Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Højkvalitets hjerne- og knoglemarvskerneforberedelse til enkeltkerner multiomassays

Published: December 22, 2023 doi: 10.3791/65715
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1, 1,3, 1
1Cytometry and Biomarkers UTechS, C2RT, Institut Pasteur, Université Paris Cité, 2Microenvironment and Immunity Unit, Institut Pasteur, Université Paris Cité, INSERM U1224, 3Istituto Superiore di Sanità

Summary

Succesen med enkeltcelle/enkeltkerner transkriptomics og multi-omics afhænger i høj grad af kvaliteten af celler/kerner. Derfor skal isolering af celler / kerner fra væv og deres oprensning være stærkt standardiseret. Denne protokol beskriver fremstillingen af kerner fra hjernen og knoglemarven til nedstrøms enkeltkerne multiomassay.

Abstract

Enkeltcelleanalyse er blevet den valgte tilgang til at afsløre kompleksiteten af biologiske processer, der kræver vurdering af variabiliteten af individuelle cellulære reaktioner på behandling eller infektion med enkeltcelleopløsning.

Mange teknikker til encelle molekylær profilering er blevet udviklet i løbet af de sidste 10 år, og flere dedikerede teknologier er blevet kommercialiseret. Den 10X Genomics dråbebaserede enkeltcelleprofilering er en udbredt teknologi, der tilbyder brugsklare reagenser til transkriptomisk og multiomisk enkeltcelleprofilering. Teknologien omfatter arbejdsgange til enkeltcelle- og enkeltkerne-RNA-sekventering (henholdsvis scRNA-Seq og snRNA-Seq), scATAC-Seq, enkeltcelleimmunprofilering (BCR/TCR-sekventering) og multiome. Sidstnævnte kombinerer transkriptionel (scRNA-Seq) og epigenetisk information (scATAC-Seq), der kommer fra den samme celle.

Kvaliteten (levedygtighed, integritet, renhed) af enkeltcelle- eller enkeltkernesuspensioner isoleret fra væv og analyseret ved hjælp af en af disse tilgange er afgørende for at generere data af høj kvalitet. Prøveforberedelsesprotokollerne bør derfor tilpasses de særlige forhold, der gør sig gældende for hvert biologisk væv, og sikre, at der dannes celle- og kernesuspensioner af høj kvalitet.

Denne artikel beskriver to protokoller til forberedelse af hjerne- og knoglemarvsprøver til downstream multiome 10X Genomics-pipelinen. Protokollerne udføres trinvis og dækker vævsdissociation, cellesortering, kerneisolering og kvalitetskontrol af forberedt kernesuspension, der bruges som udgangsmateriale til celledeling og stregkodning, biblioteksforberedelse og sekventering. Disse standardiserede protokoller producerer kernebiblioteker af høj kvalitet og robuste og pålidelige data.

Introduction

I mange år har enkeltcelleteknikker været guldstandarden til analyse af biologiske processer. De var oprindeligt begrænset til enkeltcellefænotypning gennem mikroskopi, flowcytometri og lignende assays. Et gennembrud inden for enkeltcelleanalyse kom med udviklingen af tilgange til enkeltcellemolekylær profilering, især enkeltcelle RNA-sekventering (scRNA-Seq), der muliggjorde karakterisering af hele transkriptomet af individuelle celler. Meget kraftfuld, scRNA-Seq genererer information om transkriptionsstatus for en celle i en bestemt tilstand og tid. Det giver dog ikke synlighed om genreguleringen, der driver transkription, eller om de molekylære modifikationer, der opstår over tid. For at overvinde denne begrænsning er der investeret mange bestræbelser i udviklingen af enkeltcelle multi-omics-assays, der muliggør analyse af flere faktorer og processer fra den samme celle 1,2,3,4. Den første vellykkede måling af to modaliteter inden for enkeltceller kom ved at forbinde multiplexoverfladeproteinekspressionsmønstre med det fulde transkriptom af individuelle celler i CITE-Seq-tilgangen5. Nyere evolutioner kombinerer genekspression med kromatintilgængelighed (Assay for Transposase-Accessible Chromatin ved hjælp af sekventering, ATAC-Seq) og fanger derved samtidig transkriptomiske og epigenomiske modaliteter i de samme celler (f.eks. sci-CAR)6. De første kommercielle løsninger, der tillod at forbinde transkriptomik med cellefænotype eller med epigenetiske ændringer af den samme celle, kom fra 10X Genomics.

Forsøg med encellede molekylære profilering indeholder følgende trin: (1) vævsdissociation eller fremstilling af encellede suspensioner; 2) cellerensning og/eller kerneisolering (3) opdeling og stregkodning; 4) bibliotekskonstruktion og kvalitetskontrol 5) næste generations sekventering (6) dataanalyse. Mens trin (3)-(6) kan variere betydeligt afhængigt af den anvendte teknologi, er de indledende trin generelt fælles for dem alle. Kvaliteten af den fremstillede celle/kerner suspension vil bestemme det samlede resultat af forsøget. Afhængigt af vævstypen kan det være udfordrende at opnå højkvalitets enkeltcelle / kernesuspensioner. De særlige forhold ved nogle væv, såsom hjertet, musklen, hjernen, lungen, tarmen og andre, kræver metoder til vævsforstyrrelse og kerneisolering tilpasset hver type prøve for at garantere produktionen af kerner af høj kvalitet til molekylær analyse 7,8,9,10 . Vævsforstyrrelsesmetoderne og dissociationsprotokollerne kan være mekaniske, enzymatiske (f.eks. En blanding af collagenaser og DNase) eller en kombination af de to og kan udføres manuelt eller med instrumenter (f.eks. Qiagen DSC-400, gentleMACS).

Enkeltcelleteknikker er blevet et valg af værktøj til biomedicinsk forskning. I neurobiologi kræver cellediversiteten i hjernen og kompleksiteten af deres funktioner analyse med høj opløsning og høj gennemstrømning til visualisering af sjældne cellepopulationer og til vurdering af deres heterogenitet 11,12,13,14. Sammenkædning af cellulær identitet og genregulerende mekanismer i individuelle celler giver indsigt i hjernens udvikling og fysiologi. Et andet eksempel er undersøgelser af immunrespons i forbindelse med infektiøse, autoimmune eller kræftsygdomme, som er stærkt afhængige af enkeltcelleanalyser. Heterogeniteten af immuncelleundergrupper og kompleksiteten af deres aktivitet og interaktioner med andre celletyper kræver enkeltcelleopløsning ved dechifrering af mekanismerne bag immunrespons. Immuncellerne stammer fra knoglemarven, hvor hæmatopoietiske forfædre består af gradvist differentierende celler, der erhverver og mister celleoverflademarkører gennem en trinvis proces, inden knoglemarven forlader hjemmet i periferien. Enkeltcelleanalyse giver mulighed for minutkarakterisering af cellulære udviklingsstadier. Det kan opnås gennem enkeltcellefænotypning, konventionelt udført ved multiparameterflowcytometri. Imidlertid har enkeltcelle transkriptomiske signaturer vist sig at afsløre en mere præcis identifikation af stamcelleundertyper, da disse celler fordeles i klynger, der falder ind i hinanden og derfor kan fejlidentificeres, når der anvendes en grov celleoverflademarkørmetode15. Et stigende antal undersøgelser afdækker de epigenetiske modifikationer, som hæmatopoietiske stamceller og stamceller (HSPC'er) kan erhverve ved eksponering for forskellige midler, hvilket fører til en betydelig indvirkning på immunsystemets langsigtede responsivitet 16,17,18,19. De nye multi-omics-teknologier gør det muligt at studere disse processer med enkeltcelleopløsning.

Mange protokoller for celle- og kerneisolering er blevet beskrevet for hjerne 11,20,21,22 og knoglemarvsprøver 23,24. For at minimere bias på grund af eksperimentel variabilitet er det nødvendigt at validere optimerede enkeltkerneforberedelsesprotokoller til fælles enkeltcelletranskriptomisk og epigenomisk sekventering og derved sikre reproducerbarheden af enkeltcellede multiomiske assays.

Her beskrives to robuste protokoller for kernepræparation fra (1) friskfrosset hjernevæv og (2) frisk knoglemarv HSPC'er til nedstrøms enkeltcelle Multiome-analyse (figur 1).

Figure 1
Figur 1: Skematisk gengivelse af protokoller for kerneisolering fra friskfrosset hjerne- og knoglemarvsvæv. Klik her for at se en større version af denne figur.

Protocol

Forsøgsprocedurerne blev udført under streng overholdelse af protokoller godkendt af Komitéen for Etik i Dyreforsøg (CETEA). Til isolering af hjernekerner blev der anvendt 3 måneder gamle C57BL/6-mus. Til knoglemarvsisolering blev der anvendt 8 uger gamle C57BL/6J-hunmus, der vejede 18 g.

1. Oprensning af kerner fra musehjerne

BEMÆRK: Brug altid latex- eller nitrilhandsker under proceduren. Det anbefales kraftigt at have to personer, der udfører eksperimentet, at få trin 1 til 3 (dvs. forberedelse af suspensionen med en enkelt kerne) udført af en person og trin 4 (dvs. forberedelse af sortereren) udført parallelt af en anden person. Da protokollen er meget tidsfølsom, er det afgørende at minimere prøvebehandlingstiden ved at have sortereren klar, så snart suspensionen med enkelte kerner er klar.

  1. Fremstilling af reagenser og materialer
    1. Steriliser forsigtigt dissektionsværktøjerne med autoklave (ved 121 °C i 20 min) og vask dem med ethanol 70% lige før brug. Tilbered en petriskål pr. prøve, fyldt med 2-3 ml iskold 1x Dulbeccos fosfatbufferede saltvand (DPBS).
    2. Mikrocentrifugen afkøles til 4 °C, fyldes en spand med is, og glasdouncehomogenisatoren lægges på is.
    3. Forbered kernelysebuffer ved at tilsætte digitonin til en slutkoncentration på 0,01%, 10 ml pr. Prøve.
    4. Forbered farvningsbufferen ved at tilsætte RNase-hæmmere til cellefarvningsbufferen for en slutkoncentration på 0,2 U / μL, 20 ml pr. Prøve.
    5. Forbered DPBS 0,04% BSA ved at tilsætte RNase-hæmmere til en slutkoncentration på 0,2 E / μL, 2 ml pr. Prøve.
    6. Forbered 1 ml fortyndet kernebuffer i henhold til Multiome-protokollen25.
    7. Opbevar alle reagenser og prøver på is.
  2. Dissektion af væv
    1. Ofre mus ved hjælp af protokoller godkendt af institutionen. I denne protokol blev musene halshugget efter en overdosis ketamin/xylazin.
    2. Klip musehovedet med en saks og fjern hjernen fra kraniet som beskrevet i Meyerhoff et al.26. Overfør straks hjernen til en petriskål tilberedt med det iskolde 1x DPBS under et lysdiode (LED) -oplyst stereomikroskop.
    3. Skær hjernevævet med en skalpel for at adskille hjerneområder af interesse (f.eks. Entorhinal cortex, hippocampus, præfrontale cortex) og overfør hver region til en separat petriskål, der indeholder iskold 1x DPBS. Hold på is.
    4. Med en skalpel hakkes vævet i stykker på <0,5 cm for at lette homogeniseringen i det følgende trin.
    5. Med en P1000 mikropipette overføres hakket væv og 1x DPBS fra petriskålen til et 1,5 ml rør. Sørg for at bruge rør lavet af protein-lavbindende plast. Lad vævsstykkerne adskille sig ved tyngdekraften. Fjern forsigtigt overskydende 1x DPBS ved hjælp af en P1000 mikropipette.
      BEMÆRK: Efter dette trin er det muligt at snapfryse det hakkede væv ved at overføre proteinrørene med lav binding til tøris og derefter opbevare ved -80 °C, indtil der fortsættes med kerneisolering.
  3. Isolering af kerner
    1. Fyld glasducen med 2 ml iskold kerner lysisbuffer med 0,01% digitonin. Tilsæt vævsstykkerne i dounce.
      BEMÆRK: Hvis du arbejder med friskfrosset væv, tilsættes hakket frosset væv direkte til kernernes lysbuffer 0,01% digitonin; Lad ikke vævet tø op før.
    2. Homogeniser ved hjælp af en glasdounce vævshomogenisator 25 gange med støder A og derefter 25 gange med støder B. Overfør homogenatet til et 15 ml rør.
    3. Tilsæt yderligere 2 ml iskold kerner lysebuffer med 0,01% digitonin og inkuber på is i 5 min. Centrifuger kerner ved 500 x g i 5 minutter ved 4 °C.
    4. Supernatanten fjernes med en mikropipette og tilsættes 4 ml iskolde kerner med 0,01% digitonin. Inkuber på is i 5 min og filtrer gennem en 40 μm cellesi.
    5. Centrifuger kernerne ved 500 x g i 5 minutter ved 4 °C, og supernatanten fjernes med en mikropipette.
    6. Der tilsættes 4 ml farvningsbuffer for at vaske kernerne og centrifugeres ved 500 x g i 5 minutter ved 4 °C. Supernatanten fjernes med en mikropipette og opslæmmes pelletten igen i 4 ml farvningsbuffer.
    7. Der filtreres gennem en 40 μm cellesi og centrifugeres ved 500 x g i 5 minutter ved 4 °C. Resuspender i 1 ml PBS med 0,04% BSA.
    8. Tæl kerner for at sikre konsistens af væv/kernepræparat på tværs af forskellige prøver. Det forventes at opnå lignende kernetal fra de samme hjerneområder:
      1. Tilsæt 10 μL 0,4% trypanblå til et tomt 0,5 ml rør. Der tilsættes 10 μL kerner og blandes 5x ved pipettering.
      2. Tæl kerner ved hjælp af en automatiseret celletæller efter leverandørens anbefalinger. Hold kernerne på is.
    9. Forbered kerner til sortering.
      BEMÆRK: De ekstraherede kerner indeholder 7-AAD, og denne farvning bruges til deres oprensning ved fluorescensaktiveret cellesortering (FACS).
      1. Overfør 100 μL kerner til et FACS-rør til den ufarvede kontrol. Der tilsættes 10 μL 7-AAD til de resterende kerner, og 5 minutter opbevares ved 4 °C.
      2. Sorter mindst 0,5 x 106 kerner efter FACS for at fjerne dubletter og snavs.
  4. Kernesortering ved hjælp af en FACS
    BEMÆRK: Mens kernesortering kan udføres på en lang række cellesorterere, er proceduren for brug af BD FACSAria Fusion- eller BD FACSAria III-instrumenterne beskrevet her. Det anbefales kraftigt, at kalibreringen og opsætningen af cellesorteringen udføres under tilsyn eller af en erfaren bruger af instrumentet. For at reducere prøvebehandlingstiden er det afgørende at have sortereren klar, så snart suspensionen med enkelte kerner er klar.
    1. Kalibrering af FACS-instrument
      1. Tænd cellesorteringen og computeren. Når softwaren er tilsluttet instrumentet, skal du starte den flydende opstartsprocedure. Vælg Cytometer > fluidisk opstart i hovedmenuen, og følg de fire trin. Klik på Udført efter at have gennemført hver.
      2. Indsæt 70 μm dysen, tænd for strømmen, og lad strømmen stabilisere sig i 15 minutter. Juster amplitude for at få dråbedannelse, og klik på Sweet Spot.
      3. Sæt filteret med neutral densitet (N.D) 1.0, og åbn cytometeropsætnings- og sporingsgrænsefladen (CST).
      4. Daglig kvalitetskontrol: Fortynd CST-perler i FACS-medium (se leverandørens anbefalinger) og udfør CST-kontrol. Når du er færdig, skal du udskifte N.D 1.0 med N.D 2.0.
      5. Fortynd Accudrops i FACS-medium (se leverandørens anbefalinger), og udfør faldforsinkelse som beskrevet i trin 6 til 10.
      6. Vælg eksperimentet Accudrop Drop Delay i eksperimentskabelonen, og åbn sorteringslayoutet for røret.
      7. Inde i det nederste kameravindue skal du klikke på Spænding og derefter på Optisk filter for at aktivere påføring af opladning på afbøjningspladerne og brug af et specifikt optisk filter foran kameraet. Sørg for, at kvadranten på højre side angiver 100. Juster om nødvendigt den røde laserskrue for at optimere laserpåvirkningen.
      8. Juster flowhastigheden for at nå hastigheden på 1.000 til 3.000 hændelser pr. Sekund.
      9. Klik på Sorter og annuller. Sørg for, at venstre kvadrant er lig med 100, og højre kvadrant er 0. Hvis venstre kvadrant er under 95, skal du udføre Automatisk forsinkelse.
      10. Klik på Spænding og derefter Test sortering. Kontroller kvaliteten af sidestrømmene i opsamlingsrørene. Hvis det er nødvendigt, kan du justere placeringen af sidestrømmene ved at flytte skyderne.
    2. Etablering af FACS-instrument til kernesortering.
      1. Start erhvervelsen af de ufarvede kerner. Disse bruges til at definere fremad- og sidespredningerne og detektorspændingen for 7-ADD-parameteren. Indstil parametrene, så 7-AAD-signalet for den ufarvede prøve falder inden for det første årti af logskalaen på prikplottet.
      2. Start med at erhverve røret med 7-AAD-farvede kerner, og definer kernepopulationerne ved hjælp af en gating-strategi baseret på (1) FSC-A/SCC-A og derefter FSC-H/SSC-H for størrelse og granularitet, (2) FSC-H/FSC-A for dubletterdiskrimination og (3) SSC-A/7-AAD for 7-AAD-positive kerner (se figur 2A).
      3. Sørg for, at strømmen og afbøjningen er stabile.
      4. I sidestrømskameraet skal du tænde testsorteringen, spændingen ON og bekræfte den nøjagtige faldsortering i et 1,5 ml rør monteret på venstre side.
      5. I vinduet Sorteringslayout skal du vælge den relevante population som defineret i trin 2 (ovenfor). I Målhændelser skal du vælge tærsklen i Kontinuerlig for at opnå mindst 0,5 x 106 kerner pr. prøve. Under Præcision skal du vælge 4-vejs renhed.
      6. Når du er klar, skal du klikke på Sorter og OK for at starte med kernesortering.
  5. Kvalitetskontrol og optælling af oprensede kerner
    BEMÆRK: Dette trin skal kun udføres under pilotforsøget til optimering af prøveforberedelsestrin med det formål at teste renheden af de sorterede kerner, der skal indlæses på 10X kromchippen. Når protokollen er fuldt optimeret, anbefales det ikke at udføre dette kvalitetskontroltrin i opfølgningseksperimenterne for at undgå unødvendigt spild af indsamlede kerner, der kan være tilgængelige i lavt antal.
    1. Renhedskontrol ved flowcytometri
      1. Overfør 10 μL af de sorterede kerner til et nyt FACS-rør indeholdende 90 μL DPBS med 2% varmeinaktiveret føtalt bovint serum (HI-FBS).
      2. Hent og registrer data efter sortering for at kontrollere sorteringens renhed og levedygtighed. Sørg for, at mindst 98 % af kernerne er placeret i interesseporten som defineret i 4.2 (se figur 2B).
    2. Tælling af de rensede kerner
      1. De sorterede kerner centrifugeres i 5 minutter ved 500 x g og ved 4 °C, og supernatanten fjernes forsigtigt fuldstændigt ved hjælp af en mikropipette. Resuspender i 100 μL fortyndet kernebuffer.
      2. Tilsæt 10 μL 0,4% trypanblå til et tomt 0,5 ml rør. Der tilsættes 10 μL af de sorterede kerner og blandes 5x ved pipettering.
      3. Tæl kerner ved hjælp af en automatiseret celletæller efter leverandørens anbefalinger. Kernerne justeres til 3,5 x 106/ml, dvs. 16.000 kerner pr. 5 μL.
    3. Kvalitetskontrol af oprensede kerner ved mikroskopi
      BEMÆRK: Dette trin skal kun udføres under pilotforsøget til optimering af prøveforberedelsestrin for at teste kvaliteten af kernerne, der skal indlæses på 10X kromchippen. Når protokollen er fuldt optimeret, anbefales det ikke at udføre dette kvalitetskontroltrin i opfølgningseksperimenterne for at undgå unødvendigt spild af indsamlede kerner, der kan være tilgængelige i lavt antal.
      1. Sørg for, at mikroskopglas og dæksler er rene og støvfrie. Hvis det er nødvendigt, vask og skyl dækslerne med absolut ethanol og tør dem med fnugfri servietter.
      2. Der fordeles 25 μL poly-l-lysin i de glidehuller, der skal anvendes, og inkuberes i 10 minutter ved stuetemperatur (RT), beskyttet mod støv.
      3. Det overskydende poly-l-lysin fjernes, og der tilsættes 10 μL af den oprensede kernesuspension. Inkuber i 5 minutter ved RT, beskyttet mod støv.
      4. Tilsæt en dråbe monteringsmedium til hver brønd, undgå bobler.
      5. Placer en dækseddel oven på de frøede brønde. Dæk med papirservietter, og tryk dækslet fast for at fjerne det overskydende monteringsmedium. Pas på ikke at flytte dækslet, og rengør ikke det overskydende monteringsmedium.
      6. Tag flere billeder med et omvendt mikroskop med brightfield-lys og en minimumsforstørrelse på 40x.
  6. Udfør multiome-analyse.
    1. Fortsæt straks til Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression User Guide (CG000338 - Rev F)25.

2. Oprensning af kerner fra museknoglemarv, hæmatopoietiske stamceller og stamceller (HSPC'er)

BEMÆRK Denne protokol beskriver oprensning af kerner fra tre undergrupper af knoglemarven HSPC'er: afstamning-c-Kit+Sca-1+ hæmatopoietiske stamceller (HSC), afstamning-c-Kit+Sca-1-CD34+FcγR- almindelige myeloide stamfædre (CMP) og afstamning- c-Kit+Sca-1-CD34+FcγR+ granulocyt-monocyt forfædre (GMP). Brug altid latex- eller nitrilhandsker under proceduren. Denne protokol er en tilpasning af 10X Genomics Proven Protocol - Nuclei Isolation for Single Cell Multiome ATAC + GEX sequencing (CG000365 - Rev C)27. Ændringer er blevet introduceret i den oprindelige protokol for at maksimere kernegendannelse. Det anbefales kraftigt at have to personer, der udfører eksperimentet, for at have trin 1. til 3. (dvs. fremstilling af enkeltcelleopløsningen) udført af en person, og trin 4 (dvs. forberedelse af sorteringen) udført parallelt af en anden person. Da protokollen er meget tidsfølsom, er det afgørende at minimere prøvebehandlingstiden ved at have sortereren klar, så snart enkeltcellesuspensionen er klar.

  1. Fremstilling af reagenser og materialer
    1. Fyld en spand med is.
    2. Forbered FACS-bufferen: DPBS med 2% HI-FBS-opløsning (ca. 500 ml til 6 prøver) og filtrer gennem et 0,2 μm filter.
    3. Forbered opsamlingsmediet: DPBS med 10% HI-FBS-opløsning (500 μL pr. prøve), og filtrer gennem et 0,2 μm filter.
  2. Isolering af knoglemarvsceller
    1. Ofre mus ved hjælp af protokoller godkendt af institutionen. I dette eksperiment blev musene ofret af cervikal dislokation efter en ketamin / xylazin overdosis.
    2. Sprøjt musenes mave og bagben med 70% ethanol.
    3. Brug sterile tang og saks til at lave et lille snit midt i underlivet og åbn bughinden fra bunden af bagbenene til mellemgulvet (supplerende figur 1).
    4. Lav et ekstra snit for hvert bagben vinkelret på det åbne bughinde, tag derefter fat i hver side af et af disse ekstra snit og træk det fra hinanden for at skrælle huden fra begge bagben forbi ankelleddet for at udsætte musklerne i begge bagben (supplerende figur 1A).
    5. Linj saksen langs rygsøjlen ved hofteleddet på det ene bagben for at skære benet ud uden at skære gennem lårbenet (supplerende figur 1B, C). Gentag det samme for det andet ben.
    6. For at isolere lårbenet skal du skære det meste af muskelvævet ud og derefter holde lårbenet og skinnebenet i hver hånd med fingerspidserne ved leddet (supplerende figur 1D, E). Fold forsigtigt benet mod den naturlige bøjning for at forskyde skinnebenet fra lårbenet (supplerende figur 1E), og klip derefter forsigtigt bindevævet med en saks for at adskille lårbenet og skinnebenet.
    7. Brug saksen med lette vridningsbevægelser til at forskyde rygraden fra lårbenets øverste ende (supplerende figur 1E).
    8. Rens det isolerede lårben med silkepapir for at fjerne den resterende muskel og bindevæv.
    9. Hold kold på is i en 12-brønds pladebrønd fyldt med 2 ml DMEM (1x) + GlutaMAX-I.
    10. Når alle lårbenene er samlet, skal du sikre dig, at muskel- og fibrøst væv fjernes fuldstændigt fra knoglen. Skær ikke knoglen åben for at (a) holde marven inde steril og (b) undgå at miste celler i brønden. Brug følgende trin til at skylle cellerne fra to lårben i en mus, tilpasset fra Haag og Murthy28.
    11. Forbered et 1,5 ml og et 0,5 ml rør. Tilsæt 150 μL af FACS-bufferen til 1,5 ml røret, stik derefter et hul i bunden af 0,5 ml røret ved hjælp af en 18 G nål og sæt 0,5 ml røret ind i 1,5 ml røret.
    12. Åbn den distale del af hvert lårben ved hjælp af musekirurgisk saks (supplerende figur 1F): Lås den distale epifyse mellem knivene, og tryk forsigtigt, mens du vender saksen for jævnt at løsne den distale epifyse uden at skære knoglen hårdt op. Hvis det lykkes, skal 4 fremspring være synlige i den nu eksponerede fyseende (supplerende figur 1G).
    13. De to lårben anbringes med den åbne ende nedad i det forberedte 0,5 ml rør, der er anbragt i et 1,5 ml rør indeholdende FACS-buffer (supplerende figur 1H).
    14. Anbring en 70 μm cellesi på et 50 ml rør og forvåd sien med 2 ml FACS-buffer.
    15. For at skylle knoglemarven centrifugeres rørene (hætterne åbnes) ved 12.000 x g, indtil centrifugen når 12.000 x g-værdien, og stop derefter straks centrifugen.
    16. Kontroller, at knoglemarvscellerne er pelleteret i 1,5 ml røret, og at lårbenene er hvide (før celleskylning er de røde) (supplerende figur 1I). Kassér 0,5 ml rørene med de 2 lårben.
    17. 150 μL supernatanten kasseres med en pipette.
    18. Resuspender pellet med en mikropipette i 1 ml ammoniumchlorid-kalium (ACK) lyserende buffer i 1-2 minutter ved RT for at lyse røde blodlegemer. Undgå længere inkubationstider, da de kan resultere i nedsat levedygtighed af kerneceller.
    19. Overfør til 50 ml røret gennem den forvædede 70 μm cellesi.
    20. Der tilsættes 10 ml FACS-buffer for at fortynde ACK-lyseringsbufferen, og hermed standses lysisen.
    21. Der centrifugeres ved 400 x g i 5 minutter ved 4 °C. Resuspender i 10 ml FACS-buffer ved først at resuspendere i 1 ml og derefter fylde op med 9 ml.
    22. Cellerne forberedes til tælling som beskrevet i punkt 1.3.8.
    23. Tæl cellerne ved hjælp af en automatiseret celletæller efter leverandørens anbefalinger. Det forventes at indsamle ca. 40 millioner celler fra 2 lårben.
  3. Farvning af knoglemarv HSPC
    1. Centrifuger cellerne ved 400 x g i 5 minutter ved 4 °C og resuspender pellet med en mikropipette i FACS-buffer til en slutkoncentration på 1 x 107 celler/ml.
    2. Med en P1000 mikropipette overføres suspensionen til et FACS-rør og filtreres gennem et 35 μm cellesidæksel.
    3. Forbered enkeltpletprøver reagensglas for hvert antistof, der er anført i tabel 1 , for at oprette kompensationer for fluorkromer på cellesortereren:
      1. Forbered et FACS-rør pr. antistof, og fyld glassene med 200 μL PBS.
      2. Der tilsættes 15 μL fluorkromkompensationsperler i hvert FACS-rør af fluorkromkonjugeret antistof. I FACS-rørene til ubejdsede og levende / døde enkeltfarvede celler tilsættes 500.000 celler i stedet for perler.
      3. Der tilsættes 1 μL af hvert fluorkromkonjugeret antistof (se tabel 1) i det tilsvarende FACS-rør. Tilsæt 0,5 μL levende/død plet i levende/død enkeltplet FACS-rør.
      4. Opbevares på is i 15 min beskyttet mod lys.
    4. Forbered blanding 1 og 2 som angivet i tabel 2.
      BEMÆRK: De antistofvolumener, der er angivet i tabel 2 , gælder for de antistoffer, der henvises til i materialetabellen. De skal optimeres til enhver ny antistofreference eller et andet parti af den samme antistofreference.
    5. Tilsæt 300 μL Mix 1 i prøveglasset, resuspender og opbevar i 15 minutter på is beskyttet mod lys.
    6. Tilsæt 300 μL Mix 2 i prøveglasset, resuspender og opbevar i 20 minutter på is beskyttet mod lys.
    7. Der tilsættes 3 ml FACS-buffer til de enkeltfarvede rør og de blandingsfarvede prøveglas. Spin ned ved 400 x g i 5 minutter ved 4 °C.
    8. Supernatanten kasseres forsigtigt med en mikropipette og pellettet resuspenderes i 500 μl FACS-buffer.
    9. Forbered et 1,5 ml rør fyldt med 500 μL opsamlingsmedium.
      BEMÆRK: Mix 1 fremstilles i DPBS, da det indeholder den levende/døde plet, der er væsentligt påvirket af HI-FBS. Når cellerne er farvet af Live/Dead, tilsættes Mix 2, som indeholder de fluorkromkonjugerede antistoffer resuspenderet i FACS-buffer indeholdende HI-FBS. Den eneste undtagelse er anti-CD16/32-antistoffet, der er inkluderet i antistofblanding 1 for at tjene som Fc-receptorblokker, der forhindrer den ikke-specifikke binding af de andre antistoffer, der tilsættes i det følgende trin.
  4. Cellesortering ved hjælp af en FACS
    BEMÆRK: Mens cellesortering kan udføres på en lang række cellesorterere, beskrives proceduren for brug af instrumenterne BD FACSAria Fusion eller BD FACSAria III her. Det anbefales kraftigt, at kalibreringen og opsætningen af cellesorteringen udføres under tilsyn eller af en erfaren bruger af instrumentet.
    1. Kalibrering af FACS-instrument: Se protokol 1, trin 4.1.
    2. Opsætning af FACS-instrument til cellesortering:
      1. Start erhvervelsen af de ufarvede celler. Disse bruges til at definere fremad- og sidespredningerne og detektorspændingen for hver fluorofor. Indstil parametrene, så fluorescerende signal for hver fluorofor falder inden for det første årti af logskalaen på prikplottet.
      2. Anskaf enkeltfarvekontroller for at konfigurere kompensationer manuelt (medianen af positive og negative populationer skal justeres), eller brug den automatiske beregningssoftware (hældningsmålinger). Sørg for, at kompensationskontrollerne matcher de eksperimentelle fluorkromer og detektorindstillinger. Optag 10.000 hændelser for celler og 5.000 hændelser for perler.
      3. Brug prøverøret (dvs. flerfarvede celler) til at definere cellepopulationer af interesse ved hjælp af gating-strategien vist i figur 3A. Følg trin 4-6 (nedenfor).
      4. For at identificere de tre knoglemarvs-HSPC'er af interesse (HSC, CMP og GMP) skal du starte gatingen ved at bruge størrelsen (FSC-A) og granulariteten (SSC-A) til at gate på leukocytter og derefter FSC-H / FSC-A for at diskriminere dubletter.
      5. Baseret på SSC-A / død cellemarkør, gate levende celler. Brug Afstamning/c-Kit til at vælge celler, der er afstamningsnegative og udtrykker mellemliggende til høje niveauer af c-Kit. Gennem c-Kit/Sca-1, gate på lineage-c-Kit+ Sca-1+ (LKS+) HSC'er, en af de tre populationer af interesse.
      6. Blandt de myeloide forfædre (afstamning-c-Kit+Sca-1-) skal du bruge FcγR/CD34 til at udelukke CD34-FcγR- megakaryocyt- og erythroid-stamfædre (MEP), mens CD34+ FcγR-CMP samt CD34+FcγR+ GMP inkluderes i de cellepopulationer, der skal sorteres.
      7. Sørg for, at strømmen og afbøjningen er stabil.
      8. I sidestrømskameraet skal du tænde testsorteringen, spændingen TIL og bekræfte den nøjagtige faldsortering i et 1,5 ml rør monteret på venstre side.
      9. I vinduet Sorteringslayout skal du vælge de(n) relevante population(er) (dvs. "LKS+" og "CD34+ myeloide forfædre" vist i dette eksempel). Under Enhed skal du vælge 2 Tube. Under Præcision skal du vælge Renhed. I Målhændelser skal du vælge Kontinuerlig for at sortere mellem 160.000 og 200.000 LKS+ og CD34+ myeloide forfædre.
      10. Der tilsættes 500 μL FACS-buffer til cellesuspensionen, og 1 ml af prøven overføres ved filtrering i et nyt FACS-rør med 35 μm-celle sikappe for at sikre, at alle celler er i en enkelt suspension lige før erhvervelsen. Dette eliminerer celleklumper, der kan tilstoppe instrumentet.
      11. Når du er klar, skal du klikke på Sorter og OK for at starte sorteringen. Juster flowhastigheden for at holde hastigheden under 10.000 hændelser pr. sekund.
        BEMÆRK: Det forventede forhold mellem LKS+ og CD34+ myeloide forfædre er 1:3 for en voksen (8-12 uger gammel) C57BL/6J hunmus ved steady state. De målrettede sorterede cellenumre nås normalt inden for 30 minutter efter sortering.
  5. Kvalitetskontrol og optælling af sorterede celler
    BEMÆRK: Dette trin skal kun udføres under pilotforsøget til optimering af prøveforberedelsestrin med det formål at teste renheden af de sorterede celler, der skal bruges til kerneisolering. Når protokollen er fuldt optimeret, anbefales det ikke at udføre dette kvalitetskontroltrin i opfølgningsforsøgene for at undgå unødvendigt spild af udgangsmateriale, der kan være tilgængeligt i lavt antal til kerneisolering.
    1. Renhedskontrol ved flowcytometri
      1. Overfør 10 μL af de sorterede celler til et nyt FACS-rør indeholdende 90 μL FACS-buffer.
      2. Hent og registrer data efter sortering for at kontrollere sorteringens renhed og levedygtighed. Sørg for, at mindst 95 % af cellerne vises i interesseporten, som defineret i 3-6 og illustreret i figur 3B.
  6. Kerneisolering fra sorterede knoglemarvs-HSPC'er
    1. Brug protokollen "Low Cell Input Nuclei Isolation" i tillægget fra 10X Genomics Demonstrated Protocol - Nuclei Isolation for Single Cell Multiome ATAC + GEX sequencing (CG000365 - Rev C)27, med følgende ændringer foretaget for at optimere kernegendannelse:
      1. Lysistid: Kør et piloteksperiment for denne protokol for at identificere den bedste lysistid for kerneisolering. Sørg for at opnå en komplet cellelyse, samtidig med at intakte kerner opretholdes.
        BEMÆRK: Trin f i ovennævnte 10X Genomics-protokol27 instruerer om at "inkubere [i lysisbuffer] i 3-5 minutter på is". Under pilotforsøget testes mindst 3 min, 4 minutter og 5 minutter og vurderes den genvundne kernemængde ved at tælle og kvalitet ved flowcytometri og mikroskopibilleddannelse for at vælge den optimale lysisvarighed (se beskrivelsen af disse kvalitetskontrolkontroller nedenfor). For at skåne reagenser skal du erstatte den fortyndede kernebuffer med PBS 0,04% BSA i pilotforsøget. For knoglemarv HSPC'er blev 3 min identificeret som den optimale lysisvarighed.
      2. Cellecentrifugeringer: Ved alle cellesuspensionscentrifugeringer centrifugeres ved 300 x g i 7 minutter (i stedet for 5 minutter ved CG000365 - Rev C)27 ved 4 °C.
      3. Kernecentrifugeringer: Udfør alle centrifugeringer af kerneopslæmning ved 500 x g i 5 minutter pr. CG000365 - Rev C27.
      4. Kerneopsamling: I trin b, efter resuspendering i 50 μL PBS 0,04% BSA og overførsel til et 0,2 ml rør, tilsættes 50 μL PBS 0,04% BSA til det originale rør og pipetteblanding for at opsamle eventuelle resterende celler. Overfør til 0,2 ml røret for at nå et samlet volumen på 100 μL.
      5. Fremover vil det samlede volumen være 100 μL i stedet for protokollens 50 μL. Nedstrømstrinnene justeres i overensstemmelse hermed (f.eks. fjernes 90 μL i stedet for 45 μL for trin d; for trin e tilsættes 90 μL lysisbuffer i stedet for 45 μL).
      6. I trin m resuspenderes kernepillen i 12 μL fortyndet kernebuffer i stedet for 7 μL.
      7. Tæl de isolerede kerner. I et tomt 0,5 ml rør tilsættes 10 μL 0,4% trypanblå og 8 μL PBS 0,04% BSA.
      8. Der tilsættes 2 μL kerner til røret, og tæl kernerne som beskrevet i 1.3.8. Brug en automatiseret celletæller efter leverandørens anbefalinger.
  7. Renhedskontrol ved flowcytometri
    BEMÆRK: Dette trin skal kun udføres under pilotforsøget til optimering af prøveforberedelsestrin for at teste renheden af kernerne, der skal lægges på 10X Chromium-chippen. Når protokollen er fuldt optimeret, anbefales det ikke at udføre dette kvalitetskontroltrin i opfølgningseksperimenterne for at undgå unødvendigt spild af indsamlede kerner, der kan være tilgængelige i lavt antal.
    1. Efter fuldstændig kerneisolering overføres 6 μL kerneresuspension i et nyt FACS-rør, der er fyldt med 150 μL FACS-buffer. Tilsæt 3 μL 7-AAD og inkuber i 5 minutter på is.
    2. Hent og registrer data efter sortering for at kontrollere sorteringens renhed og levedygtighed. Sørg for, at mindst 95 % af kernerne vises i interesseporten som defineret i protokol 1, trin 4.2 (se figur 4).
  8. Kvalitetskontrol af oprensede kerner ved mikroskopi:
    BEMÆRK: Dette trin skal kun udføres under pilotforsøget til optimering af prøveforberedelsestrin for at teste kvaliteten af kernerne, der skal indlæses på 10X Chromium-chippen. Når protokollen er fuldt optimeret, anbefales det ikke at udføre dette kvalitetskontroltrin i opfølgningseksperimenterne for at undgå unødvendigt spild af indsamlede kerner, der kan være tilgængelige i lavt antal.
    1. Fortsæt som beskrevet i trin 1.5.3.
  9. Udfør multiome-analyse
    1. Fortsæt straks til Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression User Guide (CG000338 - Rev F)25.

Representative Results

De to protokoller, der er beskrevet ovenfor, beskriver isoleringen af kerner startende fra to forskellige vævstyper. Forskellene og lighederne mellem de to protokoller er skematisk repræsenteret i figur 1.

Oprensning af kerner fra musehjerne
I protokollen beskrevet her foreslår vi en skånsom metode til kerneforberedelse fra hjerneprøver. Det starter med en mekanisk dissociation af hjernevævet i en lysisbuffer efterfulgt af vaske- og sifiltreringstrin, der fjerner det resterende væv fra suspensionen. Den efterfølgende fjernelse af affald, ikke-lyserede celler og små partikler opnås ved hjælp af FACS for at garantere, at kun rensede kerner indlæses til downstream Multiome-protokol. Figur 2 viser profilen af kerner før og efter sortering. Efter filtreringen og før kernesortering indeholder prøven en stor mængde affald, hvor mere end 99% af "singlets" er positive for nuklear plet (7-AAD), hvilket indikerer optimal cellelyse (figur 2A). Kerner sorteres baseret på den 7-AAD-positive port. En brøkdel af sorteret materiale erhverves for at verificere renheden af de fremstillede kerner. Figur 2B viser profilen af hjernekernerne efter sortering. Kernesorteringen tillod en stigning i kernernes renhed fra de oprindelige 36% (figur 2A) til næsten 100% (figur 2B).

Figure 2
Figur 2: Gating strategi for kernesortering og renhedstest efter sortering. Kerner blev farvet med 7-AAD og erhvervet af cellesortereren. (A) Kerner er først gated baseret på deres størrelse og granularitet (henholdsvis FSC-A og SSC-A). Enkeltpartikler vælges derefter baseret på deres FSC-A / FSC-H-egenskaber og 7-AAD-farvning. (B) Efter cellesortering testes en brøkdel af kernerne fra opsamlingsrøret for renhed ved hjælp af samme gating-strategi som i A. Klik her for at se en større version af denne figur.

Oprensning af hæmatopoietiske stamcelleprogenitorer (HSPC'er)
Ved isolering fra knoglemarven sorteres op til 2 x 105 HSPC'er efter FACS i henhold til gating-strategien vist i figur 3A. Sorteringseffektiviteten og prøvernes renhed vurderes (figur 3B).

Figure 3
Figur 3: Gating strategi til sortering af knoglemarv HSPC'er. (A) En repræsentativ FACS-gating-strategi til sortering af levedygtige LKS+ hæmatopoietiske stamceller og CD34+ myeloide stamceller til kerneisolering. B) Repræsentative FACS-afbildninger, der anvendes til verifikation af sorteret cellepopulations renhed. Vist er proportionerne af forskellige celleundergrupper i forhold til forældrepopulationen. *De to sorterede populationer. Klik her for at se en større version af denne figur.

Protokollen "Low Cell Input Nuclei Isolation" tillader kerneisolering fra prøver med maksimalt 105 celler. Det inkluderer et lavt antal centrifugeringstrin, hvorved celle / kernetab minimeres. Vi har justeret mængden af lysis og vaskebuffere proportionalt med celleindgangen og øget centrifugeringstiden for maksimal kernegenvinding. Vi har udført et pilotforsøg for at vurdere mængden af genvundne kerner ved at tælle og deres kvalitet ved flowcytometri og mikroskopibilleddannelse. Figur 4 viser HSPC-prøven efter cellelyse. Denne protokol genererede kerner af høj kvalitet, som observeret i figur 5A, uden snavs, der kunne påvirke downstream multiome-protokollen.

Figure 4
Figur 4: Renhedstestsortering af isolerede HSPC-kerner i knoglemarven. Kerner blev farvet med 7-AAD og erhvervet af cellesortereren. Kerner blev først lukket baseret på deres størrelse og granularitet (henholdsvis FSC-A og SSC-A) for at vurdere prøvens renhed. Andelen af kerner er angivet i forhold til forældrepopulationen. Klik her for at se en større version af denne figur.

Rør nummer Tube navn Plettet enhed Mængden af farvet enhed Antistof/farvestof (μL) Opsamlingsbuffer (μL)
1 Ufarvet Celler 5,00,000 NIELSEN 200
2 LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Plet Celler 5,00,000 0.5
3 APC/cyanin 7 anti-mus CD16/32 (FcγR) OneComp ePerler 15 μL 1
4 Pacific Blue anti-mus Lineage Cocktail OneComp ePerler 15 μL 1
5 PE anti-mus Ly-6A/E (Sca-1) OneComp ePerler 15 μL 1
6 APC anti-mus CD117 (c-sæt) OneComp ePerler 15 μL 1
7 FITC anti-mus CD34 OneComp ePerler 15 μL 1

Tabel 1: Enkeltpletkontroller for kompensationsindstillinger på flowcytometeret. Angivet er de krævede enkeltpletkontroller, antallet af celler eller perler, der skal farves, og antistofmængderne.

Master Mix Reagens Endelig fortynding Antistof/farvestof (μL) Buffer type Buffer (μL)
Bland 1 APC/cyanin 7 anti-mus CD16/32 (FcγR) 1/500 1.2 DPBS 300
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Plet 1/250 2.4
Bland 2 Pacific Blue anti-mus Lineage Cocktail 1/20 30 FACS-buffer 300
PE anti-mus Ly-6A/E (Sca-1) 1/200 3
APC anti-mus CD117 (c-sæt) 1/200 3
FITC anti-mus CD34 1/50 12
Samlet farvningsvolumen 600

Tabel 2: Sammensætning af farvningsblandingen til knoglemarvs-HSPC'er. Der vises mængder af reagenser, der kræves til farvning af en prøve, der indeholder 40 millioner celler. Ved farvning af et større antal prøver multipliceres det angivne volumen med det krævede antal prøver, og halvdelen af et ekstra prøvevolumen tilsættes for at sikre et tilstrækkeligt volumen af masterblandingen.

Supplerende figur 1: Protokol for isolering af knoglemarvsceller. (A) Åbn bughinden. Hvide stiplede linjer angiver den linje, der skal skæres langs. (B) Når du har skrællet huden af fra bagbenet, skal du rette saksen langs rygsøjlen ved hofteleddet for at skære benet ud uden at skære gennem lårbenet. (C) Udseendet af benet adskilt fra kroppen før fjernelse af muskler. (D) Benets udseende efter fjernelse af muskler. (E) Proceduren for adskillelse af lårbenet ved knæleddet og derefter ved hofteleddet, idet man sørger for ikke at skære lårbenet op. Hvide buede pile viser den ønskede bevægelse. Hvide stiplede pile angiver det område, der skal adskilles forsigtigt ved hjælp af en saks til at klemme af. (F) Procedure for at åbne den distale del af lårbenet (dvs. den del, der tidligere var fastgjort til skinnebenet ved knæleddet) ved sikkert at gribe brusk og distal epifyse med en saks og vende den tilbage for at udsætte knoglemarven. (G) Fire fremspring, angivet med sorte pile, skal være synlige ved den eksponerede fyseende. (H) Udseendet af et lårben med den åbne ende nedad i det forberedte 0,5 ml rør anbragt inde i et 1,5 ml rør indeholdende 150 μL FACS-buffer. (I) Udseendet af de pelleterede knoglemarvsceller og det nu hvide lårben efter hurtig centrifugering ved 12.000 x g. Klik her for at downloade denne fil.

Discussion

Forberedelse af højkvalitets celle- eller kernesuspension er af afgørende betydning for succesen med enkeltcelle eller enkeltkerner RNA-Seq og enkeltcelle multi-omiske analyser 29,30,31. Her har vi beskrevet protokoller til prøveforberedelse og kerneisolering for multiomassays fra to typer væv: hjerne og knoglemarv.

Hjerneprotokollen beskrevet i dette papir tillader genopretning af kerner af høj kvalitet fra friskfrosset hjernevæv. Det omfatter følgende trin: frosset vævsforstyrrelse, isolering af kerner, oprensning af kerner og kvalitetskontrol af det fremstillede materiale. Hjernevævet består af mange forskellige celletyper, og proceduren for vævsdissociation og kerneisolering bør bevare proportionerne af cellepopulationer som til stede i det oprindelige væv. Her blev lysisbuffersammensætningen og inkubationstiden optimeret til at muliggøre fuldstændig og skånsom lysering af alle cellepopulationer, der udgør vævet.

HSPC-protokollen for knoglemarv er noget anderledes, da det kræver et ekstra trin i begyndelsen af eksperimentet at isolere cellepopulationen af interesse fra en heterogen cellulær suspension. Efter indsamling af frisk væv lyseres røde blodlegemer, og prøven beriges til celledelmængden af interesse. De målrettede celler lyseres, kernerne isoleres, og kvaliteten af det fremstillede materiale kontrolleres.

10X Genomics giver flere protokoller valideret til kerneisolering i mange forskellige væv32,33. Virksomheden kommercialiserer også et kerneisoleringssæt med en ligetil pipeline til isolering af kerner fra valideret væv34. Disse protokoller har dog brug for yderligere optimering for at skræddersy de særlige forhold ved visse prøver. Et eksempel er de prøver, der kræver arbejde med lav celleindgang. For disse prøver er de mest udfordrende trin centrifugeringer, der skal være tilstrækkeligt strenge til at rense prøven og skånsomme nok til at undgå tab af celle / kerner. Med den her beskrevne protokol har vi tilpasset 10X Genomics Proven Protocol - Nuclei Isolation for Single Cell Multiome ATAC + GEX Sequencing (CG000365 - Rev C)27 for at finde en fin balance mellem disse to krav. Som påvist i eksemplet med fremstilling af kerner fra sorterede HSPC'er har vi forbedret genvindingen af kerner uden nogen indvirkning på prøvens kvalitet.

En yderligere udfordring er trinnet med lysering af oprensede celler til kerneisolering. Hårdere lyseringsbetingelser og længere inkubationstider kan beskadige kerner og dermed påvirke kvaliteten af sekventeringsdata. Figur 5 viser repræsentativ kernebilleddannelse fra knoglemarvsprøver ved forskellige inkubationstider med lysisbuffer og illustrerer, hvor forskellig tilstanden af kerner kan være afhængigt af cellelysen. I eksemplet med HSPC'erne har vi identificeret 3 minutters lysis som den tilstand, der resulterer i den højeste andel af sunde udseende, intakte kerner og den laveste andel af beskadigede kerner. Lysisinkubationstiderne bør optimeres for hver ny type prøve.

Figure 5
Figur 5: Kernekvalitetskontrol ved mikroskopi. Der vises repræsentative brightfield-billeder af isolerede kerner fra museknoglemarv med (A) intakte og (B) beskadigede kerner. Skala bar 5 μm. Billeder blev taget med et omvendt mikroskop ved hjælp af en 40x ELWD NA 0,60 objektiv og 1,5x digital zoom. Klik her for at se en større version af denne figur.

Begge protokoller, der er beskrevet i dette arbejde, er afhængige af rensning af målrettede celler eller kerner ved hjælp af FACS-instrumenter med høj kapacitet. Dette trin er af afgørende betydning for enkeltcelle-/kernepræparationsprotokoller, hvor sjældne delmængder af celler skal isoleres fra heterogene suspensioner. I disse, som i eksemplet vist her for HSPC-sortering, kan et højdimensionelt flowcytometripanel være nødvendigt for at muliggøre "gating" på cellepopulationen af interesse. Sorteringen er ekstremt hurtig og nøjagtig, hvilket fører til over 95% renhed af de sorterede celleundergrupper. Denne fremgangsmåde udsætter den cellulære suspension for et tryk på op til 70 psi og kan derfor være begrænsende for sortering af skrøbelige celler (f.eks. Dendritiske celler, neutrofiler), da det kan forårsage brud på deres cellemembran. I disse tilfælde bør der vælges alternative løsninger til cellulær rensning, herunder magnetisk sortering, anvendelse af nye generationsinstrumenter (f.eks. CellenOne, Cellenion; MACSQuant Tyto, Miltenyi)35,36 eller dråbebaserede systemer (f.eks. ODIN, Sensific)37. Ikke desto mindre er den langsomme sorteringshastighed for disse teknologier med cellesortering, der varer i timer i stedet for minutter, en stærk begrænsende faktor for anvendelsen af disse tilgange til fremstilling af levedygtige celler til Multiome og andre enkeltcelleapplikationer baseret på analyse af store celletal.

Til oprensning af kerner isoleret fra vævet er FACS den valgte metode på grund af dets gennemstrømning og renheden af det isolerede materiale. Kerner er ikke følsomme over for tryk, og filtrerede vævsisolater kan let renses gennem cellesortereren. Hvis laboratoriet ikke er udstyret med et FACS-instrument, findes der andre alternativer, noget mindre effektive, men tilstrækkeligt gode. Eksempler inkluderer ultracentrifugering eller brug af lille udstyr såsom MARS (Applied Cell), der adskiller partikler baseret på deres forskel i størrelse ved hjælp af akustiske bølger; CURIOX laminær skive, der bruger hydrofobe egenskaber af celle-/kernesuspensioner; eller LEVITAS bio, der er afhængig af fysiske egenskaber af celler (levitation) for at adskille dem fra affaldet.

Her beskriver vi protokoller for at opnå et højt antal kerner og den bedste renhed for downstream Multiome-protokollen. FACS-sortering og gentagne centrifugeringstrin resulterer i et betydeligt tab af det oprindelige materiale. Af denne grund kræver protokollen for kerneforberedelse fra hjernen, som vi beskriver her, tilstrækkeligt rigeligt udgangsmateriale til at resultere i indsamling af mindst 500.000 kerner efter FACS-sorteringen. Der bør anvendes alternative protokoller, hvis dette kriterium ikke kan opfyldes. Når man arbejder med sjældne cellepopulationer eller små vævssektioner, kan den tilgængelige mængde indledende materiale være en begrænsende faktor. For at løse dette problem er det muligt at forbedre gendannelsen af kerner ved (a) at reducere lysisvolumenet, (b) at reducere vaskevolumenet, (c) at bruge en enkelt vask med forlænget centrifugeringstid for at forsøge at forbedre restitutionen som angivet i 10X genomics-protokoller til isolering af kerner med lavt celleinput. Til multiomisk analyse af materiale med lavt indhold er det værd at overveje pladebaserede applikationer som scNMT, SNARE-seq og Paired-seq38 , der kræver meget færre inputprøver.

Sammenfattende har vi beskrevet to robuste protokoller til fremstilling af kerner fra hjernen og knoglemarven HSPC'er til downstream Multiome-analyse. Disse protokoller kan anvendes i ethvert videnskabeligt projekt, der kræver enkeltkernesuspensioner af høj kvalitet fra disse to vævstyper, uanset det videnskabelige spørgsmål, der stilles. Vores gruppe har anvendt hjernekerneisolationsprotokollen i studier af hjernens udvikling ved inaktivering af forskellige målrettede gener og i undersøgelser af immunrespons i forbindelse med neurologiske sygdomme. Vi bruger knoglemarvskerneisoleringsprotokollen til at dechiffrere deltagelsen af forskellige hæmatopoietiske subpopulationer i etableringen af immunsystemet.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Ana Jeemin Choi blev støttet af et stipendium fra Pasteur - Paris University (PPU) International Ph.D. Program.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
18 G x 1 ½ (1.2 mm x 38 mm) Agani needles Terumo AN*1838S1
15 mL tubes Falcon 352097
5 mL round bottom FACS tube with cell strainer cap 35 µm falcon 352235
50 mL tubes Falcon 352070
7-AAD BD pharmagen 559925
ACK Lysing Buffer Gibco A10492-01
APC anti-mouse CD117 (c-Kit) BioLegend 105812 Clone: 2B8
APC/Cyanine 7 anti-mouse CD16/32 (FcγR) BioLegend 101328 Clone: 93
BD FACSAria III BD Biosciences non-applicable
BD FACSDiva Software v8.0.1 BD Biosciences non-applicable
Bovine Serum Albumin  stock solution 10% Miltenyi Biotec 130-091-376
Cell staining buffer Biolegend 420201
CFI Suprplan Fluor ELWD 40XC ON 0.6 Nikon  non-applicable
CMOS camera Prime 95B 25 mm Photometrix non-applicable
Countess II FL Automated Cell Counter Invitrogen AMQAF1000
Countess cell counting chamber slide Invitrogen C10283
Coverglass 24 mm x 24 mm 0.13-0.17 mm Brand BR470819
Digitonine 5% Invitrogen BN2006
Disposable Scalpels  Swann-Morton  0508
DMEM (1x) + GlutaMAX-I Gibco 31966-021
DPBS (10x) Gibco 14200-067
DTT Sigma aldrich 646563
Epifluorescence inverted microscope Nikon Ti2 -E Nikon  non-applicable
Eppendorf Safe-Lock Tubes 0.5 mL Eppendorf 30123603
Ethanol 70% VWR 83801.290
FITC anti-mouse CD34 Invitrogen 11-0341-85 Clone: RAM34
Forceps for dissection FST 11152-10
Heat-inactivated Fetal Bovine Serum (FBS) Gibco 11533387
Dounce Homogeniser 2 mL Bellco glass 1984-10002 Pestle “A” Large Clearance: .0030-.0050″ and Pestle “B” Small Clearance: .0005-.0025″
LIVE/DEAD fixable aqua dead cell stain kit Invitrogen L34957
Magnesium chloride solution 1 M Sigma aldrich M1028
Microcentrifuge  Eppendorf 5424R
Mounting medium Fluoromount-G  invitrogen 00-4958-02
Nonidet P40 substitute Sigma aldrich 74385
Nuclease free water ThermoFischer AM9932
Nuclei buffer 20x  10X Genomics 2000153/2000207
Nuclei isolation kit EZ prep Sigma Aldrich NUC-101
OneComp eBeads compensation beads Invitrogen 01-1111-41
Pacific Blue anti-mouse lineage cocktail
(including anti-mouse CD3, Ly-6G/Ly-6C, CD11b, CD45R/B220, TER-119)		 BioLegend 133310 Clones (in the same order as the antibodies listed): 17A2, RB6-8C5, M1/70, RA3-6B2, Ter-119
PCR Tube Strips 0.2 mL Eppendorf 951010022
PE anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) BioLegend 122507 Clone: E13-161.7
Petri dish 100 mm x 20 mm OPTILUX Falcon 353003
Ply-L-lysine 0.01% sterile-filtered suitable for cell culture Sigma P4707
Printed microscope slides 8 well 6 mm numbered Epredia ER-301B-CE24
Protein LoBind Tubes 1.5 mL Eppendorf 30108116
Recombinant Rnase inhibitor 5000 U Takara 2313A
Scissors for dissection FST 14090-09
Sodium chloride solution 5 M Sigma aldrich 59222C
Syringe filters, PES, 0.2 µm Fisher Scientific 15206869
Transparent nail polish  any non-applicable
Trizma Hydrochloride solution pH 7.4 Sigma aldrich T2194
Trypan Blue 0.4% gibco 15250061
Tween 20 Biorad  1662404
UltraPure Distilated Water Dnase/Rnase Free Invitrogen 10977-035

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Clark, S. J., et al. scNMT-seq enables joint profiling of chromatin accessibility DNA methylation and transcription in single cells. Nature Communications. 9 (1), 781 (2018).
  2. Lee, J., Hyeon, D. Y., Hwang, D. Single-cell multiomics: technologies and data analysis methods. Experimental & Molecular Medicine. 52 (9), 1428-1442 (2020).
  3. Cerrizuela, S., et al. High-throughput scNMT protocol for multiomics profiling of single cells from mouse brain and pancreatic organoids. STAR Protocols. 3 (3), 101555 (2022).
  4. Dimitriu, M. A., Lazar-Contes, I., Roszkowski, M., Mansuy, I. M. Single-cell multiomics techniques: From conception to applications. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 854317 (2022).
  5. Stoeckius, M., et al. Simultaneous epitope and transcriptome measurement in single cells. Nature Methods. 14 (9), 865-868 (2017).
  6. Cao, J., et al. Joint profiling of chromatin accessibility and gene expression in thousands of single cells. 361 (6409), Science. New York, N.Y. 1380-1385 (2018).
  7. Narayanan, A., et al. Nuclei Isolation from Fresh Frozen Brain Tumors for Single-Nucleus RNA-seq and ATAC-seq.Journal of Visualized Experiments. JoVE. 162, 61542 (2020).
  8. Kim, M., et al. Single-nucleus transcriptomics reveals functional compartmentalization in syncytial skeletal muscle cells. Nature Communications. 11 (1), 6375 (2020).
  9. Santos, M. D., et al. Extraction and sequencing of single nuclei from murine skeletal muscles. STAR Protocols. 2 (3), 100694 (2021).
  10. Safabakhsh, S., et al. Isolating nuclei from frozen human heart tissue for single-nucleus RNA sequencing. Current Protocols. 2 (7), (2022).
  11. Lau, S. -F., Cao, H., Fu, A. K. Y., Ip, N. Y. Single-nucleus transcriptome analysis reveals dysregulation of angiogenic endothelial cells and neuroprotective glia in Alzheimer's disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (41), 25800-25809 (2020).
  12. Armand, E. J., Li, J., Xie, F., Luo, C., Mukamel, E. A. Single-cell sequencing of brain cell transcriptomes and epigenomes. Neuron. 109 (1), 11-26 (2021).
  13. Morabito, S., et al. Single-nucleus chromatin accessibility and transcriptomic characterization of Alzheimer's disease. Nature Genetics. 53 (8), 1143-1155 (2021).
  14. Chen, S., et al. Spatially resolved transcriptomics reveals genes associated with the vulnerability of middle temporal gyrus in Alzheimer's disease. Acta Neuropathologica Communications. 10 (1), (2022).
  15. Paul, F., et al. Transcriptional heterogeneity and lineage commitment in myeloid progenitors. Cell. 163 (7), 1663-1677 (2015).
  16. Kaufmann, E., et al. BCG educates hematopoietic stem cells to generate protective innate immunity against tuberculosis. Cell. 172 (1-2), 176-190 (2018).
  17. Christ, A., et al. diet triggers NLRP3-dependent innate immune reprogramming. Cell. 172 (1-2), 162-175 (2018).
  18. Moorlag, S. J. C. F. M., et al. β-Glucan Induces protective trained immunity against mycobacterium tuberculosis infection: A key role for IL-1. Cell Reports. 31 (7), 107634 (2020).
  19. de Laval, B., et al. C/EBPβ-dependent epigenetic memory induces trained immunity in hematopoietic stem cells. Cell Stem Cell. 26 (5), 657-674 (2020).
  20. Renthal, W., et al. Characterization of human mosaic Rett syndrome brain tissue by single-nucleus RNA sequencing. Nature Neuroscience. 21 (12), 1670-1679 (2018).
  21. Yang, A. C., et al. A human brain vascular atlas reveals diverse mediators of Alzheimer's risk. Nature. 603 (7903), 885-892 (2022).
  22. Lee, D. R., Zhang, Y., Rhodes, C. T., Petros, T. J. Generation of single-cell and single-nuclei suspensions from embryonic and adult mouse brains. STAR Protocols. 4 (1), 101944 (2022).
  23. Corces, M. R., et al. Lineage-specific and single-cell chromatin accessibility charts human hematopoiesis and leukemia evolution. Nature Genetics. 48 (10), 1193-1203 (2016).
  24. Ranzoni, A. M., et al. Integrative single-cell RNA-seq and ATAC-seq analysis of human developmental hematopoiesis. Cell Stem Cell. 28 (3), 472-487 (2021).
  25. 10X Genomics Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression User Guide. Document Number CG000338 Rev F. At. , (2022).
  26. J,, et al. Microdissection of mouse brain into functionally and anatomically different regions. Journal of Visualized Experiments: JoVE. 168, 61941 (2021).
  27. 10X Genomics 10X Genomics Demonstrated Protocol - Nuclei Isolation for Single Cell Multiome ATAC + GEX sequencing (CG000365 - Rev C). At. , (2022).
  28. Haag, S., Murthy, A. Murine monocyte and macrophage culture. Bio-Protocol. 11 (6), (2021).
  29. Haque, A., Engel, J., Teichmann, S. A., Lönnberg, T. A practical guide to single-cell RNA-sequencing for biomedical research and clinical applications. Genome Medicine. 9 (1), (2017).
  30. Jiang, P. Quality control of single-cell RNA-seq. Methods in Molecular Biology. , Clifton, N.J. 1-9 (1935).
  31. Regan, C., Preall, J. Practical considerations for single-cell genomics. Current Protocols. 2 (8), (2022).
  32. 10X Genomics 10X Genomics Demonstrated Protocol - Nuclei Isolation for Single Cell ATAC Sequencing (CG000169 - Rev E). At. , (2022).
  33. 10X Genomics 10X Genomics Demonstrated Protocol - Nuclei Isolation from Complex Tissues for Single Cell Multiome. ATAC + Gene Expression Sequencing. (CG000375 - Rev C). At. , (2022).
  34. 10X Genomics 10X Genomics - Chromium Nuclei Isolation Kit (CG000505 - Rev A). AT. , (2022).
  35. Shomroni, O., et al. A novel single-cell RNA-sequencing approach and its applicability connecting genotype to phenotype in ageing disease. Scientific Reports. 12 (1), 4091 (2022).
  36. Ocañas, S. R., Pham, K. D., Blankenship, H. E., Machalinski, A. H., Chucair-Elliott, A. J., Freeman, W. M. Minimizing the ex vivo confounds of cell-isolation techniques on transcriptomic and translatomic profiles of purified microglia. 9 (2), 0348-0321 (2022).
  37. Gérard, A., et al. High-throughput single-cell activity-based screening and sequencing of antibodies using droplet microfluidics. Nature Biotechnology. 38 (6), 715-721 (2020).
  38. Vandereyken, K., Sifrim, A., Thienpont, B., Voet, T. Methods and applications for single-cell and spatial multi-omics. Nature Reviews. Genetics. 24, 494-515 (2023).

Tags

Denne måned i JoVE nummer 202
Højkvalitets hjerne- og knoglemarvskerneforberedelse til enkeltkerner multiomassays
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Moraes Cabé, C., Novault, S.,… More

Moraes Cabé, C., Novault, S., Jeemin Choi, A., Seffer, V., Barrio Cano, L., Libri, V., Hasan, M. High-Quality Brain and Bone Marrow Nuclei Preparation for Single Nuclei Multiome Assays. J. Vis. Exp. (202), e65715, doi:10.3791/65715 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter