Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Forberedelse av hjerne- og benmargkjerner av høy kvalitet for enkeltkjerner multiomanalyser

Published: December 22, 2023 doi: 10.3791/65715
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1, 1,3, 1
1Cytometry and Biomarkers UTechS, C2RT, Institut Pasteur, Université Paris Cité, 2Microenvironment and Immunity Unit, Institut Pasteur, Université Paris Cité, INSERM U1224, 3Istituto Superiore di Sanità

Summary

Suksessen til encelle / enkeltkjerner transkriptomikk og multi-omics avhenger i stor grad av kvaliteten på celler / kjerner. Derfor må isolering av celler/kjerner fra vev og deres rensing være svært standardisert. Denne protokollen beskriver fremstilling av kjerner fra hjernen og benmarg for nedstrøms enkeltkjerner multiomanalyse.

Abstract

Enkeltcelleanalyse har blitt den valgte tilnærmingen for å løse kompleksiteten i biologiske prosesser som krever vurdering av variabiliteten av individuelle cellulære responser på behandling eller infeksjon med enkeltcelleoppløsning.

Mange teknikker for encelle molekylær profilering har blitt utviklet de siste 10 årene, og flere dedikerte teknologier har blitt kommersialisert. 10X Genomics dråpebasert enkeltcelleprofilering er en utbredt teknologi som tilbyr bruksklare reagenser for transkriptomisk og multi-omisk enkeltcelleprofilering. Teknologien inkluderer arbeidsflyter for enkeltcelle- og enkeltkjerners RNA-sekvensering (henholdsvis scRNA-Seq og snRNA-Seq), scATAC-Seq, enkeltcelle immunprofilering (BCR/TCR-sekvensering) og multiom. Sistnevnte kombinerer transkripsjonell (scRNA-Seq) og epigenetisk informasjon (scATAC-Seq) som kommer fra samme celle.

Kvaliteten (levedyktighet, integritet, renhet) av enkeltcelle- eller enkeltkjernesuspensjoner isolert fra vev og analysert ved noen av disse tilnærmingene er avgjørende for å generere data av høy kvalitet. Derfor bør prøveprepareringsprotokollene tilpasses særegenhetene i hvert biologisk vev og sikre generering av celle- og kjernesuspensjoner av høy kvalitet.

Denne artikkelen beskriver to protokoller for å forberede hjerne- og benmargsprøver for nedstrøms multiom 10X Genomics-rørledningen. Protokollene utføres trinnvis og dekker vevsdissosiasjon, cellesortering, kjerneisolering og kvalitetskontroll av preparerte kjernesuspensjon som brukes som utgangsmateriale for cellepartisjonering og strekkoding, bibliotekpreparering og sekvensering. Disse standardiserte protokollene produserer kjernebiblioteker av høy kvalitet og robuste og pålitelige data.

Introduction

I mange år har encelleteknikker vært gullstandarden for analyse av biologiske prosesser. De var i utgangspunktet begrenset til encellet fenotyping gjennom mikroskopi, flowcytometri og lignende analyser. Et gjennombrudd i enkeltcelleanalyse kom med utviklingen av tilnærminger for enkeltcellemolekylær profilering, spesielt enkeltcelle RNA-sekvensering (scRNA-Seq) som gjorde det mulig å karakterisere hele transkriptomet til individuelle celler. Meget kraftig, scRNA-Seq genererer informasjon om transkripsjonsstatusen til en celle i en bestemt tilstand og tidspunkt. Det gir imidlertid ikke synlighet på genreguleringen som driver transkripsjon, eller på molekylære modifikasjoner som skjer over tid. For å overvinne denne begrensningen har det blitt investert mange anstrengelser i utviklingen av enkeltcelle multi-omics-analyser som muliggjør analyse av flere faktorer og prosesser fra samme celle 1,2,3,4. Den første vellykkede målingen av to modaliteter i enkeltceller kom gjennom å koble multiplekse overflateproteinuttrykksmønstre med det fulle transkriptomet av individuelle celler i CITE-Seq-tilnærmingen5. Nyere evolusjoner kombinerer genuttrykk med kromatintilgjengelighet (Assay for Transposase-Accessible Chromatin using sequencing, ATAC-Seq), og fanger dermed samtidig transkriptomiske og epigenomiske modaliteter i de samme cellene (f.eks. sci-CAR)6. De første kommersielle løsningene som tillot å knytte transkriptomikk med cellefenotype eller med epigenetiske endringer av samme celle kom fra 10X Genomics.

Eksperimenter for encellemolekylær profilering inneholder følgende trinn: (1) vevsdissosiasjon eller fremstilling av enkeltcellesuspensjoner; (2) cellerensing og/eller kjerneisolering; (3) partisjonering og strekkoding; (4) bibliotekkonstruksjon og kvalitetskontroll; (5) neste generasjons sekvensering; (6) Dataanalyse. Mens trinn (3)-(6) kan variere betydelig avhengig av teknologien som brukes, er de første trinnene generelt felles for dem alle. Kvaliteten på den preparerte celle-/kjernesuspensjonen vil avgjøre det samlede resultatet av forsøket. Avhengig av vevstypen kan det være utfordrende å oppnå suspensjoner av høy kvalitet med enkeltcelle / kjerner. Særegenhetene til noen vev, som hjertet, muskelen, hjernen, lungen, tarmen og andre, krever metoder for vevsforstyrrelser og kjerneisolering tilpasset hver type prøve for å garantere produksjon av kjerner av høy kvalitet for molekylær analyse 7,8,9,10 . Vevsforstyrrelsesmetodene og dissosiasjonsprotokollene kan være mekaniske, enzymatiske (f.eks. En blanding av kollagenaser og DNase), eller en kombinasjon av de to, og kan utføres manuelt eller av instrumenter (f.eks. Qiagen DSC-400, gentleMACS).

Enkeltcelleteknikker har blitt et valgfritt verktøy for biomedisinsk forskning. I nevrobiologi krever cellediversiteten i hjernen og kompleksiteten i deres funksjoner høyoppløselig og høy gjennomstrømningsanalyse for visualisering av sjeldne cellepopulasjoner og for å vurdere deres heterogenitet 11,12,13,14. Kobling av cellulær identitet og genregulerende mekanismer for individuelle celler gir innsikt i hjernens utvikling og fysiologi. Et annet eksempel er studier av immunrespons i sammenheng med smittsomme, autoimmune eller kreftsykdommer, som sterkt støtter seg på encelleanalyser. Heterogeniteten til immuncelleundergrupper og kompleksiteten av deres aktivitet og interaksjoner med andre celletyper krever enkeltcelleoppløsning ved dechiffrering av mekanismene som ligger til grunn for immunrespons. Immuncellene stammer fra benmargen, hvor hematopoietiske forfedre består av gradvis differensierende celler som erverver og mister celleoverflatemarkører gjennom en trinnvis prosess før de går ut av beinmargen til hjemmet i periferien. Enkeltcelleanalyse muliggjør minuttkarakterisering av cellulære utviklingsstadier. Det kan oppnås gjennom enkeltcelle fenotyping, konvensjonelt utført ved multiparameter flowcytometri. Imidlertid har enkeltcelle transkriptomiske signaturer vist seg å avsløre en mer presis identifikasjon av stamcellesubtyper, siden disse cellene er fordelt i klynger som faller inn i hverandre og derfor kan feilidentifiseres ved bruk av en grov celleoverflatemarkør tilnærming15. Et økende antall studier avdekker de epigenetiske modifikasjonene som hematopoietiske stam- og stamceller (HSPCs) kan skaffe seg fra eksponering for forskjellige midler, noe som fører til en betydelig innvirkning på immunsystemets langsiktige respons 16,17,18,19. De nye multi-omics-teknologiene gjør det mulig å studere disse prosessene med enkeltcelleoppløsning.

Mange protokoller for celle- og kjerneisolasjon er beskrevet for hjerne 11,20,21,22 og benmargsprøver23,24. For å minimere skjevhet på grunn av eksperimentell variabilitet, er det nødvendig å validere optimaliserte enkeltkjernepreparasjonsprotokoller for felles enkeltcelle transkriptomisk og epigenomisk sekvensering, og dermed sikre reproduserbarheten av enkeltcelle multiomiske analyser.

Her beskrives to robuste protokoller for kjernepreparering fra (1) ferskfrosset hjernevev og (2) ferske benmargs-HSPCer for nedstrøms enkeltcelle multiomanalyse (figur 1).

Figure 1
Figur 1: Skjematisk fremstilling av protokoller for kjerneisolering fra ferskfryst hjerne- og beinmargsvev. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Protocol

Eksperimentelle prosedyrer ble utført under streng regulatorisk overholdelse av protokoller godkjent av Komiteen for etikk i dyreforsøk (CETEA). For hjernekjerneisolasjonen ble 3 måneder gamle C57BL/6-mus brukt. Til benmargsisoleringen ble det brukt 8 uker gamle kvinnelige C57BL/6J-mus som veide 18 g.

1. Rensing av kjerner fra musehjernen

MERK: Bruk lateks- eller nitrilhansker til enhver tid under prosedyren. Det anbefales på det sterkeste å ha to personer som utfører eksperimentet, å ha trinn 1 til 3 (dvs. fremstilling av enkeltkjernesuspensjonen) utført av en person, og trinn 4 (dvs. forberedelse av sortereren) utført parallelt av en annen person. Siden protokollen er svært tidssensitiv, er det avgjørende å minimere prøvebehandlingstiden ved å ha sortereren klar så snart enkeltkjernesuspensjonen er forberedt.

  1. Fremstilling av reagenser og materialer
    1. Steriliser disseksjonsverktøyene forsiktig med autoklav (ved 121 °C i 20 minutter) og vask dem med etanol 70 % rett før bruk. Forbered en petriskål per prøve, fylt med 2-3 ml iskald 1x Dulbeccos fosfatbufret saltvann (DPBS).
    2. Avkjøl mikrosentrifugen til 4 °C, fyll en bøtte med is og legg glassdounce-homogenisatoren på is.
    3. Forbered kjernelysisbuffer ved å tilsette digitonin for en endelig konsentrasjon på 0,01%, 10 ml per prøve.
    4. Forbered fargebufferen ved å tilsette RNase-hemmere til cellefargebufferen for en endelig konsentrasjon på 0,2 U / μL, 20 ml per prøve.
    5. Forbered DPBS 0,04% BSA ved å tilsette RNase-hemmere for en endelig konsentrasjon på 0,2 U / μL, 2 ml per prøve.
    6. Forbered 1 ml fortynnet kjernebuffer i henhold til Multiome-protokollen25.
    7. Oppbevar alle reagenser og prøver på is.
  2. Vev disseksjon
    1. Ofre mus ved hjelp av protokoller godkjent av institusjonen. I denne protokollen ble musene halshugget etter en ketamin / xylazin overdose.
    2. Klipp musehodet med saks og fjern hjernen fra skallen som beskrevet i Meyerhoff et al.26. Overfør umiddelbart hjernen til en petriskål tilberedt med den iskalde 1x DPBS under et lysemitterende diode (LED)-opplyst stereomikroskop.
    3. Klipp hjernevevet med en skalpell for å skille hjerneområder av interesse (f.eks. Entorhinal cortex, hippocampus, prefrontal cortex) og overfør hver region til en egen petriskål som inneholder iskald 1x DPBS. Hold på is.
    4. Hakk vevet i <0,5 cm stykker med en skalpell for å lette homogeniseringen i det følgende trinnet.
    5. Med en P1000-mikropipette overfører du hakket vev og 1x DPBS fra petriskålen til et 1,5 ml rør. Sørg for å bruke rør laget av protein-lavbindende plast. La vevstykkene skille seg ved tyngdekraften. Fjern forsiktig overskuddet av 1x DPBS ved hjelp av en P1000 mikropipette.
      MERK: Etter dette trinnet er det mulig å knipse og fryse det hakkede vevet ved å overføre proteinets lavbindende rør til tørris og deretter lagre ved -80 °C til du fortsetter med kjerneisolering.
  3. Kjerner isolasjon
    1. Fyll glassdunken med 2 ml iskald kjernelysbuffer med 0,01 % digitonin. Tilsett vevsbitene i spretten.
      MERK: Hvis du arbeider med ferskfrosset vev, tilsett det hakkede frosne vevet direkte til kjernelysebufferen 0,01% digitonin; Ikke la vevet tine før.
    2. Homogeniser ved hjelp av et glass dounce vev homogenisator 25 ganger med pestle A og deretter 25 ganger med pestle B. Overfør homogenatet til et 15 ml rør.
    3. Legg til ytterligere 2 ml iskald kjernelysbuffer med 0,01% digitonin og inkuber på is i 5 minutter. Sentrifugekjerner ved 500 x g i 5 minutter ved 4 °C.
    4. Fjern supernatanten med en mikropipette og tilsett 4 ml iskald kjernelysbuffer med 0,01 % digitonin. Inkuber på is i 5 min og filtrer gjennom en 40 μm cellesil.
    5. Sentrifugekjerner ved 500 x g i 5 minutter ved 4 °C og fjern supernatanten med en mikropipette.
    6. Tilsett 4 ml fargebuffer for å vaske kjernene og sentrifuger ved 500 x g i 5 minutter ved 4 °C. Fjern supernatanten med en mikropipette og resuspender pelleten i 4 ml fargebuffer.
    7. Filtrer gjennom en 40 μm cellesil og sentrifuge ved 500 x g i 5 minutter ved 4 °C. Resuspender i 1 ml PBS med 0,04 % BSA.
    8. Telle kjerner for å sikre konsistens av vev / kjerner forberedelse på tvers av ulike prøver. Det forventes å oppnå lignende kjernetall fra de samme hjernegruppene:
      1. Tilsett 10 μL 0,4% trypanblå til et tomt 0,5 ml rør. Tilsett 10 μL av kjernene og bland 5x ved pipettering.
      2. Tell kjerner ved hjelp av en automatisert celleteller etter leverandørens anbefalinger. Hold kjernene på is.
    9. Forbered kjerner for sortering.
      MERK: De ekstraherte kjernene inneholder 7-AAD, og denne fargingen brukes til rensing av fluorescensaktivert cellesortering (FACS).
      1. Overfør 100 μL kjerner til et FACS-rør for ufarget kontroll. Tilsett 10 μL 7-AAD til de gjenværende kjernene, og hold 5 minutter ved 4 °C.
      2. Sorter minimum 0,5 x 106 kjerner etter FACS for å eliminere dubletter og rusk.
  4. Kjernesortering ved hjelp av en FACS
    MERK: Mens kjernesortering kan utføres på et bredt utvalg av cellesorterere, er prosedyren for bruk av instrumentene BD FACSAria Fusion eller BD FACSAria III beskrevet her. Det anbefales sterkt at kalibreringen og oppsettet av cellesortereren utføres under tilsyn, eller av en erfaren bruker av instrumentet. For å redusere prøvebehandlingstiden er det avgjørende å ha sortereren klar så snart den enkle kjernesuspensjonen er klargjort.
    1. Kalibrering av FACS-instrument
      1. Slå på cellesorteringen og datamaskinen. Når programvaren er koblet til instrumentet, starter du den fluidiske oppstartsprosedyren. Velg Cytometer > Fluidic oppstart i hovedmenyen og følg de fire trinnene. Klikk på Ferdig etter å ha fullført hver.
      2. Sett inn 70 μm dysen, slå på strømmen og la strømmen stabilisere seg i 15 minutter. Juster amplitude for å få dråpeformasjon og klikk på Sweet Spot.
      3. Sett filteret med nøytral tetthet (N.D) 1.0 og åpne grensesnittet for cytometeroppsett og sporing (CST).
      4. Daglig kvalitetskontroll: Fortynn CST-perler i FACS-medium (se leverandørens anbefalinger) og utfør CST-kontroll. Når du er ferdig, erstatter du N.D 1.0 med N.D 2.0.
      5. Fortynn Accudrops i FACS-medium (se leverandørens anbefalinger) og utfør dråpeforsinkelse som beskrevet i trinn 6 til 10.
      6. Velg Accudrop Drop Delay-eksperimentet i eksperimentmalen og åpne sorteringsoppsettet for røret.
      7. Inne i det nedre kameravinduet klikker du på Spenning og deretter på Optisk filter for å aktivere ladning på avbøyningsplatene og bruke et spesifikt optisk filter foran kameraet. Sørg for at kvadranten på høyre side indikerer 100. Juster om nødvendig den røde laserskruen for å optimalisere laserpåvirkningen.
      8. Juster strømningshastigheten for å nå hastigheten på 1 000 til 3 000 hendelser per sekund.
      9. Klikk på Sorter og avbryt. Sørg for at venstre kvadrant er lik 100, og høyre kvadrant er 0. Hvis venstre kvadrant er under 95, utfør automatisk forsinkelse.
      10. Klikk på Spenning, deretter Test Sorter. Kontroller kvaliteten på sidestrømmene som legges i oppsamlingsrørene. Juster om nødvendig posisjonen til sidestrømmene ved å flytte glidebryterne.
    2. Oppsett av FACS-instrument for kjernesortering.
      1. Start oppkjøpet av de ufargede kjernene. Disse brukes til å definere forover- og sidespredningene, og detektorspenningen for 7-ADD-parameteren. Still inn parametrene slik at 7-AAD-signalet til den ufargede prøven faller innenfor det første tiåret av loggskalaen på punktplottet.
      2. Begynn å anskaffe røret av 7-AAD-fargede kjerner og definer kjernepopulasjonene ved å bruke en gating-strategi basert på (1) FSC-A / SCC-A og deretter FSC-H / SSC-H for størrelse og granularitet, (2) FSC-H / FSC-A for dublettdiskriminering, og (3) SSC-A / 7-AAD for 7-AAD positive kjerner (se figur 2A).
      3. Forsikre deg om at strømmen og nedbøyningen er stabile.
      4. I sidestrømkameraet slår du på testsorteringen, spenning PÅ, og bekrefter nøyaktig fallsortering i et 1,5 ml rør montert på venstre side.
      5. I vinduet Sorteringsoppsett velger du interessegruppen, som definert i trinn 2 (ovenfor). I Målhendelser velger du terskelen i Kontinuerlig for å få minst 0,5 x 106 kjerner per prøve. Under Presisjon velger du 4-veis renhet.
      6. Når du er klar, klikker du på Sorter og OK for å starte med kjernesortering.
  5. Kvalitetskontroll og telling av rensede kjerner
    MERK: Dette trinnet skal bare gjøres under piloteksperimentet for optimalisering av prøveprepareringstrinn, med mål om å teste renheten til de sorterte kjernene som skal lastes på 10X krombrikken. Når protokollen er fullstendig optimalisert, anbefales det ikke å utføre dette kvalitetskontrolltrinnet i oppfølgingsforsøkene for å unngå unødvendig sløsing med innsamlede kjerner som kan være tilgjengelige i lave antall.
    1. Renhetskontroll ved flowcytometri
      1. Overfør 10 μL av de sorterte kjernene til et nytt FACS-rør som inneholder 90 μL DPBS med 2% varmeinaktivert Fetal Bovine Serum (HI-FBS).
      2. Innhent og registrer data etter sortering for å bekrefte sorteringsrenhet og levedyktighet. Sørg for at minst 98% av kjernene vises i porten av interesse, som definert i 4.2 (se figur 2B).
    2. Teller de rensede kjernene
      1. Sentrifugesorterte kjerner i 5 minutter ved 500 x g og ved 4 °C og fjern supernatanten forsiktig helt ved hjelp av en mikropipette. Resuspender i 100 μL fortynnet kjernebuffer.
      2. Tilsett 10 μL 0,4% trypanblå til et tomt 0,5 ml rør. Tilsett 10 μL av de sorterte kjernene og bland 5x ved pipettering.
      3. Tell kjerner ved hjelp av en automatisert celleteller etter leverandørens anbefalinger. Juster kjernekonsentrasjonen til 3,5 x 106/ml, dvs. 16 000 kjerner per 5 μL.
    3. Kvalitetskontroll av rensede kjerner ved mikroskopi
      MERK: Dette trinnet skal bare gjøres under piloteksperimentet for optimalisering av prøveprepareringstrinn for å teste kvaliteten på kjernene som skal lastes på 10X krombrikken. Når protokollen er fullstendig optimalisert, anbefales det ikke å utføre dette kvalitetskontrolltrinnet i oppfølgingsforsøkene for å unngå unødvendig sløsing med innsamlede kjerner som kan være tilgjengelige i lave antall.
      1. Sørg for at lysbilder med mikroskop og dekselslipp er rene og støvfrie. Hvis nødvendig, vask og skyll dekslene med absolutt etanol og tørk dem med lofrie kluter.
      2. Fordel 25 μL poly-l-lysin i glidebrønnene som skal brukes og inkuber i 10 minutter ved romtemperatur (RT), beskyttet mot støv.
      3. Fjern overflødig poly-l-lysin og tilsett 10 μL av den rensede kjernesuspensjonen. Inkubere i 5 min ved RT, beskyttet mot støv.
      4. Tilsett en dråpe monteringsmedium til hver brønn, unngå bobler.
      5. Legg en dekkslipp på toppen av de frøede brønnene. Dekk til med papirservietter og trykk dekselet hardt for å fjerne overflødig monteringsmedium. Vær forsiktig så du ikke flytter dekselet, og ikke rengjør overflødig monteringsmedium.
      6. Ta flere bilder med et invertert mikroskop med lysfelt og en minimumsforstørrelse på 40x.
  6. Utfør multiomanalyse.
    1. Fortsett umiddelbart til Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression User Guide (CG000338 - Rev F)25.

2. Rensing av kjerner fra mus, benmarg, hematopoietisk stamme og stamceller (HSPCs)

MERK Denne protokollen beskriver rensing av kjerner fra tre undergrupper av benmargen HSPCs: lineage-c-Kit + Sca-1 + hematopoietiske stamceller (HSC), avstamning-c-Kit + Sca-1-CD34 + FcγR- vanlige myeloide forfedre (CMP), og avstamning-c-Kit + Sca-1-CD34 + FcγR + granulocyt-monocytprogenitorer (GMP). Bruk latex eller nitrilhansker til enhver tid under prosedyren. Denne protokollen er en tilpasning av 10X Genomics Demonstrated Protocol - Nuclei Isolation for Single Cell Multiome ATAC + GEX sekvensering (CG000365 - Rev C) 27. Modifikasjoner er introdusert i den opprinnelige protokollen for å maksimere kjerneutvinning. Det anbefales på det sterkeste å ha to personer som utfører eksperimentet, for å ha trinn 1. til 3. (dvs. fremstilling av encelleoppløsningen) utført av en person, og trinn 4 (dvs. fremstilling av sorteringen) utført parallelt av en annen person. Siden protokollen er svært tidssensitiv, er det avgjørende å minimere prøvebehandlingstiden ved å ha sortereren klar så snart encellesuspensjonen er klargjort.

  1. Fremstilling av reagenser og materialer
    1. Fyll en bøtte med is.
    2. Forbered FACS-bufferen: DPBS med 2% HI-FBS-løsning (ca. 500 ml for 6 prøver) og filtrer gjennom et 0,2 μm filter.
    3. Forbered oppsamlingsmediet: DPBS med 10% HI-FBS-løsning (500 μL per prøve), og filtrer gjennom et 0,2 μm filter.
  2. Isolering av benmargceller
    1. Ofre mus ved hjelp av protokoller godkjent av institusjonen. I dette forsøket ble musene ofret av cervikal dislokasjon etter en ketamin / xylazin overdose.
    2. Spray musens mage og bakben med 70% etanol.
    3. Bruk steril tang og saks til å lage et lite snitt midt i underlivet og åpne bukhinnen fra bakbeina til mellomgulvet (tilleggsfigur 1).
    4. Lag et ekstra kutt for hvert bakben vinkelrett på den åpnede bukhinnen, ta deretter tak i hver side av et av disse ekstra kuttene og trekk det fra hverandre for å skrelle av huden fra begge bakbenene forbi ankelleddet for å eksponere musklene i begge bakbenene (tilleggsfigur 1A).
    5. Linje saksen langs ryggraden ved hofteleddet på det ene bakbenet for å skjære ut benet uten å skjære gjennom lårbenet (tilleggsfigur 1B, C). Gjenta det samme for det andre benet.
    6. For å isolere lårbenet, skjær det meste av muskelvevet ut, og hold deretter lårbenet og tibia i hver hånd med fingertuppene i leddet (tilleggsfigur 1D, E). Brett benet forsiktig mot den naturlige bøyningen for å forskyve tibia fra lårbenet (tilleggsfigur 1E) og klipp deretter bindevevet forsiktig med saks for å skille lårben og tibia.
    7. Bruk saksen med lette vridningsbevegelser for å forskyve biten av ryggraden fra den øverste enden av lårbenet (tilleggsfigur 1E).
    8. Rengjør det isolerte lårbenet med silkepapir for å fjerne gjenværende muskel og bindevev.
    9. Hold kaldt på is i en 12-brønns platebrønn fylt med 2 ml DMEM (1x) + GlutaMAX-I.
    10. Når alle lårbenene er samlet, må du sørge for at muskler og fibrøst vev er helt fjernet fra beinet. Ikke kutt benet åpent for å (a) holde margen inne steril og (b) unngå å miste celler i brønnen. Bruk følgende trinn for å skylle cellene fra to lårben på en mus, tilpasset fra Haag og Murthy28.
    11. Forbered ett 1,5 ml og ett 0,5 ml rør. Tilsett 150 μL av FACS-bufferen til 1,5 ml røret, stikk deretter et hull i bunnen av 0,5 ml røret ved hjelp av en 18 G nål og sett 0,5 ml røret inn i 1,5 ml røret.
    12. Åpne den distale delen av hvert lårben med kirurgisk saks fra mus (tilleggsfigur 1F): Lås inn den distale epifysen mellom bladene og trykk forsiktig mens du snur saksen for å løsne den distale epifysen jevnt uten å kutte opp benet hardt. Hvis det lykkes, skal 4 fremspring være synlige ved den nå eksponerte fysenden (tilleggsfigur 1G).
    13. Monter de to lårbenene med den åpne enden vendt nedover i det forberedte 0,5 ml røret plassert inne i et 1,5 ml rør inneholdende FACS-buffer (tilleggsfigur 1H).
    14. Plasser en 70 μm cellesil på et 50 ml rør og forvåt silen med 2 ml FACS-bufferen.
    15. For å skylle benmargen, sentrifuge rørene (kappene åpne) ved 12.000 x g til sentrifugen når 12.000 x g-verdien, og stopp deretter sentrifugen umiddelbart.
    16. Kontroller at benmargscellene er pelletert i 1,5 ml tuben og at lårbenene er hvite (før cellespyling, de er røde) (tilleggsfigur 1I). Kast 0,5 ml rørene med de 2 lårbenene.
    17. Kast 150 μl supernatanten med en pipette.
    18. Resuspender pelleten med en mikropipette i 1 ml ammoniumklorid-kalium (ACK) lyseringsbuffer i 1-2 minutter ved RT for å lyse røde blodlegemer. Unngå lengre inkubasjonstider, da de kan føre til redusert levedyktighet av kjernefysiske celler.
    19. Overfør til 50 ml røret gjennom den forfuktede 70 μm cellesilen.
    20. Tilsett 10 ml FACS-buffer for å fortynne ACK-lyseringsbufferen og dermed stoppe lyseringen.
    21. Sentrifuge ved 400 x g i 5 minutter ved 4 °C. Resuspender i 10 ml FACS-buffer ved først å resuspendere i 1 ml og deretter fylle på med 9 ml.
    22. Forbered cellene for telling som beskrevet i 1.3.8.
    23. Tell cellene ved hjelp av en automatisert celleteller etter leverandørens anbefalinger. Det forventes å samle ca 40 millioner celler fra 2 lårben.
  3. Farging av benmarg HSPC
    1. Sentrifuger cellene ved 400 x g i 5 minutter ved 4 °C og resuspender pelleten med en mikropipette i FACS-buffer til en endelig konsentrasjon på 1 x 107 celler/ml.
    2. Med en P1000 mikropipette, overfør suspensjonen til et FACS-rør, filtrering gjennom en 35 μm cellesilhette.
    3. Forbered enkeltflekkprøverørsprøver for hvert antistoff oppført i tabell 1 for å sette opp kompensasjoner av fluorokromer på cellesortereren:
      1. Forbered ett FACS-rør per antistoff og fyll rørene med 200 μL PBS.
      2. Tilsett 15 μL fluorokromkompensasjonsperler i hvert FACS-rør av fluorokrom-konjugert antistoff. I FACS-rørene for ufarget og for levende / døde enkeltfargede celler, legg til 500 000 celler i stedet for perler.
      3. Tilsett 1 μL av hvert fluorokromkonjugert antistoff (se tabell 1) i det tilsvarende FACS-røret. Tilsett 0,5 μL levende/død flekk i Live/Dead FACS-rør med én flekk.
      4. Oppbevares på is i 15 min beskyttet mot lys.
    4. Tilbered miks 1 og 2 som angitt i tabell 2.
      MERK: Antistoffvolumene angitt i tabell 2 er gyldige for antistoffene referert i materialfortegnelsen. De må optimaliseres for enhver ny antistoffreferanse eller et annet parti av samme antistoffreferanse.
    5. Tilsett 300 μl Mix 1 i prøverøret, resuspender og oppbevar i 15 minutter på is beskyttet mot lys.
    6. Tilsett 300 μl Mix 2 i prøverøret, sett i gang igjen og oppbevar den i 20 minutter på is beskyttet mot lys.
    7. Tilsett 3 ml av FACS-bufferen til de enkeltfargede rørene og de blandede prøverørene. Spinn ned ved 400 x g i 5 minutter ved 4 °C.
    8. Kast supernatanten forsiktig med en mikropipette og resuspender pelleten i 500 mikrol FACS-bufferen.
    9. Forbered et 1,5 ml rør forhåndsfylt med 500 μL oppsamlingsmedium.
      MERK: Mix 1 er tilberedt i DPBS siden den inneholder Live/Dead-flekken som er betydelig påvirket av HI-FBS. Når cellene er farget av Live / Dead, tilsettes Mix 2, som inneholder fluorokrom-konjugerte antistoffer resuspendert i FACS-buffer som inneholder HI-FBS. Det eneste unntaket er anti-CD16/32 antistoffet som er inkludert i antistoffblanding 1 for å tjene som Fc-reseptorblokker som forhindrer den ikke-spesifikke bindingen av de andre antistoffene som ble lagt til i det følgende trinnet.
  4. Cellesortering ved hjelp av en FACS
    MERK: Mens cellesortering kan utføres på et bredt utvalg av cellesorterere, beskrives her prosedyren for bruk av instrumentene BD FACSAria Fusion eller BD FACSAria III. Det anbefales på det sterkeste at kalibreringen og oppsettet av cellesortereren utføres under tilsyn eller av en erfaren bruker av instrumentet.
    1. Kalibrering av FACS-instrument: Se protokoll 1 trinn 4.1.
    2. Oppsett av FACS-instrument for cellesortering:
      1. Start oppkjøpet av de ufargede cellene. Disse brukes til å definere forover- og sidespredningene og detektorspenningen for hver fluorofor. Sett parametrene slik at det fluorescerende signalet til hver fluorofor faller innenfor det første tiåret av loggskalaen på punktplottet.
      2. Skaff enkeltfargekontroller for å definere kompensasjoner manuelt (median for positive og negative populasjoner bør justeres) eller bruk programvaren for automatisk beregning (stigningsmålinger). Kontroller at kompensasjonskontrollene samsvarer med innstillingene for eksperimentelle fluorokrom og detektorer. Registrer 10 000 hendelser for celler og 5 000 hendelser for perler.
      3. Bruk prøverøret (dvs. flerfargede celler) for å definere cellepopulasjoner av interesse ved å bruke gating-strategien vist i figur 3A. Følg trinn 4–6 (nedenfor).
      4. For å identifisere de tre benmargs-HSPCene av interesse (HSC, CMP og GMP), start gatingen ved å bruke størrelsen (FSC-A) og granulariteten (SSC-A) til gate på leukocytter, deretter FSC-H / FSC-A for å diskriminere dubletter.
      5. Basert på SSC-A/dødcellemarkør, gate levende celler. Bruk Lineage/c-Kit til å velge celler som er avstamningsnegative og uttrykker middels til høye nivåer av c-Kit. Gjennom c-Kit / Sca-1, gate på lineage-c-Kit + Sca-1 + (LKS +) HSCs, en av de tre populasjonene av interesse.
      6. Blant de myeloide forfedrene (avstamning-c-Kit + Sca-1-), bruk FcγR / CD34 for å ekskludere CD34-FcγR- megakaryocytt og erytroide progenitorer (MEP), mens du inkluderer CD34 + FcγR- CMP, samt CD34 + FcγR + GMP i cellepopulasjonene som skal sorteres.
      7. Forsikre deg om at strømmen og nedbøyningen er stabil.
      8. I sidestrømkameraet slår du på testsorteringen, spenning PÅ, og bekrefter nøyaktig fallsortering i et 1,5 ml rør montert på venstre side.
      9. I vinduet Sorteringsoppsett velger du populasjonen(e) av interesse (dvs. "LKS+" og "CD34+ myeloide progenitorer" vist i dette eksemplet). Under Enhet velger du 2 Tube. Under Presisjon velger du Renhet. I Målhendelser velger du Kontinuerlig for å sortere mellom 160 000 og 200 000 myeloide LKS+ - og CD34+ -stamfedre.
      10. Legg til 500 μL FACS-buffer til cellesuspensjonen og overfør 1 ml av prøven ved å filtrere til et nytt 35 μm-cellesilavkortet FACS-rør for å sikre at alle celler er i en enkelt suspensjon like før oppkjøp. Dette eliminerer celleklumper som kan tette instrumentet.
      11. Når du er klar, klikker du Sorter og OK for å starte sorteringen. Juster strømningshastigheten for å holde hastigheten under 10 000 hendelser per sekund.
        MERK: Det forventede forholdet mellom LKS + og CD34 + myeloide progenitorer er 1: 3 for en voksen (8-12 uker gammel) C57BL / 6J kvinnelig mus ved en jevn tilstand. De målrettede sorterte cellenumrene nås vanligvis innen 30 minutter etter sortering.
  5. Kvalitetskontroll og telling av sorterte celler
    MERK: Dette trinnet skal bare gjøres under piloteksperimentet for optimalisering av prøveprepareringstrinn, med mål om å teste renheten til de sorterte cellene som skal brukes til kjerneisolasjon. Når protokollen er fullstendig optimalisert, anbefales det ikke å utføre dette kvalitetskontrolltrinnet i oppfølgingsforsøkene for å unngå unødvendig sløsing med startmateriale som kan være tilgjengelig i lave antall for kjerneisolering.
    1. Renhetskontroll ved flowcytometri
      1. Overfør 10 μL av de sorterte cellene til et nytt FACS-rør inneholdende 90 μL FACS-buffer.
      2. Innhent og registrer data etter sortering for å bekrefte sorteringsrenhet og levedyktighet. Sørg for at minst 95% av cellene vises i porten av interesse, som definert i 3 - 6 og illustrert i figur 3B.
  6. Kjerneisolering fra sorterte benmarg HSPCs
    1. Bruk protokollen "Low Cell Input Nuclei Isolation" i vedlegget fra 10X Genomics Demonstrated Protocol - Nuclei Isolation for Single Cell Multiome ATAC + GEX sequencing (CG000365 - Rev C)27, med følgende modifikasjoner gjort for å optimalisere kjerneutvinning:
      1. Lysistid: Kjør et piloteksperiment for denne protokollen for å identifisere den beste lysetiden for kjerneisolasjon. Sørg for å oppnå en fullstendig cellelyse samtidig som intakte kjerner opprettholdes.
        MERK: Trinn f i ovennevnte 10X Genomics-protokoll27 instruerer om å "inkubere [i lysisbuffer] i 3-5 minutter på is". Under pilotforsøket, test minst i 3 minutter, 4 minutter og 5 minutter og vurder gjenvunnet kjernemengde ved telling og kvalitet ved flowcytometri og mikroskopiavbildning for å velge optimal lysvarighet (se beskrivelse av disse kvalitetskontrollene nedenfor). For å spare reagenser, erstatt den fortynnede kjernebufferen med PBS 0,04% BSA i piloteksperimentet. For benmargs-HSPC ble 3 min identifisert som optimal lysisvarighet.
      2. Cellesentrifugeringer: For alle celleopphengssentrifugeringer, sentrifuge ved 300 x g i 7 minutter (i stedet for 5 minutter i CG000365 - Rev C)27 ved 4 °C.
      3. Kjernesentrifugeringer: Utfør alle kjernesuspensjonssentrifugeringer ved 500 x g i 5 minutter i henhold til CG000365 - Rev C27.
      4. Kjerneoppsamling: I trinn b, etter resuspendering i 50 μL PBS 0,04 % BSA og overføring til et 0,2 ml rør, tilsett 50 μL PBS 0,04 % BSA til det originale røret og pipetteblandingen for å samle eventuelle gjenværende celler. Overfør til 0,2 ml rør for å nå totalt 100 μL volum.
      5. Heretter vil det totale volumet være 100 μL i stedet for 50 μL i protokollen. Juster trinnene nedstrøms tilsvarende (f.eks. for trinn d, fjern 90 μL i stedet for 45 μL; for trinn e, legg til 90 μL lysisbuffer i stedet for 45 μL).
      6. For trinn m, resuspender kjernepelleten i 12 μL fortynnet kjernebuffer i stedet for 7 μL.
      7. Tell de isolerte kjernene. I et tomt 0,5 ml rør, tilsett 10 μL 0,4% trypanblå og 8 μL PBS 0,04% BSA.
      8. Tilsett 2 μL kjerner til røret og telle kjerner som beskrevet i 1.3.8. Bruk en automatisert celleteller etter leverandørens anbefalinger.
  7. Renhetskontroll ved flowcytometri
    MERK: Dette trinnet skal bare gjøres under piloteksperimentet for optimalisering av prøveprepareringstrinn for å teste renheten til kjernene som skal lastes på 10X Chromium-brikken. Når protokollen er fullstendig optimalisert, anbefales det ikke å utføre dette kvalitetskontrolltrinnet i oppfølgingsforsøkene for å unngå unødvendig sløsing med innsamlede kjerner som kan være tilgjengelige i lave antall.
    1. Etter å ha fullført kjerneisolering, overfør 6 μL kjerneresuspensjon i et nytt FACS-rør forhåndsfylt med 150 μL FACS-buffer. Tilsett 3 μL 7-AAD og rug i 5 min på is.
    2. Innhent og registrer data etter sortering for å bekrefte sorteringsrenhet og levedyktighet. Sørg for at minst 95 % av kjernene vises i porten av interesse, som definert i protokoll 1 trinn 4.2 (se figur 4).
  8. Kvalitetskontroll av rensede kjerner ved mikroskopi:
    MERK: Dette trinnet skal bare gjøres under piloteksperimentet for optimalisering av prøveprepareringstrinn for å teste kvaliteten på kjernene som skal lastes på 10X Chromium-brikken. Når protokollen er fullstendig optimalisert, anbefales det ikke å utføre dette kvalitetskontrolltrinnet i oppfølgingsforsøkene for å unngå unødvendig sløsing med innsamlede kjerner som kan være tilgjengelige i lave antall.
    1. Fortsett som beskrevet i trinn 1.5.3.
  9. Utfør multiomanalyse
    1. Fortsett umiddelbart til Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression User Guide (CG000338 - Rev F)25.

Representative Results

De to protokollene beskrevet ovenfor beskriver isoleringen av kjerner som starter fra to forskjellige typer vev. Forskjellene og likhetene mellom de to protokollene er skjematisk representert i figur 1.

Rensing av kjerner fra musehjerne
I protokollen som er beskrevet her, foreslår vi en skånsom metode for kjernepreparering fra hjerneprøver. Det starter med en mekanisk dissosiasjon av hjernevevet i en lysisbuffer, etterfulgt av vaske- og silfiltreringstrinn som fjerner det gjenværende vevet fra suspensjonen. Den påfølgende fjerningen av rusk, ikke-lyserte celler og små partikler oppnås av FACS for å garantere at bare rensede kjerner lastes for nedstrøms Multiome-protokoll. Figur 2 viser profilen til kjerner før og etter sortering. Etter filtreringen og før kjernesortering inneholder prøven en høy mengde rusk, med mer enn 99% av "singletene" positive for kjernefysisk flekk (7-AAD), noe som indikerer optimal cellelyse (figur 2A). Kjerner sorteres basert på den 7-AAD positive porten. En brøkdel av sortert materiale er anskaffet for å verifisere renheten til de fremstilte kjernene. Figur 2B viser profilen til hjernekjernene etter sortering. Kjernesorteringen tillot en økning i kjernens renhet fra de første 36% (figur 2A) til nesten 100% (figur 2B).

Figure 2
Figur 2: Gating strategi for kjernesortering og renhetstest etter sortering. Kjerner ble farget med 7-AAD og ervervet av cellesortereren. (A) Kjerner styres først basert på størrelse og granularitet (henholdsvis FSC-A og SSC-A). Enkeltpartikler velges deretter basert på deres FSC-A/FSC-H-egenskaper og 7-AAD-farging. (B) Etter cellesortering testes en brøkdel av kjernene fra oppsamlingsrøret for renhet ved bruk av samme gatingstrategi som i A. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Rensing av mus benmarg hematopoietiske stamcelleprogenitorer (HSPCs)
Ved isolering fra benmargen sorteres opptil 2 x 105 HSPC etter FACS, i henhold til gatingstrategien vist i figur 3A. Sorteringseffekt og prøverenhet vurderes (figur 3B).

Figure 3
Figur 3: Gating strategi for sortering av benmarg HSPCs. (A) En representativ FACS gating-strategi for sortering av levedyktige LKS+ hematopoietiske stamceller og CD34+ myeloide forfedre for kjerneisolering. (B) Representative FACS-plott som brukes til verifisering av sortert cellepopulasjonsrenhet. Vist er proporsjonene av forskjellige celleundergrupper med hensyn til foreldrepopulasjonen. *De to sorterte populasjonene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Protokollen "Low Cell Input Nuclei Isolation" tillater kjerneisolering fra prøver med maksimalt 105 celler. Den inkluderer et lavt antall sentrifugeringstrinn, og minimerer dermed celle / kjernetap. Vi har justert volumet av lysis og vaskebuffere proporsjonalt med celleinngangen og økt sentrifugeringstiden for maksimal kjernegjenvinning. Vi har utført et pilotforsøk for å vurdere mengden gjenvunnede kjerner ved telling og deres kvalitet ved flowcytometri og mikroskopiavbildning. Figur 4 viser HSPC-prøven etter cellelyse. Denne protokollen genererte kjerner av høy kvalitet, som observert i figur 5A, uten rusk som kunne påvirke nedstrøms multiomprotokollen.

Figure 4
Figur 4: Renhetstestsortering av isolerte benmargs HSPC-kjerner. Kjerner ble farget med 7-AAD og ervervet av cellesortereren. Kjerner ble først styrt basert på deres størrelse og granularitet (henholdsvis FSC-A og SSC-A) for å vurdere renheten av prøven. Andelen kjerner er indikert med hensyn til foreldrepopulasjonen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tube nummer Tube navn Beiset enhet Mengde farget enhet Antistoff/fargestoff (μL) Buffer for oppsamling (μL)
1 Ubeiset Celler 5,00,000 N/A 200
2 LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Celler 5,00,000 0.5
3 APC/cyanin 7 anti-mus CD16/32 (FcγR) OneComp eBeads 15 μL 1
4 Pacific Blue anti-mus Lineage Cocktail OneComp eBeads 15 μL 1
5 PE anti-mus Ly-6A / E (Sca-1) OneComp eBeads 15 μL 1
6 APC anti-mus CD117 (c-Kit) OneComp eBeads 15 μL 1
7 FITC anti-mus CD34 OneComp eBeads 15 μL 1

Tabell 1: Enkle flekkkontroller for kompensasjonsinnstillinger på flowcytometeret. Indikert er de nødvendige enkeltflekkkontrollene, antall celler eller perler som skal farges, og antistoffmengdene.

Master Mix Reagent Endelig fortynning Antistoff/fargestoff (μL) Type buffer Buffer (μL)
Bland 1 APC/cyanin 7 anti-mus CD16/32 (FcγR) 1/500 1.2 DPBS 300
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain 1/250 2.4
Bland 2 Pacific Blue anti-mus Lineage Cocktail 1/20 30 FACS-buffer 300
PE anti-mus Ly-6A / E (Sca-1) 1/200 3
APC anti-mus CD117 (c-Kit) 1/200 3
FITC anti-mus CD34 1/50 12
Totalt fargevolum 600

Tabell 2: Sammensetning av fargeblandingen for benmargs-HSPCer. Vist er volumer av reagenser som kreves for farging av en prøve som inneholder 40 millioner celler. For farging av et høyere antall prøver, multipliser det angitte volumet med det nødvendige antall prøver og tilsett halvparten av et ekstra prøvevolum for å sikre et tilstrekkelig volum av masterblandingen.

Tilleggsfigur 1: Benmargscelleisolasjonsprotokoll. (A) Åpne bukhinnen. Hvite stiplede linjer indikerer linjen som skal skjæres sammen. (B) Etter å ha skrellet huden av fra bakbenet, legg saksen langs ryggraden ved hofteleddet for å kutte ut benet uten å kutte gjennom lårbenet. (C) Utseendet på benet skilt fra kroppen før fjerning av muskel. (D) Utseendet til benet etter fjerning av muskel. (E) Prosedyren for å skille lårbenet ved kneleddet, deretter i hofteleddet, pass på at du ikke kutter lårbenet. Hvite buede piler viser bevegelsen som kreves. Hvite stiplede piler indikerer området som skal skilles forsiktig ved hjelp av saks for å klemme av. (F) Prosedyre for å åpne den distale delen av lårbenet (dvs. den delen som tidligere er festet til tibia ved kneleddet) ved å ta tak i brusk og distale epifyse med saks og vende den tilbake for å avsløre benmargen. (G) Fire fremspring, indikert med svarte piler, skal være synlige ved den eksponerte fyseenden. (H) Utseendet til et lårben med den åpne enden vendt nedover i det forberedte 0,5 ml røret plassert inne i et 1,5 ml rør inneholdende 150 μL FACS-buffer. (I) Utseendet til de pelleterte benmargcellene og det nå hvite lårbenet etter rask sentrifugering ved 12 000 x g. Klikk her for å laste ned denne filen.

Discussion

Fremstilling av høykvalitets celle- eller kjernesuspensjon er av avgjørende betydning for suksessen til enkeltcelle- eller enkeltkjerner RNA-Seq og encellede multi-omiske analyser 29,30,31. Her har vi beskrevet protokoller for prøvepreparering og kjerneisolering for multiomanalyser fra to typer vev: hjerne og benmarg.

Hjerneprotokollen beskrevet i dette papiret tillater utvinning av kjerner av høy kvalitet fra ferskfrosset hjernevev. Den inneholder følgende trinn: frosset vevsforstyrrelse, isolering av kjerner, rensing av kjerner og kvalitetskontroll av det tilberedte materialet. Hjernevevet består av mange forskjellige celletyper, og prosedyren for vevsdissosiasjon og kjerneisolering bør bevare proporsjonene av cellepopulasjoner som tilstede i det opprinnelige vevet. Her ble lysisbuffersammensetningen og inkubasjonstiden optimalisert for å muliggjøre fullstendig og skånsom lysering av alle cellepopulasjoner som komponerer vevet.

Benmarg HSPCs protokollen er noe annerledes siden det krever ett ekstra trinn i begynnelsen av forsøket for å isolere cellepopulasjonen av interesse fra en heterogen cellulær suspensjon. Etter samlingen av ferskt vev lyseres røde blodlegemer, og prøven er beriket for celledelmengden av interesse. De målrettede cellene lyseres, kjernene isoleres, og kvaliteten på det fremstilte materialet kontrolleres.

10X Genomics gir flere protokoller validert for kjerneisolering i mange forskjellige vev32,33. Selskapet kommersialiserer også et kjerneisolasjonssett med en enkel rørledning for å isolere kjerner fra validerte vev34. Imidlertid trenger disse protokollene ytterligere optimalisering for å skreddersy særegenhetene til visse prøver. Et eksempel er prøvene som krever arbeid med lav celleinngang. For disse prøvene er de mest utfordrende trinnene sentrifugeringer som må være tilstrekkelig strenge til å rengjøre prøven og skånsomme nok til å unngå celle-/kjernetap. Med protokollen beskrevet her har vi tilpasset 10X Genomics Demonstrated Protocol - Nuclei Isolation for Single Cell Multiome ATAC + GEX Sequencing (CG000365 - Rev C)27 for å finne en fin balanse mellom disse to kravene. Som vist i eksemplet med fremstilling av kjerner fra sorterte HSPCer, har vi forbedret kjerneutvinningen uten å påvirke prøvens kvalitet.

En ekstra utfordring er trinnet med lysis av rensede celler for kjerneisolering. Tøffere lysforhold og lengre inkubasjonstid kan skade kjerner og dermed påvirke kvaliteten på sekvenseringsdata. Figur 5 viser representative kjerneavbildning fra beinmargsprøver ved ulike inkubasjonstider med lysisbuffer og illustrerer hvor forskjellig tilstanden til kjernene kan være avhengig av cellelysen. I eksempelet med HSPC har vi identifisert 3 min lyse som tilstanden som resulterer i den høyeste andelen friske, intakte kjerner og den laveste andelen skadede kjerner. Lysisinkubasjonstidene bør optimaliseres for hver ny type prøve.

Figure 5
Figur 5: Kjernekvalitetskontroll ved mikroskopi. Vist er representative lysfeltbilder av isolerte kjerner fra musebenmarg med (A) intakte og (B) skadede kjerner. Skala bar 5 μm. Bildene ble tatt med et invertert mikroskop ved hjelp av et 40x ELWD NA 0.60 objektiv og 1.5x digital zoom. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Begge protokollene som er beskrevet i dette arbeidet, er avhengige av å rense målrettede celler eller kjerner ved hjelp av FACS-instrumenter med høy gjennomstrømning. Dette trinnet er av avgjørende betydning for enkeltcelle-/kjerneprepareringsprotokoller der sjeldne undergrupper av celler skal isoleres fra heterogene suspensjoner. I disse, som i eksemplet vist her for HSPC-sortering, kan det være nødvendig med et høydimensjonalt flowcytometripanel for å aktivere "gating" på cellepopulasjonen av interesse. Sorteringen er ekstremt rask og nøyaktig, noe som fører til over 95% renhet av de sorterte celleundergruppene. Denne tilnærmingen utsetter den cellulære suspensjonen for et trykk på opptil 70 psi og kan derfor være begrensende for sortering av skjøre celler (f.eks. Dendrittiske celler, nøytrofiler) siden det kan forårsake brudd på cellemembranen. I disse tilfellene bør alternative løsninger velges for cellulær rensing, inkludert magnetisk sortering, anvendelse av ny generasjons instrumenter (f.eks. CellenOne, Cellenion; MACSQuant Tyto, Miltenyi)35,36 eller dråpebaserte systemer (f.eks. ODIN, Sensific)37. Ikke desto mindre er den langsomme sorteringshastigheten til disse teknologiene, med cellesortering som varer i flere timer i stedet for minutter, en sterk begrensende faktor for anvendelsen av disse tilnærmingene i utarbeidelsen av levedyktige celler for Multiome og andre enkeltcelleapplikasjoner basert på analyse av store celletall.

For rensing av kjerner isolert fra vevet, er FACS den valgte metoden på grunn av dens gjennomstrømning og renheten av det isolerte materialet. Kjerner er ikke følsomme for trykk, og filtrerte vevsisolater kan enkelt renses gjennom cellesorteringen. Hvis laboratoriet ikke er utstyrt med et FACS-instrument, finnes det andre alternativer, noe mindre effektive, men tilstrekkelig gode. Eksempler inkluderer ultrasentrifugering eller bruk av lite utstyr som MARS (Applied Cell) som skiller partikler basert på deres forskjell i størrelse, ved hjelp av akustiske bølger; CURIOX laminær vaskemaskin som bruker hydrofobe egenskaper til celle-/kjernesuspensjoner; eller LEVITAS bio som er avhengig av fysiske egenskaper av celler (levitasjon) for å skille dem fra rusk.

Her beskriver vi protokoller for å oppnå et høyt antall kjerner og den beste renheten for nedstrøms Multiome-protokollen. FACS-sortering og gjentatte sentrifugeringstrinn resulterer i et betydelig tap av det opprinnelige materialet. Av denne grunn krever i protokollen for kjernepreparering fra hjernen som vi beskriver her tilstrekkelig rikelig startmateriale til å resultere i innsamling av minst 500 000 kjerner etter FACS-sorteringen. Alternative protokoller bør anvendes dersom dette kriteriet ikke kan oppfylles. Når du arbeider med sjeldne cellepopulasjoner eller små vevsseksjoner, kan den tilgjengelige mengden initialt materiale være en begrensende faktor. For å løse dette problemet er det mulig å forbedre kjerneutvinningen ved å (a) redusere lysvolumet, (b) redusere vaskevolumet, (c) bruke en enkelt vask med utvidet sentrifugeringstid for å prøve å forbedre utvinningen som angitt i 10X Genomics-protokoller for isolasjon av lavcelleinngangskjerner. For multiomisk analyse av materiale med lite innhold, er det verdt å vurdere platebaserte applikasjoner som scNMT, SNARE-seq og Paired-seq38 som krever mye færre inngangsprøver.

Oppsummert har vi beskrevet to robuste protokoller for fremstilling av kjerner fra hjernen og benmargs-HSPCer for nedstrøms multiomanalyse. Disse protokollene kan brukes i ethvert vitenskapelig prosjekt som krever suspensjoner av enkeltkjerner av høy kvalitet fra disse to vevstypene, uavhengig av det vitenskapelige spørsmålet som stilles. Vår gruppe har brukt isolasjonsprotokollen for hjernekjerner i studier av hjernens utvikling ved inaktivering av ulike målrettede gener og i studier av immunrespons i sammenheng med nevrologiske sykdommer. Vi bruker isolasjonsprotokollen for benmargskjerner for å dechiffrere deltakelsen av forskjellige hematopoietiske underpopulasjoner i etableringen av immunsystemet.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Ana Jeemin Choi ble støttet av et stipend fra Pasteur - Paris University (PPU) International Ph.D. Program.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
18 G x 1 ½ (1.2 mm x 38 mm) Agani needles Terumo AN*1838S1
15 mL tubes Falcon 352097
5 mL round bottom FACS tube with cell strainer cap 35 µm falcon 352235
50 mL tubes Falcon 352070
7-AAD BD pharmagen 559925
ACK Lysing Buffer Gibco A10492-01
APC anti-mouse CD117 (c-Kit) BioLegend 105812 Clone: 2B8
APC/Cyanine 7 anti-mouse CD16/32 (FcγR) BioLegend 101328 Clone: 93
BD FACSAria III BD Biosciences non-applicable
BD FACSDiva Software v8.0.1 BD Biosciences non-applicable
Bovine Serum Albumin  stock solution 10% Miltenyi Biotec 130-091-376
Cell staining buffer Biolegend 420201
CFI Suprplan Fluor ELWD 40XC ON 0.6 Nikon  non-applicable
CMOS camera Prime 95B 25 mm Photometrix non-applicable
Countess II FL Automated Cell Counter Invitrogen AMQAF1000
Countess cell counting chamber slide Invitrogen C10283
Coverglass 24 mm x 24 mm 0.13-0.17 mm Brand BR470819
Digitonine 5% Invitrogen BN2006
Disposable Scalpels  Swann-Morton  0508
DMEM (1x) + GlutaMAX-I Gibco 31966-021
DPBS (10x) Gibco 14200-067
DTT Sigma aldrich 646563
Epifluorescence inverted microscope Nikon Ti2 -E Nikon  non-applicable
Eppendorf Safe-Lock Tubes 0.5 mL Eppendorf 30123603
Ethanol 70% VWR 83801.290
FITC anti-mouse CD34 Invitrogen 11-0341-85 Clone: RAM34
Forceps for dissection FST 11152-10
Heat-inactivated Fetal Bovine Serum (FBS) Gibco 11533387
Dounce Homogeniser 2 mL Bellco glass 1984-10002 Pestle “A” Large Clearance: .0030-.0050″ and Pestle “B” Small Clearance: .0005-.0025″
LIVE/DEAD fixable aqua dead cell stain kit Invitrogen L34957
Magnesium chloride solution 1 M Sigma aldrich M1028
Microcentrifuge  Eppendorf 5424R
Mounting medium Fluoromount-G  invitrogen 00-4958-02
Nonidet P40 substitute Sigma aldrich 74385
Nuclease free water ThermoFischer AM9932
Nuclei buffer 20x  10X Genomics 2000153/2000207
Nuclei isolation kit EZ prep Sigma Aldrich NUC-101
OneComp eBeads compensation beads Invitrogen 01-1111-41
Pacific Blue anti-mouse lineage cocktail
(including anti-mouse CD3, Ly-6G/Ly-6C, CD11b, CD45R/B220, TER-119)		 BioLegend 133310 Clones (in the same order as the antibodies listed): 17A2, RB6-8C5, M1/70, RA3-6B2, Ter-119
PCR Tube Strips 0.2 mL Eppendorf 951010022
PE anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) BioLegend 122507 Clone: E13-161.7
Petri dish 100 mm x 20 mm OPTILUX Falcon 353003
Ply-L-lysine 0.01% sterile-filtered suitable for cell culture Sigma P4707
Printed microscope slides 8 well 6 mm numbered Epredia ER-301B-CE24
Protein LoBind Tubes 1.5 mL Eppendorf 30108116
Recombinant Rnase inhibitor 5000 U Takara 2313A
Scissors for dissection FST 14090-09
Sodium chloride solution 5 M Sigma aldrich 59222C
Syringe filters, PES, 0.2 µm Fisher Scientific 15206869
Transparent nail polish  any non-applicable
Trizma Hydrochloride solution pH 7.4 Sigma aldrich T2194
Trypan Blue 0.4% gibco 15250061
Tween 20 Biorad  1662404
UltraPure Distilated Water Dnase/Rnase Free Invitrogen 10977-035

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Clark, S. J., et al. scNMT-seq enables joint profiling of chromatin accessibility DNA methylation and transcription in single cells. Nature Communications. 9 (1), 781 (2018).
  2. Lee, J., Hyeon, D. Y., Hwang, D. Single-cell multiomics: technologies and data analysis methods. Experimental & Molecular Medicine. 52 (9), 1428-1442 (2020).
  3. Cerrizuela, S., et al. High-throughput scNMT protocol for multiomics profiling of single cells from mouse brain and pancreatic organoids. STAR Protocols. 3 (3), 101555 (2022).
  4. Dimitriu, M. A., Lazar-Contes, I., Roszkowski, M., Mansuy, I. M. Single-cell multiomics techniques: From conception to applications. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 854317 (2022).
  5. Stoeckius, M., et al. Simultaneous epitope and transcriptome measurement in single cells. Nature Methods. 14 (9), 865-868 (2017).
  6. Cao, J., et al. Joint profiling of chromatin accessibility and gene expression in thousands of single cells. 361 (6409), Science. New York, N.Y. 1380-1385 (2018).
  7. Narayanan, A., et al. Nuclei Isolation from Fresh Frozen Brain Tumors for Single-Nucleus RNA-seq and ATAC-seq.Journal of Visualized Experiments. JoVE. 162, 61542 (2020).
  8. Kim, M., et al. Single-nucleus transcriptomics reveals functional compartmentalization in syncytial skeletal muscle cells. Nature Communications. 11 (1), 6375 (2020).
  9. Santos, M. D., et al. Extraction and sequencing of single nuclei from murine skeletal muscles. STAR Protocols. 2 (3), 100694 (2021).
  10. Safabakhsh, S., et al. Isolating nuclei from frozen human heart tissue for single-nucleus RNA sequencing. Current Protocols. 2 (7), (2022).
  11. Lau, S. -F., Cao, H., Fu, A. K. Y., Ip, N. Y. Single-nucleus transcriptome analysis reveals dysregulation of angiogenic endothelial cells and neuroprotective glia in Alzheimer's disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (41), 25800-25809 (2020).
  12. Armand, E. J., Li, J., Xie, F., Luo, C., Mukamel, E. A. Single-cell sequencing of brain cell transcriptomes and epigenomes. Neuron. 109 (1), 11-26 (2021).
  13. Morabito, S., et al. Single-nucleus chromatin accessibility and transcriptomic characterization of Alzheimer's disease. Nature Genetics. 53 (8), 1143-1155 (2021).
  14. Chen, S., et al. Spatially resolved transcriptomics reveals genes associated with the vulnerability of middle temporal gyrus in Alzheimer's disease. Acta Neuropathologica Communications. 10 (1), (2022).
  15. Paul, F., et al. Transcriptional heterogeneity and lineage commitment in myeloid progenitors. Cell. 163 (7), 1663-1677 (2015).
  16. Kaufmann, E., et al. BCG educates hematopoietic stem cells to generate protective innate immunity against tuberculosis. Cell. 172 (1-2), 176-190 (2018).
  17. Christ, A., et al. diet triggers NLRP3-dependent innate immune reprogramming. Cell. 172 (1-2), 162-175 (2018).
  18. Moorlag, S. J. C. F. M., et al. β-Glucan Induces protective trained immunity against mycobacterium tuberculosis infection: A key role for IL-1. Cell Reports. 31 (7), 107634 (2020).
  19. de Laval, B., et al. C/EBPβ-dependent epigenetic memory induces trained immunity in hematopoietic stem cells. Cell Stem Cell. 26 (5), 657-674 (2020).
  20. Renthal, W., et al. Characterization of human mosaic Rett syndrome brain tissue by single-nucleus RNA sequencing. Nature Neuroscience. 21 (12), 1670-1679 (2018).
  21. Yang, A. C., et al. A human brain vascular atlas reveals diverse mediators of Alzheimer's risk. Nature. 603 (7903), 885-892 (2022).
  22. Lee, D. R., Zhang, Y., Rhodes, C. T., Petros, T. J. Generation of single-cell and single-nuclei suspensions from embryonic and adult mouse brains. STAR Protocols. 4 (1), 101944 (2022).
  23. Corces, M. R., et al. Lineage-specific and single-cell chromatin accessibility charts human hematopoiesis and leukemia evolution. Nature Genetics. 48 (10), 1193-1203 (2016).
  24. Ranzoni, A. M., et al. Integrative single-cell RNA-seq and ATAC-seq analysis of human developmental hematopoiesis. Cell Stem Cell. 28 (3), 472-487 (2021).
  25. 10X Genomics Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression User Guide. Document Number CG000338 Rev F. At. , (2022).
  26. J,, et al. Microdissection of mouse brain into functionally and anatomically different regions. Journal of Visualized Experiments: JoVE. 168, 61941 (2021).
  27. 10X Genomics 10X Genomics Demonstrated Protocol - Nuclei Isolation for Single Cell Multiome ATAC + GEX sequencing (CG000365 - Rev C). At. , (2022).
  28. Haag, S., Murthy, A. Murine monocyte and macrophage culture. Bio-Protocol. 11 (6), (2021).
  29. Haque, A., Engel, J., Teichmann, S. A., Lönnberg, T. A practical guide to single-cell RNA-sequencing for biomedical research and clinical applications. Genome Medicine. 9 (1), (2017).
  30. Jiang, P. Quality control of single-cell RNA-seq. Methods in Molecular Biology. , Clifton, N.J. 1-9 (1935).
  31. Regan, C., Preall, J. Practical considerations for single-cell genomics. Current Protocols. 2 (8), (2022).
  32. 10X Genomics 10X Genomics Demonstrated Protocol - Nuclei Isolation for Single Cell ATAC Sequencing (CG000169 - Rev E). At. , (2022).
  33. 10X Genomics 10X Genomics Demonstrated Protocol - Nuclei Isolation from Complex Tissues for Single Cell Multiome. ATAC + Gene Expression Sequencing. (CG000375 - Rev C). At. , (2022).
  34. 10X Genomics 10X Genomics - Chromium Nuclei Isolation Kit (CG000505 - Rev A). AT. , (2022).
  35. Shomroni, O., et al. A novel single-cell RNA-sequencing approach and its applicability connecting genotype to phenotype in ageing disease. Scientific Reports. 12 (1), 4091 (2022).
  36. Ocañas, S. R., Pham, K. D., Blankenship, H. E., Machalinski, A. H., Chucair-Elliott, A. J., Freeman, W. M. Minimizing the ex vivo confounds of cell-isolation techniques on transcriptomic and translatomic profiles of purified microglia. 9 (2), 0348-0321 (2022).
  37. Gérard, A., et al. High-throughput single-cell activity-based screening and sequencing of antibodies using droplet microfluidics. Nature Biotechnology. 38 (6), 715-721 (2020).
  38. Vandereyken, K., Sifrim, A., Thienpont, B., Voet, T. Methods and applications for single-cell and spatial multi-omics. Nature Reviews. Genetics. 24, 494-515 (2023).

Tags

Denne måneden i JoVE utgave 202
Forberedelse av hjerne- og benmargkjerner av høy kvalitet for enkeltkjerner multiomanalyser
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Moraes Cabé, C., Novault, S.,… More

Moraes Cabé, C., Novault, S., Jeemin Choi, A., Seffer, V., Barrio Cano, L., Libri, V., Hasan, M. High-Quality Brain and Bone Marrow Nuclei Preparation for Single Nuclei Multiome Assays. J. Vis. Exp. (202), e65715, doi:10.3791/65715 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter