Summary
Aqui, apresentamos um modelo de traumatismo cranioencefálico (TCEm) de cabeça fechada em ratos e sua validação exibindo notável semelhança com o TCEm humano em relação às manifestações comportamentais durante as fases aguda e subaguda.
Abstract
Os modelos animais são cruciais para avançar nossa compreensão do traumatismo cranioencefálico leve (TCEm) e orientar a pesquisa clínica. Para obter insights significativos, o desenvolvimento de um modelo animal estável e reprodutível é essencial. Neste estudo, relatamos uma descrição detalhada de um modelo de TCEm de cabeça fechada e um método de validação representativo usando ratos Sprague-Dawley para verificar o efeito da modelagem. O modelo envolve a queda de um peso de massa de 550 g de uma altura de 100 cm diretamente na cabeça de um rato em uma superfície destrutível, seguido por um giro de 180 graus. Para avaliar a lesão, os ratos foram submetidos a uma série de avaliações neurocomportamentais 10 min após a lesão, incluindo tempo de perda de consciência, tempo de comportamento de primeira busca, habilidade de escape e teste de habilidade de equilíbrio do feixe. Durante os estágios agudo e subagudo após a lesão, foram realizados testes comportamentais para avaliar a capacidade de coordenação motora (tarefa Beam), ansiedade (teste de Campo Aberto) e habilidades de aprendizagem e memória (teste Morris Water Maze). O modelo de TCEm de cabeça fechada produziu uma resposta consistente à lesão com mortalidade mínima e situações replicadas da vida real. O método de validação verificou efetivamente o desenvolvimento do modelo e garantiu a estabilidade e consistência do modelo.
Introduction
O traumatismo cranioencefálico leve (TCEm), ou concussão, é o tipo de lesão mais prevalente e pode levar a vários sintomas crônicos e de curta duração1. Esses sintomas podem incluir tontura, cefaleia, depressão, anedonia, entre outros, levando a sofrimento significativo para os indivíduos acometidos pelo TCEm2. Como a maioria dos TCEm é causada por trauma contuso3, torna-se imperativo desenvolver modelos animais que mimetizem com precisão tais lesões. Esses modelos são essenciais para uma melhor compreensão da lesão e de seus mecanismos subjacentes, oferecendo um ambiente controlado com variabilidade e heterogeneidade reduzidas em relação aos estudos em humanos.
Numerosos modelos bem estabelecidos de roedores foram desenvolvidos para traumatismo cranioencefálico (TCE), incluindo lesão por percussão líquida (IFP)4, impacto cortical controlado (CCI)5, lesão por queda depeso6, traumatismo cranioencefálico blásteo7, entre outros. No entanto, esses modelos se concentram principalmente na replicação de cenários de TCE moderado a grave. Em contraste, os modelos experimentais especificamente desenhados para simular o TCEm têm recebido relativamente menos atenção e permanecem pouco explorados8. Portanto, há uma necessidade crítica de estabelecer um modelo animal estável e reprodutível que represente com precisão o TCEm. Tal modelo melhoraria significativamente nossa compreensão das consequências neurobiológicas e comportamentais associadas ao TCEm.
Não é possível distinguir os déficits funcionais em ratos com TCEm em comparação com ratos normais por meio de observação casual após o término dos efeitos da anestesia. Portanto, é necessário aplicar testes específicos. Em humanos, uma ampla gama de avaliações clínicas é utilizada para avaliar os pacientes 9,10,11. Da mesma forma, o estabelecimento de um modelo bem-sucedido no modelo de ratos também requer o uso de instrumentos de avaliação rápida para determinar sua validade.
Neste estudo, apresentamos um modelo de TCEm de cabeça fechada em ratos, permitindo a investigação de TCEm de uma maneira que se assemelha muito à condição humana. A descrição detalhada do modelo e seu procedimento de validação fornecem uma compreensão abrangente da abordagem experimental utilizada no estudo do TCEm.
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Protocol
Os experimentos com animais foram aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais da Universidade Central Sul. Todos os estudos foram conduzidos de acordo com os princípios éticos e de bem-estar dos animais de laboratório.
1. Procedimento de alimentação e anestesia dos animais
- O grupo abriga 280-320 g de ratos machos Sprague-Dawley e os mantém em um ciclo claro/escuro de 12 h/12 h com acesso a comida e água ad libitum. Realizar o estudo após os ratos se aclimatarem por 6 dias.
- Anestesiar o rato com isoflurano a 3% a 0,6 L/min de fluxo de ar em caixa de indução até que este não responda ao pinçamento da pata ou cauda. Manter a vazão por 30 s.
OBS: Não foram utilizadas medicações para dor, pois interfeririam na resposta do rato nas avaliações neurocomportamentais.
2. Configuração pré-operatória
- Posicione uma esponja com um valor de dureza de 35D (peso de 35 kg/m3 de esponja), com comprimento e largura idênticos, mas uma espessura de 12 cm, dentro de uma caixa de acrílico (15 cm x 22 cm x 43 cm) sem tampa superior.
- Cortar uma folha de estanho (uma espessura de 20 μm) e fixá-la na caixa de acrílico usando fita adesiva para formar uma superfície destrutível capaz de suportar o peso de um rato. Além disso, marque uma linha de corte medindo aproximadamente 10 cm para ser o local designado para o posicionamento da cabeça do rato.
- Com o auxílio de um suporte de ferro, fixe firmemente o tubo de PVC no lugar. Prepare um peso perfurado, pesando 550 gramas com um diâmetro de 18 milímetros. Fixe o peso a uma linha de pesca a uma altura de 1 metro dentro de um tubo de policloreto de vinila ou PVC. e ajuste a posição do tubo guia 3 centímetros acima da folha de estanho.
- Prepare um capacete e um travesseiro. Faça um capacete usando um disco de aço inoxidável medindo 10 mm de diâmetro e 3 mm de espessura. Prepare um travesseiro de esponja em forma de cunha para colocar sob a cabeça do rato, garantindo que ele esteja perpendicular à direção da gravidade.
NOTA: Um diagrama esquemático do aparelho de impacto é apresentado na Figura 1. O capacete serve para identificar o local do impacto e melhorar a distribuição da força externa. O travesseiro é utilizado para garantir danos uniformes e estáveis.
3. Indução de mTBI
- Coloque rapidamente o rato anestesiado em seu peito sobre o papel alumínio.
NOTA: Dois operadores são necessários para a indução do mTBI - um para a preparação e o outro para a verificação. - Modo de preparo: Coloque o travesseiro embaixo do rato, garantindo que sua cabeça fique paralela ao papel alumínio. Alinhe o capacete com as orelhas do rato e fixe-o no lugar.
- Verificação: Verifique se o tubo de PVC está posicionado diretamente acima do capacete. Depois que ambos os operadores confirmarem a configuração correta, vá para a próxima etapa.
- Indução da rotação da cabeça: Solte o peso, permitindo que ele caia e atinja a cabeça do rato, induzindo uma queda sobre a esponja e uma rotação de 180°.
- Coloque o rato de costas em uma gaiola limpa.
4. Indução simulada
- Trate o rato da mesma forma que a descrição anterior da indução do mTBI, mas não o submeta ao impacto da cabeça.
5. Procedimento de validação: avaliações neurocomportamentais agudas
OBS: As seguintes avaliações foram modificadas com basenos Escores de Severidade Neurológica9 e no protocolo de Flierl et al.10. Todas essas avaliações foram realizadas 10 min após o rato recuperar o reflexo de retificação.
- Tempo de perda de consciência: Registre a duração desde quando o rato está anestesiado até quando ele recupera o reflexo de endireitamento.
NOTA: O reflexo de retificação é o processo no qual o rato vira quando colocado de costas. A perda do reflexo de retificação deve ser considerada como um desfecho humano, e o animal deve ser sacrificado de acordo com as diretrizes institucionais. - Primeiro tempo de comportamento de busca: Registre a duração desde quando o rato é anestesiado até quando ele mostra o comportamento de busca pela primeira vez.
OBS: Buscar comportamento é um sinal de interesse pelo ambiente, uma resposta fisiológica. - Capacidade de escapar
- Coloque o rato no meio de um aparelho circular (0,5 m de diâmetro e 0,3 m de altura) com uma saída (12,5 cm de comprimento e 9 cm de largura).
- Registre o tempo que o rato leva para sair do círculo.
NOTA: Se o rato não sair do círculo dentro de 180 s, registre o tempo como 180 s.
- Teste de habilidade de equilíbrio de feixe
- Coloque o rato em uma viga de 3 cm, 2 cm e 1,5 cm de largura por 1 min de acordo.
- Se o rato mantiver um equilíbrio com uma postura firme na trave, marque-o como 0.
- Se o rato agarrar o lado da trave, dê uma pontuação de 1. Se o rato abraçar a trave e um membro cair dela, marque-a como 2.
- Se o rato abraçar a trave e os dois membros caírem dela ou girarem sobre ela (>60 s), marque-a como 3.
- Se o rato tentar se equilibrar na trave, mas cair (> 40 s), marque-o como 4.
- Se o rato tentar se equilibrar na trave, mas cair (>20 s), marque-o como 5.
- Se o rato não tentar se equilibrar ou se pendurar na trave e cair dentro de 20 s, marque-o como 6.
NOTA: O ensaio de balanceamento de feixe não requer um pré-ensaio.
6. Procedimento de validação: Avaliação do neurocomportamento
NOTA: Antes dos experimentos comportamentais, os ratos foram manuseados por 2 min diariamente por 3 dias consecutivos para minimizar o estresse e a interrupção da novidade. Todos os experimentos comportamentais foram realizados colocando-se os animais no ambiente de teste por 60 min antes do início do experimento.
- Capacidade de coordenação motora (tarefa de feixe)
- Arranjo experimental
- Coloque os ratos em uma das extremidades da viga de equilíbrio (1,5 m de comprimento e 75 cm acima do chão). Coloque uma caixa de escape (uma gaiola de cama inclinada) na outra extremidade.
- Posicione um acolchoamento de espuma abaixo da viga para mitigar o risco potencial de lesões em ratos em caso de quedas durante o teste.
- Ligue a câmera de vídeo.
- Agende dias de teste em momentos específicos pós-lesão ou pós-tratamento simulado (por exemplo, dia 1, dia 3 e dia 7).
- Fase de treinamento (2 dias)
- Treine os ratos para cruzar a viga de 4 cm de largura 3 vezes consecutivas, seguida de duas tentativas na viga de 2 cm de largura.
- Durante o treinamento, guie suavemente os ratos através da viga até que eles possam atravessá-los facilmente sem interferência.
- Experimento de viga de equilíbrio
- Coloque os ratos sobre a viga de 2 cm de largura por 5 tentativas consecutivas.
- Registre o início e o fim de cada tentativa quando o nariz do rato cruzar as linhas de partida e chegada, respectivamente.
- Retorne os ratos para suas gaiolas no final do experimento.
- Teste basal
- Realizar o experimento do feixe de equilíbrio antes da lesão ou tratamento.
- Calcule os valores médios destes 5 ensaios consecutivos para estabelecer a linha de base para cada rato.
- Análise de dados
- Analise o tempo para atravessar a viga e o número total de deslizamentos do retropé usando análise de vídeo por pesquisadores cegos para as condições experimentais.
- Arranjo experimental
- Ansiedade (teste de campo aberto)
- Arranjo experimental
- Prepare a arena de campo aberto, certificando-se de que está limpa e livre de quaisquer sinais de odor anteriores. Divida a arena em três zonas: uma zona interna central (33 cm x 33 cm), uma zona do meio (66 cm x 66 cm) e uma zona externa.
- Fase de testes
- Coloque um rato no centro da arena de campo aberto e inicie o cronômetro. Permita que o rato explore a arena por 5 minutos livremente. Após 5 min, retorne o rato com cuidado e delicadeza à sua gaiola doméstica.
- Recolha de dados
- Meça a distância total percorrida pelo rato durante o período de exploração de 5 minutos. Determine o tempo que o rato passa nas zonas interna, média e externa central.
- Análise de dados
- Use a distância total percorrida como uma medida do comportamento exploratório global e da habilidade locomotora. Calcule o tempo gasto na zona interna central como um indicador de respostas semelhantes à ansiedade.
- Arranjo experimental
- Habilidades de aprendizagem e memória (teste do labirinto aquático de Morris)
- Certifique-se de que o aparelho do labirinto aquático está em condições adequadas. Tinga a água de preto e coloque pistas nas quatro direções cardeais. Posicione a plataforma 2,5 cm abaixo da superfície da água.
- Montar um sistema de monitoramento para registrar e observar o comportamento dos ratos.
- Dia da trilha
- Coloque rapidamente o rato no labirinto aquático. Se o rato não conseguir alcançar a plataforma dentro de 2 min, guie-o suavemente usando o bastão de madeira.
- Permita que o rato se familiarize com o ambiente do labirinto enquanto estiver na plataforma por 20 s e, em seguida, remova-o. Uma vez que o rato está na plataforma, deixe-o ficar por 20 s e, em seguida, remova-o.
- Repetição diária
- Repita o procedimento do dia de treino, colocando o rato na água de diferentes quadrantes. Repita a etapa 6.3.3. Continue o treinamento por 5 dias consecutivos.
- Dia do teste da sonda: No6º dia, remova a plataforma e coloque o rato no mesmo quadrante por 2 min.
- Observação e registro: Utilizar o sistema de monitoramento para monitorar o comportamento do rato nos dias de teste e teste de sonda.
- Limpeza: Depois de remover o rato do labirinto aquático, use uma toalha para secá-lo completamente.
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Representative Results
O aparelho utilizado neste trabalho foi uma versão modificada do modelo de Kane e do modelo pediátrico de Richelle Mychasiuk11,12. Neste estudo, ratos SD foram alocados em grupos sham e mTBI. Para demonstrar a reprodutibilidade desse modelo, realizamos três réplicas independentes desse modelo juntamente com a avaliação neurocomportamental aguda, com cada experimento envolvendo 8-12 ratos. Neste estudo, foram utilizados mais de 30 ratos com TCEm, sendo que 2 ratos apresentaram mortalidade por anestesia. No entanto, nenhum rato sucumbiu à lesão cerebral durante o experimento. Os resultados desses experimentos são apresentados na Figura 2. Além disso, foram realizadas avaliações neurocomportamentais durante as fases aguda e subaguda (Figura 3, Figura 4 e Figura 5).
Resultados da avaliação neurocomportamental aguda
Todas essas avaliações foram realizadas após anestesia/impacto 0 min (tempo de perda de consciência e tempo de comportamento de primeira busca) ou 10 min (saída do círculo e balanço do feixe), respectivamente.
Como mostrado na Figura 2A, ratos com TCEm passaram significativamente mais tempo se recuperando da inconsciência, o que está de acordo com os resultados obtidos em estudos anteriores12,13. O comportamento de busca em ratos, considerado uma atividade fisiológica normal, exibiu um aumento estatisticamente significativo no período de recuperação dentro do grupo TCEm (Figura 2B). Esse achado sugere que os ratos com TCEm necessitaram de uma duração maior para recuperar suas habilidades de locomoção, olfato, sondagem tátil e varredura ambiental.
O teste do círculo existente substituiu os testes sensoriais originais no escore de gravidade neurológica, que anteriormente dependia de observações subjetivas dos examinadores, como os testes de colocação e proprioceptivos. Os ratos com TCEm passaram um tempo significativamente maior saindo do círculo em comparação com os ratos simulados (Figura 2C). A análise estatística utilizando ANOVA two-way para o tempo de saída do círculo mostrou um efeito principal significativo da lesão (F [1, 36] = 21,29, p < 0,0001), indicando uma diferença entre os grupos mTBI e sham. No entanto, diferentes ensaios não tiveram efeito significativo (F [2, 36] = 0,1396, p = 0,87).
Os resultados do teste de balanço de feixe foram analisados por meio de ANOVA two-way, seguida de comparações múltiplas de Bonferroni para diferenças entre médias entre os grupos (Figura 2D). Houve um efeito global significativo da lesão em todas as tarefas de feixe largo (3 cm: F = 13,89, p < 0,001; 2 cm: F = 42,7, p < 0,001; 1,5 cm: F = 27,25, p < 0,001), indicando que os ratos com TCEm exibiram prejuízo no equilíbrio em comparação com os ratos sham após 10 min após o impacto. De acordo com três experimentos repetidos independentes, o feixe de equilíbrio de 2 cm e 1,5 cm de largura apresentou melhor discriminação entre os grupos sham e mTBI do que o feixe de 3 cm de largura.
Resultados da avaliação do neurocomportamento
A habilidade de coordenação motora foi avaliada por meio da tarefa de feixe em 1 dia pré-anestesia/lesão e 1 dia, 3 dias e 7 dias pós-anestesia/lesão (Figura 3). O número total de deslizamentos de membros posteriores (Figura 3A) foi analisado por ANOVA bidirecional medida repetidamente, e comparações múltiplas de Bonferroni mostraram que os ratos com TCEm apresentaram significativamente mais deslizamentos de membros posteriores no dia 1 pós-lesão em comparação com ratos sham (Figura 3A; p < 0,01). No entanto, após uma recuperação de 2 dias, não foram observadas alterações nos erros posteriores, com um número total de deslizes retornando aos níveis simulados após 7 dias. Notavelmente, todos os ratos com TCEm apresentaram mais deslizamentos de membros posteriores pós-impacto do que seu desempenho basal. O leve aumento dos escorregamentos dos membros posteriores em ratos sham pode estar associado à falta de prática do feixe de equilíbrio. No 1 dia e 3 dias pós-lesão, os ratos com TCEm passaram mais tempo atravessando o feixe de 150 cm (39,8 s ± 3,79 s vs. 28,68 s ± 0,82 s, 37,06 s ± 4,06 s vs. 29,28 s ± 3,42 s), embora não tenha havido diferenças entre ratos com TCEm e ratos sham no tempo necessário para atravessar o feixe em todos os momentos (Figura 3B).
Não houve diferenças significativas na distância percorrida entre os grupos sham e mTBI (Figura 4A). O comportamento ansioso foi avaliado medindo-se o tempo gasto na zona central durante o teste de campo aberto. Tanto 3 dias quanto 7 dias após a lesão, os ratos mTBI exibiram uma redução significativa no tempo gasto na zona central em comparação com os ratos sham. Esse achado indica que os ratos com TCEm apresentaram níveis mais altos de comportamento semelhante à ansiedade após o impacto em 7 dias (Figura 4B,C).
Os resultados dos dias de aprendizado do labirinto aquático de Morris revelaram que os ratos com TCEm necessitaram de mais tempo para localizar a plataforma oculta do que os ratos simulados, indicando prejuízo no aprendizado espacial e na memória no grupo TCEm (Figura 5). Posteriormente, durante o teste de sonda, os ratos com TCEm exibiram déficits na retenção de memória espacial, como evidenciado por gastar menos tempo procurando a plataforma removida. Notadamente, não foi observada diferença significativa na velocidade de nado entre os grupos sham e mTBI, corroborando os achados consistentes observados na análise da distância percorrida no teste de campo aberto. Esses resultados sugerem que o impacto não teve um efeito discernível sobre a função locomotora espontânea.
Figura 1: Aparelho de impacto para TCEm em ratos. (A) A vista superior e a vista lateral do travesseiro e do capacete na posição relativa da cabeça do rato. A linha pontilhada vermelha mostra a posição do capacete. (B) Imagem de todo o conjunto mostrando um tubo guia vertical para o peso caído posicionado acima do estágio do rato e esponja coletora. (C) Uma imagem capturada de um vídeo de impacto que mostra a rotação de 180° do rato após o impacto da cabeça e a subsequente aceleração/rotação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Resultados da avaliação neurocomportamental aguda após ratos com TCEm simulados, repetidos três vezes de forma independente. (A) Aumento significativo do tempo de perda de consciência após a descontinuação da anestesia em ratos que receberam um mTBI em comparação com ratos sham. Houve efeito significativo de grupo (P < 0,0001, ANOVA two-way), mas nenhum efeito de tempo significativo (P = 0,6226) ou interação grupo x tempo (P = 0,5803). (B) ratos com TCEm apresentaram seu primeiro comportamento de busca após a anestesia. (C) Ratos sham passaram menos tempo escapando do círculo de 60 cm (*p < 0,01, **p < 0,001, teste t não pareado). (D) O desempenho no escore de equilíbrio de vigas de 3 cm, 2 cm e 1,5 cm de largura. Os resultados das comparações múltiplas de Bonferroni para cada grupo são apresentados nas figuras. Dados apresentados como média ± erro padrão da média. N = 8-12 ratos foram utilizados por experimento. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Desempenho da tarefa do feixe antes do impacto e após o impacto no dia 1, dia 3 e dia 7. (A) Os ratos com TCEm apresentaram mais escorregões nos membros posteriores no dia 1 pós-lesão (*p < 0,001, ANOVA de 2 vias medida repetidamente). (B) O tempo médio de travessia dos ratos simulados é menor do que o dos ratos com TCEm. Dados apresentados como média ± erro padrão da média (N = 6/grupo). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Realização do teste de campo aberto no dia 1 pré-lesão e no dia 1 pós-lesão, dia 3, dia 7 e dia 14. (A) Não houve diferença entre ratos sham e mTBI na distância percorrida. (B) os ratos com TCEm permaneceram menos tempo no centro do que os ratos sham nos dias 3 e 7 (*p < 0,01, **p < 0,001, ANOVA de 2 vias medida repetidamente), sem diferenças aparentes no dia 1 pré-lesão e no dia 1 e 14 pós-lesão. (C) Mapa de rastreamento de ratos com TCEm no dia 1, dia 3, dia 7 e dia 14 pós-TCEm. Os dados apresentados como média ± erro padrão da média (N = 6-10/grupo). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: O desempenho no labirinto aquático de Morris. (A) Não houve diferença na velocidade no teste de habilidade de natação entre os ratos sham e mTBI. (B) Latência para a plataforma oculta da tarefa de memória de referência no dia da avaliação. (C) Os ratos cruzaram a plataforma mais vezes no teste de sonda de 2 min após 5 dias de teste. Sham (5,14 ± 0,65) vs. mTBI (3,56 ± 0,6), (*p < 0,01, teste t não pareado). Os dados apresentados como média ± erro padrão da média (N = 9/grupo). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Este modelo simula com sucesso um TCEm de cabeça fechada sem a necessidade de incisão do couro cabeludo ou abertura do crânio, fornecendo uma representação mais precisa do cenário de impacto observado em casos humanos. Evitar a incisão do couro cabeludo ajuda a prevenir respostas inflamatórias que podem não se alinhar com a situação real. Em comparação com o modelo pediátrico de Richelle Mychasiuk12, o modelo usado neste estudo é especificamente adaptado para ratos adultos pesando entre 280-320 g, permitindo-nos obter informações valiosas sobre os efeitos do TCEm em indivíduos adultos. Além disso, a incorporação de componentes-chave, como travesseiro e capacete, facilita a entrega de força de impacto mais uniforme e auxilia o operador a identificar com precisão a área alvo para impacto.
É importante ressaltar que o procedimento de impacto em ratos foi realizado sem manutenção anestésica, de modo que a profundidade da anestesia foi confirmada antes de iniciar o impacto. Garantimos que os ratos não tivessem resposta agitando suavemente a caixa de indução anestésica e estendendo o tempo de anestesia por mais 30 s para garantir um nível adequado de anestesia. Recomenda-se completar todo o processo de impacto dentro de 1 min.
O aparato de impacto descrito neste estudo é relativamente fácil de construir e pode ser replicado em praticamente qualquer laboratório usando as especificações fornecidas. Isso promove maior padronização e comparabilidade dos dados experimentais em diferentes cenários de pesquisa. Além disso, os dados de validação obtidos neste estudo servem como um recurso valioso para os pesquisadores abordarem questões científicas específicas. Ao analisar os resultados neurocomportamentais observados neste estudo, os pesquisadores podem tomar decisões informadas e adaptar a abordagem experimental para se alinhar com seus objetivos específicos de pesquisa. Isso aumenta a qualidade geral e a relevância de estudos futuros sobre TCEm e facilita avanços em nossa compreensão de seus mecanismos subjacentes e desfechos associados.
Este estudo envolveu exclusivamente ratos machos para ou implementando o modelo de TCEm de cabeça fechada. Dadas as pesquisas anteriores que indicam variações específicas do sexo no comportamento ansioso e sintomas cognitivos e somáticos persistentes relacionados ao TCEm14,15, estudos futuros devem ser realizados em roedores fêmeas.
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Disclosures
Os autores não têm interesse financeiro a divulgar.
Acknowledgments
Queremos agradecer a todos os bolsistas do Departamento de Animais de Laboratório da Universidade Central Sul. Este estudo foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (No. 81971791); Shanghai Key Lab of Forensic Medicine, Key Lab of Forensic Science, Ministério da Justiça, China (Academia de Ciências Forenses) (No. KF202104).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acrylic box | In-house | N/A | 15 cm x 22 cm x 43 cm |
| Anesthesia Machine | RWD Life Science Co. | R540 Mice & Rat Animal Anesthesia Machine | |
| Helmet | In-house | N/A | Stainless-steel disk measuring 10 mm in diameter and 3 mm in thickness |
| Morris water maze | RWD Life Science Co. | Diameter 150 cm, height 50 cm,platform diameter 35 cm | |
| Open field | RWD Life Science Co. | 63007 | Width100 cm, height 40 cm |
| Panlab SMART V3.0 | RWD Life Science Co. | SMART v3.0 | |
| Perforated weight | In-house | N/A | Weight of 550 g and diameter of 18 mm |
| Pillow | In-house | N/A | Wedge-shaped sponge to place beneath the rat's head |
References
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