Summary
Het succes van single-cell/single-nuclei transcriptomics en multi-omics hangt grotendeels af van de kwaliteit van cellen/kernen. Daarom moet het isoleren van cellen/kernen uit weefsel en hun zuivering sterk gestandaardiseerd zijn. Dit protocol beschrijft de bereiding van kernen uit de hersenen en het beenmerg voor stroomafwaartse single-nuclei multioomanalyse.
Abstract
Single-cell analyse is de voorkeursbenadering geworden voor het ontrafelen van de complexiteit van biologische processen die het beoordelen van de variabiliteit van individuele cellulaire reacties op behandeling of infectie met single-cell resolutie vereisen.
In de afgelopen 10 jaar zijn er veel technieken voor eencellige moleculaire profilering ontwikkeld en zijn er verschillende specifieke technologieën op de markt gebracht. De 10X Genomics druppelgebaseerde single-cell profiling is een wijdverbreide technologie die kant-en-klare reagentia biedt voor transcriptomische en multi-omic single-cell profilering. De technologie omvat workflows voor single-cell en single-nuclei RNA-sequencing (respectievelijk scRNA-Seq en snRNA-Seq), scATAC-Seq, single-cell immuunprofilering (BCR/TCR-sequencing) en multioom. De laatste combineert transcriptionele (scRNA-Seq) en epigenetische informatie (scATAC-Seq) afkomstig van dezelfde cel.
De kwaliteit (levensvatbaarheid, integriteit, zuiverheid) van eencellige of eenkernige suspensies die uit weefsels zijn geïsoleerd en met een van deze benaderingen worden geanalyseerd, is van cruciaal belang voor het genereren van gegevens van hoge kwaliteit. Daarom moeten de protocollen voor de bereiding van monsters worden aangepast aan de specifieke kenmerken van elk biologisch weefsel en moeten ervoor zorgen dat hoogwaardige cel- en kernsuspensies worden gegenereerd.
Dit artikel beschrijft twee protocollen voor het voorbereiden van hersen- en beenmergmonsters voor de stroomafwaartse multioom 10X Genomics-pijplijn. De protocollen worden stapsgewijs uitgevoerd en hebben betrekking op weefseldissociatie, celsortering, kernisolatie en kwaliteitscontrole van bereide kernsuspensie die wordt gebruikt als uitgangsmateriaal voor celpartitionering en barcodering, bibliotheekvoorbereiding en sequencing. Deze gestandaardiseerde protocollen produceren kernbibliotheken van hoge kwaliteit en robuuste en betrouwbare gegevens.
Introduction
Single-cell technieken zijn al jaren de gouden standaard voor de analyse van biologische processen. Ze waren aanvankelijk beperkt tot fenotypering van eencellige cellen door middel van microscopie, flowcytometrie en soortgelijke tests. Een doorbraak in single-cell analyse kwam met de ontwikkeling van benaderingen voor single-cell moleculaire profilering, in het bijzonder single-cell RNA sequencing (scRNA-Seq) die het mogelijk maakte om het volledige transcriptoom van individuele cellen te karakteriseren. ScRNA-Seq is zeer krachtig en genereert informatie over de transcriptionele status van een cel in een specifieke toestand en op een specifiek tijdstip. Het geeft echter geen zicht op de genregulatie die transcriptie aandrijft, of op de moleculaire modificaties die in de loop van de tijd optreden. Om deze beperking te overwinnen, zijn er veel inspanningen geleverd in de ontwikkeling van single-cell multi-omics-assays die de analyse van meerdere factoren en processen uit dezelfde cel mogelijk maken 1,2,3,4. De eerste succesvolle meting van twee modaliteiten binnen afzonderlijke cellen kwam door het koppelen van multiplex oppervlakte-eiwitexpressiepatronen met het volledige transcriptoom van individuele cellen in de CITE-Seq-benadering5. Recentere evoluties combineren genexpressie met de toegankelijkheid van chromatine (Assay for Transposase-Accessible Chromatin using sequencing, ATAC-Seq), waardoor tegelijkertijd transcriptomische en epigenomische modaliteiten in dezelfde cellen worden vastgelegd (bijv. sci-CAR)6. De eerste commerciële oplossingen die het mogelijk maakten om transcriptomics te associëren met celfenotype of met epigenetische veranderingen van dezelfde cel, kwamen van 10X Genomics.
Experimenten voor eencellige moleculaire profilering omvatten de volgende stappen: (1) weefseldissociatie of bereiding van eencellige suspensies; (2) celzuivering en/of isolatie van kernen; (3) partitionering en streepjescodering; (4) bibliotheekbouw en kwaliteitscontrole; (5) sequencing van de volgende generatie; (6) gegevensanalyse. Hoewel de stappen (3)-(6) aanzienlijk kunnen variëren, afhankelijk van de gebruikte technologie, zijn de eerste stappen over het algemeen gemeenschappelijk voor alle stappen. De kwaliteit van de bereide cel-/kernsuspensie zal de algehele uitkomst van het experiment bepalen. Afhankelijk van het type weefsel kan het verkrijgen van hoogwaardige eencellige/kernsuspensies een uitdaging zijn. De bijzonderheden van sommige weefsels, zoals het hart, de spieren, de hersenen, de longen, de darmen en andere, vereisen methoden voor weefselverstoring en isolatie van kernen die zijn aangepast aan elk type monster om de productie van hoogwaardige kernen voor moleculaire analyse te garanderen 7,8,9,10 . De weefseldisruptiemethoden en dissociatieprotocollen kunnen mechanisch, enzymatisch (bijv. een mix van collagenasen en DNase) of een combinatie van beide zijn, en kunnen handmatig of door instrumenten worden uitgevoerd (bijv. Qiagen DSC-400, gentleMACS).
Single-cell technieken zijn een instrument bij uitstek geworden voor biomedisch onderzoek. In de neurobiologie vereisen de celdiversiteit in de hersenen en de complexiteit van hun functies een analyse met hoge resolutie en hoge doorvoer voor visualisatie van zeldzame celpopulaties en voor het beoordelen van hun heterogeniteit 11,12,13,14. Het koppelen van cellulaire identiteit en genregulatiemechanismen van individuele cellen geeft inzicht in de ontwikkeling en fysiologie van de hersenen. Een ander voorbeeld zijn studies naar immuunrespons in de context van infectieuze, auto-immuun- of kankerziekten, die sterk afhankelijk zijn van eencellige analyses. De heterogeniteit van subsets van immuuncellen en de complexiteit van hun activiteit en interacties met andere celtypen vereisen een oplossing van één cel bij het ontcijferen van de mechanismen die ten grondslag liggen aan de immuunrespons. De immuuncellen zijn afkomstig uit het beenmerg, waar hematopoëtische voorlopercellen zijn samengesteld uit geleidelijk differentiërende cellen die celoppervlaktemarkers verwerven en verliezen tijdens een stapsgewijs proces voordat ze het beenmerg verlaten naar huis in de periferie. Analyse van één cel maakt een minutieuze karakterisering van cellulaire ontwikkelingsstadia mogelijk. Het kan worden bereikt door middel van fenotypering van één cel, conventioneel uitgevoerd door flowcytometrie met meerdere parameters. Er is echter aangetoond dat eencellige transcriptomische handtekeningen een nauwkeurigere identificatie van subtypes van voorlopercellen onthullen, aangezien deze cellen zijn verdeeld in clusters die in elkaar vallen en daarom verkeerd kunnen worden geïdentificeerd bij gebruik van een grove celoppervlaktemarkerbenadering15. Een toenemend aantal studies onthult de epigenetische modificaties die hematopoëtische stam- en voorlopercellen (HSPC's) kunnen verwerven door blootstelling aan verschillende middelen, wat leidt tot een aanzienlijke impact op de responsiviteit van het immuunsysteem op lange termijn 16,17,18,19. De nieuwe multi-omics-technologieën maken het mogelijk om deze processen te bestuderen met een resolutie van één cel.
Er zijn veel protocollen voor cel- en kernisolatie beschreven voor hersenen 11,20,21,22 en beenmergmonsters23,24. Om vertekening als gevolg van experimentele variabiliteit te minimaliseren, is het noodzakelijk om geoptimaliseerde single-nuclei voorbereidingsprotocollen voor gezamenlijke single-cell transcriptomische en epigenomische sequencing te valideren, waardoor de reproduceerbaarheid van single-cell multiomische assays wordt gegarandeerd.
Hier worden twee robuuste protocollen beschreven voor de voorbereiding van kernen uit (1) vers ingevroren hersenweefsel en (2) verse beenmerg-HSPC's voor stroomafwaartse single-cell Multioom-analyse (Figuur 1).
Figuur 1: Schematische weergave van protocollen voor het isoleren van kernen uit vers ingevroren hersen- en beenmergweefsel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Protocol
Experimentele procedures werden uitgevoerd onder de strikte naleving van de regelgeving van protocollen die zijn goedgekeurd door het Comité voor ethiek in dierproeven (CETEA). Voor de isolatie van de hersenkernen werden C57BL/6-muizen van 3 maanden oud gebruikt. Voor de beenmergisolatie werden 8 weken oude vrouwelijke C57BL/6J-muizen met een gewicht van 18 g gebruikt.
1. Zuivering van kernen uit muizenhersenen
NOTITIE: Draag tijdens de procedure te allen tijde latex of nitril handschoenen. Het wordt sterk aangeraden om het experiment door twee personen te laten uitvoeren, om stap 1 tot en met 3 (d.w.z. de bereiding van de suspensie met één kern) door één persoon te laten uitvoeren, en stap 4 (d.w.z. de voorbereiding van de sorteerder) parallel door een andere persoon te laten uitvoeren. Aangezien het protocol zeer tijdgevoelig is, is het van cruciaal belang om de verwerkingstijd van het monster te minimaliseren door de sorteerder klaar te hebben zodra de suspensie met één kern is bereid.
- Bereiding van reagentia en materialen
- Steriliseer de dissectiegereedschappen zorgvuldig met een autoclaaf (bij 121 °C gedurende 20 min) en was ze vlak voor gebruik met ethanol 70%. Bereid één petrischaaltje per monster, gevuld met 2-3 ml ijskoude 1x Dulbecco's fosfaatgebufferde zoutoplossing (DPBS).
- Koel de microcentrifuge af tot 4 °C, vul een emmer met ijs en zet de glazen dounce-homogenisator op ijs.
- Bereid nuclei lysisbuffer voor door digitonine toe te voegen voor een eindconcentratie van 0,01%, 10 ml per monster.
- Bereid de kleuringsbuffer voor door RNaseremmers toe te voegen aan de celkleuringsbuffer voor een eindconcentratie van 0,2 E/μL, 20 ml per monster.
- Bereid DPBS 0,04% BSA voor door RNaseremmers toe te voegen voor een eindconcentratie van 0,2 E/μL, 2 ml per monster.
- Bereid 1 ml verdunde kernbuffer volgens het Multioom-protocol25.
- Bewaar alle reagentia en monsters op ijs.
- Weefseldissectie
- Offer muizen met behulp van protocollen die zijn goedgekeurd door de instelling. In dit protocol werden de muizen onthoofd na een overdosis ketamine/xylazine.
- Knip de muizenkop af met een schaar en verwijder de hersenen uit de schedel zoals beschreven in Meyerhoff et al.26. Breng de hersenen onmiddellijk over in een petrischaaltje bereid met de ijskoude 1x DPBS onder een met lichtgevende diode (LED) verlichte stereomicroscoop.
- Snijd het hersenweefsel met een scalpel om interessante hersengebieden te scheiden (bijv. Entorhinale cortex, hippocampus, prefrontale cortex) en breng elk gebied over in een aparte petrischaal met ijskoude 1x DPBS. Blijf op ijs.
- Hak het weefsel met een scalpel in stukjes van <0,5 cm om de homogenisatie in de volgende stap te vergemakkelijken.
- Breng met een P1000 micropipet het gehakte weefsel en de 1x DPBS van de petrischaal over naar een buisje van 1,5 ml. Zorg ervoor dat je tubes gebruikt die gemaakt zijn van eiwitarm plastic. Laat de weefselstukjes door de zwaartekracht scheiden. Verwijder voorzichtig het teveel aan 1x DPBS met behulp van een P1000-micropipet.
OPMERKING: Na deze stap is het mogelijk om het gehakte weefsel vast te vriezen door de eiwitbindingsbuizen over te brengen naar droogijs en vervolgens op te slaan bij -80 °C totdat de kernen worden geïsoleerd.
- Isolatie van kernen
- Vul de glazen dounce met 2 ml ijskoude nuclei lysisbuffer met 0,01% digitonine. Voeg de stukjes weefsel toe aan de dounce.
OPMERKING: als u met vers ingevroren weefsel werkt, voeg dan het fijngehakte bevroren weefsel rechtstreeks toe aan de nuclei lysisbuffer 0,01% digitonine; Laat het weefsel niet eerder ontdooien. - Homogeniseer met behulp van een glazen dounce weefselhomogenisator 25 keer met stamper A en vervolgens 25 keer met stamper B. Breng het homogenaat over in een buis van 15 ml.
- Voeg nog eens 2 ml ijskoude nuclei lysisbuffer met 0,01% digitonine toe en incubeer gedurende 5 minuten op ijs. Centrifugeer de kernen bij 500 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
- Verwijder het supernatans met een micropipet en voeg 4 ml ijskoude nuclei lysisbuffer met 0,01% digitonine toe. Incubeer gedurende 5 minuten op ijs en filtreer door een celzeef van 40 μm.
- Centrifugeer de kernen bij 500 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C en verwijder het supernatans met een micropipet.
- Voeg 4 ml kleurbuffer toe om de kernen te wassen en centrifugeer op 500 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Verwijder het supernatans met een micropipet en resuspendeer de pellet in 4 ml kleurbuffer.
- Filtreer door een celzeef van 40 μm en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 4 °C bij 500 x g . Resuspendeer in 1 ml PBS met 0,04% BSA.
- Tel kernen om de consistentie van de voorbereiding van weefsel/kernen in verschillende monsters te garanderen. Verwacht wordt dat het vergelijkbare aantal kernen uit dezelfde hersengebieden zal verkrijgen:
- Voeg 10 μL 0,4% trypan blue toe aan een lege tube van 0,5 ml. Voeg 10 μL van de kernen toe en meng 5x door te pipetteren.
- Tel kernen met behulp van een geautomatiseerde celteller volgens de aanbevelingen van de leverancier. Houd de kernen op ijs.
- Bereid kernen voor op het sorteren.
OPMERKING: De geëxtraheerde kernen bevatten 7-AAD en deze kleuring wordt gebruikt voor hun zuivering door fluorescentie-geactiveerde celsorteerder (FACS).- Breng 100 μL kernen over in een FACS-buis voor de ongekleurde controle. Voeg 10 μL 7-AAD toe aan de resterende kernen en houd 5 minuten bij 4 °C.
- Sorteer minimaal 0,5 x 106 kernen op FACS om doubletten en puin te verwijderen.
- Vul de glazen dounce met 2 ml ijskoude nuclei lysisbuffer met 0,01% digitonine. Voeg de stukjes weefsel toe aan de dounce.
- Sorteren van kernen met behulp van een FACS
OPMERKING: Hoewel het sorteren van kernen kan worden uitgevoerd op een breed scala aan celsorteerders, wordt de procedure voor het gebruik van de BD FACSAria Fusion- of BD FACSAria III-instrumenten hier beschreven. Het wordt sterk aanbevolen om de kalibratie en de instelling van de celsorteerder uit te voeren onder toezicht of door een ervaren gebruiker van het instrument. Om de verwerkingstijd van het monster te verkorten, is het van cruciaal belang om de sorteerder klaar te hebben zodra de suspensie met één kern is voorbereid.- Kalibratie van FACS-instrument
- Schakel de celsorteerder en de computer in. Zodra de software op het instrument is aangesloten, start u de fluïdische opstartprocedure. Selecteer Cytometer > Fluidic start-up in het hoofdmenu en volg de vier stappen. Klik op Gereed nadat u ze allemaal hebt voltooid.
- Plaats het mondstuk van 70 μm, zet de straal aan en laat de straal 15 minuten stabiliseren. Pas de amplitude aan om druppelvorming te krijgen en klik op Sweet Spot.
- Plaats het filter met neutrale dichtheid (ND) 1.0 en open de interface voor het instellen en volgen van de cytometer (CST).
- Dagelijkse kwaliteitscontrole: Verdun CST-korrels in FACS-medium (zie aanbevelingen van de leverancier) en voer CST-controle uit. Als u klaar bent, vervangt u de ND 1.0 door de ND 2.0.
- Verdun Accudrops in FACS-medium (zie aanbevelingen van de leverancier) en voer een druppelvertraging uit zoals beschreven in stap 6 tot 10.
- Selecteer in de experimentsjabloon het experiment Accudrop Drop Delay en open de sorteerlay-out voor de buis.
- Klik in het onderste cameravenster op Voltage en vervolgens op Optisch filter om lading op de afbuigplaten toe te passen en een specifiek optisch filter voor de camera te gebruiken. Zorg ervoor dat het kwadrant aan de rechterkant 100 aangeeft. Pas indien nodig de rode laserschroef aan om de laserimpact te optimaliseren.
- Pas het debiet aan om de snelheid van 1.000 tot 3.000 gebeurtenissen per seconde te bereiken.
- Klik op Sorteren en annuleren. Zorg ervoor dat het linkerkwadrant gelijk is aan 100 en het rechterkwadrant 0. Als het linkerkwadrant lager is dan 95, voert u Auto Delay uit.
- Klik op Voltage en vervolgens op Test Sort. Controleer de kwaliteit van de zijstromen die in de opvangbuizen worden afgezet. Pas indien nodig de positie van de zijstromen aan door de schuifregelaars te verplaatsen.
- Opzetten van een FACS-instrument voor het sorteren van kernen.
- Begin met het verwerven van de ongekleurde kernen. Deze worden gebruikt om de voorwaartse en zijwaartse verstrooiingen en de detectorspanning voor de 7-ADD-parameter te definiëren. Stel de parameters zo in dat het 7-AAD-signaal van het ongekleurde monster binnen het eerste decennium van de logschaal op de puntplot valt.
- Begin met het verwerven van de buis met 7-AAD-gekleurde kernen en definieer de kernpopulaties met behulp van een poortstrategie op basis van (1) FSC-A/SCC-A en vervolgens FSC-H/SSC-H voor grootte en granulariteit, (2) FSC-H/FSC-A voor doubletdiscriminatie en (3) SSC-A/7-AAD voor 7-AAD-positieve kernen (zie figuur 2A).
- Zorg ervoor dat de stroom en de afbuiging stabiel zijn.
- Schakel in de zijstroomcamera de testsortering in, voltage AAN, en bevestig de nauwkeurige druppelsortering in een buis van 1.5 ml die aan de linkerkant is aangebracht.
- Selecteer in het venster Sorteerindeling de populatie die u interesseert, zoals gedefinieerd in stap 2 (hierboven). Selecteer in Target Events de drempelwaarde in Continu om een minimum van 0,5 x 106 kernen per monster te verkrijgen. Selecteer onder Precisie de optie 4-weg zuiverheid.
- Als u klaar bent, klikt u op Sorteren en OK om te beginnen met het sorteren van kernen.
- Kalibratie van FACS-instrument
- Kwaliteitscontrole en telling van gezuiverde kernen
OPMERKING: Deze stap mag alleen worden uitgevoerd tijdens het pilotexperiment voor optimalisatie van monstervoorbereidingsstappen, met als doel de zuiverheid te testen van de gesorteerde kernen die op de 10X-chroomchip moeten worden geladen. Zodra het protocol volledig is geoptimaliseerd, wordt het niet geadviseerd om deze kwaliteitscontrolestap in de vervolgexperimenten uit te voeren om onnodige verspilling van verzamelde kernen te voorkomen die mogelijk in kleine aantallen beschikbaar zijn.- Zuiverheidscontrole door flowcytometrie
- Breng 10 μL van de gesorteerde kernen over in een nieuwe FACS-buis met 90 μL DPBS met 2% warmte-geïnactiveerd foetaal runderserum (HI-FBS).
- Verwerf en registreer gegevens na het sorteren om de zuiverheid en levensvatbaarheid van de sortering te verifiëren. Zorg ervoor dat ten minste 98% van de kernen in de poort van belang verschijnen, zoals gedefinieerd in 4.2 (zie figuur 2B).
- Het tellen van de gezuiverde kernen
- Centrifugeer gesorteerde kernen gedurende 5 minuten bij 500 x g en bij 4 °C en verwijder het supernatans voorzichtig volledig met behulp van een micropipet. Resuspenderen in 100 μL verdunde kernbuffer.
- Voeg 10 μL 0,4% trypan blue toe aan een lege tube van 0,5 ml. Voeg 10 μL van de gesorteerde kernen toe en meng 5x door te pipetteren.
- Tel kernen met behulp van een geautomatiseerde celteller volgens de aanbevelingen van de leverancier. Pas de kernconcentratie aan naar 3,5 x 106/ml, d.w.z. 16.000 kernen per 5 μL.
- Kwaliteitscontrole van gezuiverde kernen door microscopie
OPMERKING: Deze stap mag alleen worden uitgevoerd tijdens het pilotexperiment voor optimalisatie van monstervoorbereidingsstappen om de kwaliteit te testen van de kernen die op de 10X-chroomchip moeten worden geladen. Zodra het protocol volledig is geoptimaliseerd, wordt het niet geadviseerd om deze kwaliteitscontrolestap in de vervolgexperimenten uit te voeren om onnodige verspilling van verzamelde kernen te voorkomen die mogelijk in kleine aantallen beschikbaar zijn.- Zorg ervoor dat microscoopglaasjes en dekglaasjes schoon en stofvrij zijn. Was en spoel de dekglaasjes indien nodig af met absolute ethanol en droog ze af met pluisvrije doekjes.
- Verdeel 25 μL poly-l-lysine in de te gebruiken glijglaasjes en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur (RT), beschermd tegen stof.
- Verwijder het teveel aan poly-l-lysine en voeg 10 μL van de gezuiverde kernsuspensie toe. Incubeer gedurende 5 minuten bij RT, beschermd tegen stof.
- Voeg een druppel montagemedium toe aan elk putje en vermijd luchtbellen.
- Plaats een dekglaasje op de ingezaaide putjes. Dek af met papieren doekjes en druk stevig op het dekglaasje om het overtollige montagemedium te verwijderen. Zorg ervoor dat u het dekglaasje niet verplaatst en reinig het overtollige montagemedium niet.
- Maak meerdere foto's met een omgekeerde microscoop met helderveldlicht en een minimale vergroting van 40x.
- Zuiverheidscontrole door flowcytometrie
- Voer een multioomtest uit.
- Ga onmiddellijk verder naar Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression Gebruikershandleiding (CG000338 - Rev F)25.
2. Zuivering van kernen uit hematopoëtische stam- en voorlopercellen van muizenbeenmerg (HSPC's)
OPMERKING Dit protocol beschrijft de zuivering van kernen uit drie subsets van de HSPC's in het beenmerg: lineage-c-Kit+Sca-1+ hematopoëtische stamcellen (HSC), lineage-c-Kit+Sca-1-CD34+FcγR- gemeenschappelijke myeloïde voorlopercellen (CMP) en lineage- c-Kit+Sca-1-CD34+FcγR+ granulocyt-monocyt voorlopercellen (GMP). Draag tijdens de procedure te allen tijde latex of nitril handschoenen. Dit protocol is een aanpassing van het 10X Genomics Shown Protocol - Nuclei Isolation for Single Cell Multiome ATAC + GEX sequencing (CG000365 - Rev C)27. In het oorspronkelijke protocol zijn wijzigingen aangebracht om het herstel van kernen te maximaliseren. Het wordt sterk aangeraden om twee mensen het experiment te laten uitvoeren, om stap 1 te hebben. tot 3. (d.w.z. bereiding van de eencellige oplossing) uitgevoerd door één persoon, en stap 4 (d.w.z. voorbereiding van de sorteerder) parallel uitgevoerd door een andere persoon. Aangezien het protocol zeer tijdgevoelig is, is het van cruciaal belang om de verwerkingstijd van het monster te minimaliseren door de sorteerder klaar te hebben zodra de eencellige suspensie is voorbereid.
- Bereiding van reagentia en materialen
- Vul een emmer met ijs.
- Bereid de FACS-buffer voor: DPBS met 2% HI-FBS-oplossing (ongeveer 500 ml voor 6 monsters) en filtreer door een filter van 0,2 μm.
- Bereid het verzamelmedium voor: DPBS met 10% HI-FBS-oplossing (500 μL per monster) en filtreer door een filter van 0,2 μm.
- Isolatie van beenmergcellen
- Offer muizen met behulp van protocollen die zijn goedgekeurd door de instelling. In dit experiment werden de muizen opgeofferd door cervicale dislocatie na een overdosis ketamine/xylazine.
- Besproei de buik en achterpoten van de muizen met 70% ethanol.
- Gebruik een steriele tang en schaar om een kleine incisie in het midden van de onderbuik te maken en open het buikvlies vanaf de basis van de achterpoten tot het middenrif (aanvullende figuur 1).
- Maak een extra snede voor elke achterpoot loodrecht op het geopende buikvlies, pak dan een van deze extra sneden vast en trek deze uit elkaar om de huid van beide achterpoten voorbij het enkelgewricht af te pellen om de spieren van beide achterpoten bloot te leggen (aanvullende figuur 1A).
- Lijn de schaar langs de ruggengraat bij het heupgewricht van een achterpoot om het been uit te knippen zonder door het dijbeen te knippen (aanvullende figuur 1B, C). Herhaal hetzelfde voor het andere been.
- Om het dijbeen te isoleren, snijdt u het grootste deel van het spierweefsel weg en houdt u vervolgens het dijbeen en het scheenbeen in elke hand met de vingertoppen bij het gewricht (aanvullende figuur 1D, E). Vouw het been voorzichtig tegen de natuurlijke buiging in om het scheenbeen van het dijbeen te ontwrichten (aanvullende figuur 1E) en knip vervolgens voorzichtig het bindweefsel door met een schaar om het dijbeen en het scheenbeen te scheiden.
- Gebruik de schaar met lichte draaiende bewegingen om het stukje ruggengraat van het bovenste uiteinde van het dijbeen te ontwrichten (aanvullende figuur 1E).
- Reinig het geïsoleerde dijbeen met tissuepapier om de resterende spier- en bindweefsel te verwijderen.
- Bewaar koud op ijs in een bord met 12 putjes, goed gevuld met 2 ml DMEM (1x) + GlutaMAX-I.
- Zodra alle dijbenen zijn verzameld, moet u ervoor zorgen dat spier- en vezelweefsel volledig uit het bot zijn verwijderd. Snijd het bot niet open om (a) het merg binnen steriel te houden en (b) te voorkomen dat cellen in het putje verloren gaan. Gebruik de volgende stappen voor het spoelen van de cellen van twee dijbenen van één muis, aangepast van Haag en Murthy28.
- Maak een tube van 1,5 ml en een tube van 0,5 ml. Voeg 150 μL van de FACS-buffer toe aan de buis van 1,5 ml, prik vervolgens een gaatje in de bodem van de buis van 0,5 ml met een naald van 18 G en steek de buis van 0,5 ml in de buis van 1,5 ml.
- Open het distale deel van elk dijbeen met een chirurgische muisschaar (aanvullende afbeelding 1F): Vergrendel de distale epifyse tussen de messen en oefen lichte druk uit terwijl u de schaar omdraait om de distale epifyse soepel los te maken zonder het bot hard open te snijden. Als dit lukt, zouden er 4 uitsteeksels zichtbaar moeten zijn aan het nu blootgestelde physis-uiteinde (aanvullende figuur 1G).
- Plaats de twee dijbenen met het open uiteinde naar beneden gericht in de voorbereide buis van 0.5 ml die in een buis van 1.5 ml met FACS-buffer is geplaatst (aanvullende afbeelding 1H).
- Plaats een celzeef van 70 μm op een buis van 50 ml en bevochtig de zeef vooraf met 2 ml van de FACS-buffer.
- Om het beenmerg te spoelen, centrifugeert u de buisjes (doppen open) op 12.000 x g totdat de centrifuge de waarde van 12.000 x g bereikt, en stopt u de centrifuge onmiddellijk.
- Controleer of de beenmergcellen in de buis van 1,5 ml zijn gepelleteerd en of de dijbenen wit zijn (vóór het spoelen van de cellen zijn ze rood) (aanvullende figuur 1I). Gooi de buisjes van 0,5 ml met de 2 dijbenen weg.
- Gooi het supernatans van 150 μl weg met behulp van een pipet.
- Resuspendeer de pellet met een micropipet in 1 ml ammoniumchloride-kalium (ACK) lyseerbuffer gedurende 1-2 minuten bij RT om rode bloedcellen te lyseren. Vermijd langere incubatietijden, omdat deze kunnen leiden tot een verminderde levensvatbaarheid van kerncellen.
- Breng over in de buis van 50 ml via de vooraf bevochtigde celzeef van 70 μm.
- Voeg 10 ml FACS-buffer toe om de ACK-lyseerbuffer te verdunnen en stop hierbij de lysis.
- Centrifugeer op 400 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Resuspendeer in 10 ml FACS-buffer door eerst te resuspenderen in 1 ml en vervolgens bij te vullen met 9 ml.
- Bereid de cellen voor op het tellen zoals beschreven in 1.3.8.
- Tel de cellen met behulp van een geautomatiseerde cellenteller volgens de aanbevelingen van de leverancier. Verwacht wordt dat het ongeveer 40 miljoen cellen van 2 dijbenen zal verzamelen.
- Kleuring van beenmerg HSPC
- Centrifugeer de cellen bij 400 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C en resuspendeer de pellet met een micropipet in FACS-buffer tot een eindconcentratie van 1 x 107 cellen/ml.
- Breng met een P1000-micropipet de suspensie over in een FACS-buisje en filtreer door een celzeefkap van 35 μm.
- Bereid reageerbuismonsters met één kleuring voor voor elk antilichaam dat in tabel 1 wordt vermeld om compensaties van fluorochromen op de celsorteerder in te stellen:
- Maak één FACS-buisje per antilichaam klaar en vul de buisjes met 200 μL PBS.
- Voeg 15 μL fluorochroomcompensatiekorrels toe aan elke FACS-buis met fluorochroom-geconjugeerd antilichaam. Voeg in de FACS-buizen voor ongekleurde en voor levende/dode enkelvoudig gekleurde cellen 500.000 cellen toe in plaats van kralen.
- Voeg 1 μL van elk fluorochroom-geconjugeerd antilichaam (zie tabel 1) toe aan de corresponderende FACS-buis. Voeg 0,5 μL Live/Dead kleuring toe aan de Live/Dead FACS-buis met enkele kleuring.
- Bewaar 15 minuten op ijs, beschermd tegen licht.
- Bereid mengsels 1 en 2 voor zoals aangegeven in tabel 2.
OPMERKING: De antilichaamvolumes die in tabel 2 worden vermeld, zijn geldig voor de antilichamen waarnaar in de materiaaltabel wordt verwezen. Ze moeten worden geoptimaliseerd voor elke nieuwe antilichaamreferentie of een andere partij van dezelfde antilichaamreferentie. - Voeg 300 μL Mix 1 toe aan het monsterbuisje, resuspendeer en bewaar 15 minuten op ijs beschermd tegen licht.
- Voeg 300 μL Mix 2 toe aan het monsterbuisje, resuspendeer en bewaar 20 minuten op ijs beschermd tegen licht.
- Voeg 3 ml van de FACS-buffer toe aan de enkelvoudig gekleurde buisjes en de met Mix bevlekte monsterbuisjes. Centrifugeren op 400 x g gedurende 5 minuten bij 4°C.
- Gooi het supernatans voorzichtig weg met behulp van een micropipet en resuspendeer de pellet in 500 μl FACS-buffer.
- Bereid een buis van 1,5 ml voorgevuld met 500 μL opvangmedium voor.
OPMERKING: Mix 1 wordt bereid in DPBS omdat het de Live/Dead-vlek bevat die aanzienlijk is aangetast door HI-FBS. Zodra de cellen zijn gekleurd door Live/Dead, wordt Mix 2 toegevoegd, dat de fluorochrome-geconjugeerde antilichamen bevat die zijn geresuspendeerd in FACS-buffer die HI-FBS bevat. De enige uitzondering is het anti-CD16/32-antilichaam dat is opgenomen in antilichaammix 1 om te dienen als Fc-receptorblokker die de niet-specifieke binding van de andere antilichamen die in de volgende stap zijn toegevoegd, voorkomt.
- Cellen sorteren met behulp van een FACS
OPMERKING: Hoewel het sorteren van cellen kan worden uitgevoerd op een breed scala aan celsorteerders, wordt hier de procedure beschreven voor het gebruik van de BD FACSAria Fusion- of BD FACSAria III-instrumenten. Het wordt sterk aanbevolen om de kalibratie en de instelling van de celsorteerder uit te voeren onder toezicht of door een ervaren gebruiker van het instrument.- Kalibratie van het FACS-instrument: Raadpleeg Protocol 1 stap 4.1.
- Opzetten van een FACS-instrument voor het sorteren van cellen:
- Begin met het verwerven van de ongekleurde cellen. Deze worden gebruikt om de voorwaartse en zijwaartse verstrooiing en de detectorspanning voor elke fluorofoor te definiëren. Stel de parameters zo in dat het fluorescerende signaal van elke fluorofoor binnen het eerste decennium van de logschaal op de dotplot valt.
- Schaf enkelvoudige kleurcontroles aan om compensaties handmatig in te stellen (mediaan van positieve en negatieve populaties moet worden uitgelijnd) of gebruik de automatische berekeningssoftware (hellingsmetingen). Zorg ervoor dat de compensatieregelaars overeenkomen met de experimentele fluorochromen en detectorinstellingen. Noteer 10.000 gebeurtenissen voor cellen en 5.000 gebeurtenissen voor kralen.
- Gebruik de monsterbuis (d.w.z. meervoudig gekleurde cellen) om celpopulaties van belang te definiëren met behulp van de poortstrategie die wordt weergegeven in figuur 3A. Volg stap 4 t/m 6 (hieronder).
- Voor het identificeren van de drie HSPC's in het beenmerg die van belang zijn (HSC, CMP en GMP), begint u de gating door de grootte (FSC-A) en granulariteit (SSC-A) te gebruiken om leukocyten te poorten, en vervolgens FSC-H/FSC-A om doubletten te onderscheiden.
- Gebaseerd op SSC-A/dode celmarker, poort levende cellen. Gebruik Lineage/c-Kit om cellen te selecteren die lineage-negatief zijn en gemiddelde tot hoge niveaus van c-Kit tot expressie brengen. Via c-Kit/Sca-1, poort op lineage-c-Kit+ Sca-1+ (LKS+) HSC's, een van de drie populaties van belang.
- Gebruik onder de myeloïde voorlopercellen (afstamming-c-Kit+Sca-1-) FcγR/CD34 om CD34-FcγR- megakaryocyten en erytroïde voorlopercellen (MEP) uit te sluiten, terwijl CD34+ FcγR-CMP, evenals CD34+FcγR+ GMP in de te sorteren celpopulaties worden opgenomen.
- Zorg ervoor dat de stroom en de afbuiging stabiel zijn.
- Schakel in de zijstroomcamera de testsortering in, voltage AAN, en bevestig de nauwkeurige druppelsortering in een buis van 1.5 ml die aan de linkerkant is aangebracht.
- Selecteer in het venster Sorteerlay-out de populatie(s) die u interesseren (d.w.z. "LKS+" en "CD34+ myeloïde voorlopercellen" die in dit voorbeeld worden weergegeven). Selecteer onder Apparaat de optie 2 Tube. Selecteer onder Precisie de optie Zuiverheid. Selecteer in Doelgebeurtenissen de optie Continu om te sorteren tussen 160.000 en 200.000 myeloïde voorlopercellen van LKS+ en CD34+ .
- Voeg 500 μL FACS-buffer toe aan de celsuspensie en breng de 1 ml van het monster over door te filteren in een nieuwe FACS-buis met zeefdeksel van 35 μm om ervoor te zorgen dat alle cellen zich vlak voor de verwerving in een enkele suspensie bevinden. Dit elimineert celklonten die het instrument zouden kunnen verstoppen.
- Als u klaar bent, klikt u op Sorteren en OK om te beginnen met sorteren. Pas het debiet aan om de snelheid onder de 10.000 gebeurtenissen per seconde te houden.
OPMERKING: De verwachte verhouding van LKS+ tot CD34+ myeloïde voorlopercellen is 1:3 voor een volwassen (8-12 weken oud) C57BL/6J vrouwelijke muis in een steady state. De beoogde gesorteerde celnummers worden meestal binnen 30 minuten na het sorteren bereikt.
- Kwaliteitscontrole en telling van gesorteerde cellen
OPMERKING: Deze stap mag alleen worden uitgevoerd tijdens het proefexperiment voor de optimalisatie van de monstervoorbereidingsstappen, met als doel de zuiverheid te testen van de gesorteerde cellen die zullen worden gebruikt voor de isolatie van kernen. Zodra het protocol volledig is geoptimaliseerd, wordt het niet geadviseerd om deze kwaliteitscontrolestap in de vervolgexperimenten uit te voeren om onnodige verspilling van uitgangsmateriaal te voorkomen dat in lage aantallen beschikbaar kan zijn voor kernisolatie.- Zuiverheidscontrole door flowcytometrie
- Breng 10 μL van de gesorteerde cellen over in een nieuwe FACS-buis met 90 μL FACS-buffer.
- Verwerf en registreer gegevens na het sorteren om de zuiverheid en levensvatbaarheid van de sortering te verifiëren. Zorg ervoor dat ten minste 95% van de cellen in de poort van belang voorkomt, zoals gedefinieerd in 3 - 6 en geïllustreerd in figuur 3B.
- Zuiverheidscontrole door flowcytometrie
- Kernisolatie van gesorteerde HSPC's in het beenmerg
- Gebruik het "Low Cell Input Nuclei Isolation"-protocol van de bijlage van het 10X Genomics Shown Protocol - Nuclei Isolation for Single Cell Multiome ATAC + GEX sequencing (CG000365 - Rev C)27, met de volgende wijzigingen om het herstel van kernen te optimaliseren:
- Lysistijd: Voer een proefexperiment uit voor dit protocol om de beste lysistijd voor kernisolatie te bepalen. Zorg voor een volledige cellyse met behoud van intacte kernen.
OPMERKING: Stap f van het bovengenoemde 10X Genomics-protocol27 instrueert om "3-5 minuten op ijs te incuberen [in Lysis Buffer]". Test tijdens het pilotexperiment ten minste gedurende 3 minuten, 4 minuten en 5 minuten en beoordeel de hoeveelheid teruggewonnen kernen door te tellen en de kwaliteit door middel van flowcytometrie en microscopiebeeldvorming om de optimale lysisduur te kiezen (zie de beschrijving van deze kwaliteitscontroles hieronder). Om reagentia te sparen, vervangt u de verdunde kernbuffer door PBS 0,04% BSA in het proefexperiment. Voor HSPC's in het beenmerg werd 3 min geïdentificeerd als de optimale lysisduur. - Celcentrifugaties: Voor alle centrifugaties met celsuspensie, centrifugeer bij 300 x g gedurende 7 min (in plaats van de 5 min in CG000365 - Rev C)27 bij 4 °C.
- Centrifugaties van kernen: Voer alle centrifugaties van de kernsuspensie uit bij 500 x g gedurende 5 minuten volgens CG000365 - Rev C27.
- Kernverzameling: Voeg bij stap b, na resuspendatie in 50 μL PBS 0,04% BSA en overbrengen naar een buisje van 0,2 ml, 50 μL PBS 0,04% BSA toe aan het oorspronkelijke buisje en pipetmengsel om eventuele overgebleven cellen op te vangen. Breng over naar de buis van 0,2 ml om een totaal volume van 100 μl te bereiken.
- Voortaan zal het totale volume 100 μL bedragen in plaats van de 50 μL van het protocol. Pas de stroomafwaartse stappen dienovereenkomstig aan (verwijder bijvoorbeeld voor stap d 90 μL in plaats van 45 μL; voeg voor stap e 90 μL lysisbuffer toe in plaats van 45 μL).
- Voor stap m resuspendeert u de kernpellet in 12 μL verdunde kernbuffer in plaats van 7 μL.
- Tel de geïsoleerde kernen. Voeg in een leeg buisje van 0,5 ml 10 μl 0,4% trypanblauw en 8 μl PBS 0,04% BSA toe.
- Voeg 2 μL kernen toe aan de buis en tel de kernen zoals beschreven in 1.3.8. Gebruik een geautomatiseerde celteller volgens de aanbevelingen van de leverancier.
- Lysistijd: Voer een proefexperiment uit voor dit protocol om de beste lysistijd voor kernisolatie te bepalen. Zorg voor een volledige cellyse met behoud van intacte kernen.
- Gebruik het "Low Cell Input Nuclei Isolation"-protocol van de bijlage van het 10X Genomics Shown Protocol - Nuclei Isolation for Single Cell Multiome ATAC + GEX sequencing (CG000365 - Rev C)27, met de volgende wijzigingen om het herstel van kernen te optimaliseren:
- Zuiverheidscontrole door flowcytometrie
NOTITIE: Deze stap mag alleen worden uitgevoerd tijdens het pilotexperiment voor optimalisatie van monstervoorbereidingsstappen om de zuiverheid te testen van de kernen die op de 10X Chromium-chip moeten worden geladen. Zodra het protocol volledig is geoptimaliseerd, wordt het niet geadviseerd om deze kwaliteitscontrolestap in de vervolgexperimenten uit te voeren om onnodige verspilling van verzamelde kernen te voorkomen die mogelijk in kleine aantallen beschikbaar zijn.- Breng na voltooiing van de kernisolatie 6 μL kernresuspensie over in een nieuwe FACS-buis die is voorgevuld met 150 μL FACS-buffer. Voeg 3 μL 7-AAD toe en incubeer gedurende 5 minuten op ijs.
- Verwerf en registreer gegevens na het sorteren om de zuiverheid en levensvatbaarheid van de sortering te verifiëren. Zorg ervoor dat ten minste 95% van de kernen in de poort van belang verschijnen, zoals gedefinieerd in Protocol 1 stap 4.2 (zie figuur 4).
- Kwaliteitscontrole van gezuiverde kernen door microscopie:
OPMERKING: Deze stap mag alleen worden uitgevoerd tijdens het pilotexperiment voor optimalisatie van monstervoorbereidingsstappen om de kwaliteit te testen van de kernen die op de 10X Chromium-chip moeten worden geladen. Zodra het protocol volledig is geoptimaliseerd, wordt het niet geadviseerd om deze kwaliteitscontrolestap in de vervolgexperimenten uit te voeren om onnodige verspilling van verzamelde kernen te voorkomen die mogelijk in kleine aantallen beschikbaar zijn.- Ga te werk zoals beschreven in stap 1.5.3.
- Multioomtest uitvoeren
- Ga onmiddellijk verder naar Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression Gebruikershandleiding (CG000338 - Rev F)25.
Representative Results
De twee hierboven beschreven protocollen beschrijven de isolatie van kernen uit twee verschillende soorten weefsel. De verschillen en overeenkomsten tussen de twee protocollen zijn schematisch weergegeven in figuur 1.
Zuivering van kernen uit muizenhersenen
In het hier beschreven protocol stellen we een zachte methode voor voor de voorbereiding van kernen uit hersenmonsters. Het begint met een mechanische dissociatie van het hersenweefsel in een lysisbuffer, gevolgd door was- en zeeffilterstappen die het resterende weefsel uit de suspensie verwijderen. De daaropvolgende verwijdering van puin, niet-gelyseerde cellen en kleine deeltjes wordt bereikt door FACS om te garanderen dat alleen gezuiverde kernen worden geladen voor het stroomafwaartse Multiome-protocol. Figuur 2 toont het profiel van kernen voor en na het sorteren. Na het filteren en vóór het sorteren van de kernen bevat het monster een grote hoeveelheid puin, waarbij meer dan 99% van de "singlets" positief is voor nucleaire kleuring (7-AAD), wat wijst op een optimale cellyse (Figuur 2A). Kernen worden gesorteerd op basis van de 7-AAD-positieve poort. Een fractie gesorteerd materiaal wordt verkregen om de zuiverheid van de voorbereide kernen te verifiëren. Figuur 2B toont het profiel van de hersenkernen na sortering. De sortering van de kernen maakte een toename van de zuiverheid van de kernen mogelijk van de aanvankelijke 36% (Figuur 2A) tot bijna 100% (Figuur 2B).
Figuur 2: Poortstrategie voor het sorteren van kernen en zuiverheidstest na het sorteren. Kernen werden gekleurd met 7-AAD en verkregen door de celsorteerder. (A) Kernen worden eerst omheind op basis van hun grootte en granulariteit (respectievelijk FSC-A en SSC-A). Afzonderlijke deeltjes worden vervolgens geselecteerd op basis van hun FSC-A/FSC-H-eigenschappen en 7-AAD-kleuring. (B) Na het sorteren van de cellen wordt een fractie van de kernen uit de verzamelbuis op zuiverheid getest met behulp van dezelfde poortstrategie als in A. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Zuivering van hematopoëtische stamcelvoorlopercellen (HSPC's) in het beenmerg van muizen
Na isolatie van het beenmerg worden maximaal 2 x 105 HSPC's gesorteerd door FACS, volgens de poortstrategie die wordt weergegeven in figuur 3A. De sorteerefficiëntie en de zuiverheid van het monster worden beoordeeld (figuur 3B).
Figuur 3: Poortstrategie voor het sorteren van HSPC's in het beenmerg. (A) Een representatieve FACS-poortstrategie voor het sorteren van levensvatbare LKS+ hematopoëtische stamcellen en CD34+ myeloïde voorlopercellen voor kernisolatie. B) Representatieve FACS-waarnemingspunten die worden gebruikt voor de controle van de zuiverheid van de gesorteerde celpopulatie. Getoond worden de verhoudingen van verschillende celsubsets ten opzichte van de ouderpopulatie. *De twee gesorteerde populaties. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Het protocol "Low Cell Input Nuclei Isolation" maakt het mogelijk om kernen te isoleren uit monsters met een maximum van 105 cellen. Het bevat een laag aantal centrifugatiestappen, waardoor het verlies van cellen/kernen tot een minimum wordt beperkt. We hebben het volume van lysis en wasbuffers proportioneel aangepast aan de celinput en de centrifugatietijd verlengd voor maximaal herstel van de kernen. We hebben een pilootexperiment uitgevoerd om de kwantiteit van herstelde kernen te beoordelen door te tellen en hun kwaliteit door middel van flowcytometrie en microscopiebeeldvorming. Figuur 4 toont het HSPC-monster na cellyse. Dit protocol genereerde kernen van hoge kwaliteit, zoals waargenomen in figuur 5A, zonder puin dat het stroomafwaartse multioomprotocol zou kunnen beïnvloeden.
Figuur 4: Sorteren van geïsoleerde HSPC-kernen in het beenmerg van de zuiverheidstest. Kernen werden gekleurd met 7-AAD en verkregen door de celsorteerder. Kernen werden eerst omheind op basis van hun grootte en granulariteit (respectievelijk FSC-A en SSC-A) om de zuiverheid van het monster te beoordelen. Het aandeel kernen wordt aangegeven ten opzichte van de ouderpopulatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Tube aantal | Naam van de buis | Bevlekte entiteit | Hoeveelheid bevlekte entiteit | Antilichaam/kleurstof (μL) | Opvangbuffer (μL) |
| 1 | Onbevlekt | Cellen | 5,00,000 | N.V.T | 200 |
| 2 | LEVEND/DOOD Fixeerbare Aqua Dode Cel Vlek | Cellen | 5,00,000 | 0.5 | |
| 3 | APC/Cyanine 7 anti-muis CD16/32 (FcγR) | OneComp eBeads | 15 μL | 1 | |
| 4 | Pacific Blue anti-muis Lineage Cocktail | OneComp eBeads | 15 μL | 1 | |
| 5 | PE anti-muis Ly-6A/E (Sca-1) | OneComp eBeads | 15 μL | 1 | |
| 6 | APC anti-muis CD117 (c-Kit) | OneComp eBeads | 15 μL | 1 | |
| 7 | FITC anti-muis CD34 | OneComp eBeads | 15 μL | 1 |
Tabel 1: Enkelvoudige kleuringscontroles voor compensatie-instellingen op de flowcytometer. Aangegeven zijn de vereiste enkelvoudige kleuringscontroles, het aantal cellen of kralen dat moet worden gekleurd en de hoeveelheden antilichamen.
| Meester Mix | Reagens | Definitieve verdunning | Antilichaam/kleurstof (μL) | Soort buffer | Buffer (μL) |
| Mengen 1 | APC/Cyanine 7 anti-muis CD16/32 (FcγR) | 1/500 | 1.2 | DPBS | 300 |
| LEVEND/DOOD Fixeerbare Aqua Dode Cel Vlek | 1/250 | 2.4 | |||
| Mengen 2 | Pacific Blue anti-muis Lineage Cocktail | 1/20 | 30 | FACS-buffer | 300 |
| PE anti-muis Ly-6A/E (Sca-1) | 1/200 | 3 | |||
| APC anti-muis CD117 (c-Kit) | 1/200 | 3 | |||
| FITC anti-muis CD34 | 1/50 | 12 | |||
| Totaal kleurvolume | 600 |
Tabel 2: Samenstelling van het kleuringsmengsel voor HSPC's in het beenmerg. Getoond worden volumes reagentia die nodig zijn voor de kleuring van één monster dat 40 miljoen cellen bevat. Voor het kleuren van een groter aantal monsters, vermenigvuldigt u het aangegeven volume met het vereiste aantal monsters en voegt u de helft van een extra monstervolume toe om een voldoende volume van de mastermix te garanderen.
Aanvullende figuur 1: Protocol voor de isolatie van beenmergcellen. (A) Open het buikvlies. Witte stippellijnen geven de lijn aan die moet worden doorgeknipt. (B) Nadat u de huid van het achterbeen hebt afgepeld, trekt u de schaar langs de wervelkolom bij het heupgewricht om het been uit te knippen zonder door het dijbeen te snijden. (C) Het uiterlijk van het been gescheiden van het lichaam vóór de verwijdering van spieren. (D) Het uiterlijk van het been na verwijdering van spieren. (E) De procedure voor het scheiden van het dijbeen bij het kniegewricht en vervolgens bij het heupgewricht, waarbij ervoor moet worden gezorgd dat het dijbeen niet wordt opengesneden. Witte gebogen pijlen geven de vereiste beweging aan. Witte gestippelde pijlen geven het gebied aan dat voorzichtig moet worden gescheiden met een schaar om af te knijpen. (F) Procedure om het distale deel van het dijbeen te openen (d.w.z. het deel dat eerder aan het scheenbeen bij het kniegewricht was bevestigd) door het kraakbeen en de distale epifyse stevig vast te pakken met een schaar en deze terug te draaien om het beenmerg bloot te leggen. (G) Vier uitsteeksels, aangegeven met zwarte pijlen, moeten zichtbaar zijn aan het blootgestelde physis-uiteinde. (H) Het uiterlijk van een dijbeen met het open uiteinde naar beneden gericht in de voorbereide buis van 0,5 ml die is geplaatst in een buis van 1,5 ml die 150 μl FACS-buffer bevat. (I) Het uiterlijk van de gepelleteerde beenmergcellen en het nu witte dijbeen na snelle centrifugatie bij 12.000 x g. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Discussion
De bereiding van hoogwaardige cel- of kernsuspensie is van cruciaal belang voor het succes van single-cell of single-nuclei RNA-Seq en single-cell multi-omic analyses 29,30,31. Hier hebben we protocollen beschreven voor monstervoorbereiding en kernisolatie voor multioomtesten van twee soorten weefsel: hersenen en beenmerg.
Het hersenprotocol dat in dit artikel wordt beschreven, maakt het mogelijk om kernen van hoge kwaliteit te herstellen uit vers ingevroren hersenweefsel. Het omvat de volgende stappen: verstoring van bevroren weefsel, isolatie van kernen, zuivering van kernen en kwaliteitscontrole van het bereide materiaal. Het hersenweefsel is samengesteld uit veel verschillende celtypen en de procedure van weefseldissociatie en kernisolatie moet de verhoudingen van celpopulaties zoals aanwezig in het oorspronkelijke weefsel behouden. Hier werden de samenstelling van de lysisbuffer en de incubatietijd geoptimaliseerd om een volledige en zachte lysis mogelijk te maken van alle celpopulaties waaruit het weefsel bestaat.
Het HSPC-protocol voor beenmerg is enigszins anders, omdat er aan het begin van het experiment een extra stap nodig is om de celpopulatie van belang te isoleren van een heterogene cellulaire suspensie. Na het verzamelen van vers weefsel worden rode bloedcellen gelyseerd en wordt het monster verrijkt voor de celsubset van belang. De beoogde cellen worden gelyseerd, de kernen worden geïsoleerd en de kwaliteit van het bereide materiaal wordt gecontroleerd.
10X Genomics biedt verschillende protocollen die zijn gevalideerd voor het isoleren van kernen in tal van verschillende weefsels32,33. Het bedrijf brengt ook een nuclei-isolatiekit op de markt met een eenvoudige pijplijn voor het isoleren van kernen uit gevalideerde weefsels34. Deze protocollen moeten echter extra worden geoptimaliseerd om de bijzonderheden van bepaalde monsters aan te passen. Een voorbeeld zijn de monsters die moeten worden gewerkt met een lage celinput. Voor deze monsters zijn de meest uitdagende stappen centrifugaties die voldoende streng moeten zijn om het monster te reinigen en zacht genoeg om verlies van cellen/kernen te voorkomen. Met het hier beschreven protocol hebben we het 10X Genomics Shown Protocol - Nuclei Isolation for Single Cell Multiome ATAC + GEX Sequencing (CG000365 - Rev C)27 aangepast om een fijne balans te vinden tussen deze twee vereisten. Zoals aangetoond in het voorbeeld van de bereiding van kernen uit gesorteerde HSPC's, hebben we de terugwinning van kernen verbeterd zonder dat dit gevolgen heeft voor de kwaliteit van het monster.
Een extra uitdaging is de stap van lysis van gezuiverde cellen voor het isoleren van kernen. Zwaardere lysisomstandigheden en langere incubatietijden kunnen kernen beschadigen en daardoor de kwaliteit van sequentiegegevens beïnvloeden. Figuur 5 toont representatieve beeldvorming van kernen uit beenmergmonsters op verschillende incubatietijden met lysisbuffer en illustreert hoe verschillend de toestand van de kernen kan zijn, afhankelijk van de cellyse. In het voorbeeld van de HSPC's hebben we 3 min lysis geïdentificeerd als de aandoening die resulteert in het hoogste aandeel gezond ogende, intacte kernen en het laagste aandeel beschadigde kernen. De lysis-incubatietijden moeten voor elk nieuw type monster worden geoptimaliseerd.
Figuur 5: Kwaliteitscontrole van de kernen door middel van microscopie. Getoond worden representatieve helderveldbeelden van geïsoleerde kernen uit het beenmerg van muizen met (A) intacte en (B) beschadigde kernen. Schaal staaf 5 μm. De foto's zijn gemaakt met een omgekeerde microscoop met een 40x ELWD NA 0.60 objectief en 1.5x digitale zoom. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Beide protocollen die in dit werk worden beschreven, zijn gebaseerd op het zuiveren van gerichte cellen of kernen door FACS-instrumenten met een hoge doorvoer. Deze stap is van cruciaal belang voor protocollen voor de bereiding van eencellige cellen/kernen, waarbij zeldzame subgroepen van cellen moeten worden geïsoleerd uit heterogene suspensies. In deze, zoals in het hier getoonde voorbeeld voor het sorteren van HSPC's, kan een hoogdimensionaal flowcytometriepaneel nodig zijn om "gating" op de celpopulatie van belang mogelijk te maken. De sortering is extreem snel en nauwkeurig, wat leidt tot een zuiverheid van meer dan 95% van de gesorteerde celsubsets. Deze benadering stelt de cellulaire suspensie bloot aan een druk tot 70 psi en kan daarom beperkend zijn voor het sorteren van fragiele cellen (bijv. dendritische cellen, neutrofielen), omdat het de breuk van hun celmembraan kan veroorzaken. In deze gevallen moeten alternatieve oplossingen worden gekozen voor cellulaire zuivering, waaronder magnetische sortering, toepassing van instrumenten van de nieuwe generatie (bijv. CellenOne, Cellenion; MACSQuant Tyto, Miltenyi)35,36, of op druppels gebaseerde systemen (bijv. ODIN, Sensific)37. Niettemin is de trage sorteersnelheid van deze technologieën, met celsortering die uren in plaats van minuten duurt, een sterke beperkende factor voor de toepassing van deze benaderingen bij de voorbereiding van levensvatbare cellen voor Multiome en andere eencellige toepassingen op basis van analyse van grote celaantallen.
Voor de zuivering van kernen die uit het weefsel zijn geïsoleerd, is FACS de voorkeursmethode vanwege de doorvoer en de zuiverheid van het geïsoleerde materiaal. Kernen zijn niet gevoelig voor druk en gefilterde weefselisolaten kunnen gemakkelijk worden gezuiverd via de celsorteerder. Als het laboratorium niet is uitgerust met een FACS-instrument, bestaan er andere alternatieven, iets minder efficiënt maar voldoende goed. Voorbeelden hiervan zijn ultracentrifugatie of het gebruik van kleine apparatuur zoals MARS (Applied Cell) die deeltjes scheidt op basis van hun verschil in grootte, met behulp van akoestische golven; CURIOX laminaire ring die gebruik maakt van hydrofobe eigenschappen van cel-/kernsuspensies; of LEVITAS bio die vertrouwt op fysische eigenschappen van cellen (levitatie) om ze van het puin te scheiden.
Hier beschrijven we protocollen om een hoog aantal kernen en de beste zuiverheid voor het stroomafwaartse Multiome-protocol te verkrijgen. FACS-sortering en herhaalde centrifugatiestappen resulteren in een aanzienlijk verlies van het oorspronkelijke materiaal. Om deze reden is in het protocol voor de voorbereiding van kernen uit de hersenen dat we hier beschrijven voldoende overvloedig uitgangsmateriaal nodig om te resulteren in de verzameling van ten minste 500.000 kernen na de FACS-sortering. Alternatieve protocollen moeten worden toegepast als aan dit criterium niet kan worden voldaan. Bij het werken met zeldzame celpopulaties of kleine weefselcoupes kan de beschikbare hoeveelheid uitgangsmateriaal een beperkende factor zijn. Om dit probleem aan te pakken, is het mogelijk om het herstel van kernen te verbeteren door (a) het lysisvolume te verminderen, (b) het wasvolume te verminderen, (c) een enkele wasbeurt met verlengde centrifugatietijd te gebruiken om te proberen het herstel te verbeteren, zoals aangegeven in 10X Genomics-protocollen voor isolatie van kernen met een lage celinput. Voor multiomische analyse van materiaal met een laag gehalte is het de moeite waard om plaatgebaseerde toepassingen te overwegen, zoals scNMT, SNARE-seq en Paired-seq38 , waarvoor veel minder invoermonsters nodig zijn.
Samengevat hebben we twee robuuste protocollen beschreven voor de voorbereiding van kernen uit de hersenen en de HSPC's van het beenmerg voor stroomafwaartse Multioomanalyse. Deze protocollen zijn toepasbaar in elk wetenschappelijk project dat hoogwaardige suspensies van één kern uit deze twee soorten weefsel vereist, ongeacht de wetenschappelijke vraag die wordt gesteld. Onze groep heeft het protocol voor het isoleren van hersenkernen toegepast in studies van hersenontwikkeling na inactivatie van verschillende gerichte genen en in studies van immuunrespons in de context van neurologische aandoeningen. We gebruiken het protocol voor het isoleren van beenmergkernen voor het ontcijferen van de deelname van verschillende hematopoëtische subpopulaties aan de opbouw van het immuunsysteem.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Ana Jeemin Choi werd ondersteund door een stipendium van de Pasteur - Paris University (PPU) International Ph.D. Programma.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18 G x 1 ½ (1.2 mm x 38 mm) Agani needles | Terumo | AN*1838S1 | |
| 15 mL tubes | Falcon | 352097 | |
| 5 mL round bottom FACS tube with cell strainer cap 35 µm | falcon | 352235 | |
| 50 mL tubes | Falcon | 352070 | |
| 7-AAD | BD pharmagen | 559925 | |
| ACK Lysing Buffer | Gibco | A10492-01 | |
| APC anti-mouse CD117 (c-Kit) | BioLegend | 105812 | Clone: 2B8 |
| APC/Cyanine 7 anti-mouse CD16/32 (FcγR) | BioLegend | 101328 | Clone: 93 |
| BD FACSAria III | BD Biosciences | non-applicable | |
| BD FACSDiva Software v8.0.1 | BD Biosciences | non-applicable | |
| Bovine Serum Albumin stock solution 10% | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
| Cell staining buffer | Biolegend | 420201 | |
| CFI Suprplan Fluor ELWD 40XC ON 0.6 | Nikon | non-applicable | |
| CMOS camera Prime 95B 25 mm | Photometrix | non-applicable | |
| Countess II FL Automated Cell Counter | Invitrogen | AMQAF1000 | |
| Countess cell counting chamber slide | Invitrogen | C10283 | |
| Coverglass 24 mm x 24 mm 0.13-0.17 mm | Brand | BR470819 | |
| Digitonine 5% | Invitrogen | BN2006 | |
| Disposable Scalpels | Swann-Morton | 0508 | |
| DMEM (1x) + GlutaMAX-I | Gibco | 31966-021 | |
| DPBS (10x) | Gibco | 14200-067 | |
| DTT | Sigma aldrich | 646563 | |
| Epifluorescence inverted microscope Nikon Ti2 -E | Nikon | non-applicable | |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes 0.5 mL | Eppendorf | 30123603 | |
| Ethanol 70% | VWR | 83801.290 | |
| FITC anti-mouse CD34 | Invitrogen | 11-0341-85 | Clone: RAM34 |
| Forceps for dissection | FST | 11152-10 | |
| Heat-inactivated Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 11533387 | |
| Dounce Homogeniser 2 mL | Bellco glass | 1984-10002 | Pestle “A” Large Clearance: .0030-.0050″ and Pestle “B” Small Clearance: .0005-.0025″ |
| LIVE/DEAD fixable aqua dead cell stain kit | Invitrogen | L34957 | |
| Magnesium chloride solution 1 M | Sigma aldrich | M1028 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5424R | |
| Mounting medium Fluoromount-G | invitrogen | 00-4958-02 | |
| Nonidet P40 substitute | Sigma aldrich | 74385 | |
| Nuclease free water | ThermoFischer | AM9932 | |
| Nuclei buffer 20x | 10X Genomics | 2000153/2000207 | |
| Nuclei isolation kit EZ prep | Sigma Aldrich | NUC-101 | |
| OneComp eBeads compensation beads | Invitrogen | 01-1111-41 | |
| Pacific Blue anti-mouse lineage cocktail (including anti-mouse CD3, Ly-6G/Ly-6C, CD11b, CD45R/B220, TER-119) |
BioLegend | 133310 | Clones (in the same order as the antibodies listed): 17A2, RB6-8C5, M1/70, RA3-6B2, Ter-119 |
| PCR Tube Strips 0.2 mL | Eppendorf | 951010022 | |
| PE anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) | BioLegend | 122507 | Clone: E13-161.7 |
| Petri dish 100 mm x 20 mm OPTILUX | Falcon | 353003 | |
| Ply-L-lysine 0.01% sterile-filtered suitable for cell culture | Sigma | P4707 | |
| Printed microscope slides 8 well 6 mm numbered | Epredia | ER-301B-CE24 | |
| Protein LoBind Tubes 1.5 mL | Eppendorf | 30108116 | |
| Recombinant Rnase inhibitor 5000 U | Takara | 2313A | |
| Scissors for dissection | FST | 14090-09 | |
| Sodium chloride solution 5 M | Sigma aldrich | 59222C | |
| Syringe filters, PES, 0.2 µm | Fisher Scientific | 15206869 | |
| Transparent nail polish | any | non-applicable | |
| Trizma Hydrochloride solution pH 7.4 | Sigma aldrich | T2194 | |
| Trypan Blue 0.4% | gibco | 15250061 | |
| Tween 20 | Biorad | 1662404 | |
| UltraPure Distilated Water Dnase/Rnase Free | Invitrogen | 10977-035 |
References
- Clark, S. J., et al. scNMT-seq enables joint profiling of chromatin accessibility DNA methylation and transcription in single cells. Nature Communications. 9 (1), 781 (2018).
- Lee, J., Hyeon, D. Y., Hwang, D. Single-cell multiomics: technologies and data analysis methods. Experimental & Molecular Medicine. 52 (9), 1428-1442 (2020).
- Cerrizuela, S., et al. High-throughput scNMT protocol for multiomics profiling of single cells from mouse brain and pancreatic organoids. STAR Protocols. 3 (3), 101555 (2022).
- Dimitriu, M. A., Lazar-Contes, I., Roszkowski, M., Mansuy, I. M. Single-cell multiomics techniques: From conception to applications. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 854317 (2022).
- Stoeckius, M., et al. Simultaneous epitope and transcriptome measurement in single cells. Nature Methods. 14 (9), 865-868 (2017).
- Cao, J., et al. Joint profiling of chromatin accessibility and gene expression in thousands of single cells. 361 (6409), Science. New York, N.Y. 1380-1385 (2018).
- Narayanan, A., et al. Nuclei Isolation from Fresh Frozen Brain Tumors for Single-Nucleus RNA-seq and ATAC-seq.Journal of Visualized Experiments. JoVE. 162, 61542 (2020).
- Kim, M., et al. Single-nucleus transcriptomics reveals functional compartmentalization in syncytial skeletal muscle cells. Nature Communications. 11 (1), 6375 (2020).
- Santos, M. D., et al. Extraction and sequencing of single nuclei from murine skeletal muscles. STAR Protocols. 2 (3), 100694 (2021).
- Safabakhsh, S., et al. Isolating nuclei from frozen human heart tissue for single-nucleus RNA sequencing. Current Protocols. 2 (7), (2022).
- Lau, S. -F., Cao, H., Fu, A. K. Y., Ip, N. Y. Single-nucleus transcriptome analysis reveals dysregulation of angiogenic endothelial cells and neuroprotective glia in Alzheimer's disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (41), 25800-25809 (2020).
- Armand, E. J., Li, J., Xie, F., Luo, C., Mukamel, E. A. Single-cell sequencing of brain cell transcriptomes and epigenomes. Neuron. 109 (1), 11-26 (2021).
- Morabito, S., et al. Single-nucleus chromatin accessibility and transcriptomic characterization of Alzheimer's disease. Nature Genetics. 53 (8), 1143-1155 (2021).
- Chen, S., et al. Spatially resolved transcriptomics reveals genes associated with the vulnerability of middle temporal gyrus in Alzheimer's disease. Acta Neuropathologica Communications. 10 (1), (2022).
- Paul, F., et al. Transcriptional heterogeneity and lineage commitment in myeloid progenitors. Cell. 163 (7), 1663-1677 (2015).
- Kaufmann, E., et al. BCG educates hematopoietic stem cells to generate protective innate immunity against tuberculosis. Cell. 172 (1-2), 176-190 (2018).
- Christ, A., et al. diet triggers NLRP3-dependent innate immune reprogramming. Cell. 172 (1-2), 162-175 (2018).
- Moorlag, S. J. C. F. M., et al. β-Glucan Induces protective trained immunity against mycobacterium tuberculosis infection: A key role for IL-1. Cell Reports. 31 (7), 107634 (2020).
- de Laval, B., et al. C/EBPβ-dependent epigenetic memory induces trained immunity in hematopoietic stem cells. Cell Stem Cell. 26 (5), 657-674 (2020).
- Renthal, W., et al. Characterization of human mosaic Rett syndrome brain tissue by single-nucleus RNA sequencing. Nature Neuroscience. 21 (12), 1670-1679 (2018).
- Yang, A. C., et al. A human brain vascular atlas reveals diverse mediators of Alzheimer's risk. Nature. 603 (7903), 885-892 (2022).
- Lee, D. R., Zhang, Y., Rhodes, C. T., Petros, T. J. Generation of single-cell and single-nuclei suspensions from embryonic and adult mouse brains. STAR Protocols. 4 (1), 101944 (2022).
- Corces, M. R., et al. Lineage-specific and single-cell chromatin accessibility charts human hematopoiesis and leukemia evolution. Nature Genetics. 48 (10), 1193-1203 (2016).
- Ranzoni, A. M., et al. Integrative single-cell RNA-seq and ATAC-seq analysis of human developmental hematopoiesis. Cell Stem Cell. 28 (3), 472-487 (2021).
- 10X Genomics Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression User Guide. Document Number CG000338 Rev F. At. , (2022).
- J,, et al. Microdissection of mouse brain into functionally and anatomically different regions. Journal of Visualized Experiments: JoVE. 168, 61941 (2021).
- 10X Genomics 10X Genomics Demonstrated Protocol - Nuclei Isolation for Single Cell Multiome ATAC + GEX sequencing (CG000365 - Rev C). At. , (2022).
- Haag, S., Murthy, A. Murine monocyte and macrophage culture. Bio-Protocol. 11 (6), (2021).
- Haque, A., Engel, J., Teichmann, S. A., Lönnberg, T. A practical guide to single-cell RNA-sequencing for biomedical research and clinical applications. Genome Medicine. 9 (1), (2017).
- Jiang, P.
- Regan, C., Preall, J. Practical considerations for single-cell genomics. Current Protocols. 2 (8), (2022).
- 10X Genomics 10X Genomics Demonstrated Protocol - Nuclei Isolation for Single Cell ATAC Sequencing (CG000169 - Rev E). At. , (2022).
- 10X Genomics 10X Genomics Demonstrated Protocol - Nuclei Isolation from Complex Tissues for Single Cell Multiome. ATAC + Gene Expression Sequencing. (CG000375 - Rev C). At. , (2022).
- 10X Genomics 10X Genomics - Chromium Nuclei Isolation Kit (CG000505 - Rev A). AT. , (2022).
- Shomroni, O., et al. A novel single-cell RNA-sequencing approach and its applicability connecting genotype to phenotype in ageing disease. Scientific Reports. 12 (1), 4091 (2022).
- Ocañas, S. R., Pham, K. D., Blankenship, H. E., Machalinski, A. H., Chucair-Elliott, A. J., Freeman, W. M. Minimizing the ex vivo confounds of cell-isolation techniques on transcriptomic and translatomic profiles of purified microglia. 9 (2), 0348-0321 (2022).
- Gérard, A., et al. High-throughput single-cell activity-based screening and sequencing of antibodies using droplet microfluidics. Nature Biotechnology. 38 (6), 715-721 (2020).
- Vandereyken, K., Sifrim, A., Thienpont, B., Voet, T. Methods and applications for single-cell and spatial multi-omics. Nature Reviews. Genetics. 24, 494-515 (2023).
