Summary
Burada, kapalı başlı hafif travmatik beyin hasarı (mTBI) sıçan modelini ve akut ve subakut evrelerdeki davranışsal belirtiler açısından insan mTBI'sına dikkate değer benzerlik gösteren doğrulamasını sunuyoruz.
Abstract
Hayvan modelleri, hafif travmatik beyin hasarı (mTBI) anlayışımızı ilerletmek ve klinik araştırmalara rehberlik etmek için çok önemlidir. Anlamlı içgörüler elde etmek için istikrarlı ve tekrarlanabilir bir hayvan modeli geliştirmek çok önemlidir. Bu çalışmada, modelleme etkisini doğrulamak için kapalı başlı bir mTBI modelinin ayrıntılı bir tanımını ve Sprague-Dawley sıçanlarını kullanan temsili bir doğrulama yöntemini sunuyoruz. Model, 550 g'lık bir kütle ağırlığını 100 cm yükseklikten doğrudan tahrip edilebilir bir yüzey üzerinde bir sıçanın kafasına düşürmeyi ve ardından 180 derecelik bir dönüşü içerir. Yaralanmayı değerlendirmek için sıçanlar, yaralanmadan 10 dakika sonra, bilinç kaybı zamanı, ilk arama davranışı süresi, kaçış yeteneği ve ışın dengesi yetenek testi dahil olmak üzere bir dizi nörodavranışsal değerlendirmeye tabi tutuldu. Yaralanmayı takip eden akut ve subakut aşamalarda, motor koordinasyon yeteneğini (Işın görevi), anksiyeteyi (Açık Alan testi) ve öğrenme ve hafıza yeteneklerini (Morris Su Labirenti testi) değerlendirmek için davranış testleri yapıldı. Kapalı kafa mTBI modeli, minimum mortalite ve çoğaltılmış gerçek yaşam durumları ile tutarlı bir yaralanma yanıtı üretti. Doğrulama yöntemi, model geliştirmeyi etkili bir şekilde doğruladı ve modelin kararlılığını ve tutarlılığını sağladı.
Introduction
Hafif travmatik beyin hasarı (mTBI) veya beyin sarsıntısı, en yaygın yaralanma türüdür ve çeşitli kısa süreli ve kronik semptomlara yol açabilir1. Bu semptomlar, diğerlerinin yanı sıra baş dönmesi, baş ağrısı, depresyon ve anhedoniyi içerebilir ve mTBI2'den etkilenen bireyler için önemli acılara yol açabilir. Çoğu mTBI'ye künt kuvvet travması3 neden olduğundan, bu tür yaralanmaları doğru bir şekilde taklit eden hayvan modelleri geliştirmek zorunlu hale gelir. Bu modeller, yaralanmayı ve altında yatan mekanizmaları daha iyi anlamak için gereklidir ve insan çalışmalarına kıyasla daha az değişkenlik ve heterojenlik ile kontrollü bir ortam sunar.
Travmatik beyin hasarı (TBI) için sıvı perküsyon yaralanması (FPI)4, kontrollü kortikal etki (CCI)5, ağırlık düşürme yaralanması6, patlama travmatik beyin hasarı7 ve diğerleri dahil olmak üzere çok sayıda köklü kemirgen modeli geliştirilmiştir. Bununla birlikte, bu modeller öncelikle orta ila şiddetli TBI senaryolarını çoğaltmaya odaklanmaktadır. Buna karşılık, mTBI'yi simüle etmek için özel olarak tasarlanmış deneysel modeller nispeten daha az ilgi gördü ve yeterince keşfedilmedi8. Bu nedenle, mTBI'yi doğru bir şekilde temsil eden istikrarlı ve tekrarlanabilir bir hayvan modeli oluşturmak için kritik bir ihtiyaç vardır. Böyle bir model, mTBI ile ilişkili nörobiyolojik ve davranışsal sonuçlar hakkındaki anlayışımızı önemli ölçüde artıracaktır.
Anestezinin etkileri geçtikten sonra mTBI sıçanlarında fonksiyonel eksiklikler normal sıçanlara göre rastgele gözlem yoluyla ayırt edilemez. Bu nedenle, spesifik testlerin uygulanması gereklidir. İnsanlarda, hastaları değerlendirmek için çok çeşitli klinik değerlendirmeler kullanılır 9,10,11. Benzer şekilde, sıçan modelinde başarılı bir model oluşturmak, geçerliliğini belirlemek için hızlı değerlendirme araçlarının kullanılmasını da gerektirir.
Bu çalışmada, mTBH'nin insan durumuna çok benzer bir şekilde araştırılmasını sağlayan kapalı başlı bir mTBI sıçan modeli sunuyoruz. Modelin ayrıntılı açıklaması ve doğrulama prosedürü, mTBI çalışmasında kullanılan deneysel yaklaşımın kapsamlı bir şekilde anlaşılmasını sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hayvan deneyleri, Central South Üniversitesi Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylandı. Tüm çalışmalar laboratuvar hayvanlarının refahı ve etik ilkeleri doğrultusunda yürütülmüştür.
1. Hayvan besleme ve anestezi prosedürü
- 280-320 g Sprague-Dawley erkek sıçanlarını gruplandırın ve onları yiyecek ve suya erişim ile 12 saat / 12 saat aydınlık/karanlık döngüsünde tutun. Sıçanlar 6 gün boyunca iklime alıştıktan sonra çalışmayı gerçekleştirin.
- Sıçanı, pençe veya kuyruk sıkışmasına yanıt vermeyene kadar bir indüksiyon kutusunda 0.6 L / dak hava akışında% 3 izofluran ile uyuşturun. Akış hızını 30 saniye koruyun.
NOT: Nörodavranışsal değerlendirmelerde sıçanın tepkisini etkileyeceği için ağrı kesici ilaçlar kullanılmamıştır.
2. Ameliyat öncesi kurulum
- Sertlik değeri 35D (süngerin ağırlığı 35 kg/m3), aynı uzunluk ve genişlikte ancak 12 cm kalınlığında bir süngeri, üst kapağı olmayan akrilik bir kutuya (15 cm x 22 cm x 43 cm) yerleştirin.
- Bir teneke folyoyu (20 μm kalınlığında) kesin ve bir sıçanın ağırlığını taşıyabilecek tahrip edilebilir bir yüzey oluşturmak için yapışkan bant kullanarak akrilik kutuya yapıştırın. Ek olarak, sıçanın kafasını konumlandırmak için belirlenmiş yer olarak yaklaşık 10 cm'lik bir kesim çizgisi işaretleyin.
- Demir bir sehpa yardımıyla PVC boruyu yerine sıkıca sabitleyin. 18 milimetre çapında 550 gram ağırlığında delikli bir ağırlık hazırlayın. Ağırlığı, bir polivinil klorür veya PVC tüpün içinde 1 metre yükseklikte bir oltaya takın. ve kılavuz borunun konumunu kalay folyonun 3 santimetre yukarısına ayarlayın.
- Bir kask ve bir yastık hazırlayın. 10 mm çapında ve 3 mm kalınlığında paslanmaz çelik bir disk kullanarak bir kask yapın. Sıçanın başının altına yerleştirmek için kama şeklinde bir sünger yastık hazırlayın ve yerçekimi yönüne dik olduğundan emin olun.
NOT: Darbe aparatının şematik bir diyagramı Şekil 1'de sunulmuştur. Kask, çarpma yerini belirleme ve dış kuvvetin dağılımını artırma amacına hizmet eder. Yastık, düzgün ve sabit hasarı garanti etmek için kullanılır.
3. mTBI indüksiyonu
- Anestezi uygulanmış fareyi hızlı bir şekilde göğsüne, teneke folyo üzerine yerleştirin.
NOT: mTBI indüksiyonu için biri hazırlık, diğeri doğrulama için olmak üzere iki operatör gereklidir. - Hazırlık: Yastığı farenin altına yerleştirin ve başının folyo kağıda paralel olduğundan emin olun. Kaskı farenin kulaklarıyla hizalayın ve yerine sabitleyin.
- Doğrulama: PVC borunun doğrudan kaskın üzerine yerleştirildiğini doğrulayın. Her iki operatör de doğru kurulumu onayladıktan sonra bir sonraki adıma geçin.
- Kafa dönüşünün indüksiyonu: Ağırlığı serbest bırakın, düşmesine ve farenin kafasına çarpmasına izin verin, süngerin üzerine düşmeye ve 180 ° dönmeye neden olun.
- Fareyi temiz bir kafese sırt üstü yerleştirin.
4. Sahte indüksiyon
- Sıçana önceki mTBI indüksiyon açıklamasıyla aynı şekilde davranın, ancak kafa darbesine maruz bırakmayın.
5. Doğrulama prosedürü: Akut nörodavranışsal değerlendirmeler
NOT: Aşağıdaki değerlendirmeler Nörolojik Şiddet Skorları9 ve Flierl ve ark.10 protokolüne göre değiştirilmiştir. Tüm bu değerlendirmeler, sıçan düzeltme refleksini geri kazandıktan 10 dakika sonra yapıldı.
- Bilinç kaybı zamanı: Sıçanın uyuşturulmasından doğrultma refleksini geri kazanmasına kadar geçen süreyi kaydedin.
NOT: Doğrultma refleksi, sıçanın sırt üstü yatırıldığında döndüğü süreçtir. Düzeltme refleksinin kaybı, insancıl bir son nokta olarak kabul edilmeli ve hayvana kurumsal yönergelere göre ötenazi yapılmalıdır. - İlk arama davranışı zamanı: Sıçanın uyuşturulduğu andan arama davranışını ilk kez gösterdiği zamana kadar geçen süreyi kaydedin.
NOT: Davranış aramak, çevreye olan ilginin bir işaretidir, fizyolojik bir tepkidir. - Kaçma yeteneği
- Fareyi, çıkışı (12,5 cm uzunluğunda ve 9 cm genişliğinde) dairesel bir aparatın (0,5 m çapında ve 0,3 m yüksekliğinde) ortasına yerleştirin.
- Sıçanın çemberden çıkması için geçen süreyi kaydedin.
NOT: Sıçan 180 s içinde daireden çıkmazsa, süreyi 180 s olarak kaydedin.
- Işın dengesi yetenek testi
- Fareyi buna göre 1 dakika boyunca 3 cm, 2 cm ve 1,5 cm genişliğinde bir kirişe yerleştirin.
- Sıçan, kiriş üzerinde sabit bir duruşla dengeyi koruyorsa, 0 olarak puanlayın.
- Sıçan kirişin kenarını kavrarsa, 1 puan verin. Sıçan kirişe sarılırsa ve bir uzuv düşerse, 2 olarak puanlayın.
- Sıçan kirişe sarılırsa ve iki uzuv ondan düşerse veya üzerinde dönerse (>60 s), 3 olarak puanlayın.
- Sıçan kiriş üzerinde dengede durmaya çalışır ancak düşerse (> 40 s), 4 olarak puanlayın.
- Sıçan kiriş üzerinde dengede durmaya çalışır ancak düşerse (>20 sn), 5 olarak puanlayın.
- Sıçan kirişi dengelemeye veya asmaya çalışmazsa ve 20 saniye içinde düşerse, 6 olarak puanlayın.
NOT: Işın dengesi testi bir ön deneme gerektirmez.
6. Doğrulama prosedürü: Nörodavranış değerlendirmesi
NOT: Davranışsal deneylerden önce, sıçanlar, stresi ve yenilik bozulmasını en aza indirmek için art arda 3 gün boyunca günde 2 dakika boyunca ele alındı. Tüm davranışsal deneyler, deney başlamadan önce hayvanlar 60 dakika boyunca test ortamına yerleştirilerek gerçekleştirilmiştir.
- Motor koordinasyon yeteneği (Işın görevi)
- Deney düzeneği
- Fareleri denge kirişinin bir ucuna (1,5 m uzunluğunda ve yerden 75 cm yukarıda) yerleştirin. Diğer ucuna bir kaçış kutusu (eğimli bir yatak ev kafesi) yerleştirin.
- Test sırasında düşme durumunda sıçanların potansiyel yaralanma riskini azaltmak için kirişin altına bir köpük dolgu yerleştirin.
- Video kamerayı açın.
- Test günlerini yaralanma sonrası veya sahte tedavi sonrası belirli zaman noktalarında planlayın (örneğin, 1. gün, 3. gün ve 7. gün).
- Eğitim aşaması (2 gün)
- Sıçanları 4 cm genişliğindeki kirişi art arda 3 kez geçmeleri için eğitin, ardından 2 cm genişliğindeki kiriş üzerinde iki deneme yapın.
- Eğitim sırasında, fareleri parazit olmadan kolayca geçebilene kadar kiriş boyunca nazikçe yönlendirin.
- Denge kirişi deneyi
- Fareleri art arda 5 deneme için 2 cm genişliğindeki kirişe yerleştirin.
- Sıçanın burnu sırasıyla başlangıç ve bitiş çizgilerini geçtiğinde her denemenin başlangıcını ve bitişini kaydedin.
- Deneyin sonunda fareleri kafeslerine geri koyun.
- Temel test
- Yaralanma veya tedaviden önce denge kirişi deneyini yapın.
- Her sıçan için taban çizgisini belirlemek için bu 5 ardışık denemeden elde edilen ortalama değerleri hesaplayın.
- Veri analizi
- Deneysel koşullara kör olan araştırmacılar tarafından video analizini kullanarak kirişi geçme süresini ve toplam arka ayak kayma sayısını analiz edin.
- Deney düzeneği
- Anksiyete (Açık alan testi)
- Deney düzeneği
- Açık alan arenasını hazırlayın, temiz olduğundan ve önceki koku ipuçlarından arınmış olduğundan emin olun. Arenayı üç bölgeye ayırın: merkezi bir iç bölge (33 cm x 33 cm), bir orta bölge (66 cm x 66 cm) ve bir dış bölge.
- Test aşaması
- Açık alan arenasının ortasına bir fare yerleştirin ve zamanlayıcıyı başlatın. Farenin arenayı 5 dakika boyunca özgürce keşfetmesine izin verin. 5 dakika sonra, fareyi dikkatlice ve nazikçe ev kafesine geri koyun.
- Veri toplama
- 5 dakikalık keşif süresi boyunca sıçan tarafından kat edilen toplam mesafeyi ölçün. Sıçanın merkezi iç, orta ve dış bölgelerde geçirdiği süreyi belirleyin.
- Veri analizi
- Kat edilen toplam mesafeyi, genel keşif davranışının ve lokomotor yeteneğin bir ölçüsü olarak kullanın. Kaygı benzeri tepkilerin bir göstergesi olarak merkezi iç bölgede geçirilen zamanı hesaplayın.
- Deney düzeneği
- Öğrenme ve hafıza yetenekleri (Morris su labirenti testi)
- Su labirenti aparatının uygun durumda olduğundan emin olun. Suyu siyaha boyayın ve ipuçlarını dört ana yöne yerleştirin. Platformu su yüzeyinin 2,5 cm altına yerleştirin.
- Sıçanların davranışlarını kaydetmek ve gözlemlemek için bir izleme sistemi kurun.
- İz günü
- Fareyi hızlı bir şekilde su labirentine yerleştirin. Sıçan 2 dakika içinde platforma ulaşamazsa, tahta çubuğu kullanarak yavaşça yönlendirin.
- Platformda 20 saniye dururken farenin labirent ortamına alışmasına izin verin, ardından çıkarın. Sıçan platforma girdikten sonra 20 saniye kalmasına izin verin, ardından çıkarın.
- Günlük tekrarlama
- Sıçanı farklı kadranlardan suya yerleştirerek eğitim günü prosedürünü tekrarlayın. Adım 6.3.3'ü tekrarlayın. Arka arkaya 5 gün boyunca eğitime devam edin.
- Prob test günü: 6. günde , platformu çıkarın ve fareyi 2 dakika boyunca aynı kadrana yerleştirin.
- Gözlem ve kayıt: Deneme ve prob test günlerinde sıçanın davranışını izlemek için izleme sistemini kullanın.
- Temizleme: Fareyi su labirentinden çıkardıktan sonra, iyice kurutmak için bir havlu kullanın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu çalışmada kullanılan aparat, Kane modelinin ve Richelle Mychasiuk'un pediatrik modelinin değiştirilmiş bir versiyonuydu11,12. Bu çalışmada, SD sıçanlar sahte ve mTBI gruplarına ayrıldı. Bu modelin tekrarlanabilirliğini göstermek için, her deneyde 8-12 sıçan içeren akut nörodavranışsal değerlendirme ile birlikte bu modelin üç bağımsız kopyasını gerçekleştirdik. Bu çalışmada 30'dan fazla mTBI sıçan kullandık ve 2 sıçan anesteziye bağlı mortalite yaşadı. Bununla birlikte, deney sırasında hiçbir sıçan beyin hasarına yenik düşmedi. Bu deneylerin sonuçları Şekil 2'de sunulmuştur. Ek olarak, akut ve subakut evrelerde nörodavranışsal değerlendirmeler yapıldı (Şekil 3, Şekil 4 ve Şekil 5).
Akut nörodavranışsal değerlendirme sonuçları
Tüm bu değerlendirmeler sırasıyla anestezi/darbe 0 dk (bilinç kaybı zamanı ve ilk arama davranışı zamanı) veya 10 dk (daireden çıkış ve ışın dengesi) sonra yapıldı.
Şekil 2A'da gösterildiği gibi, mTBI sıçanları bilinç kaybından kurtulmak için önemli ölçüde daha fazla zaman harcadılar, bu da önceki çalışmalarda elde edilen sonuçlarla uyumludur12,13. Normal bir fizyolojik aktivite olarak kabul edilen sıçanlarda arama davranışı, mTBI grubu içinde iyileşme süresinde istatistiksel olarak anlamlı bir artış sergilemiştir (Şekil 2B). Bu bulgu, mTBI sıçanlarının hareket, koku alma, dokunsal sondalama ve çevresel tarama yeteneklerini yeniden kazanmak için daha uzun bir süreye ihtiyaç duyduğunu göstermektedir.
Çember mevcut testi, daha önce sınav görevlilerinin yerleştirme ve propriyoseptif testler gibi öznel gözlemlerine dayanan nörolojik şiddet puanındaki orijinal duyusal testlerin yerini almıştır. mTBI sıçanları, sahte sıçanlara kıyasla çemberden çıkmak için önemli ölçüde daha uzun zaman harcadılar (Şekil 2C). Çember çıkış süresi için iki yönlü bir ANOVA kullanılarak yapılan istatistiksel analiz, yaralanmanın önemli bir ana etkisini gösterdi (F [1, 36] = 21.29, p < 0.0001), bu da mTBI ve sahte gruplar arasında bir fark olduğunu gösteriyor. Bununla birlikte, farklı çalışmaların anlamlı bir etkisi yoktu (F [2, 36] = 0.1396, p = 0.87).
Işın dengesi testinin sonuçları iki yönlü bir ANOVA kullanılarak analiz edildi, ardından Bonferroni'nin grup ortalamaları arasındaki farklar için çoklu karşılaştırmaları yapıldı (Şekil 2D). Tüm geniş ışın görevlerinde yaralanmanın önemli bir genel etkisi vardı (3 cm: F = 13.89, p < 0.001; 2 cm: F = 42.7, p < 0.001; 1.5 cm: F = 27.25, p < 0.001), mTBI sıçanlarının darbeden 10 dakika sonra sahte sıçanlara kıyasla denge bozukluğu sergilediğini gösterir. Tekrarlanan üç bağımsız deneye göre, 2 cm ve 1.5 cm genişliğindeki denge kirişi, sahte ve mTBI grupları arasında 3 cm genişliğindeki kirişe göre daha iyi ayrım gösterdi.
Nörodavranış değerlendirme sonuçları
Motor koordinasyon yeteneği, anestezi öncesi/yaralanma öncesi 1 gün ve anestezi/yaralanma sonrası 1 gün, 3 gün ve 7 gün sonra ışın görevi kullanılarak değerlendirildi (Şekil 3). Arka bacak kaymalarının toplam sayısı (Şekil 3A), tekrarlanan ölçülen iki yönlü ANOVA ile analiz edildi ve Bonferroni'nin çoklu karşılaştırmaları, mTBI sıçanlarının, sahte sıçanlara kıyasla yaralanma sonrası 1. günde önemli ölçüde daha fazla arka bacak kayması gösterdiğini buldu (Şekil 3A; p < 0.01). Bununla birlikte, 2 günlük bir iyileşmeden sonra, arka hatalarda herhangi bir değişiklik görülmedi ve toplam kayma sayısı 7 gün sonra sahte seviyelere geri döndü. Özellikle, 6 mTBI sıçanının tümünde, temel performanslarından daha fazla darbe sonrası arka bacak kayması vardı. Sahte sıçanlarda hafifçe artan arka bacak kaymaları, pratik denge kirişi eksikliği ile ilişkili olabilir. Yaralanma sonrası 1 gün ve 3 günde, mTBI sıçanları 150 cm'lik kirişi geçmek için daha fazla zaman harcadılar (39.8 s ± 3.79 s vs. 28.68 s ± 0.82 s, 37.06 s ± 4.06 s vs. 29.28 s ± 3.42 s), ancak mTBI sıçanları ve sahte sıçanlar arasında ışını tüm zaman noktalarında geçmek için geçen sürede hiçbir fark yoktu (Şekil 3B).
Sahte ve mTBI grupları arasında kat edilen mesafede anlamlı bir fark yoktu (Şekil 4A). Anksiyete benzeri davranışlar, açık alan testi sırasında merkez bölgede geçirilen süre ölçülerek değerlendirildi. Yaralanmadan sonraki hem 3 gün hem de 7 gün sonra, mTBI sıçanları, sahte sıçanlara kıyasla merkez bölgede geçirilen sürede önemli bir azalma sergiledi. Bu bulgu, mTBI sıçanlarının 7 gün içinde etkiyi takiben daha yüksek düzeyde anksiyete benzeri davranışlar sergilediğini göstermektedir (Şekil 4B, C).
Morris su labirenti öğrenme günleri sonuçları, mTBI sıçanlarının gizli platformu bulmak için sahte sıçanlardan daha fazla zamana ihtiyaç duyduğunu ortaya koydu, bu da mTBI grubunda uzamsal öğrenme ve hafızanın bozulduğunu gösteriyor (Şekil 5). Daha sonra, prob denemesi sırasında, mTBI sıçanları, kaldırılan platformu aramak için daha az zaman harcayarak kanıtlandığı gibi, uzamsal hafızayı korumada eksiklikler sergiledi. Özellikle, sahte ve mTBI grupları arasında yüzme hızında anlamlı bir fark gözlenmedi ve bu da açık alan testinde yapılan kat edilen mesafe analizinde gözlemlenen tutarlı bulguları destekledi. Bu sonuçlar, etkinin spontan lokomotor fonksiyon üzerinde fark edilebilir bir etkisi olmadığını göstermektedir.
Şekil 1: Sıçanlarda mTBI için darbe aparatı. (A) Sıçan kafasının göreceli pozisyonunda yastığın ve kaskın üstten görünümü ve yandan görünümü. Kırmızı noktalı çizgi kaskın konumunu gösterir. (B) Sıçan aşamasının ve toplama süngerinin üzerine yerleştirilmiş düşen ağırlık için dikey bir kılavuz boruyu gösteren tüm düzeneğin bir görüntüsü. (C) Kafa çarpmasını takiben sıçanın 180° dönüşünü ve ardından hızlanmayı/dönmeyi gösteren bir darbe videosundan alınan bir hareket. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Sahte mTBI sıçanlarını takiben akut nörodavranışsal değerlendirme sonuçları, bağımsız olarak üç kez tekrarlandı. (A) Sıçanlarda anestezinin kesilmesinden sonra bilinç kaybının önemli ölçüde artması, sahte sıçanlara karşı bir mTBI aldı. Anlamlı bir grup (P < 0.0001, iki yönlü ANOVA) etkisi vardı, ancak anlamlı zaman (P = 0.6226) etkisi veya grup x zamanı (P = 0.5803) etkileşimi yoktu. (B) mTBI sıçanları anesteziden sonra ilk arama davranışlarını gösterdiler. (C) Sahte sıçanlar 60 cm'lik daireden kaçmak için daha az zaman harcadılar (*p < 0.01, **p < 0.001, eşleştirilmemiş t-testi). (D) 3 cm, 2 cm ve 1.5 cm genişliğindeki kiriş dengesi puanındaki performans. Bonferroni'nin her grup için yaptığı çoklu karşılaştırmaların sonuçları şekillerde gösterilmiştir. Veriler, ortalamanın standart hatası ± ortalama olarak sunulur. Deney başına N = 8-12 sıçan kullanıldı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: 1. gün, 3. gün ve 7. gündeki çarpmadan önceki ve sonraki darbeden sonraki ışın görevi performansı. (A) mTBI sıçanları, yaralanma sonrası 1. günde daha fazla arka bacak kayması yaptı (*p < 0.001, tekrarlanan ölçülen 2 yönlü ANOVA). (B) Sahte sıçanların ortalama geçiş süresi, mTBI sıçanlarınınkinden daha azdır. Veriler, ortalamanın standart hatası ± ortalama olarak sunulmuştur (N = 6/grup). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Yaralanma öncesi 1. gün ve yaralanma sonrası 1. gün, 3. gün, 7. gün ve 14. günde açık alan testinin performansı. (A) Sahte ve mTBI sıçanları arasında kat edilen mesafede bir fark yoktu. (B) mTBI sıçanları, 3. ve 7. günlerde sahte sıçanlara göre merkezde daha az zaman geçirdiler (* p < 0.01, ** p < 0.001, tekrarlanan ölçülen 2 yönlü ANOVA), yaralanma öncesi 1. günde ve yaralanma sonrası 1. günde ve 14. günde belirgin bir fark yoktu. (C) mTBI sonrası 1. gün, 3. gün, 7. gün ve 14. günde mTBI sıçanlarının haritasını takip edin. Veriler, ortalamanın standart hatası ± ortalama olarak sunulmuştur (N = 6-10/grup). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Morris su labirentindeki performans. (A) Sahte ve mTBI sıçanlar arasında yüzme yetenek testinde hız açısından fark yoktu. (B) Deneme gününde referans bellek görevinin gizli platformunda gecikme. (C) Sıçanlar, 5 deneme gününden sonra 2 dakikalık prob testi denemesinde platformu daha fazla kez geçti. Sham (5.14 ± 0.65) ve mTBI (3.56 ± 0.6), (*p < 0.01, Eşleştirilmemiş t-testi). Veriler, ortalamanın standart hatası ± ortalama olarak sunulmuştur (N = 9/grup). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu model, kafa derisi kesisine veya kafatası açılmasına gerek kalmadan kapalı başlı bir mTBI'yi başarılı bir şekilde simüle ederek, insan vakalarında gözlemlenen etki senaryosunun daha doğru bir temsilini sağlar. Kafa derisi insizyonundan kaçınmak, gerçek durumla uyumlu olmayabilecek enflamatuar yanıtların önlenmesine yardımcı olur. Richelle Mychasiuk'un pediatrik modeli12 ile karşılaştırıldığında, bu çalışmada kullanılan model, 280-320 g ağırlığındaki yetişkin sıçanlar için özel olarak uyarlanmıştır ve mTBI'nın yetişkin bireyler üzerindeki etkileri hakkında değerli bilgiler edinmemizi sağlar. Ek olarak, yastık ve kask gibi temel bileşenlerin dahil edilmesi, daha homojen bir çarpma kuvvetinin sağlanmasını kolaylaştırır ve operatörün çarpma için hedef alanı tam olarak belirlemesine yardımcı olur.
Sıçanlarda darbe prosedürünün anestezi bakımı olmadan gerçekleştirildiğini vurgulamak önemlidir, bu nedenle etki başlamadan önce anestezi derinliği doğrulandı. Anestezi indüksiyon kutusunu hafifçe sallayarak ve yeterli anestezi seviyesini sağlamak için anestezi süresini 30 saniye daha uzatarak sıçanların yanıt vermemesini sağladık. Tüm darbe işleminin 1 dakika içinde tamamlanması tavsiye edilir.
Bu çalışmada tarif edilen darbe aparatının yapımı nispeten kolaydır ve sağlanan spesifikasyonlar kullanılarak hemen hemen her laboratuvarda çoğaltılabilir. Bu, farklı araştırma ortamlarında deneysel verilerin daha fazla standardizasyonunu ve karşılaştırılabilirliğini teşvik eder. Ayrıca, bu çalışmadan elde edilen doğrulama verileri, araştırmacılar için belirli bilimsel soruları ele almada değerli bir kaynak görevi görmektedir. Araştırmacılar, bu çalışmada gözlemlenen nörodavranışsal sonuçları analiz ederek bilinçli kararlar verebilir ve deneysel yaklaşımı kendi özel araştırma hedefleriyle uyumlu hale getirebilir. Bu, mTBI ile ilgili gelecekteki çalışmaların genel kalitesini ve alaka düzeyini artırır ve altta yatan mekanizmaları ve ilişkili sonuçları anlamamızdaki ilerlemeleri kolaylaştırır.
Bu çalışma, yalnızca kapalı kafa mTBI modelini uygulayan veya uygulayan erkek sıçanları içeriyordu. Anksiyete benzeri davranışlarda cinsiyete özgü varyasyonları ve mTBI14,15 ile ilgili kalıcı bilişsel ve somatik semptomları gösteren önceki araştırmalar göz önüne alındığında, dişi kemirgenler üzerinde gelecekteki çalışmalar yapılmalıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların ifşa edecek herhangi bir mali çıkarı yoktur.
Acknowledgments
Central South Üniversitesi Laboratuvar Hayvanları Bölümü'ndeki tüm bursiyerlere teşekkür etmek istiyoruz. Bu çalışma Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (No. 81971791) tarafından desteklenmiştir; Şangay Adli Tıp Anahtar Laboratuvarı, Adli Bilimler Anahtar Laboratuvarı, Adalet Bakanlığı, Çin (Adli Bilimler Akademisi) (No. KF202104).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acrylic box | In-house | N/A | 15 cm x 22 cm x 43 cm |
| Anesthesia Machine | RWD Life Science Co. | R540 Mice & Rat Animal Anesthesia Machine | |
| Helmet | In-house | N/A | Stainless-steel disk measuring 10 mm in diameter and 3 mm in thickness |
| Morris water maze | RWD Life Science Co. | Diameter 150 cm, height 50 cm,platform diameter 35 cm | |
| Open field | RWD Life Science Co. | 63007 | Width100 cm, height 40 cm |
| Panlab SMART V3.0 | RWD Life Science Co. | SMART v3.0 | |
| Perforated weight | In-house | N/A | Weight of 550 g and diameter of 18 mm |
| Pillow | In-house | N/A | Wedge-shaped sponge to place beneath the rat's head |
References
- Silverberg, N. D., Duhaime, A. C., Iaccarino, M. A.
- Kim, K., Priefer, R.
- Peeters, W., et al.
- Kabadi, S. V., Hilton, G. D., Stoica, B. A., Zapple, D. N., Faden, A. I. Fluid-percussion-induced traumatic brain injury model in rats. Nature Protocols. 5 (9), 1552-1563 (2010).
- Smith, D. H., et al. A model of parasagittal controlled cortical impact in the mouse: cognitive and histopathologic effects. Journal of Neurotrauma. 12 (2), 169-178 (1995).
- Feeney, D. M., Boyeson, M. G., Linn, R. T., Murray, H. M., Dail, W. G. Responses to cortical injury: I. Methodology and local effects of contusions in the rat. Brain Research. 211 (1), 67-77 (1981).
- Cernak, I., et al. The pathobiology of blast injuries and blast-induced neurotrauma as identified using a new experimental model of injury in mice. Neurobiology of Disease. 41 (2), 538-551 (2011).
- Shultz, S. R., et al. The potential for animal models to provide insight into mild traumatic brain injury: Translational challenges and strategies. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 76 (Pt B), 396-414 (2017).
- Chen, J., et al. Therapeutic benefit of intravenous administration of bone marrow stromal cells after cerebral ischemia in rats. Stroke. 32 (4), 1005-1011 (2001).
- Flierl, M. A., et al. Mouse closed head injury model induced by a weight-drop device. Nature Protocols. 4 (9), 1328-1337 (2009).
- Kane, M. J., et al. A mouse model of human repetitive mild traumatic brain injury. J Neuroscience Methods. 203 (1), 41-49 (2012).
- Mychasiuk, R., Farran, A., Esser, M. J. Assessment of an experimental rodent model of pediatric mild traumatic brain injury. Journal of Neurotrauma. 31 (8), 749-757 (2014).
- Pham, L., et al. Mild closed-head injury in conscious rats causes transient neurobehavioral and glial disturbances: A novel experimental model of concussion. Journal of Neurotrauma. 36 (14), 2260-2271 (2019).
- Jacotte-Simancas, A., Molina, P., Gilpin, N. W. Repeated mild traumatic brain injury and JZL184 produce sex-specific increases in anxiety-like behavior and alcohol consumption in Wistar rats. Journal of Neurotrauma. , (2023).
- Levin, H. S., et al. Association of sex and age with mild traumatic brain injury-related symptoms: A TRACK-TBI study. JAMA Network Open. 4 (4), e213046 (2021).
