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Biology

Hochwertige Präparation von Hirn- und Knochenmarkkernen für Einzelkern-Multiom-Assays

Published: December 22, 2023 doi: 10.3791/65715
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1, 1,3, 1
1Cytometry and Biomarkers UTechS, C2RT, Institut Pasteur, Université Paris Cité, 2Microenvironment and Immunity Unit, Institut Pasteur, Université Paris Cité, INSERM U1224, 3Istituto Superiore di Sanità

Summary

Der Erfolg von Einzelzell-/Einzelkern-Transkriptomik und Multi-Omics hängt weitgehend von der Qualität der Zellen/Zellkerne ab. Daher muss die Isolierung von Zellen/Zellkernen aus Gewebe und deren Aufreinigung hochgradig standardisiert sein. Dieses Protokoll beschreibt die Präparation von Zellkernen aus Gehirn und Knochenmark für den nachgeschalteten Einzelkern-Multiom-Assay.

Abstract

Die Einzelzellanalyse ist zum Ansatz der Wahl geworden, um die Komplexität biologischer Prozesse zu entschlüsseln, die eine Bewertung der Variabilität einzelner zellulärer Reaktionen auf eine Behandlung oder Infektion mit Einzelzellauflösung erfordern.

In den letzten 10 Jahren wurden viele Techniken für das molekulare Profiling einzelner Zellen entwickelt, und mehrere spezielle Technologien wurden kommerzialisiert. Das tröpfchenbasierte Einzelzell-Profiling von 10X Genomics ist eine weit verbreitete Technologie, die gebrauchsfertige Reagenzien für die transkriptomische und multiomic-Einzelzellprofilierung bietet. Die Technologie umfasst Arbeitsabläufe für die Einzelzell- und Einzelkern-RNA-Sequenzierung (scRNA-Seq bzw. snRNA-Seq), scATAC-Seq, Einzelzell-Immunprofilierung (BCR/TCR-Sequenzierung) und Multiom. Letzteres kombiniert transkriptionelle (scRNA-Seq) und epigenetische Informationen (scATAC-Seq), die aus derselben Zelle stammen.

Die Qualität (Lebensfähigkeit, Integrität, Reinheit) von Einzelzell- oder Einzelkernsuspensionen, die aus Geweben isoliert und mit einem dieser Ansätze analysiert werden, ist entscheidend für die Generierung qualitativ hochwertiger Daten. Daher sollten die Protokolle der Probenvorbereitung an die Besonderheiten jedes biologischen Gewebes angepasst werden und die Erzeugung hochwertiger Zell- und Zellkernsuspensionen gewährleisten.

In diesem Artikel werden zwei Protokolle für die Aufbereitung von Gehirn- und Knochenmarkproben für die nachgeschaltete Multiom-10X-Genomics-Pipeline beschrieben. Die Protokolle werden schrittweise durchgeführt und umfassen die Gewebedissoziation, die Zellsortierung, die Zellkernisolierung und die Qualitätskontrolle der vorbereiteten Zellkernsuspension, die als Ausgangsmaterial für die Zellpartitionierung und Barcodierung, die Bibliotheksvorbereitung und die Sequenzierung verwendet wird. Diese standardisierten Protokolle erzeugen qualitativ hochwertige Kernbibliotheken sowie robuste und zuverlässige Daten.

Introduction

Seit vielen Jahren sind Einzelzelltechniken der Goldstandard für die Analyse biologischer Prozesse. Sie waren zunächst auf die Einzelzell-Phänotypisierung durch Mikroskopie, Durchflusszytometrie und ähnliche Assays beschränkt. Ein Durchbruch in der Einzelzellanalyse gelang mit der Entwicklung von Ansätzen für das molekulare Einzelzellprofiling, insbesondere der Einzelzell-RNA-Sequenzierung (scRNA-Seq), die es ermöglichte, das gesamte Transkriptom einzelner Zellen zu charakterisieren. scRNA-Seq ist hochleistungsfähig und generiert Informationen über den Transkriptionsstatus einer Zelle in einem bestimmten Zustand und zu einem bestimmten Zeitpunkt. Es bietet jedoch keinen Einblick in die Genregulation, die die Transkription antreibt, oder über die molekularen Modifikationen, die im Laufe der Zeit auftreten. Um diese Einschränkung zu überwinden, wurden viele Anstrengungen in die Entwicklung von Einzelzell-Multi-Omics-Assays investiert, die die Analyse mehrerer Faktoren und Prozesse aus derselben Zelle ermöglichen 1,2,3,4. Die erste erfolgreiche Messung von zwei Modalitäten innerhalb einzelner Zellen erfolgte durch die Verknüpfung von Multiplex-Oberflächenproteinexpressionsmustern mit dem vollständigen Transkriptom einzelner Zellen im CITE-Seq-Ansatz5. Neuere Entwicklungen kombinieren die Genexpression mit der Zugänglichkeit von Chromatin (Assay for Transposase-Accessible Chromatin using sequencing, ATAC-Seq), wodurch gleichzeitig transkriptomische und epigenomische Modalitäten in denselben Zellen erfasst werden (z. B. sci-CAR)6. Die ersten kommerziellen Lösungen, die es ermöglichten, die Transkriptomik mit dem Zellphänotyp oder mit epigenetischen Veränderungen derselben Zelle zu assoziieren, stammten von 10X Genomics.

Experimente zur Erstellung von molekularen Einzelzellprofilen umfassen die folgenden Schritte: (1) Gewebedissoziation oder Herstellung von Einzelzellsuspensionen; (2) Zellreinigung und/oder Zellkernisolierung; (3) Partitionierung und Barcodes; (4) Bibliotheksaufbau und Qualitätskontrolle; (5) Sequenzierung der nächsten Generation; (6) Datenanalyse. Während die Schritte (3) bis (6) je nach verwendeter Technologie erheblich variieren können, sind die ersten Schritte im Allgemeinen für alle gleich. Die Qualität der hergestellten Zell-/Zellkernsuspension bestimmt das Gesamtergebnis des Experiments. Je nach Art des Gewebes kann es schwierig sein, qualitativ hochwertige Einzelzell-/Zellkernsuspensionen zu erhalten. Die Besonderheiten einiger Gewebe, wie z. B. des Herzens, des Muskels, des Gehirns, der Lunge, des Darms und anderer, erfordern Methoden zum Gewebeaufschluss und zur Kernisolierung, die an jede Art von Probe angepasst sind, um die Produktion qualitativ hochwertiger Kerne für die molekulare Analyse zu gewährleisten 7,8,9,10 . Die Gewebeaufschlussmethoden und Dissoziationsprotokolle können mechanisch, enzymatisch (z. B. eine Mischung aus Kollagenasen und DNase) oder eine Kombination aus beidem sein und können manuell oder mit Instrumenten (z. B. Qiagen DSC-400, gentleMACS) durchgeführt werden.

Einzelzelltechniken sind zu einem Werkzeug der Wahl für die biomedizinische Forschung geworden. In der Neurobiologie erfordern die Zelldiversität im Gehirn und die Komplexität ihrer Funktionen eine hochauflösende Hochdurchsatzanalyse zur Visualisierung seltener Zellpopulationen und zur Beurteilung ihrer Heterogenität 11,12,13,14. Die Verknüpfung von zellulärer Identität und genregulatorischen Mechanismen einzelner Zellen ermöglicht Einblicke in die Entwicklung und Physiologie des Gehirns. Ein weiteres Beispiel sind Studien zur Immunantwort im Rahmen von Infektions-, Autoimmun- oder Krebserkrankungen, die stark auf Einzelzellanalysen angewiesen sind. Die Heterogenität der Untergruppen von Immunzellen und die Komplexität ihrer Aktivität und Interaktionen mit anderen Zelltypen erfordern eine Einzelzellauflösung, um die Mechanismen zu entschlüsseln, die der Immunantwort zugrunde liegen. Die Immunzellen stammen aus dem Knochenmark, wo hämatopoetische Vorläuferzellen aus sich allmählich differenzierenden Zellen bestehen, die in einem schrittweisen Prozess Zelloberflächenmarker erwerben und verlieren, bevor sie das Knochenmark verlassen und sich in der Peripherie niederlassen. Die Einzelzellanalyse ermöglicht eine minutiöse Charakterisierung zellulärer Entwicklungsstadien. Dies kann durch Einzelzell-Phänotypisierung erreicht werden, die konventionell durch Multiparameter-Durchflusszytometrie durchgeführt wird. Es wurde jedoch gezeigt, dass einzellige Transkriptomsignaturen eine genauere Identifizierung von Vorläuferzell-Subtypen ermöglichen, da diese Zellen in Clustern verteilt sind, die ineinander fallen und daher bei Verwendung eines grobzelligen Oberflächenmarkeransatzes falsch identifiziert werden können15. Eine zunehmende Anzahl von Studien deckt die epigenetischen Modifikationen auf, die hämatopoetische Stamm- und Vorläuferzellen (HSPCs) durch die Exposition gegenüber verschiedenen Wirkstoffen erhalten können, was zu einem signifikanten Einfluss auf die langfristige Reaktionsfähigkeit des Immunsystems führt 16,17,18,19. Die neuartigen Multi-Omics-Technologien ermöglichen es, diese Prozesse mit Einzelzellauflösung zu untersuchen.

Viele Protokolle für die Isolierung von Zellen und Zellkernen wurden für Gehirnproben 11,20,21,22 und Knochenmarkproben23,24 beschrieben. Um Verzerrungen aufgrund experimenteller Variabilität zu minimieren, ist es notwendig, optimierte Einzelkernpräparationsprotokolle für die gemeinsame Einzelzell-Transkriptom- und Epigenomsequenzierung zu validieren und so die Reproduzierbarkeit von Einzelzell-Multiom-Assays sicherzustellen.

Hier werden zwei robuste Protokolle für die Zellkernpräparation aus (1) frisch gefrorenem Hirngewebe und (2) frischen Knochenmark-HSPCs für die nachgeschaltete Einzelzell-Multiom-Analyse beschrieben (Abbildung 1).

Figure 1
Abbildung 1: Schematische Darstellung von Protokollen zur Zellkernisolierung aus frisch gefrorenem Hirn- und Knochenmarkgewebe. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Protocol

Die Versuchsverfahren wurden unter strikter Einhaltung der vom Komitee für Ethik bei Tierversuchen (CETEA) genehmigten Protokolle durchgeführt. Für die Isolierung der Hirnkerne wurden 3 Monate alte C57BL/6-Mäuse verwendet. Für die Knochenmarkisolierung wurden 8 Wochen alte weibliche C57BL/6J-Mäuse mit einem Gewicht von 18 g verwendet.

1. Reinigung von Zellkernen aus dem Gehirn von Mäusen

HINWEIS: Tragen Sie während des gesamten Eingriffs Latex- oder Nitrilhandschuhe. Es wird dringend empfohlen, das Experiment von zwei Personen durchführen zu lassen, die Schritte 1 bis 3 (d. h. die Herstellung der Einzelkernsuspension) von einer Person und Schritt 4 (d. h. die Vorbereitung des Sortierers) parallel von einer anderen Person durchführen zu lassen. Da das Protokoll sehr zeitkritisch ist, ist es wichtig, die Probenverarbeitungszeit zu minimieren, indem der Sortierer bereit ist, sobald die Einzelkernsuspension vorbereitet ist.

  1. Aufbereitung von Reagenzien und Materialien
    1. Sterilisieren Sie die Sezierwerkzeuge sorgfältig im Autoklaven (bei 121 °C für 20 min) und waschen Sie sie kurz vor Gebrauch mit 70% Ethanol. Bereiten Sie eine Petrischale pro Probe vor, gefüllt mit 2-3 ml eiskalter 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (DPBS) von Dulbecco.
    2. Kühlen Sie die Mikrozentrifuge auf 4 °C ab, füllen Sie einen Eimer mit Eis und stellen Sie den Glasduzen-Homogenisator auf Eis.
    3. Bereiten Sie den Nuklei-Lysepuffer vor, indem Sie Digitonin für eine Endkonzentration von 0,01 %, 10 ml pro Probe hinzufügen.
    4. Bereiten Sie den Färbepuffer vor, indem Sie RNase-Inhibitoren zum Zellfärbepuffer für eine Endkonzentration von 0,2 U/μl, 20 ml pro Probe hinzufügen.
    5. Bereiten Sie DPBS 0,04 % BSA durch Zugabe von RNase-Inhibitoren für eine Endkonzentration von 0,2 U/μl, 2 ml pro Probe vor.
    6. Bereiten Sie 1 ml verdünnten Kernpuffer gemäß dem Multiome-Protokoll25 vor.
    7. Bewahren Sie alle Reagenzien und Proben auf Eis auf.
  2. Gewebedissektion
    1. Opfern Sie Mäuse unter Verwendung von Protokollen, die von der Institution genehmigt wurden. In diesem Protokoll wurden die Mäuse nach einer Überdosis Ketamin/Xylazin enthauptet.
    2. Schneiden Sie den Mauskopf mit einer Schere ab und entfernen Sie das Gehirn aus dem Schädel, wie in Meyerhoff et al.26 beschrieben. Übertragen Sie das Gehirn sofort in eine Petrischale, die mit dem eiskalten 1x DPBS unter einem mit Leuchtdiode (LED) beleuchteten Stereomikroskop zubereitet wurde.
    3. Schneiden Sie das Hirngewebe mit einem Skalpell ab, um interessante Hirnareale (z. B. entorhinaler Kortex, Hippocampus, präfrontaler Kortex) zu trennen, und übertragen Sie jede Region in eine separate Petrischale, die eiskaltes 1x DPBS enthält. Auf Eis bleiben.
    4. Zerkleinern Sie das Gewebe mit einem Skalpell in <0,5 cm große Stücke, um die Homogenisierung im folgenden Schritt zu erleichtern.
    5. Mit einer P1000 Mikropipette das Hackfleisch und das 1x DPBS aus der Petrischale in ein 1,5 mL Röhrchen überführen. Achten Sie darauf, Röhrchen aus proteinarmem Kunststoff zu verwenden. Lassen Sie die Gewebestücke durch die Schwerkraft trennen. Entfernen Sie vorsichtig den Überschuss von 1x DPBS mit einer P1000-Mikropipette.
      HINWEIS: Nach diesem Schritt ist es möglich, das zerkleinerte Gewebe einzufrieren, indem die Proteinröhrchen mit geringer Bindung in Trockeneis überführt und dann bei -80 °C gelagert werden, bis mit der Kernisolierung fortgefahren wird.
  3. Isolierung von Zellkernen
    1. Füllen Sie die Glasunze mit 2 ml eiskaltem Kernlysepuffer mit 0,01 % Digitonin. Fügen Sie die Gewebestücke in die Unze ein.
      HINWEIS: Wenn Sie mit frisch gefrorenem Gewebe arbeiten, fügen Sie das gehackte gefrorene Gewebe direkt dem Zelllysepuffer 0,01% Digitonin hinzu; Lassen Sie das Gewebe vorher nicht auftauen.
    2. Homogenisieren Sie mit einem Glas-Unzen-Gewebehomogenisator 25 Mal mit Stößel A und dann 25 Mal mit Stößel B. Füllen Sie das Homogenat in ein 15-ml-Röhrchen.
    3. Fügen Sie zusätzlich 2 ml eiskalten Nuklei-Lysepuffer mit 0,01 % Digitonin hinzu und inkubieren Sie 5 Minuten lang auf Eis. Die Kerne werden bei 500 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugiert.
    4. Entfernen Sie den Überstand mit einer Mikropipette und fügen Sie 4 ml eiskalten Nuklei-Lysepuffer mit 0,01 % Digitonin hinzu. 5 Minuten auf Eis inkubieren und durch ein 40-μm-Zellsieb filtrieren.
    5. Kerne bei 500 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren und den Überstand mit einer Mikropipette entfernen.
    6. Man fügt 4 ml Färbepuffer hinzu, um die Kerne zu waschen, und zentrifugiert bei 500 x g für 5 Minuten bei 4 °C. Entfernen Sie den Überstand mit einer Mikropipette und resuspendieren Sie das Pellet in 4 ml Färbepuffer.
    7. Durch ein 40 μm Zellsieb filtrieren und bei 500 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren. Resuspendieren in 1 ml PBS mit 0,04% BSA.
    8. Zählen Sie die Zellkerne, um die Konsistenz der Gewebe-/Kernpräparation über verschiedene Proben hinweg sicherzustellen. Es wird erwartet, dass es ähnliche Kernzahlen aus den gleichen Hirnregionen erhält:
      1. 10 μl 0,4%iges Trypanblau in ein leeres 0,5-ml-Röhrchen geben. Geben Sie 10 μl der Zellkerne hinzu und mischen Sie sie 5x durch Pipettieren.
      2. Zählen Sie die Zellkerne mit einem automatischen Zellzähler gemäß den Empfehlungen des Lieferanten. Halten Sie die Kerne auf Eis.
    9. Bereiten Sie die Kerne für die Sortierung vor.
      HINWEIS: Die extrahierten Zellkerne enthalten 7-AAD, und diese Färbung wird für ihre Reinigung durch Fluoreszenz-aktivierten Zellsortierer (FACS) verwendet.
      1. 100 μl Zellkerne werden für die ungefärbte Kontrolle in ein FACS-Röhrchen überführt. 10 μl 7-AAD zu den verbleibenden Kernen geben und 5 min bei 4 °C halten.
      2. Sortieren Sie mindestens 0,5 x 106 Kerne nach FACS, um Dubletten und Ablagerungen zu entfernen.
  4. Kernsortierung mit einem FACS
    HINWEIS: Während die Zellkernsortierung auf einer Vielzahl von Zellsortierern durchgeführt werden kann, wird hier das Verfahren zur Verwendung der Geräte BD FACSAria Fusion oder BD FACSAria III beschrieben. Es wird dringend empfohlen, dass die Kalibrierung und die Einrichtung des Zellsortierers unter Aufsicht oder von einem erfahrenen Benutzer des Geräts durchgeführt werden. Um die Probenverarbeitungszeit zu verkürzen, ist es wichtig, dass der Sortierer bereit ist, sobald die Einzelkernsuspension vorbereitet ist.
    1. Kalibrierung des FACS-Instruments
      1. Schalten Sie die Zellsortierung und den Computer ein. Sobald die Software mit dem Gerät verbunden ist, starten Sie den Fluidik-Startvorgang. Wählen Sie Zytometer > Fluidik-Start im Hauptmenü und folgen Sie den vier Schritten. Klicken Sie auf Fertig , nachdem Sie die einzelnen Schritte abgeschlossen haben.
      2. Setzen Sie die 70-μm-Düse ein, schalten Sie den Strahl ein und lassen Sie den Strahl 15 Minuten lang stabilisieren. Passen Sie die Amplitude an, um die Tropfenbildung zu erhalten, und klicken Sie auf Sweet Spot.
      3. Setzen Sie den Neutraldichtefilter (N.D.) 1.0 ein und öffnen Sie die CST-Schnittstelle (Setup and Tracking) des Zytometers.
      4. Tägliche Qualitätskontrolle: CST-Kügelchen in FACS-Medium verdünnen (siehe Empfehlungen des Lieferanten) und CST-Kontrolle durchführen. Wenn Sie fertig sind, ersetzen Sie den N.D 1.0 durch den N.D 2.0.
      5. Verdünnen Sie Accudrops in FACS-Medium (siehe Empfehlungen des Lieferanten) und führen Sie die Tropfenverzögerung wie in den Schritten 6 bis 10 beschrieben durch.
      6. Wählen Sie in der Experimentvorlage das Experiment Accudrop Drop Delay aus, und öffnen Sie das Sortierlayout für das Röhrchen.
      7. Klicken Sie im unteren Kamerafenster auf Spannung und dann auf Optischer Filter , um das Aufladen der Ablenkplatten und die Verwendung eines bestimmten optischen Filters vor der Kamera zu aktivieren. Stellen Sie sicher, dass der Quadrant auf der rechten Seite 100 anzeigt. Passen Sie bei Bedarf die rote Laserschraube an, um die Laserwirkung zu optimieren.
      8. Passen Sie die Flussrate an, um die Geschwindigkeit von 1.000 bis 3.000 Ereignissen pro Sekunde zu erreichen.
      9. Klicken Sie auf Sortieren und Abbrechen. Stellen Sie sicher, dass der linke Quadrant gleich 100 und der rechte Quadrant 0 ist. Wenn der linke Quadrant unter 95 liegt, führen Sie die automatische Verzögerung aus.
      10. Klicken Sie auf Spannung und dann auf Sortierung testen. Kontrollieren Sie die Qualität der Nebenströme, die sich in den Sammelröhrchen ablagern. Passen Sie bei Bedarf die Position der Seitenströme an, indem Sie die Schieberegler verschieben.
    2. Aufbau eines FACS-Instruments zur Sortierung von Kernen.
      1. Beginnen Sie mit der Erfassung der ungefärbten Kerne. Diese werden verwendet, um die Durchlass- und Seitenstreuung sowie die Detektorspannung für den 7-ADD-Parameter zu definieren. Stellen Sie die Parameter so ein, dass das 7-AAD-Signal der ungefärbten Probe innerhalb der ersten Dekade der logarithmischen Skala im Punktdiagramm liegt.
      2. Beginnen Sie mit der Erfassung des Röhrchens mit 7-AAD-gefärbten Kernen und definieren Sie die Kernpopulationen mithilfe einer Gating-Strategie, die auf (1) FSC-A/SCC-A und dann FSC-H/SSC-H für Größe und Granularität, (2) FSC-H/FSC-A für die Unterscheidung von Dubletten und (3) SSC-A/7-AAD für 7-AAD-positive Kerne basiert (siehe Abbildung 2A).
      3. Achten Sie darauf, dass der Strahl und die Auslenkung stabil sind.
      4. Schalten Sie in der Seitenstromkamera die Testsortierung ein, schalten Sie die Spannung ein und bestätigen Sie die genaue Tropfensortierung in einem 1,5-ml-Röhrchen, das auf der linken Seite angebracht ist.
      5. Wählen Sie im Fenster Sortierlayout die gewünschte Grundgesamtheit aus, wie in Schritt 2 (oben) definiert. Wählen Sie unter Zielereignisse den Schwellenwert unter Kontinuierlich aus, um mindestens 0,5 x 106 Kerne pro Probe zu erhalten. Wählen Sie unter "Präzision" die Option "4-Wege-Reinheit" aus.
      6. Wenn Sie fertig sind, klicken Sie auf Sortieren und OK , um mit der Sortierung der Kerne zu beginnen.
  5. Qualitätskontrolle und Zählung der gereinigten Zellkerne
    HINWEIS: Dieser Schritt darf nur während des Pilotversuchs zur Optimierung der Probenvorbereitungsschritte durchgeführt werden, mit dem Ziel, die Reinheit der sortierten Kerne zu testen, die auf den 10X-Chromchip geladen werden sollen. Sobald das Protokoll vollständig optimiert ist, wird davon abgeraten, diesen Qualitätskontrollschritt in den Folgeexperimenten durchzuführen, um eine unnötige Verschwendung von gesammelten Kernen zu vermeiden, die möglicherweise in geringer Anzahl verfügbar sind.
    1. Reinheitskontrolle durch Durchflusszytometrie
      1. 10 μl der sortierten Zellkerne werden in ein neues FACS-Röhrchen überführt, das 90 μl DPBS mit 2 % hitzeinaktiviertem fötalem Kälberserum (HI-FBS) enthält.
      2. Erfassen und zeichnen Sie Daten nach der Sortierung auf, um die Reinheit und Durchführbarkeit der Sortierung zu überprüfen. Stellen Sie sicher, dass sich mindestens 98 % der Kerne im interessierenden Gate befinden, wie in Abschnitt 4.2 definiert (siehe Abbildung 2B).
    2. Zählung der gereinigten Zellkerne
      1. Sortierte Kerne 5 min bei 500 x g und bei 4 °C zentrifugieren und den Überstand mit einer Mikropipette vorsichtig vollständig entfernen. Resuspendieren Sie in 100 μl verdünntem Zellkernpuffer.
      2. 10 μl 0,4%iges Trypanblau in ein leeres 0,5-ml-Röhrchen geben. 10 μl der sortierten Kerne zugeben und 5x durch Pipettieren mischen.
      3. Zählen Sie die Zellkerne mit einem automatischen Zellzähler gemäß den Empfehlungen des Lieferanten. Stellen Sie die Kernkonzentration auf 3,5 x 106/ml ein, d. h. 16.000 Kerne pro 5 μl.
    3. Qualitätskontrolle von gereinigten Zellkernen mittels Mikroskopie
      HINWEIS: Dieser Schritt darf nur während des Pilotexperiments zur Optimierung der Probenvorbereitungsschritte durchgeführt werden, um die Qualität der Kerne zu testen, die auf den 10X-Chromchip geladen werden sollen. Sobald das Protokoll vollständig optimiert ist, wird davon abgeraten, diesen Qualitätskontrollschritt in den Folgeexperimenten durchzuführen, um eine unnötige Verschwendung von gesammelten Kernen zu vermeiden, die möglicherweise in geringer Anzahl verfügbar sind.
      1. Stellen Sie sicher, dass Objektträger und Deckgläser sauber und staubfrei sind. Waschen und spülen Sie die Deckgläser bei Bedarf mit absolutem Ethanol und trocknen Sie sie mit fusselfreien Tüchern.
      2. Verteilen Sie 25 μl Poly-L-Lysin in den Objektträgern, die verwendet werden, und inkubieren Sie 10 Minuten lang bei Raumtemperatur (RT), geschützt vor Staub.
      3. Entfernen Sie das überschüssige Poly-L-Lysin und fügen Sie 10 μl der gereinigten Kernsuspension hinzu. 5 Minuten bei RT vor Staub geschützt inkubieren.
      4. Geben Sie einen Tropfen Eindeckmedium in jede Vertiefung, um Blasen zu vermeiden.
      5. Lege ein Deckglas auf die ausgesäten Vertiefungen. Decken Sie das Deckglas mit Papiertüchern ab und drücken Sie das Deckglas fest an, um das überschüssige Eindeckmedium zu entfernen. Achten Sie darauf, das Deckglas nicht zu bewegen, und reinigen Sie das überschüssige Eindeckmedium nicht.
      6. Nehmen Sie mehrere Bilder mit einem inversen Mikroskop mit Hellfeldlicht und einer minimalen 40-fachen Vergrößerung auf.
  6. Führen Sie einen Multiom-Assay durch.
    1. Fahren Sie sofort mit Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression User Guide (CG000338 - Rev F)25 fort.

2. Reinigung von Zellkernen aus hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen des Knochenmarks der Maus (HSPCs)

HINWEIS Dieses Protokoll beschreibt die Aufreinigung von Zellkernen aus drei Untergruppen der Knochenmark-HSPCs: Lineage-c-Kit+Sca-1+ hämatopoetische Stammzellen (HSC), Lineage-c-Kit+Sca-1-CD34+FcγR- gemeinsame myeloische Vorläuferzellen (CMP) und Lineage-c-Kit+Sca-1-CD34+FcγR+ Granulozyten-Monozyten-Vorläuferzellen (GMP). Tragen Sie während des gesamten Eingriffs Latex- oder Nitrilhandschuhe. Dieses Protokoll ist eine Adaption des 10X Genomics Demonstrated Protocol - Nuclei Isolation for Single Cell Multiome ATAC + GEX Sequencing (CG000365 - Rev C)27. Das ursprüngliche Protokoll wurde modifiziert, um die Rückgewinnung der Kerne zu maximieren. Es wird dringend empfohlen, das Experiment von zwei Personen durchführen zu lassen, um die Schritte 1 durchzuführen. bis 3. (d. h. die Herstellung der Einzelzelllösung), die von einer Person durchgeführt wird, und Schritt 4 (d. h. die Vorbereitung des Sortierers), der parallel von einer anderen Person durchgeführt wird. Da das Protokoll sehr zeitkritisch ist, ist es wichtig, die Probenverarbeitungszeit zu minimieren, indem der Sortierer bereit ist, sobald die einzellige Suspension vorbereitet ist.

  1. Aufbereitung von Reagenzien und Materialien
    1. Fülle einen Eimer mit Eis.
    2. Bereiten Sie den FACS-Puffer vor: DPBS mit 2%iger HI-FBS-Lösung (ca. 500 ml für 6 Proben) und filtrieren Sie durch einen 0,2-μm-Filter.
    3. Bereiten Sie das Sammelmedium vor: DPBS mit 10%iger HI-FBS-Lösung (500 μl pro Probe) und filtrieren Sie durch einen 0,2-μm-Filter.
  2. Isolierung von Knochenmarkzellen
    1. Opfern Sie Mäuse unter Verwendung von Protokollen, die von der Institution genehmigt wurden. In diesem Experiment wurden die Mäuse nach einer Überdosis Ketamin/Xylazin durch Gebärmutterhalsverrenkung getötet.
    2. Besprühen Sie den Bauch und die Hinterbeine der Mäuse mit 70%igem Ethanol.
    3. Machen Sie mit einer sterilen Pinzette und Schere einen kleinen Schnitt in der Mitte des Unterbauchs und öffnen Sie das Bauchfell von der Basis der Hinterbeine bis zum Zwerchfell (ergänzende Abbildung 1).
    4. Machen Sie einen zusätzlichen Schnitt für jedes Hinterbein senkrecht zum geöffneten Bauchfell, greifen Sie dann beide Seiten eines dieser zusätzlichen Schnitte und ziehen Sie ihn auseinander, um die Haut von beiden Hinterbeinen über das Sprunggelenk hinaus abzuziehen, um die Muskeln beider Hinterbeine freizulegen (Ergänzende Abbildung 1A).
    5. Legen Sie die Schere entlang der Wirbelsäule am Hüftgelenk eines Hinterbeins aus, um das Bein herauszuschneiden, ohne den Oberschenkelknochen zu durchtrennen (Ergänzende Abbildung 1B, C). Wiederholen Sie das Gleiche für das andere Bein.
    6. Um den Oberschenkelknochen zu isolieren, schneiden Sie den größten Teil des Muskelgewebes heraus und halten Sie dann den Oberschenkelknochen und das Schienbein in jeder Hand mit den Fingerspitzen am Gelenk (Ergänzende Abbildung 1D, E). Beugen Sie das Bein vorsichtig gegen die natürliche Biegung, um das Schienbein vom Oberschenkelknochen zu trennen (Ergänzende Abbildung 1E) und schneiden Sie dann das Bindegewebe vorsichtig mit einer Schere ab, um Oberschenkelknochen und Schienbein zu trennen.
    7. Verwenden Sie die Schere mit leichten Drehbewegungen, um das Stück Rückgrat vom oberen Ende des Oberschenkelknochens auszurenken (Ergänzende Abbildung 1E).
    8. Reinigen Sie den isolierten Oberschenkelknochen mit Seidenpapier, um den restlichen Muskel und das Bindegewebe zu entfernen.
    9. Kühl auf Eis in einer 12-Well-Platte aufbewahren, die gut mit 2 ml DMEM (1x) + GlutaMAX-I gefüllt ist.
    10. Sobald alle Oberschenkelknochen entnommen sind, stellen Sie sicher, dass Muskel- und Fasergewebe vollständig aus dem Knochen entfernt werden. Schneiden Sie den Knochen nicht auf, um (a) das Knochenmark im Inneren steril zu halten und (b) den Verlust von Zellen im Well zu vermeiden. Verwenden Sie die folgenden Schritte, um die Zellen aus zwei Oberschenkelknochen einer Maus zu spülen, die von Haag und Murthy28 übernommen wurden.
    11. Bereiten Sie ein 1,5-ml- und ein 0,5-ml-Röhrchen vor. Geben Sie 150 μl des FACS-Puffers in das 1,5-ml-Röhrchen, stechen Sie dann mit einer 18-g-Nadel ein Loch in den Boden des 0,5-ml-Röhrchens und setzen Sie das 0,5-ml-Röhrchen in das 1,5-ml-Röhrchen ein.
    12. Öffnen Sie den distalen Teil jedes Oberschenkelknochens mit einer chirurgischen Mausschere (Ergänzende Abbildung 1F): Verriegeln Sie die distale Epiphyse zwischen den Klingen und üben Sie sanften Druck aus, während Sie die Schere umdrehen, um die distale Epiphyse sanft zu lösen, ohne den Knochen hart aufzuschneiden. Im Erfolgsfall sollten 4 Ausstülpungen am nun freiliegenden Physisende sichtbar sein (Ergänzende Abbildung 1G).
    13. Setzen Sie die beiden Oberschenkelknochen mit dem offenen Ende nach unten in das vorbereitete 0,5-ml-Röhrchen ein, das sich in einem 1,5-ml-Röhrchen mit FACS-Puffer befindet (Ergänzende Abbildung 1H).
    14. Legen Sie ein 70-μm-Zellsieb auf ein 50-ml-Röhrchen und benetzen Sie das Sieb mit 2 ml FACS-Puffer vor.
    15. Um das Knochenmark zu spülen, zentrifugieren Sie die Röhrchen (Kappen offen) bei 12.000 x g , bis die Zentrifuge den Wert von 12.000 x g erreicht, und stoppen Sie dann sofort die Zentrifuge.
    16. Stellen Sie sicher, dass die Knochenmarkzellen im 1,5-ml-Röhrchen pelletiert sind und dass die Oberschenkelknochen weiß sind (vor der Zellspülung sind sie rot) (ergänzende Abbildung 1I). Entsorgen Sie die 0,5-ml-Röhrchen mit den 2 Oberschenkelknochen.
    17. Entsorgen Sie den 150-μl-Überstand mit einer Pipette.
    18. Resuspendieren Sie das Pellet mit einer Mikropipette in 1 ml Ammonium-Chlorid-Kalium (ACK)-Lysepuffer für 1-2 Minuten bei RT, um die roten Blutkörperchen zu lysieren. Vermeiden Sie längere Inkubationszeiten, da sie zu einer verminderten Lebensfähigkeit kernhaltiger Zellen führen können.
    19. In das 50-ml-Röhrchen durch das vorgetränkte 70-μm-Zellsieb überführen.
    20. Fügen Sie 10 ml FACS-Puffer hinzu, um den ACK-Lysepuffer zu verdünnen und die Lyse zu stoppen.
    21. Bei 400 x g 5 min bei 4 °C zentrifugieren. Resuspendieren Sie in 10 ml FACS-Puffer, indem Sie zuerst in 1 ml resuspendieren und dann mit 9 ml auffüllen.
    22. Bereiten Sie die Zellen für die Zählung vor, wie in 1.3.8 beschrieben.
    23. Zählen Sie die Zellen mit einem automatischen Zellzähler gemäß den Empfehlungen des Lieferanten. Es wird erwartet, dass es etwa 40 Millionen Zellen aus 2 Oberschenkelknochen sammelt.
  3. Färbung des Knochenmarks HSPC
    1. Die Zellen werden bei 400 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugiert und das Pellet mit einer Mikropipette in FACS-Puffer auf eine Endkonzentration von 1 x 107 Zellen/ml resuspendiert.
    2. Mit einer P1000-Mikropipette wird die Suspension in ein FACS-Röhrchen überführt, das durch eine 35-μm-Zellsiebkappe filtriert wird.
    3. Bereiten Sie Einzelproben im Reagenzglas für jeden in Tabelle 1 aufgeführten Antikörper vor, um Kompensationen von Fluorochromen auf dem Zellsortierer einzurichten:
      1. Bereiten Sie ein FACS-Röhrchen pro Antikörper vor und füllen Sie die Röhrchen mit 200 μl PBS.
      2. Geben Sie 15 μl Fluorochrom-Kompensationskügelchen in jedes FACS-Röhrchen mit Fluorochrom-konjugiertem Antikörper. Geben Sie in die FACS-Röhrchen für ungefärbte und für lebende/tote Einzelzellen 500.000 Zellen anstelle von Kügelchen.
      3. Geben Sie 1 μl jedes Fluorochrom-konjugierten Antikörpers (siehe Tabelle 1) in das entsprechende FACS-Röhrchen. Geben Sie 0,5 μl Lebende/Tot-Färbung in das Lebend/Tot-FACS-Röhrchen.
      4. 15 Minuten lichtgeschützt auf Eis legen.
    4. Bereiten Sie die Mischungen 1 und 2 wie in Tabelle 2 angegeben vor.
      HINWEIS: Die in Tabelle 2 angegebenen Antikörpervolumina gelten für die in der Materialtabelle genannten Antikörper. Sie müssen für jede neue Antikörperreferenz oder eine andere Charge derselben Antikörperreferenz optimiert werden.
    5. Geben Sie 300 μl Mix 1 in das Probenröhrchen, resuspendieren Sie es und bewahren Sie es 15 Minuten lang lichtgeschützt auf Eis auf.
    6. 300 μl Mix 2 in das Probenröhrchen geben, resuspendieren und 20 Minuten lang auf Eis vor Licht geschützt aufbewahren.
    7. Geben Sie 3 ml des FACS-Puffers in die einfach gefärbten Röhrchen und die mit Mix gefärbten Probenröhrchen. Bei 400 x g 5 min bei 4 °C herunterschleudern.
    8. Verwerfen Sie den Überstand vorsichtig mit einer Mikropipette und resuspendieren Sie das Pellet in 500 μl des FACS-Puffers.
    9. Bereiten Sie ein 1,5-ml-Röhrchen vor, das mit 500 μl Sammelmedium vorgefüllt ist.
      HINWEIS: Mischung 1 wird in DPBS hergestellt, da sie die Lebend-/Totenfärbung enthält, die erheblich von HI-FBS beeinflusst wird. Sobald die Zellen mit Lebend/Tot gefärbt sind, wird Mix 2 hinzugefügt, der die Fluorochrom-konjugierten Antikörper enthält, die in einem HI-FBS-haltigen FACS-Puffer resuspendiert sind. Die einzige Ausnahme ist der Anti-CD16/32-Antikörper, der im Antikörper-Mix 1 enthalten ist, um als Fc-Rezeptor-Blocker zu dienen, der die unspezifische Bindung der anderen im folgenden Schritt hinzugefügten Antikörper verhindert.
  4. Zellsortierung mit einem FACS
    HINWEIS: Während die Zellsortierung auf einer Vielzahl von Zellsortierern durchgeführt werden kann, wird hier das Verfahren zur Verwendung der Geräte BD FACSAria Fusion oder BD FACSAria III beschrieben. Es wird dringend empfohlen, dass die Kalibrierung und die Einrichtung des Zellsortierers unter Aufsicht oder von einem erfahrenen Benutzer des Geräts durchgeführt werden.
    1. Kalibrierung des FACS-Geräts: Siehe Protokoll 1 Schritt 4.1.
    2. Aufbau des FACS-Instruments für die Zellsortierung:
      1. Beginnen Sie mit der Erfassung der ungefärbten Zellen. Diese werden verwendet, um die Vorwärts- und Seitenstreuung sowie die Detektorspannung für jeden Fluorophor zu definieren. Stellen Sie die Parameter so ein, dass das Fluoreszenzsignal jedes Fluorophors innerhalb der ersten Dekade der logarithmischen Skala im Punktdiagramm liegt.
      2. Erfassen Sie einfarbige Steuerelemente, um Kompensationen manuell einzurichten (Median positiver und negativer Grundgesamtheiten sollte ausgerichtet werden) oder verwenden Sie die automatische Berechnungssoftware (Neigungsmessungen). Stellen Sie sicher, dass die Kompensationssteuerungen mit den experimentellen Fluorochromen und Detektoreinstellungen übereinstimmen. Zeichnen Sie 10.000 Ereignisse für Zellen und 5.000 Ereignisse für Perlen auf.
      3. Verwenden Sie das Probenröhrchen (d. h. mehrfach gefärbte Zellen), um Zellpopulationen von Interesse zu definieren, indem Sie die in Abbildung 3A gezeigte Gating-Strategie verwenden. Führen Sie die Schritte 4 bis 6 (unten) aus.
      4. Um die drei interessierenden HSPCs im Knochenmark (HSC, CMP und GMP) zu identifizieren, beginnen Sie das Gating, indem Sie die Größe (FSC-A) und die Granularität (SSC-A) verwenden, um Leukozyten zu gleiten, und dann FSC-H/FSC-A, um Dubletten zu unterscheiden.
      5. Basierend auf SSC-A/totem Zellmarker, Gate lebende Zellen. Verwenden Sie Lineage/c-Kit, um Zellen auszuwählen, die abstammungsnegativ sind und mittlere bis hohe Konzentrationen von c-Kit exprimieren. Durch c-Kit/Sca-1, Gate auf Lineage-c-Kit+ Sca-1+ (LKS+) HSCs, eine der drei Populationen von Interesse.
      6. Unter den myeloischen Vorläuferzellen (Linie-c-Kit+Sca-1-) wird FcγR/CD34 verwendet, um CD34-FcγR-Megakaryozyten und erythroide Vorläuferzellen (MEP) auszuschließen, während CD34+ FcγR-CMP sowie CD34+FcγR+ GMP in die zu sortierenden Zellpopulationen aufgenommen werden.
      7. Stellen Sie sicher, dass der Strahl und die Ablenkung stabil sind.
      8. Schalten Sie in der Seitenstromkamera die Testsortierung ein, schalten Sie die Spannung ein und bestätigen Sie die genaue Tropfensortierung in einem 1,5-ml-Röhrchen, das auf der linken Seite angebracht ist.
      9. Wählen Sie im Fenster Sortierlayout die Population(en) aus, die Sie interessieren (d. h. "LKS+"- und "CD34+ -myeloische Vorläufer", die in diesem Beispiel gezeigt werden). Wählen Sie unter Gerät die Option 2 Tube aus. Wählen Sie unter "Präzision" die Option "Reinheit" aus. Wählen Sie unter Zielereignisse die Option Kontinuierlich aus, um zwischen 160.000 und 200.000 myeloischen LKS+ - und CD34+ -Vorläuferzellen zu sortieren.
      10. Geben Sie 500 μl FACS-Puffer zur Zellsuspension und überführen Sie die 1 ml der Probe durch Filtern in ein neues 35-μm-Zell-FACS-Röhrchen mit Siebverschluss, um sicherzustellen, dass sich alle Zellen kurz vor der Aufnahme in einer einzigen Suspension befinden. Dadurch werden Zellklumpen vermieden, die das Gerät verstopfen könnten.
      11. Wenn Sie fertig sind, klicken Sie auf Sortieren und OK , um mit dem Sortieren zu beginnen. Passen Sie die Durchflussrate an, um die Geschwindigkeit unter 10.000 Ereignissen pro Sekunde zu halten.
        ANMERKUNG: Das erwartete Verhältnis von LKS+ zu CD34+ myeloischen Vorläuferzellen beträgt 1:3 für eine erwachsene (8-12 Wochen alte) weibliche C57BL/6J-Maus im stationären Zustand. Die angestrebten sortierten Zellzahlen werden in der Regel innerhalb von 30 Minuten nach der Sortierung erreicht.
  5. Qualitätskontrolle und Zählung der sortierten Zellen
    HINWEIS: Dieser Schritt darf nur während des Pilotversuchs zur Optimierung der Probenvorbereitungsschritte durchgeführt werden, mit dem Ziel, die Reinheit der sortierten Zellen zu testen, die für die Zellkernisolierung verwendet werden sollen. Sobald das Protokoll vollständig optimiert ist, wird davon abgeraten, diesen Qualitätskontrollschritt in den Folgeexperimenten durchzuführen, um unnötige Verschwendung von Ausgangsmaterial zu vermeiden, das möglicherweise in geringer Anzahl für die Kernisolierung zur Verfügung steht.
    1. Reinheitskontrolle durch Durchflusszytometrie
      1. 10 μl der sortierten Zellen werden in ein neues FACS-Röhrchen mit 90 μl FACS-Puffer überführt.
      2. Erfassen und zeichnen Sie Daten nach der Sortierung auf, um die Reinheit und Durchführbarkeit der Sortierung zu überprüfen. Stellen Sie sicher, dass mindestens 95 % der Zellen im interessierenden Gate angezeigt werden, wie in 3 - 6 definiert und in Abbildung 3B dargestellt.
  6. Zellkernisolierung aus sortierten Knochenmark-HSPCs
    1. Verwenden Sie das Protokoll "Low Cell Input Nuclei Isolation" des Anhangs aus dem 10X Genomics Demonstrated Protocol - Nuclei Isolation for Single Cell Multiome ATAC + GEX Sequencing (CG000365 - Rev C)27 mit den folgenden Änderungen, um die Zellkernrückgewinnung zu optimieren:
      1. Lysezeit: Führen Sie ein Pilotexperiment für dieses Protokoll durch, um die beste Lysezeit für die Zellkernisolierung zu ermitteln. Stellen Sie sicher, dass eine vollständige Zelllyse erreicht wird, während intakte Zellkerne erhalten bleiben.
        ANMERKUNG: Schritt f des oben erwähnten 10X Genomics-Protokolls27 weist an, "3-5 Minuten lang [im Lysepuffer] auf Eis zu inkubieren". Während des Pilotversuchs mindestens 3 Minuten, 4 Minuten und 5 Minuten lang testen und die Quantität der gewonnenen Kerne durch Zählen und die Qualität durch Durchflusszytometrie und mikroskopische Bildgebung bewerten, um die optimale Lysedauer zu wählen (siehe Beschreibung dieser Qualitätskontrollen unten). Um Reagenzien zu sparen, ersetzen Sie im Pilotversuch den verdünnten Kernpuffer durch PBS 0,04% BSA. Für Knochenmark-HSPCs wurde 3 min als optimale Lysedauer identifiziert.
      2. Zellzentrifugationen: Bei allen Zellsuspensionszentrifugationen bei 300 x g für 7 min zentrifugieren (statt der 5 min in CG000365 - Rev C)27 bei 4 °C.
      3. Kernzentrifugationen: Alle Kernsuspensionszentrifugationen bei 500 x g für 5 min gemäß CG000365 - Rev C27 durchführen.
      4. Zellkernentnahme: In Schritt b werden nach der Resuspendierung in 50 μl PBS 0,04 % BSA und dem Transfer in ein 0,2 ml-Röhrchen 50 μl PBS 0,04 % BSA in das ursprüngliche Röhrchen gegeben und mit einer Pipettenmischung versehen, um alle verbleibenden Zellen zu sammeln. In das 0,2-ml-Röhrchen umfüllen, um ein Gesamtvolumen von 100 μl zu erreichen.
      5. Von nun an beträgt das Gesamtvolumen 100 μl statt der 50 μl des Protokolls. Passen Sie die nachgeschalteten Schritte entsprechend an (z. B. für Schritt d 90 μl statt 45 μl entfernen; für Schritt e 90 μl Lysepuffer statt 45 μl hinzufügen).
      6. Für Schritt m wird das Kernpellet in 12 μl verdünntem Kernpuffer anstelle von 7 μl resuspendiert.
      7. Zähle die isolierten Kerne. In ein leeres 0,5-ml-Röhrchen 10 μl 0,4 % Trypanblau und 8 μl PBS 0,04 % BSA geben.
      8. 2 μl Zellkerne in das Röhrchen geben und die Kerne wie in Abschnitt 1.3.8 beschrieben zählen. Verwenden Sie einen automatisierten Zellzähler gemäß den Empfehlungen des Lieferanten.
  7. Reinheitskontrolle durch Durchflusszytometrie
    HINWEIS: Dieser Schritt darf nur während des Pilotexperiments zur Optimierung der Probenvorbereitungsschritte durchgeführt werden, um die Reinheit der Kerne zu testen, die auf den 10X-Chrom-Chip geladen werden sollen. Sobald das Protokoll vollständig optimiert ist, wird davon abgeraten, diesen Qualitätskontrollschritt in den Folgeexperimenten durchzuführen, um eine unnötige Verschwendung von gesammelten Kernen zu vermeiden, die möglicherweise in geringer Anzahl verfügbar sind.
    1. Nach Abschluss der Zellkernisolierung werden 6 μl Zellkernresuspension in ein neues FACS-Röhrchen überführt, das mit 150 μl FACS-Puffer vorgefüllt ist. Fügen Sie 3 μl 7-AAD hinzu und inkubieren Sie 5 Minuten lang auf Eis.
    2. Erfassen und zeichnen Sie Daten nach der Sortierung auf, um die Reinheit und Durchführbarkeit der Sortierung zu überprüfen. Stellen Sie sicher, dass mindestens 95 % der Kerne im Gate of Interest erscheinen, wie in Protokoll 1 Schritt 4.2 definiert (siehe Abbildung 4).
  8. Qualitätskontrolle von gereinigten Zellkernen mittels Mikroskopie:
    HINWEIS: Dieser Schritt darf nur während des Pilotversuchs zur Optimierung der Probenvorbereitungsschritte durchgeführt werden, um die Qualität der Kerne zu testen, die auf den 10X-Chromium-Chip geladen werden sollen. Sobald das Protokoll vollständig optimiert ist, wird davon abgeraten, diesen Qualitätskontrollschritt in den Folgeexperimenten durchzuführen, um eine unnötige Verschwendung von gesammelten Kernen zu vermeiden, die möglicherweise in geringer Anzahl verfügbar sind.
    1. Gehen Sie wie in Schritt 1.5.3 beschrieben vor.
  9. Multiom-Assay durchführen
    1. Fahren Sie sofort mit Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression User Guide (CG000338 - Rev F)25 fort.

Representative Results

Die beiden oben beschriebenen Protokolle beschreiben die Isolierung von Zellkernen ausgehend von zwei verschiedenen Gewebetypen. Die Unterschiede und Gemeinsamkeiten zwischen den beiden Protokollen sind in Abbildung 1 schematisch dargestellt.

Aufreinigung von Zellkernen aus dem Gehirn von Mäusen
In dem hier beschriebenen Protokoll schlagen wir eine schonende Methode zur Zellkernpräparation aus Hirnproben vor. Es beginnt mit einer mechanischen Dissoziation des Hirngewebes in einem Lysepuffer, gefolgt von Wasch- und Siebfilterschritten, die das verbleibende Gewebe aus der Suspension entfernen. Die anschließende Entfernung von Trümmern, nicht lysierten Zellen und kleinen Partikeln wird durch FACS erreicht, um sicherzustellen, dass nur gereinigte Kerne für das nachgeschaltete Multiome-Protokoll geladen werden. Abbildung 2 zeigt das Profil der Kerne vor und nach der Sortierung. Nach der Filterung und vor der Sortierung der Zellkerne enthält die Probe eine große Menge an Ablagerungen, wobei mehr als 99 % der "Singuletts" positiv für eine Kernfärbung (7-AAD) sind, was auf eine optimale Zelllyse hinweist (Abbildung 2A). Die Zellkerne werden nach dem 7-AAD-positiven Gatter sortiert. Ein Bruchteil des sortierten Materials wird gewonnen, um die Reinheit der präparierten Kerne zu überprüfen. Abbildung 2B zeigt das Profil der Hirnkerne nach der Sortierung. Die Sortierung der Zellkerne ermöglichte eine Erhöhung der Kernreinheit von anfänglich 36 % (Abbildung 2A) auf fast 100 % (Abbildung 2B).

Figure 2
Abbildung 2: Anschnittstrategie für die Kernsortierung und Reinheitsprüfung nach der Sortierung. Die Zellkerne wurden mit 7-AAD gefärbt und mit dem Zellsortierer erfasst. (A) Die Kerne werden zunächst auf der Grundlage ihrer Größe und Granularität (FSC-A bzw. SSC-A) gegatet. Die einzelnen Partikel werden dann auf der Grundlage ihrer FSC-A/FSC-H-Eigenschaften und der 7-AAD-Färbung ausgewählt. (B) Nach der Zellsortierung wird ein Teil der Zellkerne aus dem Sammelröhrchen auf Reinheit geprüft, wobei die gleiche Anschnittstrategie wie in A verwendet wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Aufreinigung von hämatopoetischen Stammzellvorläuferzellen (HSPCs) aus dem Knochenmark der Maus
Nach der Isolierung aus dem Knochenmark werden bis zu 2 x 105 HSPCs gemäß der in Abbildung 3A gezeigten Anschnittstrategie nach FACS sortiert. Die Sortiereffizienz und die Reinheit der Probe werden bewertet (Abbildung 3B).

Figure 3
Abbildung 3: Anschnittstrategie für die Sortierung von Knochenmark-HSPCs. (A) Eine repräsentative FACS-Gating-Strategie für die Sortierung lebensfähiger hämatopoetischer LKS+ -Stammzellen und CD34+ -myeloischer Vorläuferzellen zur Zellkernisolierung. (B) Repräsentative FACS-Diagramme, die zur Überprüfung der Reinheit der sortierten Zellpopulation verwendet werden. Dargestellt sind die Anteile verschiedener Zelluntergruppen in Bezug auf die übergeordnete Population. *Die beiden sortierten Populationen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Das Protokoll "Low Cell Input Nuclei Isolation" ermöglicht die Kernisolierung aus Proben mit maximal 105 Zellen. Es beinhaltet eine geringe Anzahl von Zentrifugationsschritten, wodurch der Zell-/Kernverlust minimiert wird. Wir haben das Volumen der Lyse- und Waschpuffer proportional zum Zelleingang angepasst und die Zentrifugationszeit für eine maximale Zellkernausbeute erhöht. Wir haben ein Pilotexperiment durchgeführt, um die Quantität der geborgenen Kerne durch Zählung und ihre Qualität durch Durchflusszytometrie und mikroskopische Bildgebung zu bewerten. Abbildung 4 zeigt die HSPC-Probe nach der Zelllyse. Dieses Protokoll erzeugte qualitativ hochwertige Kerne, wie in Abbildung 5A zu sehen, ohne Ablagerungen, die das nachgeschaltete Multiom-Protokoll beeinträchtigen könnten.

Figure 4
Abbildung 4: Reinheitstest-Sortierung von isolierten Knochenmark-HSPC-Kernen. Die Zellkerne wurden mit 7-AAD gefärbt und mit dem Zellsortierer erfasst. Die Zellkerne wurden zunächst anhand ihrer Größe und Körnung (FSC-A bzw. SSC-A) beschnitten, um die Reinheit der Probe zu beurteilen. Der Anteil der Zellkerne wird in Bezug auf die Elternpopulation angegeben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Nummer der Röhre Name der Röhre Gefärbte Entität Menge der gefärbten Entität Antikörper/Farbstoff (μL) Sammelpuffer (μL)
1 Ungefleckt Zellen 5,00,000 N/A 200
2 LIVE/DEAD Fixierbare Aqua Dead Cell Färbung Zellen 5,00,000 0.5
3 APC/Cyanin 7 Anti-Maus CD16/32 (FcγR) OneComp eBeads 15 μl 1
4 Pacific Blue Anti-Maus Lineage Cocktail OneComp eBeads 15 μl 1
5 PE Anti-Maus Ly-6A/E (Sca-1) OneComp eBeads 15 μl 1
6 APC Anti-Maus CD117 (c-Kit) OneComp eBeads 15 μl 1
7 FITC Anti-Maus CD34 OneComp eBeads 15 μl 1

Tabelle 1: Einzelfärbungskontrollen für Kompensationseinstellungen am Durchflusszytometer. Angegeben sind die erforderlichen Einzelfärbungskontrollen, die Anzahl der zu färbenden Zellen oder Kügelchen und die Antikörpermengen.

Master-Mix Reagenz Endgültige Verdünnung Antikörper/Farbstoff (μL) Puffer-Typ Puffer (μL)
Mischung 1 APC/Cyanin 7 Anti-Maus CD16/32 (FcγR) 1/500 1.2 DPBS 300
LIVE/DEAD Fixierbare Aqua Dead Cell Färbung 1/250 2.4
Mischung 2 Pacific Blue Anti-Maus Lineage Cocktail 1/20 30 FACS-Puffer 300
PE Anti-Maus Ly-6A/E (Sca-1) 1/200 3
APC Anti-Maus CD117 (c-Kit) 1/200 3
FITC Anti-Maus CD34 1/50 12
Gesamtvolumen der Färbung 600

Tabelle 2: Zusammensetzung der Färbemischung für Knochenmark-HSPCs. Dargestellt sind die Volumina der Reagenzien, die für die Färbung einer Probe mit 40 Millionen Zellen erforderlich sind. Um eine größere Anzahl von Proben zu färben, multiplizieren Sie das angegebene Volumen mit der erforderlichen Anzahl von Proben und fügen Sie die Hälfte eines zusätzlichen Probenvolumens hinzu, um ein ausreichendes Volumen der Mastermischung zu gewährleisten.

Ergänzende Abbildung 1: Protokoll zur Isolierung von Knochenmarkzellen. (A) Öffnen Sie das Bauchfell. Weiße gestrichelte Linien zeigen die Linie an, entlang der geschnitten werden soll. (B) Nachdem Sie die Haut vom Hinterbein abgezogen haben, legen Sie die Schere entlang der Wirbelsäule am Hüftgelenk aus, um das Bein herauszuschneiden, ohne den Oberschenkelknochen zu durchtrennen. (C) Das Aussehen des vom Körper getrennten Beins vor der Entfernung des Muskels. (D) Das Aussehen des Beins nach der Entfernung des Muskels. (E) Das Verfahren zur Abtrennung des Oberschenkelknochens am Kniegelenk und dann am Hüftgelenk, wobei darauf zu achten ist, dass der Oberschenkelknochen nicht aufgeschnitten wird. Weiße gebogene Pfeile zeigen die erforderliche Bewegung an. Weiße gestrichelte Pfeile zeigen den Bereich an, der vorsichtig mit einer Schere abgetrennt werden muss. (F) Verfahren zur Öffnung des distalen Teils des Femurs (d. h. des Teils, der zuvor am Kniegelenk mit dem Schienbein verbunden war), indem der Knorpel und die distale Epiphyse mit einer Schere sicher gegriffen und zurückgedreht werden, um das Knochenmark freizulegen. (G) Vier Vorsprünge, die durch schwarze Pfeile gekennzeichnet sind, sollten am exponierten Ende des Körpers sichtbar sein. (H) Das Auftreten eines Oberschenkelknochens mit dem offenen Ende nach unten in das vorbereitete 0,5-ml-Röhrchen, das in ein 1,5-ml-Röhrchen mit 150 μl FACS-Puffer gelegt wird. (I) Das Erscheinungsbild der pelletierten Knochenmarkzellen und des nun weißen Oberschenkelknochens nach schneller Zentrifugation bei 12.000 x g. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Discussion

Die Herstellung einer qualitativ hochwertigen Zell- oder Zellkernsuspension ist von entscheidender Bedeutung für den Erfolg von Einzelzell- oder Einzelkern-RNA-Seq- und Einzelzell-Multiomic-Analysen 29,30,31. Hier haben wir Protokolle für die Probenvorbereitung und die Zellkernisolierung für Multiom-Assays aus zwei Arten von Gewebe beschrieben: Gehirn und Knochenmark.

Das in dieser Arbeit beschriebene Gehirnprotokoll ermöglicht die Gewinnung hochwertiger Zellkerne aus frisch gefrorenem Hirngewebe. Es umfasst die folgenden Schritte: Aufschluss von gefrorenem Gewebe, Isolierung von Kernen, Reinigung von Kernen und Qualitätskontrolle des vorbereiteten Materials. Das Hirngewebe besteht aus vielen verschiedenen Zelltypen, und das Verfahren der Gewebedissoziation und der Zellkernisolierung sollte die Anteile der Zellpopulationen erhalten, wie sie im Ausgangsgewebe vorhanden sind. Hier wurden die Zusammensetzung des Lysepuffers und die Inkubationszeit optimiert, um eine vollständige und schonende Lyse aller Zellpopulationen zu ermöglichen, aus denen das Gewebe besteht.

Das Knochenmark-HSPC-Protokoll ist etwas anders, da es einen zusätzlichen Schritt zu Beginn des Experiments erfordert, um die interessierende Zellpopulation aus einer heterogenen zellulären Suspension zu isolieren. Nach der Entnahme von frischem Gewebe werden die roten Blutkörperchen lysiert und die Probe für die gewünschte Zelluntergruppe angereichert. Die Zielzellen werden lysiert, die Zellkerne isoliert und die Qualität des präparierten Materials kontrolliert.

10X Genomics bietet mehrere Protokolle an, die für die Zellkernisolierung in zahlreichen verschiedenen Geweben validiert sind32,33. Das Unternehmen vermarktet auch ein Kernisolationskit mit einer unkomplizierten Pipeline zur Isolierung von Kernen aus validierten Geweben34. Diese Protokolle müssen jedoch zusätzlich optimiert werden, um die Besonderheiten bestimmter Proben maßzuschneidern. Ein Beispiel sind die Beispiele, die mit geringem Zellaufwand arbeiten müssen. Bei diesen Proben sind die schwierigsten Schritte Zentrifugationen, die streng genug sein müssen, um die Probe zu reinigen, und sanft genug, um Zell-/Kernverlust zu vermeiden. Mit dem hier beschriebenen Protokoll haben wir das 10X Genomics Demonstrated Protocol - Nuclei Isolation for Single Cell Multiome ATAC + GEX Sequencing (CG000365 - Rev C)27 angepasst, um eine feine Balance zwischen diesen beiden Anforderungen zu finden. Wie am Beispiel der Präparation von Zellkernen aus sortierten HSPCs gezeigt, haben wir die Zellkernrückgewinnung verbessert, ohne die Qualität der Probe zu beeinträchtigen.

Eine weitere Herausforderung ist der Schritt der Lyse von gereinigten Zellen zur Zellkernisolierung. Härtere Lysebedingungen und längere Inkubationszeiten können Zellkerne schädigen und dadurch die Qualität der Sequenzierungsdaten beeinträchtigen. Abbildung 5 zeigt eine repräsentative Kernbildgebung von Knochenmarkproben bei unterschiedlichen Inkubationszeiten mit Lysepuffer und zeigt, wie unterschiedlich der Zustand der Zellkerne in Abhängigkeit von der Zelllyse sein kann. Im Beispiel der HSPCs haben wir die 3-minütige Lyse als die Bedingung identifiziert, die zu dem höchsten Anteil an gesund aussehenden, intakten Kernen und dem geringsten Anteil an geschädigten Kernen führt. Die Inkubationszeiten der Lyse sollten für jeden neuen Probentyp optimiert werden.

Figure 5
Abbildung 5: Qualitätskontrolle der Kerne durch Mikroskopie. Gezeigt werden repräsentative Hellfeldbilder von isolierten Zellkernen aus dem Knochenmark von Mäusen mit (A) intakten und (B) beschädigten Kernen. Maßstabsleiste 5 μm. Die Bilder wurden mit einem inversen Mikroskop mit einem 40-fachen ELWD-Objektiv NA 0,60 und einem 1,5-fachen Digitalzoom aufgenommen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Beide Protokolle, die in dieser Arbeit beschrieben werden, beruhen auf der Reinigung von Zielzellen oder -kernen mit FACS-Instrumenten mit hohem Durchsatz. Dieser Schritt ist von entscheidender Bedeutung für Einzelzell-/Kernpräparationsprotokolle, bei denen seltene Untergruppen von Zellen aus heterogenen Suspensionen isoliert werden sollen. In diesen, wie in dem hier gezeigten Beispiel für die Sortierung von HSPCs, kann ein hochdimensionales Durchflusszytometrie-Panel erforderlich sein, um das "Gating" der interessierenden Zellpopulation zu ermöglichen. Die Sortierung ist extrem schnell und genau, was zu einer Reinheit von über 95 % der sortierten Zelluntergruppen führt. Dieser Ansatz setzt die zelluläre Suspension einem Druck von bis zu 70 psi aus und kann daher für die Sortierung fragiler Zellen (z. B. dendritische Zellen, Neutrophile) einschränkend sein, da dies den Bruch ihrer Zellmembran verursachen kann. In diesen Fällen sollten alternative Lösungen für die Zellreinigung ausgewählt werden, einschließlich magnetischer Sortierung, Anwendung von Instrumenten der neuen Generation (z. B. CellenOne, Cellenion; MACSQuant Tyto, Miltenyi)35,36, oder tröpfchenbasierte Systeme (z. B. ODIN, Sensific)37. Nichtsdestotrotz ist die langsame Sortiergeschwindigkeit dieser Technologien, mit einer Zellsortierung, die Stunden statt Minuten dauert, ein starker limitierender Faktor für die Anwendung dieser Ansätze bei der Vorbereitung lebensfähiger Zellen für Multiome und andere Einzelzellanwendungen, die auf der Analyse großer Zellzahlen basieren.

Für die Aufreinigung von aus dem Gewebe isolierten Kernen ist FACS aufgrund seines Durchsatzes und der Reinheit des isolierten Materials die Methode der Wahl. Zellkerne sind unempfindlich gegen Druck, und gefilterte Gewebeisolate können leicht durch den Zellsortierer gereinigt werden. Wenn das Labor nicht mit einem FACS-Gerät ausgestattet ist, gibt es andere Alternativen, die etwas weniger effizient, aber ausreichend gut sind. Beispiele hierfür sind die Ultrazentrifugation oder der Einsatz von Kleingeräten wie MARS (Applied Cell), die Partikel anhand ihres Größenunterschieds mithilfe akustischer Wellen trennen; CURIOX Laminarwaschanlage, die hydrophobe Eigenschaften von Zell-/Kernsuspensionen nutzt; oder LEVITAS bio, das sich auf die physikalischen Eigenschaften der Zellen (Levitation) stützt, um sie von den Trümmern zu trennen.

Hier beschreiben wir Protokolle, um eine hohe Anzahl von Kernen und die beste Reinheit für das nachgeschaltete Multiom-Protokoll zu erhalten. FACS-Sortierung und wiederholte Zentrifugationsschritte führen zu einem erheblichen Verlust des Ausgangsmaterials. Aus diesem Grund benötigt das hier beschriebene Protokoll für die Kernpräparation aus dem Gehirn ausreichend reichlich Ausgangsmaterial, um nach der FACS-Sortierung eine Sammlung von mindestens 500.000 Kernen zu erzielen. Alternative Protokolle sollten angewendet werden, wenn dieses Kriterium nicht erfüllt werden kann. Bei der Arbeit mit seltenen Zellpopulationen oder kleinen Gewebeschnitten kann die verfügbare Menge an Ausgangsmaterial ein limitierender Faktor sein. Um dieses Problem anzugehen, ist es möglich, die Zellkernrückgewinnung zu verbessern, indem (a) das Lysevolumen reduziert wird, (b) das Waschvolumen reduziert wird, (c) eine einzige Wäsche mit verlängerter Zentrifugationszeit verwendet wird, um zu versuchen, die Wiederfindung zu verbessern, wie es in den 10X Genomics-Protokollen für die Isolierung von Zellkernen mit niedrigem Input angegeben ist. Für die multiomische Analyse von Material mit niedrigem Gehalt lohnt es sich, plattenbasierte Anwendungen wie scNMT, SNARE-seq und Paired-seq38 in Betracht zu ziehen, die viel weniger Eingangsproben erfordern.

Zusammenfassend haben wir zwei robuste Protokolle für die Präparation von Zellkernen aus dem Gehirn und dem Knochenmark HSPCs für die nachgeschaltete Multiomanalyse beschrieben. Diese Protokolle sind in jedem wissenschaftlichen Projekt anwendbar, das qualitativ hochwertige Einzelkernsuspensionen aus diesen beiden Gewebearten erfordert, unabhängig von der gestellten wissenschaftlichen Fragestellung. Unsere Gruppe hat das Protokoll zur Isolierung von Hirnkernen in Studien zur Gehirnentwicklung nach Inaktivierung verschiedener Zielgene und in Studien zur Immunantwort im Zusammenhang mit neurologischen Erkrankungen angewendet. Wir verwenden das Protokoll zur Isolierung von Knochenmarkkernen, um die Beteiligung verschiedener hämatopoetischer Subpopulationen an der Etablierung des Immunsystems zu entschlüsseln.

Disclosures

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Acknowledgments

Ana Jeemin Choi wurde durch ein Stipendium des Pasteur - Paris University (PPU) International Ph.D. Program unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
18 G x 1 ½ (1.2 mm x 38 mm) Agani needles Terumo AN*1838S1
15 mL tubes Falcon 352097
5 mL round bottom FACS tube with cell strainer cap 35 µm falcon 352235
50 mL tubes Falcon 352070
7-AAD BD pharmagen 559925
ACK Lysing Buffer Gibco A10492-01
APC anti-mouse CD117 (c-Kit) BioLegend 105812 Clone: 2B8
APC/Cyanine 7 anti-mouse CD16/32 (FcγR) BioLegend 101328 Clone: 93
BD FACSAria III BD Biosciences non-applicable
BD FACSDiva Software v8.0.1 BD Biosciences non-applicable
Bovine Serum Albumin  stock solution 10% Miltenyi Biotec 130-091-376
Cell staining buffer Biolegend 420201
CFI Suprplan Fluor ELWD 40XC ON 0.6 Nikon  non-applicable
CMOS camera Prime 95B 25 mm Photometrix non-applicable
Countess II FL Automated Cell Counter Invitrogen AMQAF1000
Countess cell counting chamber slide Invitrogen C10283
Coverglass 24 mm x 24 mm 0.13-0.17 mm Brand BR470819
Digitonine 5% Invitrogen BN2006
Disposable Scalpels  Swann-Morton  0508
DMEM (1x) + GlutaMAX-I Gibco 31966-021
DPBS (10x) Gibco 14200-067
DTT Sigma aldrich 646563
Epifluorescence inverted microscope Nikon Ti2 -E Nikon  non-applicable
Eppendorf Safe-Lock Tubes 0.5 mL Eppendorf 30123603
Ethanol 70% VWR 83801.290
FITC anti-mouse CD34 Invitrogen 11-0341-85 Clone: RAM34
Forceps for dissection FST 11152-10
Heat-inactivated Fetal Bovine Serum (FBS) Gibco 11533387
Dounce Homogeniser 2 mL Bellco glass 1984-10002 Pestle “A” Large Clearance: .0030-.0050″ and Pestle “B” Small Clearance: .0005-.0025″
LIVE/DEAD fixable aqua dead cell stain kit Invitrogen L34957
Magnesium chloride solution 1 M Sigma aldrich M1028
Microcentrifuge  Eppendorf 5424R
Mounting medium Fluoromount-G  invitrogen 00-4958-02
Nonidet P40 substitute Sigma aldrich 74385
Nuclease free water ThermoFischer AM9932
Nuclei buffer 20x  10X Genomics 2000153/2000207
Nuclei isolation kit EZ prep Sigma Aldrich NUC-101
OneComp eBeads compensation beads Invitrogen 01-1111-41
Pacific Blue anti-mouse lineage cocktail
(including anti-mouse CD3, Ly-6G/Ly-6C, CD11b, CD45R/B220, TER-119)		 BioLegend 133310 Clones (in the same order as the antibodies listed): 17A2, RB6-8C5, M1/70, RA3-6B2, Ter-119
PCR Tube Strips 0.2 mL Eppendorf 951010022
PE anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) BioLegend 122507 Clone: E13-161.7
Petri dish 100 mm x 20 mm OPTILUX Falcon 353003
Ply-L-lysine 0.01% sterile-filtered suitable for cell culture Sigma P4707
Printed microscope slides 8 well 6 mm numbered Epredia ER-301B-CE24
Protein LoBind Tubes 1.5 mL Eppendorf 30108116
Recombinant Rnase inhibitor 5000 U Takara 2313A
Scissors for dissection FST 14090-09
Sodium chloride solution 5 M Sigma aldrich 59222C
Syringe filters, PES, 0.2 µm Fisher Scientific 15206869
Transparent nail polish  any non-applicable
Trizma Hydrochloride solution pH 7.4 Sigma aldrich T2194
Trypan Blue 0.4% gibco 15250061
Tween 20 Biorad  1662404
UltraPure Distilated Water Dnase/Rnase Free Invitrogen 10977-035

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References

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Moraes Cabé, C., Novault, S., Jeemin Choi, A., Seffer, V., Barrio Cano, L., Libri, V., Hasan, M. High-Quality Brain and Bone Marrow Nuclei Preparation for Single Nuclei Multiome Assays. J. Vis. Exp. (202), e65715, doi:10.3791/65715 (2023).

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