轻度创伤性脑损伤 （mTBI） 大鼠模型及其验证，在急性和亚急性阶段的行为表现方面与人类 mTBI 表现出显着的相似性。
Abstract
动物模型对于促进我们对轻度创伤性脑损伤 （mTBI） 的理解和指导临床研究至关重要。为了获得有意义的见解，开发稳定且可重复的动物模型至关重要。在这项研究中，我们报告了闭头 mTBI 模型的详细描述以及使用 Sprague-Dawley 大鼠验证建模效果的代表性验证方法。该模型涉及将 550 克的质量砝码从 100 厘米的高度直接落到可破坏表面上的大鼠头部，然后进行 180 度转弯。为了评估损伤，大鼠在受伤后 10 分钟接受了一系列神经行为评估，包括意识丧失时间、首次寻找行为时间、逃生能力和光束平衡能力测试。在受伤后的急性和亚急性阶段，进行行为测试以评估运动协调能力（光束任务）、焦虑（开放场地测试）以及学习和记忆能力（莫里斯水迷宫测试）。闭头 mTBI 模型以最低的死亡率产生了一致的损伤反应，并复制了现实生活中的情况。验证方法有效地验证了模型的开发，保证了模型的稳定性和一致性。
Introduction
轻度创伤性脑损伤 （mTBI） 或脑震荡是最普遍的损伤类型，可导致各种短期和慢性症状1。这些症状可能包括头晕、头痛、抑郁和快感缺乏等，导致受 mTBI2 影响的个体遭受重大痛苦。由于大多数 mTBI 是由钝器外伤引起的 3，因此必须开发准确模拟此类损伤的动物模型。这些模型对于更好地了解损伤及其潜在机制至关重要，与人类研究相比，提供了一个可控的环境，减少了变异性和异质性。
已经开发了许多成熟的啮齿动物模型来治疗创伤性脑损伤 （TBI），包括液体叩击损伤 （FPI）4、受控皮质冲击 （CCI）5、体重下降损伤6、爆炸性创伤性脑损伤7 等。然而，这些模型主要侧重于复制中度至重度 TBI 情景。相比之下，专门设计用于模拟 mTBI 的实验模型受到的关注相对较少，并且仍未得到充分探索8。因此，迫切需要建立一个稳定且可重复的动物模型，以准确表示mTBI。这样的模型将显着增强我们对与 mTBI 相关的神经生物学和行为后果的理解。
在麻醉效果消失后，人们无法通过随意观察来区分mTBI大鼠与正常大鼠的功能缺陷。因此，有必要进行特定的测试。在人类中，广泛的临床评估用于评估患者 9,10,11。同样，在大鼠模型中建立一个成功的模型也需要使用快速评估工具来确定其有效性。
在这项研究中，我们提出了一个闭头mTBI大鼠模型，能够以与人类状况非常相似的方式研究mTBI。对模型及其验证程序的详细描述提供了对研究 mTBI 所用实验方法的全面理解。
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Protocol
动物实验由中南大学动物护理和使用委员会批准。所有研究均按照实验动物的福利和伦理原则进行。
1.动物喂养和麻醉程序
- 群居280-320克Sprague-Dawley雄性大鼠，并将它们维持在12小时/ 12小时的光/暗循环中， 并随意获得食物和水。在大鼠适应环境6天后进行研究。
- 在诱导箱中以0.6L / min的气流用3%异氟醚麻醉大鼠，直到它对爪子或尾巴捏没有反应。保持流速30秒。
注意：不使用止痛药，因为它们会干扰大鼠在神经行为评估中的反应。
2. 术前设置
- 将硬度值为 35D（海绵重量为 35 kg/m3）的海绵放置在没有顶盖的亚克力盒 （15 cm x 22 cm x 43 cm） 中，长度和宽度相同，但厚度为 12 cm。
- 修剪锡箔（厚度为20μm）并使用胶带将其固定在亚克力盒上，以形成能够支撑大鼠重量的可破坏表面。此外，标记一条大约 10 厘米的切割线作为定位大鼠头部的指定位置。
- 借助铁架，将 PVC 管牢固地固定到位。准备一个穿孔砝码，重 550 克，直径为 18 毫米。将重物连接到聚氯乙烯或 PVC 管内 1 米高的钓鱼线上。并将导管的位置调整到锡箔上方 3 厘米处。
- 准备头盔和枕头。使用直径为 10 毫米、厚度为 3 毫米的不锈钢圆盘制作头盔。准备一个楔形海绵枕头放在老鼠的头部下方，确保它垂直于重力方向。
注： 冲击装置的示意图如 图 1 所示。头盔的作用是识别撞击位置并增强外力的分布。枕头用于保证均匀稳定的损坏。
3. mTBI诱导
- 迅速将麻醉的大鼠放在锡箔纸上的胸部。
注意：mTBI 诱导需要两名操作员 - 一名用于准备，另一名用于验证。 - 准备：将枕头放在老鼠下面，确保其头部与铝箔纸平行。将头盔与老鼠的耳朵对齐并将其固定到位。
- 验证：验证 PVC 管是否位于头盔的正上方。两个操作员确认设置正确后，继续下一步。
- 诱导头部旋转：释放重物，让它下落并撞击大鼠的头部，导致跌落到海绵上并旋转 180°。
- 将老鼠放在干净的笼子里。
4. 假诱导
- 以与先前mTBI诱导描述相同的方式对待大鼠，但不要使其受到头部撞击。
5. 验证程序：急性神经行为评估
注意：以下评估是根据 Flierl 等人 10 的神经严重程度评分9 和协议修改的。所有这些评估都是在大鼠恢复矫正反射后 10 分钟进行的。
- 意识丧失时间：记录从大鼠被麻醉到恢复矫正反射的持续时间。
注意：矫正反射是大鼠仰卧时翻身的过程。矫正反射的丧失应被视为人道的终点，并且必须按照机构指南对动物实施安乐死。 - 第一次寻找行为时间：记录从大鼠被麻醉到第一次出现寻找行为的持续时间。
注意：寻求行为是对环境感兴趣的标志，是一种生理反应。 - 逃生能力
- 将大鼠放在带有出口（长12.5厘米，宽9厘米）的圆形装置（直径0.5米，高0.3米）的中间。
- 记录老鼠离开圆圈所需的时间。
注意：如果大鼠在180秒内没有离开圆圈，则将时间记录为180秒。
- 光束平衡能力测试
- 将大鼠放在3cm，2cm和1.5cm宽的光束上1分钟。
- 如果大鼠在横梁上保持平衡，保持稳定姿势，则将其打为 0。
- 如果老鼠抓住横梁的一侧，则给 1 分。如果老鼠抱住横梁，一只肢体从横梁上掉下来，则将其打成 2。
- 如果老鼠拥抱横梁，两肢从横梁上掉下来或在上面旋转（>60 秒），则将其打成 3。
- 如果大鼠试图在横梁上保持平衡但掉下来（> 40 秒），则将其打成 4。
- 如果大鼠试图在横梁上保持平衡但掉下来（>20 秒），则将其打成 5。
- 如果老鼠没有试图平衡或挂在横梁上并在 20 秒内掉下来，则将其打为 6。
注意：光束平衡测试不需要预试验。
6. 验证程序：神经行为评估
注意：在行为实验之前，连续3天每天处理大鼠2分钟，以尽量减少压力和新奇性干扰。所有行为实验都是通过在实验开始前将动物置于测试环境中 60 分钟来进行的。
- 运动协调能力（光束任务）
- 实验装置
- 将大鼠放在平衡木的一端（长1.5 m，离地面75厘米）。在另一端放置一个逃生箱（倾斜的床上用品家庭笼子）。
- 在横梁下方放置泡沫衬垫，以减轻在测试过程中跌倒时对大鼠造成伤害的潜在风险。
- 打开摄像机。
- 将检测日安排在受伤后或假治疗后的特定时间点（例如，第 1 天、第 3 天和第 7 天）。
- 培训阶段（2天）
- 训练大鼠连续 3 次穿过 4 厘米宽的光束，然后在 2 厘米宽的光束上进行两次试验。
- 在训练过程中，轻轻地引导老鼠穿过光束，直到它们可以不受干扰地轻松穿过光束。
- 平衡木实验
- 将大鼠放在2厘米宽的光束上连续5次试验。
- 当大鼠的鼻子分别越过起点和终点线时，记录每次试验的开始和结束。
- 在实验结束时将大鼠放回笼子。
- 基线测试
- 在受伤或治疗前进行平衡木实验。
- 计算这 5 次连续试验的平均值，以建立每只大鼠的基线。
- 数据分析
- 使用对实验条件不知情的研究人员的视频分析，分析穿过横梁的时间和后足滑倒的总数。
- 实验装置
- 焦虑（开放场测试）
- 实验装置
- 准备空旷的场地，确保它干净，没有任何以前的气味提示。将竞技场分为三个区域：中央内区（33 cm x 33 cm）、中间区（66 cm x 66 cm）和外区。
- 测试阶段
- 将一只老鼠放在空旷场地的中央并启动计时器。让老鼠自由探索竞技场 5 分钟。5分钟后，小心轻轻地将老鼠放回笼子里。
- 数据采集
- 测量大鼠在 5 分钟的探索期间行进的总距离。确定大鼠在中央内区、中区和外区停留的时间。
- 数据分析
- 使用行进的总距离作为整体探索行为和运动能力的衡量标准。计算在中央内区花费的时间，作为焦虑样反应的指标。
- 实验装置
- 学习和记忆能力（莫里斯水迷宫测试）
- 确保水迷宫设备处于正常状态。将水染成黑色，并在四个基本方向上放置提示。将平台放置在水面以下 2.5 厘米处。
- 设置监控系统来记录和观察老鼠的行为。
- 步道日
- 迅速将老鼠放入水迷宫中。如果老鼠未能在2分钟内到达平台，请用木棍轻轻引导它。
- 让老鼠在平台上站立 20 秒时熟悉迷宫环境，然后将其移除。一旦老鼠在平台上，让它停留 20 秒，然后将其移除。
- 每日重复
- 重复训练日程序，将大鼠放入不同象限的水中。重复步骤 6.3.3。连续 5 天继续训练。
- 探针测试日：在第 6天，取下平台并将大鼠置于同一象限2分钟。
- 观察和记录：利用监测系统监测大鼠在试验和探测测试日的行为。
- 清洁：将老鼠从水迷宫中取出后，用毛巾彻底擦干。
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Representative Results
这项工作中使用的设备是 Kane 模型和 Richelle Mychasiuk 的儿科模型11,12 的改进版本。在这项研究中，SD大鼠被分配到假手术组和mTBI组。为了证明该模型的可重复性，我们对该模型进行了三次独立重复以及急性神经行为评估，每个实验涉及 8-12 只大鼠。在这项研究中，我们使用了 30 多只 mTBI 大鼠，其中 2 只大鼠因麻醉而死亡。然而，在实验过程中没有大鼠死于脑损伤。这些实验的结果如图2所示。此外，在急性和亚急性期进行了神经行为评估（图3、图4和图5）。
急性神经行为评估结果
所有这些评估分别在麻醉/撞击 0 分钟（意识丧失时间和首次寻找行为时间）或 10 分钟（圆圈退出和光束平衡）后进行。
如图2A所示，mTBI大鼠从昏迷中恢复的时间明显更长，这与先前研究12,13的结果一致。大鼠的寻找行为被认为是正常的生理活动，在mTBI组的恢复期中表现出统计学上的显着增加（图2B）。这一发现表明，mTBI大鼠需要更长的时间才能恢复其运动，嗅觉，触觉探测和环境扫描能力。
现有的圆圈测试已经取代了神经严重程度评分中的原始感觉测试，该测试以前依赖于检查者的主观观察，例如放置和本体感觉测试。与假大鼠相比，mTBI大鼠离开圆圈的时间明显更长（图2C）。使用双因素方差分析对圆圈退出时间进行统计分析显示损伤的显著主效应（F [1， 36] = 21.29，p < 0.0001），表明 mTBI 组和假手术组之间存在差异。然而，不同的试验没有显著影响（F [2， 36] = 0.1396，p = 0.87）。
使用双向方差分析分析光束平衡检验的结果，然后对组均值之间的差异进行 Bonferroni 的多重比较（图 2D）。在所有宽光束任务中，损伤的总体影响显着（3 cm：F = 13.89，p < 0.001;2 cm：F = 42.7，p < 0.001;1.5 cm：F = 27.25，p < 0.001），表明mTBI大鼠在撞击后10分钟后表现出平衡障碍。根据三个独立的重复实验，2 cm和1.5 cm宽的平衡木比3 cm宽的平衡木对假和mTBI组的区分更好。
神经行为评估结果
在麻醉/受伤前 1 天和麻醉/受伤后 1 天、3 天和 7 天使用束任务评估运动协调能力（图 3）。通过重复测量的双向方差分析分析后肢滑脱的总数（图3A），Bonferroni的多重比较发现，与假大鼠相比，mTBI大鼠在受伤后第1天表现出明显的后肢滑移（图3A;p < 0.01）。然而，经过 2 天的恢复后，后方错误没有变化，7 天后滑倒总数恢复到假水平。值得注意的是，所有 6 只 mTBI 大鼠的撞击后后肢滑脱都多于其基线表现。假大鼠后肢滑脱略有增加可能与缺乏练习平衡木有关。在受伤后1天和3天，mTBI大鼠花费更多的时间穿越150厘米的光束（39.8秒±3.79秒对28.68秒±0.82秒，37.06秒±4.06秒对29.28秒±3.42秒），尽管mTBI大鼠和假大鼠在所有时间点穿越光束所需的时间没有差异（图3B）。
假手术组和mTBI组之间的行进距离没有显着差异（图4A）。通过测量在开阔场测试期间在中心区域花费的时间来评估焦虑样行为。在受伤后 3 天和 7 天，与假大鼠相比，mTBI 大鼠在中心区域花费的时间显着减少。这一发现表明，mTBI大鼠在7天内受到冲击后表现出更高水平的焦虑样行为（图4B，C）。
莫里斯水迷宫学习日的结果显示，mTBI大鼠比假大鼠需要更多的时间来定位隐藏的平台，这表明mTBI组的空间学习和记忆受损（图5）。随后，在探针试验期间，mTBI大鼠在保留空间记忆方面表现出缺陷，这可以通过花费较少的时间搜索被移除的平台来证明。值得注意的是，假手术组和mTBI组之间的游泳速度没有显著差异，这支持了在野外测试中进行的距离分析中观察到的一致结果。这些结果表明，这种影响对自发运动功能没有明显的影响。
图1：大鼠mTBI的冲击装置。 （A）枕头和头盔在大鼠头部相对位置的俯视图和侧视图。红色虚线表示头盔位置。（B） 整个组件的图像，显示位于大鼠阶段上方和收集海绵上方的用于下降重物的垂直导管。（C） 从撞击视频中截取的静止图像，描绘了大鼠在头部撞击后旋转 180° 以及随后的加速/旋转。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2：假 mTBI 大鼠独立重复 3 次后的急性神经行为评估结果。 （A）与假大鼠相比，接受mTBI的大鼠停止麻醉后意识丧失的时间显着增加。存在显著的组效应（P < 0.0001，双向方差分析），但无显著的时间效应（P = 0.6226）或组x时间效应（P = 0.5803）的交互作用。（B）mTBI大鼠在麻醉后表现出第一次寻找行为。（C） 假大鼠逃离 60 cm 圆圈的时间较少（*p < 0.01，**p < 0.001，未配对 t 检验）。（D） 3 cm、2 cm 和 1.5 cm 宽光束的光束平衡得分。Bonferroni对每组的多重比较结果如图所示。以平均值±均值的标准误差表示的数据。N = 8-12 每只实验使用大鼠。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 3：撞击前和撞击后第 1 天、第 3 天和第 7 天的光束任务性能。 （A） mTBI 大鼠在受伤后第 1 天后出现更多后肢滑脱 （*p < 0.001，重复测量的 2 因素方差分析）。（B）假大鼠的平均穿越时间小于mTBI大鼠。数据表示为均值±均值的标准误差（N = 6/组）。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 4：受伤前第 1 天和受伤后第 1 天、第 3 天、第 7 天和第 14 天的露天测试的表现。 （A）假大鼠和mTBI大鼠在行进距离上没有差异。（B） mTBI 大鼠在第 3 天和第 7 天在中心花费的时间少于假大鼠（*p < 0.01，**p < 0.001，重复测量的 2 因素方差分析），在受伤前第 1 天和受伤后第 1 天和第 14 天没有明显差异。（C） mTBI 后第 1 天、第 3 天、第 7 天和第 14 天的 mTBI 大鼠轨迹图。数据表示为均值±均值的标准误差（N = 6-10/组）。 请点击这里查看此图的较大版本.
图5：莫里斯水迷宫的表现。 （A）假大鼠和mTBI大鼠游泳能力测试速度无差异。（B）试验日参考记忆任务隐藏平台的延迟。（C）在5个试验日后，大鼠在2 min探针试验中越过平台的次数更多。假 （5.14 ± 0.65） 与 mTBI （3.56 ± 0.6）， （*p < 0.01， 未配对 t 检验）。数据表示为均值±均值的标准误差（N = 9/组）。请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
该模型成功地模拟了闭合的头部 mTBI，而无需头皮切口或颅骨开口，从而更准确地表示了在人类病例中观察到的撞击场景。避免头皮切口有助于防止可能与实际情况不符的炎症反应。与 Richelle Mychasiuk 的儿科模型12 相比，本研究中使用的模型专为体重在 280-320 g 之间的成年大鼠量身定制，使我们能够获得对 mTBI 对成年个体影响的宝贵见解。此外，结合枕头和头盔等关键部件有助于传递更均匀的冲击力，并帮助操作员精确识别冲击目标区域。
需要强调的是，大鼠的冲击过程是在没有麻醉维持的情况下进行的，因此在开始冲击之前确认了麻醉深度。我们通过轻轻摇晃麻醉诱导箱并将麻醉时间再延长 30 秒以确保足够的麻醉水平来确保大鼠没有反应。建议在1分钟内完成整个冲击过程。
本研究中描述的冲击装置相对容易构建，几乎可以在任何使用所提供规格的实验室中复制。这促进了不同研究环境中实验数据的更大标准化和可比性。此外，从这项研究中获得的验证数据是研究人员解决特定科学问题的宝贵资源。通过分析本研究中观察到的神经行为结果，研究人员可以做出明智的决定并定制实验方法以符合他们的特定研究目标。这提高了未来 mTBI 研究的整体质量和相关性，并促进了我们对其潜在机制和相关结果的理解。
本研究仅涉及雄性大鼠或实施闭头 mTBI 模型。鉴于先前的研究表明与 mTBI 相关的焦虑样行为和持续认知和躯体症状的性别特异性变化14,15，未来的研究应该对雌性啮齿动物进行。
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Disclosures
作者没有经济利益需要披露。
Acknowledgments
我们要感谢中南大学实验动物系的所有研究员。本研究得到了国家自然科学基金（第81971791号）的支持;法医学上海市重点实验室， 法医学部重点实验室（法医学研究院）KF202104）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acrylic box | In-house | N/A | 15 cm x 22 cm x 43 cm |
| Anesthesia Machine | RWD Life Science Co. | R540 Mice & Rat Animal Anesthesia Machine | |
| Helmet | In-house | N/A | Stainless-steel disk measuring 10 mm in diameter and 3 mm in thickness |
| Morris water maze | RWD Life Science Co. | Diameter 150 cm, height 50 cm,platform diameter 35 cm | |
| Open field | RWD Life Science Co. | 63007 | Width100 cm, height 40 cm |
| Panlab SMART V3.0 | RWD Life Science Co. | SMART v3.0 | |
| Perforated weight | In-house | N/A | Weight of 550 g and diameter of 18 mm |
| Pillow | In-house | N/A | Wedge-shaped sponge to place beneath the rat's head |
References
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