Suksessen til encelle / enkeltkjerner transkriptomikk og multi-omics avhenger i stor grad av kvaliteten på celler / kjerner. Derfor må isolering av celler/kjerner fra vev og deres rensing være svært standardisert. Denne protokollen beskriver fremstilling av kjerner fra hjernen og benmarg for nedstrøms enkeltkjerner multiomanalyse.
Enkeltcelleanalyse har blitt den valgte tilnærmingen for å løse kompleksiteten i biologiske prosesser som krever vurdering av variabiliteten av individuelle cellulære responser på behandling eller infeksjon med enkeltcelleoppløsning.
Mange teknikker for encelle molekylær profilering har blitt utviklet de siste 10 årene, og flere dedikerte teknologier har blitt kommersialisert. 10X Genomics dråpebasert enkeltcelleprofilering er en utbredt teknologi som tilbyr bruksklare reagenser for transkriptomisk og multi-omisk enkeltcelleprofilering. Teknologien inkluderer arbeidsflyter for enkeltcelle- og enkeltkjerners RNA-sekvensering (henholdsvis scRNA-Seq og snRNA-Seq), scATAC-Seq, enkeltcelle immunprofilering (BCR/TCR-sekvensering) og multiom. Sistnevnte kombinerer transkripsjonell (scRNA-Seq) og epigenetisk informasjon (scATAC-Seq) som kommer fra samme celle.
Kvaliteten (levedyktighet, integritet, renhet) av enkeltcelle- eller enkeltkjernesuspensjoner isolert fra vev og analysert ved noen av disse tilnærmingene er avgjørende for å generere data av høy kvalitet. Derfor bør prøveprepareringsprotokollene tilpasses særegenhetene i hvert biologisk vev og sikre generering av celle- og kjernesuspensjoner av høy kvalitet.
Denne artikkelen beskriver to protokoller for å forberede hjerne- og benmargsprøver for nedstrøms multiom 10X Genomics-rørledningen. Protokollene utføres trinnvis og dekker vevsdissosiasjon, cellesortering, kjerneisolering og kvalitetskontroll av preparerte kjernesuspensjon som brukes som utgangsmateriale for cellepartisjonering og strekkoding, bibliotekpreparering og sekvensering. Disse standardiserte protokollene produserer kjernebiblioteker av høy kvalitet og robuste og pålitelige data.
I mange år har encelleteknikker vært gullstandarden for analyse av biologiske prosesser. De var i utgangspunktet begrenset til encellet fenotyping gjennom mikroskopi, flowcytometri og lignende analyser. Et gjennombrudd i enkeltcelleanalyse kom med utviklingen av tilnærminger for enkeltcellemolekylær profilering, spesielt enkeltcelle RNA-sekvensering (scRNA-Seq) som gjorde det mulig å karakterisere hele transkriptomet til individuelle celler. Meget kraftig, scRNA-Seq genererer informasjon om transkripsjonsstatusen til en celle i en bestemt tilstand og tidspunkt. Det gir imidlertid ikke synlighet på genreguleringen som driver transkripsjon, eller på molekylære modifikasjoner som skjer over tid. For å overvinne denne begrensningen har det blitt investert mange anstrengelser i utviklingen av enkeltcelle multi-omics-analyser som muliggjør analyse av flere faktorer og prosesser fra samme celle 1,2,3,4. Den første vellykkede målingen av to modaliteter i enkeltceller kom gjennom å koble multiplekse overflateproteinuttrykksmønstre med det fulle transkriptomet av individuelle celler i CITE-Seq-tilnærmingen5. Nyere evolusjoner kombinerer genuttrykk med kromatintilgjengelighet (Assay for Transposase-Accessible Chromatin using sequencing, ATAC-Seq), og fanger dermed samtidig transkriptomiske og epigenomiske modaliteter i de samme cellene (f.eks. sci-CAR)6. De første kommersielle løsningene som tillot å knytte transkriptomikk med cellefenotype eller med epigenetiske endringer av samme celle kom fra 10X Genomics.
Eksperimenter for encellemolekylær profilering inneholder følgende trinn: (1) vevsdissosiasjon eller fremstilling av enkeltcellesuspensjoner; (2) cellerensing og/eller kjerneisolering; (3) partisjonering og strekkoding; (4) bibliotekkonstruksjon og kvalitetskontroll; (5) neste generasjons sekvensering; (6) Dataanalyse. Mens trinn (3)-(6) kan variere betydelig avhengig av teknologien som brukes, er de første trinnene generelt felles for dem alle. Kvaliteten på den preparerte celle-/kjernesuspensjonen vil avgjøre det samlede resultatet av forsøket. Avhengig av vevstypen kan det være utfordrende å oppnå suspensjoner av høy kvalitet med enkeltcelle / kjerner. Særegenhetene til noen vev, som hjertet, muskelen, hjernen, lungen, tarmen og andre, krever metoder for vevsforstyrrelser og kjerneisolering tilpasset hver type prøve for å garantere produksjon av kjerner av høy kvalitet for molekylær analyse 7,8,9,10 . Vevsforstyrrelsesmetodene og dissosiasjonsprotokollene kan være mekaniske, enzymatiske (f.eks. En blanding av kollagenaser og DNase), eller en kombinasjon av de to, og kan utføres manuelt eller av instrumenter (f.eks. Qiagen DSC-400, gentleMACS).
Enkeltcelleteknikker har blitt et valgfritt verktøy for biomedisinsk forskning. I nevrobiologi krever cellediversiteten i hjernen og kompleksiteten i deres funksjoner høyoppløselig og høy gjennomstrømningsanalyse for visualisering av sjeldne cellepopulasjoner og for å vurdere deres heterogenitet 11,12,13,14. Kobling av cellulær identitet og genregulerende mekanismer for individuelle celler gir innsikt i hjernens utvikling og fysiologi. Et annet eksempel er studier av immunrespons i sammenheng med smittsomme, autoimmune eller kreftsykdommer, som sterkt støtter seg på encelleanalyser. Heterogeniteten til immuncelleundergrupper og kompleksiteten av deres aktivitet og interaksjoner med andre celletyper krever enkeltcelleoppløsning ved dechiffrering av mekanismene som ligger til grunn for immunrespons. Immuncellene stammer fra benmargen, hvor hematopoietiske forfedre består av gradvis differensierende celler som erverver og mister celleoverflatemarkører gjennom en trinnvis prosess før de går ut av beinmargen til hjemmet i periferien. Enkeltcelleanalyse muliggjør minuttkarakterisering av cellulære utviklingsstadier. Det kan oppnås gjennom enkeltcelle fenotyping, konvensjonelt utført ved multiparameter flowcytometri. Imidlertid har enkeltcelle transkriptomiske signaturer vist seg å avsløre en mer presis identifikasjon av stamcellesubtyper, siden disse cellene er fordelt i klynger som faller inn i hverandre og derfor kan feilidentifiseres ved bruk av en grov celleoverflatemarkør tilnærming15. Et økende antall studier avdekker de epigenetiske modifikasjonene som hematopoietiske stam- og stamceller (HSPCs) kan skaffe seg fra eksponering for forskjellige midler, noe som fører til en betydelig innvirkning på immunsystemets langsiktige respons 16,17,18,19. De nye multi-omics-teknologiene gjør det mulig å studere disse prosessene med enkeltcelleoppløsning.
Mange protokoller for celle- og kjerneisolasjon er beskrevet for hjerne 11,20,21,22 og benmargsprøver23,24. For å minimere skjevhet på grunn av eksperimentell variabilitet, er det nødvendig å validere optimaliserte enkeltkjernepreparasjonsprotokoller for felles enkeltcelle transkriptomisk og epigenomisk sekvensering, og dermed sikre reproduserbarheten av enkeltcelle multiomiske analyser.
Her beskrives to robuste protokoller for kjernepreparering fra (1) ferskfrosset hjernevev og (2) ferske benmargs-HSPCer for nedstrøms enkeltcelle multiomanalyse (figur 1).
Figur 1: Skjematisk fremstilling av protokoller for kjerneisolering fra ferskfryst hjerne- og beinmargsvev. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Fremstilling av høykvalitets celle- eller kjernesuspensjon er av avgjørende betydning for suksessen til enkeltcelle- eller enkeltkjerner RNA-Seq og encellede multi-omiske analyser 29,30,31. Her har vi beskrevet protokoller for prøvepreparering og kjerneisolering for multiomanalyser fra to typer vev: hjerne og benmarg.
Hjerneprotokollen beskrevet i dette papiret tillater utvinning av kjerner av høy kvalitet fra ferskfrosset hjernevev. Den inneholder følgende trinn: frosset vevsforstyrrelse, isolering av kjerner, rensing av kjerner og kvalitetskontroll av det tilberedte materialet. Hjernevevet består av mange forskjellige celletyper, og prosedyren for vevsdissosiasjon og kjerneisolering bør bevare proporsjonene av cellepopulasjoner som tilstede i det opprinnelige vevet. Her ble lysisbuffersammensetningen og inkubasjonstiden optimalisert for å muliggjøre fullstendig og skånsom lysering av alle cellepopulasjoner som komponerer vevet.
Benmarg HSPCs protokollen er noe annerledes siden det krever ett ekstra trinn i begynnelsen av forsøket for å isolere cellepopulasjonen av interesse fra en heterogen cellulær suspensjon. Etter samlingen av ferskt vev lyseres røde blodlegemer, og prøven er beriket for celledelmengden av interesse. De målrettede cellene lyseres, kjernene isoleres, og kvaliteten på det fremstilte materialet kontrolleres.
10X Genomics gir flere protokoller validert for kjerneisolering i mange forskjellige vev32,33. Selskapet kommersialiserer også et kjerneisolasjonssett med en enkel rørledning for å isolere kjerner fra validerte vev34. Imidlertid trenger disse protokollene ytterligere optimalisering for å skreddersy særegenhetene til visse prøver. Et eksempel er prøvene som krever arbeid med lav celleinngang. For disse prøvene er de mest utfordrende trinnene sentrifugeringer som må være tilstrekkelig strenge til å rengjøre prøven og skånsomme nok til å unngå celle-/kjernetap. Med protokollen beskrevet her har vi tilpasset 10X Genomics Demonstrated Protocol – Nuclei Isolation for Single Cell Multiome ATAC + GEX Sequencing (CG000365 – Rev C)27 for å finne en fin balanse mellom disse to kravene. Som vist i eksemplet med fremstilling av kjerner fra sorterte HSPCer, har vi forbedret kjerneutvinningen uten å påvirke prøvens kvalitet.
En ekstra utfordring er trinnet med lysis av rensede celler for kjerneisolering. Tøffere lysforhold og lengre inkubasjonstid kan skade kjerner og dermed påvirke kvaliteten på sekvenseringsdata. Figur 5 viser representative kjerneavbildning fra beinmargsprøver ved ulike inkubasjonstider med lysisbuffer og illustrerer hvor forskjellig tilstanden til kjernene kan være avhengig av cellelysen. I eksempelet med HSPC har vi identifisert 3 min lyse som tilstanden som resulterer i den høyeste andelen friske, intakte kjerner og den laveste andelen skadede kjerner. Lysisinkubasjonstidene bør optimaliseres for hver ny type prøve.
Figur 5: Kjernekvalitetskontroll ved mikroskopi. Vist er representative lysfeltbilder av isolerte kjerner fra musebenmarg med (A) intakte og (B) skadede kjerner. Skala bar 5 μm. Bildene ble tatt med et invertert mikroskop ved hjelp av et 40x ELWD NA 0.60 objektiv og 1.5x digital zoom. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Begge protokollene som er beskrevet i dette arbeidet, er avhengige av å rense målrettede celler eller kjerner ved hjelp av FACS-instrumenter med høy gjennomstrømning. Dette trinnet er av avgjørende betydning for enkeltcelle-/kjerneprepareringsprotokoller der sjeldne undergrupper av celler skal isoleres fra heterogene suspensjoner. I disse, som i eksemplet vist her for HSPC-sortering, kan det være nødvendig med et høydimensjonalt flowcytometripanel for å aktivere “gating” på cellepopulasjonen av interesse. Sorteringen er ekstremt rask og nøyaktig, noe som fører til over 95% renhet av de sorterte celleundergruppene. Denne tilnærmingen utsetter den cellulære suspensjonen for et trykk på opptil 70 psi og kan derfor være begrensende for sortering av skjøre celler (f.eks. Dendrittiske celler, nøytrofiler) siden det kan forårsake brudd på cellemembranen. I disse tilfellene bør alternative løsninger velges for cellulær rensing, inkludert magnetisk sortering, anvendelse av ny generasjons instrumenter (f.eks. CellenOne, Cellenion; MACSQuant Tyto, Miltenyi)35,36 eller dråpebaserte systemer (f.eks. ODIN, Sensific)37. Ikke desto mindre er den langsomme sorteringshastigheten til disse teknologiene, med cellesortering som varer i flere timer i stedet for minutter, en sterk begrensende faktor for anvendelsen av disse tilnærmingene i utarbeidelsen av levedyktige celler for Multiome og andre enkeltcelleapplikasjoner basert på analyse av store celletall.
For rensing av kjerner isolert fra vevet, er FACS den valgte metoden på grunn av dens gjennomstrømning og renheten av det isolerte materialet. Kjerner er ikke følsomme for trykk, og filtrerte vevsisolater kan enkelt renses gjennom cellesorteringen. Hvis laboratoriet ikke er utstyrt med et FACS-instrument, finnes det andre alternativer, noe mindre effektive, men tilstrekkelig gode. Eksempler inkluderer ultrasentrifugering eller bruk av lite utstyr som MARS (Applied Cell) som skiller partikler basert på deres forskjell i størrelse, ved hjelp av akustiske bølger; CURIOX laminær vaskemaskin som bruker hydrofobe egenskaper til celle-/kjernesuspensjoner; eller LEVITAS bio som er avhengig av fysiske egenskaper av celler (levitasjon) for å skille dem fra rusk.
Her beskriver vi protokoller for å oppnå et høyt antall kjerner og den beste renheten for nedstrøms Multiome-protokollen. FACS-sortering og gjentatte sentrifugeringstrinn resulterer i et betydelig tap av det opprinnelige materialet. Av denne grunn krever i protokollen for kjernepreparering fra hjernen som vi beskriver her tilstrekkelig rikelig startmateriale til å resultere i innsamling av minst 500 000 kjerner etter FACS-sorteringen. Alternative protokoller bør anvendes dersom dette kriteriet ikke kan oppfylles. Når du arbeider med sjeldne cellepopulasjoner eller små vevsseksjoner, kan den tilgjengelige mengden initialt materiale være en begrensende faktor. For å løse dette problemet er det mulig å forbedre kjerneutvinningen ved å (a) redusere lysvolumet, (b) redusere vaskevolumet, (c) bruke en enkelt vask med utvidet sentrifugeringstid for å prøve å forbedre utvinningen som angitt i 10X Genomics-protokoller for isolasjon av lavcelleinngangskjerner. For multiomisk analyse av materiale med lite innhold, er det verdt å vurdere platebaserte applikasjoner som scNMT, SNARE-seq og Paired-seq38 som krever mye færre inngangsprøver.
Oppsummert har vi beskrevet to robuste protokoller for fremstilling av kjerner fra hjernen og benmargs-HSPCer for nedstrøms multiomanalyse. Disse protokollene kan brukes i ethvert vitenskapelig prosjekt som krever suspensjoner av enkeltkjerner av høy kvalitet fra disse to vevstypene, uavhengig av det vitenskapelige spørsmålet som stilles. Vår gruppe har brukt isolasjonsprotokollen for hjernekjerner i studier av hjernens utvikling ved inaktivering av ulike målrettede gener og i studier av immunrespons i sammenheng med nevrologiske sykdommer. Vi bruker isolasjonsprotokollen for benmargskjerner for å dechiffrere deltakelsen av forskjellige hematopoietiske underpopulasjoner i etableringen av immunsystemet.
The authors have nothing to disclose.
Ana Jeemin Choi ble støttet av et stipend fra Pasteur – Paris University (PPU) International Ph.D. Program.
18 G x 1 ½ (1.2 mm x 38 mm) Agani needles | Terumo | AN*1838S1 | |
15 mL tubes | Falcon | 352097 | |
5 mL round bottom FACS tube with cell strainer cap 35 µm | falcon | 352235 | |
50 mL tubes | Falcon | 352070 | |
7-AAD | BD pharmagen | 559925 | |
ACK Lysing Buffer | Gibco | A10492-01 | |
APC anti-mouse CD117 (c-Kit) | BioLegend | 105812 | Clone: 2B8 |
APC/Cyanine 7 anti-mouse CD16/32 (FcγR) | BioLegend | 101328 | Clone: 93 |
BD FACSAria III | BD Biosciences | non-applicable | |
BD FACSDiva Software v8.0.1 | BD Biosciences | non-applicable | |
Bovine Serum Albumin stock solution 10% | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
Cell staining buffer | Biolegend | 420201 | |
CFI Suprplan Fluor ELWD 40XC ON 0.6 | Nikon | non-applicable | |
CMOS camera Prime 95B 25 mm | Photometrix | non-applicable | |
Countess II FL Automated Cell Counter | Invitrogen | AMQAF1000 | |
Countess cell counting chamber slide | Invitrogen | C10283 | |
Coverglass 24 mm x 24 mm 0.13-0.17 mm | Brand | BR470819 | |
Digitonine 5% | Invitrogen | BN2006 | |
Disposable Scalpels | Swann-Morton | 0508 | |
DMEM (1x) + GlutaMAX-I | Gibco | 31966-021 | |
DPBS (10x) | Gibco | 14200-067 | |
DTT | Sigma aldrich | 646563 | |
Epifluorescence inverted microscope Nikon Ti2 -E | Nikon | non-applicable | |
Eppendorf Safe-Lock Tubes 0.5 mL | Eppendorf | 30123603 | |
Ethanol 70% | VWR | 83801.290 | |
FITC anti-mouse CD34 | Invitrogen | 11-0341-85 | Clone: RAM34 |
Forceps for dissection | FST | 11152-10 | |
Heat-inactivated Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 11533387 | |
Dounce Homogeniser 2 mL | Bellco glass | 1984-10002 | Pestle “A” Large Clearance: .0030-.0050″ and Pestle “B” Small Clearance: .0005-.0025″ |
LIVE/DEAD fixable aqua dead cell stain kit | Invitrogen | L34957 | |
Magnesium chloride solution 1 M | Sigma aldrich | M1028 | |
Microcentrifuge | Eppendorf | 5424R | |
Mounting medium Fluoromount-G | invitrogen | 00-4958-02 | |
Nonidet P40 substitute | Sigma aldrich | 74385 | |
Nuclease free water | ThermoFischer | AM9932 | |
Nuclei buffer 20x | 10X Genomics | 2000153/2000207 | |
Nuclei isolation kit EZ prep | Sigma Aldrich | NUC-101 | |
OneComp eBeads compensation beads | Invitrogen | 01-1111-41 | |
Pacific Blue anti-mouse lineage cocktail (including anti-mouse CD3, Ly-6G/Ly-6C, CD11b, CD45R/B220, TER-119) |
BioLegend | 133310 | Clones (in the same order as the antibodies listed): 17A2, RB6-8C5, M1/70, RA3-6B2, Ter-119 |
PCR Tube Strips 0.2 mL | Eppendorf | 951010022 | |
PE anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) | BioLegend | 122507 | Clone: E13-161.7 |
Petri dish 100 mm x 20 mm OPTILUX | Falcon | 353003 | |
Ply-L-lysine 0.01% sterile-filtered suitable for cell culture | Sigma | P4707 | |
Printed microscope slides 8 well 6 mm numbered | Epredia | ER-301B-CE24 | |
Protein LoBind Tubes 1.5 mL | Eppendorf | 30108116 | |
Recombinant Rnase inhibitor 5000 U | Takara | 2313A | |
Scissors for dissection | FST | 14090-09 | |
Sodium chloride solution 5 M | Sigma aldrich | 59222C | |
Syringe filters, PES, 0.2 µm | Fisher Scientific | 15206869 | |
Transparent nail polish | any | non-applicable | |
Trizma Hydrochloride solution pH 7.4 | Sigma aldrich | T2194 | |
Trypan Blue 0.4% | gibco | 15250061 | |
Tween 20 | Biorad | 1662404 | |
UltraPure Distilated Water Dnase/Rnase Free | Invitrogen | 10977-035 |