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Biology

एकल नाभिक मल्टीओम परख के लिए उच्च गुणवत्ता वाले मस्तिष्क और अस्थि मज्जा नाभिक तैयारी

Published: December 22, 2023 doi: 10.3791/65715
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1, 1,3, 1
1Cytometry and Biomarkers UTechS, C2RT, Institut Pasteur, Université Paris Cité, 2Microenvironment and Immunity Unit, Institut Pasteur, Université Paris Cité, INSERM U1224, 3Istituto Superiore di Sanità

Summary

एकल-कोशिका/एकल-नाभिक ट्रांसक्रिप्टोमिक्स और बहु-ओमिक्स की सफलता काफी हद तक कोशिकाओं/नाभिक की गुणवत्ता पर निर्भर करती है। इसलिए, ऊतक से कोशिकाओं/नाभिकों को अलग करना और उनकी शुद्धि को अत्यधिक मानकीकृत किया जाना चाहिए। यह प्रोटोकॉल डाउनस्ट्रीम सिंगल-न्यूक्ली मल्टीओम परख के लिए मस्तिष्क और अस्थि मज्जा से नाभिक की तैयारी का वर्णन करता है।

Abstract

एकल-कोशिका विश्लेषण जैविक प्रक्रियाओं की जटिलता को उजागर करने के लिए पसंद का दृष्टिकोण बन गया है जिसके लिए एकल-कोशिका संकल्प के साथ उपचार या संक्रमण के लिए व्यक्तिगत सेलुलर प्रतिक्रियाओं की परिवर्तनशीलता का आकलन करने की आवश्यकता होती है।

पिछले 10 वर्षों में एकल-कोशिका आणविक रूपरेखा के लिए कई तकनीकों का विकास किया गया है, और कई समर्पित प्रौद्योगिकियों का व्यावसायीकरण किया गया है। 10X जीनोमिक्स बूंद-आधारित एकल-सेल प्रोफाइलिंग एक व्यापक तकनीक है जो ट्रांसक्रिप्टोमिक और मल्टी-ओमिक सिंगल-सेल प्रोफाइलिंग के लिए तैयार-से-उपयोग अभिकर्मकों की पेशकश करती है। प्रौद्योगिकी में सिंगल-सेल और सिंगल-न्यूक्ली आरएनए सीक्वेंसिंग (क्रमशः स्क्आरएनए-सेक और एसएनआरएनए-सेक), एससीएटीएसी-सेक, सिंगल-सेल इम्यून प्रोफाइलिंग (बीसीआर/टीसीआर सीक्वेंसिंग), और मल्टीओम के लिए वर्कफ़्लो शामिल हैं। उत्तरार्द्ध एक ही सेल से आने वाले ट्रांसक्रिप्शनल (स्आरएनए-सेक) और एपिजेनेटिक जानकारी (एससीएटीएसी-सेक) को जोड़ती है।

ऊतकों से अलग एकल-कोशिका या एकल-नाभिक निलंबन की गुणवत्ता (व्यवहार्यता, अखंडता, शुद्धता) और इनमें से किसी भी दृष्टिकोण द्वारा विश्लेषण उच्च गुणवत्ता वाले डेटा उत्पन्न करने के लिए महत्वपूर्ण है। इसलिए, नमूना तैयारी प्रोटोकॉल को प्रत्येक जैविक ऊतक की विशिष्टताओं के अनुकूल बनाया जाना चाहिए और उच्च गुणवत्ता वाले सेल और नाभिक निलंबन की पीढ़ी सुनिश्चित करना चाहिए।

यह लेख डाउनस्ट्रीम मल्टीओम 10X जीनोमिक्स पाइपलाइन के लिए मस्तिष्क और अस्थि मज्जा के नमूने तैयार करने के लिए दो प्रोटोकॉल का वर्णन करता है। प्रोटोकॉल चरणबद्ध प्रदर्शन कर रहे हैं और ऊतक पृथक्करण, सेल छँटाई, नाभिक अलगाव, और तैयार नाभिक निलंबन की गुणवत्ता नियंत्रण है कि सेल विभाजन और बारकोडिंग, पुस्तकालय की तैयारी, और अनुक्रमण के लिए शुरू सामग्री के रूप में प्रयोग किया जाता है कवर. ये मानकीकृत प्रोटोकॉल उच्च गुणवत्ता वाले नाभिक पुस्तकालयों और मजबूत और विश्वसनीय डेटा का उत्पादन करते हैं।

Introduction

कई वर्षों के लिए, एकल सेल तकनीक जैविक प्रक्रियाओं के विश्लेषण के लिए स्वर्ण मानक किया गया है. वे शुरू में माइक्रोस्कोपी, प्रवाह साइटोमेट्री और इसी तरह के परख के माध्यम से एकल-कोशिका फेनोटाइपिंग तक सीमित थे। एकल-कोशिका विश्लेषण में एक सफलता एकल-कोशिका आणविक प्रोफाइलिंग के लिए दृष्टिकोण के विकास के साथ आई, विशेष रूप से एकल-कोशिका आरएनए अनुक्रमण (स्आरएनए-सेक) में जो व्यक्तिगत कोशिकाओं के पूरे प्रतिलेख को चिह्नित करने में सक्षम था। अत्यधिक शक्तिशाली, स्आरएनए-सेक एक विशिष्ट स्थिति और समय बिंदु में सेल की ट्रांसक्रिप्शनल स्थिति के बारे में जानकारी उत्पन्न करता है। हालांकि, यह जीन विनियमन पर दृश्यता प्रदान नहीं करता है जो प्रतिलेखन को चलाता है, या समय के साथ होने वाले आणविक संशोधनों पर। इस सीमा को दूर करने के लिए, एकल-कोशिका बहु-ओमिक्स परख के विकास में कई प्रयासों का निवेश किया गया है जो एक ही सेल 1,2,3,4 से कई कारकों और प्रक्रियाओं के विश्लेषण को सक्षम करते हैं। एकल कोशिकाओं के भीतर दो तौर-तरीकों का पहला सफल माप सीआईटीई-सेक दृष्टिकोण5 में व्यक्तिगत कोशिकाओं के पूर्ण प्रतिलेख के साथ मल्टीप्लेक्स सतह प्रोटीन अभिव्यक्ति पैटर्न को जोड़ने के माध्यम से आया था। अधिक हाल के evolutions क्रोमैटिन पहुंच (अनुक्रमण, ATAC-Seq का उपयोग Transposase-सुलभ क्रोमैटिन के लिए परख) के साथ जीन अभिव्यक्ति गठबंधन, जिससे एक ही कोशिकाओं (जैसे, विज्ञान कार)6में ट्रांसक्रिप्टोमिक और epigenomic तौर-तरीकों पर कब्जा. पहला वाणिज्यिक समाधान जिसने ट्रांसक्रिप्टोमिक्स को सेल फेनोटाइप के साथ या उसी सेल के एपिजेनेटिक परिवर्तनों के साथ जोड़ने की अनुमति दी, 10X जीनोमिक्स से आया था।

एकल-कोशिका आणविक रूपरेखा के प्रयोगों में निम्नलिखित चरण होते हैं: (1) ऊतक पृथक्करण या एकल-कोशिका निलंबन की तैयारी; (2) सेल शुद्धि और/या नाभिक अलगाव; (3) विभाजन और बारकोडिंग; (4) पुस्तकालय निर्माण और गुणवत्ता नियंत्रण; (5) अगली पीढ़ी के अनुक्रमण; (6) डेटा विश्लेषण। जबकि चरण (3) - (6) नियोजित तकनीक के आधार पर काफी भिन्न हो सकते हैं, प्रारंभिक चरण आम तौर पर उन सभी के लिए सामान्य होते हैं। तैयार सेल/नाभिक निलंबन की गुणवत्ता प्रयोग के समग्र परिणाम का निर्धारण करेगी। ऊतक के प्रकार के आधार पर, उच्च-गुणवत्ता वाले एकल-सेल/नाभिक निलंबन प्राप्त करना चुनौतीपूर्ण हो सकता है। कुछ ऊतकों की विशिष्टता, जैसे हृदय, मांसपेशी, मस्तिष्क, फेफड़े, आंत और अन्य, आणविक विश्लेषण 7,8,9,10 के लिए उच्च गुणवत्ता वाले नाभिक के उत्पादन की गारंटी देने के लिए प्रत्येक प्रकार के नमूने के लिए अनुकूलित ऊतक व्यवधान और नाभिक अलगाव के तरीकों की आवश्यकता होती है . ऊतक व्यवधान विधियों और पृथक्करण प्रोटोकॉल यांत्रिक, एंजाइमेटिक (जैसे, कोलेजनेज और डीएनएज़ का मिश्रण), या दोनों का संयोजन हो सकता है, और मैन्युअल रूप से या उपकरणों (जैसे, Qiagen DSC-400, gentleMACS) द्वारा किया जा सकता है।

एकल सेल तकनीक जैव चिकित्सा अनुसंधान के लिए पसंद का एक उपकरण बन गए हैं. तंत्रिका जीव विज्ञान में, मस्तिष्क में कोशिका विविधता और उनके कार्यों की जटिलता को दुर्लभ कोशिका आबादी के दृश्य के लिए और उनकी विषमता 11,12,13,14का आकलन करने के लिए उच्च-रिज़ॉल्यूशन और उच्च-थ्रूपुट विश्लेषण की आवश्यकता होती है। व्यक्तिगत कोशिकाओं के सेलुलर पहचान और जीन नियामक तंत्र को जोड़ना मस्तिष्क के विकास और शरीर विज्ञान में अंतर्दृष्टि प्रदान करता है। एक अन्य उदाहरण संक्रामक, ऑटोइम्यून, या कैंसर रोगों के संदर्भ में प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का अध्ययन है, जो एकल-कोशिका विश्लेषण पर दृढ़ता से भरोसा करते हैं। प्रतिरक्षा सेल सबसेट की विषमता और उनकी गतिविधि की जटिलता और अन्य सेल प्रकारों के साथ बातचीत को प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया अंतर्निहित तंत्र को समझने में एकल-कोशिका संकल्प की आवश्यकता होती है। प्रतिरक्षा कोशिकाएं अस्थि मज्जा से उत्पन्न होती हैं, जहां हेमटोपोइएटिक पूर्वज धीरे-धीरे विभेदक कोशिकाओं से बने होते हैं जो परिधि में अस्थि मज्जा से घर से बाहर निकलने से पहले एक चरणबद्ध प्रक्रिया के दौरान सेल सतह मार्करों को प्राप्त करते हैं और खो देते हैं। एकल-कोशिका विश्लेषण सेलुलर विकास चरणों के मिनट लक्षण वर्णन के लिए अनुमति देता है। यह एकल-कोशिका फेनोटाइपिंग के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है, पारंपरिक रूप से बहु-पैरामीटर प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा किया जाता है। हालांकि, एकल सेल ट्रांसक्रिप्टोमिक हस्ताक्षर पूर्वज सेल उपप्रकारों की एक अधिक सटीक पहचान प्रकट करने के लिए दिखाए गए हैं क्योंकि इन कोशिकाओं को एक दूसरे में गिरने वाले समूहों में वितरित किया जाता है और इसलिए मोटे सेल सतह मार्कर दृष्टिकोण15 का उपयोग करते समय गलत पहचाना जा सकता है। अध्ययनों की बढ़ती संख्या एपिजेनेटिक संशोधनों को उजागर करती है जो हेमटोपोइएटिक स्टेम और पूर्वज कोशिकाएं (एचएसपीसी) विभिन्न एजेंटों के संपर्क से प्राप्त कर सकती हैं, जिससे प्रतिरक्षा प्रणाली 16,17,18,19की दीर्घकालिक जवाबदेही पर महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ता है। उपन्यास मल्टी-ओमिक्स प्रौद्योगिकियां एकल-कोशिका संकल्प के साथ इन प्रक्रियाओं का अध्ययन करने में सक्षम बनाती हैं।

सेल और नाभिक अलगाव के लिए कई प्रोटोकॉल मस्तिष्क 11,20,21,22 और अस्थि मज्जा नमूने23,24 के लिए वर्णित किया गया है. प्रयोगात्मक परिवर्तनशीलता के कारण पूर्वाग्रह को कम करने के लिए, संयुक्त एकल-कोशिका ट्रांसक्रिप्टोमिक और एपिजेनोमिक अनुक्रमण के लिए अनुकूलित एकल-नाभिक तैयारी प्रोटोकॉल को मान्य करना आवश्यक है, जिससे एकल-कोशिका मल्टीओमिक परख की प्रजनन क्षमता सुनिश्चित होती है।

यहां, (1) ताजा जमे हुए मस्तिष्क के ऊतकों और (2) ताजा अस्थि मज्जा एचएसपीसी से नाभिक तैयारी के लिए दो मजबूत प्रोटोकॉल डाउनस्ट्रीम सिंगल-सेल मल्टीओम विश्लेषण के लिए वर्णित हैं(चित्रा 1)।

Figure 1
चित्रा 1: ताजा जमे हुए मस्तिष्क और अस्थि मज्जा के ऊतकों से नाभिक अलगाव के लिए प्रोटोकॉल का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Protocol

प्रायोगिक प्रक्रियाओं पशु प्रयोग में नैतिकता के लिए समिति (CETEA) द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल के सख्त नियामक अनुपालन के तहत आयोजित किए गए थे. मस्तिष्क नाभिक अलगाव के लिए, 3 महीने पुराने C57BL/6 चूहों का उपयोग किया गया था। अस्थि मज्जा अलगाव के लिए, 8 सप्ताह की महिला C57BL/6J चूहों का वजन 18 ग्राम था।

1. माउस मस्तिष्क से नाभिक की शुद्धि

नोट: प्रक्रिया के दौरान हर समय लेटेक्स या नाइट्राइल दस्ताने पहनें। यह दृढ़ता से प्रयोग प्रदर्शन दो लोगों के लिए सलाह दी है, चरण 1 से 3 (यानी, एकल नाभिक निलंबन की तैयारी) एक व्यक्ति द्वारा प्रदर्शन किया है, और चरण 4 (यानी, सॉर्टर की तैयारी) किसी अन्य व्यक्ति द्वारा समानांतर में प्रदर्शन किया. चूंकि प्रोटोकॉल अत्यधिक समय के प्रति संवेदनशील है, इसलिए जैसे ही एकल नाभिक निलंबन तैयार होता है, सॉर्टर तैयार होने से नमूना प्रसंस्करण समय को कम करना महत्वपूर्ण होता है।

  1. अभिकर्मकों और सामग्रियों की तैयारी
    1. ध्यान से आटोक्लेव (20 मिनट के लिए 121 डिग्री सेल्सियस पर) द्वारा विच्छेदन उपकरण निष्फल और बस उपयोग करने से पहले उन्हें इथेनॉल 70% के साथ धो लें. प्रति नमूना एक पेट्री डिश तैयार करें, बर्फ-ठंडे 1x डलबेको के फॉस्फेट-बफर खारा (डीपीबीएस) के 2-3 एमएल से भरा हुआ है।
    2. माइक्रोसेंट्रीफ्यूज को 4 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा करें, एक बाल्टी को बर्फ से भरें, और ग्लास डाउंस होमोजेनाइज़र को बर्फ पर रखें।
    3. 0.01%, 10 एमएल प्रति नमूना की अंतिम एकाग्रता के लिए डिजिटोनिन जोड़कर नाभिक लाइसिस बफर तैयार करें।
    4. 0.2 U/μL, 20 mL प्रति नमूना की अंतिम एकाग्रता के लिए सेल धुंधला बफर में RNase अवरोधकों को जोड़कर धुंधला बफर तैयार करें।
    5. 0.2 U/μL, 2 mL प्रति नमूना की अंतिम एकाग्रता के लिए RNase अवरोधकों को जोड़कर DPBS 0.04% BSA तैयार करें।
    6. के अनुसार पतला नाभिक बफर के 1 एमएल तैयार Multiome प्रोटोकॉल25.
    7. बर्फ पर सभी अभिकर्मकों और नमूने रखें.
  2. ऊतक विच्छेदन
    1. संस्था द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल का उपयोग करके चूहों की बलि दें। इस प्रोटोकॉल में, चूहों एक केटामाइन / xylazine अधिक मात्रा के बाद सिर काट रहे थे.
    2. कैंची के साथ माउस सिर को काटें और मेयरहॉफ एट अल.26में वर्णित के रूप में खोपड़ी से मस्तिष्क को हटा दें। तुरंत एक प्रकाश उत्सर्जक डायोड (एलईडी) प्रबुद्ध स्टीरियो माइक्रोस्कोप के तहत बर्फ ठंड 1x DPBS के साथ तैयार एक पेट्री डिश में मस्तिष्क हस्तांतरण.
    3. ब्याज के मस्तिष्क क्षेत्रों को अलग करने के लिए एक स्केलपेल के साथ मस्तिष्क के ऊतकों को काटें (जैसे, एंटोरहिनल कॉर्टेक्स, हिप्पोकैम्पस, प्रीफ्रंटल कॉर्टेक्स) और प्रत्येक क्षेत्र को बर्फ-ठंडा 1x डीपीबीएस युक्त एक अलग पेट्री डिश में स्थानांतरित करें। बर्फ पर रखें।
    4. एक स्केलपेल के साथ, निम्नलिखित चरण में समरूपता की सुविधा के लिए ऊतक को <0.5 सेमी टुकड़ों में कीमा बनाएं।
    5. P1000 माइक्रोपिपेट के साथ, कीमा बनाया हुआ ऊतक और पेट्री डिश से 1x DPBS को 1.5 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें। प्रोटीन-लो-बाइंडिंग प्लास्टिक से बने ट्यूबों का उपयोग करना सुनिश्चित करें। ऊतक के टुकड़ों को गुरुत्वाकर्षण द्वारा अलग करने की अनुमति दें। P1 माइक्रोपिपेट का उपयोग करके 1x DPBS की अधिकता को सावधानी से हटा दें।
      नोट: इस चरण के बाद, प्रोटीन कम-बाध्यकारी ट्यूबों को सूखी बर्फ में स्थानांतरित करके और फिर नाभिक अलगाव के साथ आगे बढ़ने तक -80 डिग्री सेल्सियस पर भंडारण करके कीमा बनाया हुआ ऊतक स्नैप-फ्रीज करना संभव है।
  3. नाभिक अलगाव
    1. 0.01% डिजिटोनिन के साथ बर्फ-ठंडे नाभिक lysis बफर के 2 एमएल के साथ ग्लास डाउंस भरें। डुंस में ऊतक के टुकड़े जोड़ें।
      नोट: यदि ताजा जमे हुए ऊतक के साथ काम कर रहे हैं, तो कीमा बनाया हुआ जमे हुए ऊतक को सीधे नाभिक lysis बफर 0.01% डिजिटोनिन में जोड़ें; ऊतक को पहले पिघलने न दें।
    2. मूसल ए के साथ 25 बार और फिर मूसल बी के साथ 25 बार एक ग्लास डाउंस ऊतक होमोजेनाइज़र का उपयोग करके समरूप बनाएं।
    3. 0.01% डिजिटोनिन के साथ बर्फ-ठंडे नाभिक लाइसिस बफर के अतिरिक्त 2 एमएल जोड़ें और 5 मिन के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए 500 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र नाभिक।
    4. एक माइक्रोपिपेट के साथ सतह पर तैरनेवाला निकालें और 0.01% डिजिटोनिन के साथ बर्फ-ठंडे नाभिक लाइसिस बफर के 4 एमएल जोड़ें। 5 मिनट के लिए बर्फ पर सेते हैं और एक 40 माइक्रोन सेल झरनी के माध्यम से छानना.
    5. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए 500 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र नाभिक और एक माइक्रोपिपेट के साथ सतह पर तैरनेवाला हटा दें।
    6. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए 500 x ग्राम पर नाभिक और अपकेंद्रित्र धोने के लिए धुंधला बफर के 4 एमएल जोड़ें। एक माइक्रोपिपेट के साथ सतह पर तैरनेवाला निकालें और धुंधला बफर के 4 एमएल में गोली को फिर से निलंबित करें।
    7. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए 500 x ग्राम पर 40 माइक्रोन सेल स्ट्रेनर और अपकेंद्रित्र के माध्यम से फ़िल्टर करें। 0.04% बीएसए के साथ पीबीएस के 1 एमएल में फिर से निलंबित।
    8. विभिन्न नमूनों में ऊतक/नाभिक तैयारी की स्थिरता सुनिश्चित करने के लिए नाभिक की गणना करें। यह एक ही मस्तिष्क क्षेत्रों से समान नाभिक गणना प्राप्त करने की उम्मीद है:
      1. एक खाली 0.5 एमएल ट्यूब में 0.4% ट्राइपैन ब्लू के 10 माइक्रोन जोड़ें। नाभिक के 10 माइक्रोन जोड़ें और पाइपिंग द्वारा 5x मिलाएं।
      2. आपूर्तिकर्ता की सिफारिशों के बाद एक स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग करके नाभिक की गणना करें। नाभिक को बर्फ पर रखें।
    9. छँटाई के लिए नाभिक तैयार करें।
      नोट: निकाले गए नाभिक में 7-एएडी शामिल है, और इस धुंधला का उपयोग प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल सॉर्टर (एफएसीएस) द्वारा उनके शुद्धिकरण के लिए किया जाता है।
      1. बेदाग नियंत्रण के लिए नाभिक के 100 माइक्रोन को एफएसीएस ट्यूब में स्थानांतरित करें। शेष नाभिक के लिए 7-एएडी के 10 माइक्रोन जोड़ें, और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट रखें.
      2. डबल्स और मलबे को खत्म करने के लिए FACS द्वारा न्यूनतम 0.5 x 106 नाभिक को क्रमबद्ध करें।
  4. FACS का उपयोग करके नाभिक छँटाई
    नोट: जबकि नाभिक छँटाई सेल सॉर्टर्स की एक विस्तृत विविधता पर किया जा सकता है, BD FACSAria फ्यूजन या BD FACSAria III उपकरणों का उपयोग करने की प्रक्रिया यहाँ वर्णित है. यह दृढ़ता से अनुशंसा की जाती है कि अंशांकन और सेल सॉर्टर का सेटअप पर्यवेक्षण के तहत, या उपकरण के एक अनुभवी उपयोगकर्ता द्वारा किया जाए। नमूना प्रसंस्करण समय को कम करने के लिए, जैसे ही एकल नाभिक निलंबन तैयार किया जाता है, सॉर्टर तैयार होना महत्वपूर्ण है।
    1. FACS उपकरण का अंशांकन
      1. सेल सॉर्टर और कंप्यूटर चालू करें। एक बार सॉफ्टवेयर उपकरण से कनेक्ट हो जाने के बाद, फ्लुइडिक स्टार्ट-अप प्रक्रिया लॉन्च करें। मुख्य मेनू में साइटोमीटर > फ्लुइडिक स्टार्ट-अप का चयन करें और चार चरणों का पालन करें। प्रत्येक को पूरा करने के बाद Done पर क्लिक करें।
      2. 70 माइक्रोन नोजल डालें, धारा चालू करें, और 15 मिनट के लिए स्थिर करने के लिए धारा छोड़ दें। ड्रॉप फॉर्मेशन प्राप्त करने के लिए आयाम समायोजित करें और स्वीट स्पॉट पर क्लिक करें।
      3. तटस्थ घनत्व (एनडी) फ़िल्टर 1.0 डालें और साइटोमीटर सेटअप और ट्रैकिंग (सीएसटी) इंटरफ़ेस खोलें।
      4. दैनिक गुणवत्ता नियंत्रण: एफएसीएस माध्यम में सीएसटी मोतियों को पतला करें (आपूर्तिकर्ता की सिफारिशें देखें) और सीएसटी नियंत्रण करें। एक बार पूरा हो जाने पर, एनडी 1.0 को एनडी 2.0 से बदलें।
      5. FACS माध्यम में Accudrops पतला (आपूर्तिकर्ता की सिफारिशें देखें) और चरण 6 से 10 में वर्णित ड्रॉप विलंब करें।
      6. प्रयोग टेम्पलेट में, Accudrop ड्रॉप देरी प्रयोग का चयन करें और ट्यूब के लिए छँटाई लेआउट खुला.
      7. निचले कैमरे की खिड़की के अंदर, वोल्टेज पर क्लिक करें और फिर ऑप्टिकल फ़िल्टर पर विक्षेपण प्लेटों पर चार्ज लागू करने और कैमरे के सामने एक विशिष्ट ऑप्टिकल फ़िल्टर का उपयोग करने में सक्षम करने के लिए। सुनिश्चित करें कि दाईं ओर का चतुर्थांश 100 इंगित करता है। यदि आवश्यक हो, तो लेजर प्रभाव को अनुकूलित करने के लिए लाल लेजर स्क्रू को समायोजित करें।
      8. प्रति सेकंड 1,000 से 3,000 घटनाओं की गति तक पहुंचने के लिए प्रवाह दर को समायोजित करें।
      9. Sort and Cancel पर क्लिक करें। सुनिश्चित करें कि बायां चतुर्थांश 100 के बराबर है, और दायां चतुर्थांश 0 है। यदि बायां चतुर्थांश 95 से नीचे है, तो ऑटो विलंब करें।
      10. वोल्टेज पर क्लिक करें, फिर टेस्ट सॉर्ट करें। संग्रह ट्यूबों में जमा साइड धाराओं की गुणवत्ता को नियंत्रित करें। यदि आवश्यक हो, तो स्लाइडर्स को स्थानांतरित करके साइड स्ट्रीम की स्थिति को समायोजित करें।
    2. नाभिक छँटाई के लिए FACS उपकरण की स्थापना।
      1. बिना दाग वाले नाभिक का अधिग्रहण शुरू करें। इनका उपयोग आगे और साइड स्कैटर को परिभाषित करने के लिए किया जाता है, और डिटेक्टर वोल्टेज 7-एडीडी पैरामीटर के लिए। मापदंडों को सेट करें ताकि बेदाग नमूने का 7-एएडी सिग्नल डॉट प्लॉट पर लॉग स्केल के पहले दशक के अंदर गिर जाए।
      2. 7-एएडी-सना हुआ नाभिक की ट्यूब प्राप्त करना शुरू करें और आकार और ग्रैन्युलैरिटी के लिए (1) एफएससी-ए/एससीसी-ए और फिर एफएससी-एच/एसएससी-एच, (2) एफएससी-एच/एफएससी-ए के आधार पर गेटिंग रणनीति का उपयोग करके नाभिक आबादी को परिभाषित करें, (2) एफएससी-एच/एफएससी-ए दोहरे भेदभाव के लिए, और (3) एसएससी-ए/7-एएडी 7-एएडी 7-एएडी 7-एएडी के लिए ( चित्र 2ए देखें)।
      3. सुनिश्चित करें कि धारा और विक्षेपण स्थिर हैं।
      4. साइड स्ट्रीम कैमरे में, परीक्षण सॉर्ट चालू करें, वोल्टेज ऑन, और बाईं ओर लगे 1.5 एमएल ट्यूब में सटीक ड्रॉप सॉर्टिंग की पुष्टि करें।
      5. सॉर्टिंग लेआउट विंडो में, रुचि की जनसंख्या का चयन करें, जैसा कि चरण 2 (ऊपर) में परिभाषित किया गया है। लक्ष्य घटनाओं में, प्रति नमूना न्यूनतम 0.5 x 106 नाभिक प्राप्त करने के लिए निरंतर में दहलीज का चयन करें। परिशुद्धता के अंतर्गत, 4-मार्ग शुद्धता का चयन करें.
      6. एक बार तैयार होने के बाद, क्लिक करें क्रमबद्ध करें और ठीक नाभिक छँटाई के साथ शुरू करने के लिए।
  5. गुणवत्ता नियंत्रण और शुद्ध नाभिक की गिनती
    नोट: यह कदम केवल नमूना तैयार करने के चरणों के अनुकूलन के लिए पायलट प्रयोग के दौरान किया जाना है, सॉर्ट किए गए नाभिक की शुद्धता का परीक्षण करने के लक्ष्य के साथ जो 10X क्रोमियम चिप पर लोड किया जाना है। एक बार प्रोटोकॉल पूरी तरह से अनुकूलित है, यह कम संख्या में उपलब्ध हो सकता है कि एकत्रित नाभिक के अनावश्यक अपशिष्ट से बचने के लिए अनुवर्ती प्रयोगों में इस गुणवत्ता नियंत्रण कदम प्रदर्शन करने के लिए सलाह नहीं दी है.
    1. प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा शुद्धता नियंत्रण
      1. सॉर्ट किए गए नाभिक के 10 माइक्रोन को एक नई एफएसीएस ट्यूब में स्थानांतरित करें जिसमें 2% गर्मी-निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय सीरम (एचआई-एफबीएस) के साथ डीपीबीएस के 90 माइक्रोन होते हैं।
      2. सॉर्टिंग शुद्धता और व्यवहार्यता को सत्यापित करने के लिए पोस्ट-सॉर्ट डेटा प्राप्त करें और रिकॉर्ड करें। सुनिश्चित करें कि नाभिक का कम से कम 98% ब्याज के द्वार में दिखाई देता है, जैसा कि 4.2 में परिभाषित किया गया है (चित्र 2B देखें)।
    2. शुद्ध नाभिक की गिनती
      1. अपकेंद्रित्र 500 x ग्राम पर और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए नाभिक को क्रमबद्ध करता है और ध्यान से माइक्रोपिपेट का उपयोग करके सतह पर तैरनेवाला को पूरी तरह से हटा देता है। पतला नाभिक बफर के 100 माइक्रोन में फिर से निलंबित।
      2. एक खाली 0.5 एमएल ट्यूब में 0.4% ट्राइपैन ब्लू के 10 माइक्रोन जोड़ें। सॉर्ट किए गए नाभिक के 10 माइक्रोन जोड़ें और पाइपिंग द्वारा 5x मिलाएं।
      3. आपूर्तिकर्ता की सिफारिशों के बाद एक स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग करके नाभिक की गणना करें। नाभिक एकाग्रता को 3.5 x 106/mL, यानी, 16,000 नाभिक प्रति 5 μL में समायोजित करें।
    3. माइक्रोस्कोपी द्वारा शुद्ध नाभिक का गुणवत्ता नियंत्रण
      नोट: यह कदम केवल 10X क्रोमियम चिप पर लोड किए जाने वाले नाभिक की गुणवत्ता का परीक्षण करने के लिए नमूना तैयार करने के चरणों के अनुकूलन के लिए पायलट प्रयोग के दौरान किया जाना है। एक बार प्रोटोकॉल पूरी तरह से अनुकूलित है, यह कम संख्या में उपलब्ध हो सकता है कि एकत्रित नाभिक के अनावश्यक अपशिष्ट से बचने के लिए अनुवर्ती प्रयोगों में इस गुणवत्ता नियंत्रण कदम प्रदर्शन करने के लिए सलाह नहीं दी है.
      1. सुनिश्चित करें कि माइक्रोस्कोप स्लाइड और कवर पर्ची साफ और धूल रहित हैं। यदि आवश्यक हो, तो पूर्ण इथेनॉल के साथ कवरस्लिप को धोएं और कुल्ला करें और उन्हें लिंट-फ्री वाइप्स से सुखाएं।
      2. स्लाइड कुओं में पॉली-एल-लाइसिन के 25 माइक्रोन वितरित करें जिनका उपयोग किया जाएगा और धूल से सुरक्षित कमरे के तापमान (आरटी) पर 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट किया जाएगा।
      3. अतिरिक्त पॉली-एल-लाइसिन निकालें और शुद्ध नाभिक निलंबन के 10 माइक्रोन जोड़ें। आरटी पर 5 मिनट के लिए सेते हैं, धूल से संरक्षित.
      4. बुलबुले से बचते हुए, प्रत्येक कुएं में बढ़ते माध्यम की एक बूंद जोड़ें।
      5. बीज वाले कुओं के ऊपर एक कवरस्लिप रखें। पेपर वाइप्स के साथ कवर करें और अतिरिक्त बढ़ते माध्यम को हटाने के लिए कवरस्लिप को मजबूती से दबाएं। सावधान रहें कि कवरस्लिप को स्थानांतरित न करें, और अतिरिक्त बढ़ते माध्यम को साफ न करें।
      6. ब्राइटफील्ड लाइट और 40x के न्यूनतम आवर्धन के साथ एक उल्टे माइक्रोस्कोप के साथ कई छवियां लें।
  6. मल्टीओम परख करें।
    1. क्रोमियम नेक्स्ट GEM सिंगल सेल मल्टीओम ATAC + जीन एक्सप्रेशन यूजर गाइड (CG000338 - रेव एफ)25 के लिए तुरंत आगे बढ़ें।

2. माउस अस्थि मज्जा हेमटोपोइएटिक स्टेम और पूर्वज कोशिकाओं (एचएसपीसी) से नाभिक की शुद्धि

नोट यह प्रोटोकॉल अस्थि मज्जा एचएसपीसी के तीन सबसेट से नाभिक की शुद्धि का वर्णन करता है: वंश-सी-किट + एससीए -1 + हेमटोपोइएटिक स्टेम सेल (एचएससी), वंश-सी-किट + एससीए -1-सीडी 34 + एफसीγआर- सामान्य मायलोइड पूर्वज (सीएमपी), और वंश- सी-किट + एससीए -1-सीडी 34 + एफसीγआर + ग्रैनुलोसाइट-मोनोसाइट पूर्वज (जीएमपी)। प्रक्रिया के दौरान हर समय लेटेक्स या नाइट्राइल दस्ताने पहनें। यह प्रोटोकॉल 10X जीनोमिक्स प्रदर्शित प्रोटोकॉल का एक अनुकूलन है - सिंगल सेल मल्टीओम एटीएसी + जीईएक्स अनुक्रमण (CG000365 - रेव सी)27के लिए नाभिक अलगाव। नाभिक वसूली को अधिकतम करने के लिए मूल प्रोटोकॉल में संशोधन पेश किए गए हैं। यह दृढ़ता से दो लोगों को प्रयोग प्रदर्शन करने की सलाह दी जाती है, चरण 1 है। सेवा मेरे 3. (यानी, एकल-कोशिका समाधान की तैयारी) एक व्यक्ति द्वारा किया जाता है, और चरण 4 (यानी, सॉर्टर की तैयारी) किसी अन्य व्यक्ति द्वारा समानांतर में किया जाता है। चूंकि प्रोटोकॉल अत्यधिक समय के प्रति संवेदनशील है, इसलिए सिंगल-सेल सस्पेंशन तैयार होते ही सॉर्टर तैयार होने से नमूना प्रसंस्करण समय को कम करना महत्वपूर्ण है।

  1. अभिकर्मकों और सामग्रियों की तैयारी
    1. बर्फ के साथ एक बाल्टी भरें।
    2. एफएसीएस बफर तैयार करें: डीपीबीएस 2% एचआई-एफबीएस समाधान (6 नमूनों के लिए लगभग 500 एमएल) और 0.2 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से फ़िल्टर करें।
    3. संग्रह माध्यम तैयार करें: डीपीबीएस 10% एचआई-एफबीएस समाधान (नमूना प्रति 500 माइक्रोन) के साथ, और 0.2 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से फ़िल्टर करें।
  2. अस्थि मज्जा कोशिकाओं का अलगाव
    1. संस्था द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल का उपयोग करके चूहों की बलि दें। इस प्रयोग में, चूहों को केटामाइन / xylazine ओवरडोज के बाद गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था द्वारा बलिदान किया गया था।
    2. 70% इथेनॉल के साथ चूहों के पेट और हिंद पैर स्प्रे.
    3. निचले पेट के बीच में एक छोटा चीरा बनाने के लिए बाँझ संदंश और कैंची का प्रयोग करें और डायाफ्राम (अनुपूरक चित्रा 1) के लिए हिंद पैर के आधार से पेरिटोनियम खोलें.
    4. खोला पेरिटोनियम के लिए लंबवत प्रत्येक हिंद पैर के लिए एक अतिरिक्त कटौती करें, तो इन अतिरिक्त कटौती में से एक के दोनों तरफ हड़पने और दोनों हिंद पैर (अनुपूरक चित्रा 1 ए) की मांसपेशियों को बेनकाब करने के लिए टखने संयुक्त अतीत पिछले दोनों पैरों से त्वचा को छीलने के लिए इसे अलग खींचें.
    5. फीमर (पूरक चित्रा 1 बी, सी) के माध्यम से काटने के बिना पैर को काटने के लिए एक हिंद पैर के कूल्हे संयुक्त पर रीढ़ की हड्डी के साथ कैंची लाइन। दूसरे पैर के लिए भी यही दोहराएं।
    6. फीमर को अलग करने के लिए, मांसपेशियों के ऊतकों के अधिकांश को काट लें, फिर संयुक्त (पूरक चित्रा 1 डी, ई) पर उंगलियों के साथ प्रत्येक हाथ में फीमर और टिबिया पकड़ें। धीरे फीमर (पूरक चित्रा 1E) से टिबिया को अव्यवस्थित करने के लिए प्राकृतिक मोड़ के खिलाफ पैर को मोड़ो और फिर फीमर और टिबिया को अलग करने के लिए कैंची के साथ संयोजी ऊतक को ध्यान से काट लें।
    7. फीमर (अनुपूरक चित्रा 1E) के शीर्ष छोर से रीढ़ की हड्डी के बिट को अव्यवस्थित करने के लिए प्रकाश घुमा गति के साथ कैंची का प्रयोग करें।
    8. शेष मांसपेशियों और संयोजी ऊतक को हटाने के लिए टिशू पेपर के साथ पृथक फीमर को साफ करें।
    9. DMEM (1x) + GlutaMAX-I के 2 एमएल से अच्छी तरह से भरी 12-वेल प्लेट में बर्फ पर ठंडा रखें।
    10. एक बार जब सभी फीमर एकत्र हो जाते हैं, तो सुनिश्चित करें कि मांसपेशियों और रेशेदार ऊतकों को हड्डी से पूरी तरह से हटा दिया गया है। (ए) बाँझ के अंदर मज्जा रखने के लिए हड्डी को खुला न काटें और (बी) कुएं में कोशिकाओं को खोने से बचें। एक माउस के दो फीमर से कोशिकाओं को फ्लश करने के लिए निम्नलिखित चरणों का उपयोग करें, हाग और मूर्ति28 से अनुकूलित।
    11. एक 1.5 एमएल और एक 0.5 एमएल ट्यूब तैयार करें। 1.5 एमएल ट्यूब में एफएसीएस बफर के 150 माइक्रोन जोड़ें, फिर 18 जी सुई का उपयोग करके 0.5 एमएल ट्यूब के नीचे एक छेद करें और 0.5 एमएल ट्यूब को 1.5 एमएल ट्यूब में फिट करें।
    12. माउस सर्जिकल कैंची (अनुपूरक चित्रा 1 एफ) का उपयोग कर प्रत्येक फीमर के बाहर का हिस्सा खोलें: ब्लेड के बीच बाहर का epiphysis में ताला और हड्डी कठोर काटने के बिना आसानी से बाहर का epiphysis अलग करने के लिए कैंची flipping जबकि कोमल दबाव लागू. सफल होने पर, 4 प्रोट्रूशियंस अब उजागर काया अंत (अनुपूरक चित्रा 1 जी) पर दिखाई देना चाहिए।
    13. एफएसीएस बफर(अनुपूरक चित्रा 1एच) युक्त 1.5 एमएल ट्यूब के अंदर रखी तैयार 0.5 एमएल ट्यूब में खुले अंत के साथ दो फीमर फिट करें।
    14. एक 50 एमएल ट्यूब पर एक 70 माइक्रोन सेल झरनी रखें और एफएसीएस बफर के 2 एमएल के साथ छलनी पूर्व गीला.
    15. अस्थि मज्जा फ्लश करने के लिए, अपकेंद्रित्र 12,000 x ग्राम पर ट्यूबों (कैप खुले) अपकेंद्रित्र जब तक अपकेंद्रित्र 12,000 x ग्राम मूल्य तक पहुँच जाता है, तो तुरंत अपकेंद्रित्र बंद करो.
    16. सत्यापित करें कि अस्थि मज्जा कोशिकाओं को 1.5 एमएल ट्यूब में गोली मार दी जाती है और फीमर सफेद होते हैं (सेल फ्लशिंग से पहले, वे लाल होते हैं) (पूरक चित्रा 1I)। 2 femurs के साथ 0.5 एमएल ट्यूबों त्यागें.
    17. एक विंदुक का उपयोग कर 150 माइक्रोन सतह पर तैरनेवाला त्यागें.
    18. लाल रक्त कोशिकाओं को लाइज़ करने के लिए आरटी पर 1-2 मिनट के लिए अमोनियम-क्लोराइड-पोटेशियम (एसीके) लाइसिंग बफर के 1 एमएल में एक माइक्रोपिपेट के साथ गोली को फिर से निलंबित करें। लंबे समय तक इनक्यूबेशन बार बचें क्योंकि वे न्यूक्लियेटेड कोशिकाओं की व्यवहार्यता कम कर सकते हैं।
    19. पूर्व गीला 70 माइक्रोन सेल झरनी के माध्यम से 50 एमएल ट्यूब में स्थानांतरण.
    20. ACK lysing बफर को पतला करने के लिए FACS बफर के 10 एमएल जोड़ें और इसके द्वारा lysis को रोकें।
    21. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए 400 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र। पहले 1 एमएल में निलंबित करके 10 एमएल एफएसीएस बफर में फिर से निलंबित करें और फिर 9 एमएल के साथ टॉपिंग करें।
    22. 1.3.8 में वर्णित के रूप में गिनती के लिए कोशिकाओं को तैयार करें.
    23. आपूर्तिकर्ता की सिफारिशों के बाद एक स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग कर कोशिकाओं की गणना. यह 2 फीमर से लगभग 40 मिलियन कोशिकाओं को इकट्ठा करने की उम्मीद है।
  3. अस्थि मज्जा एचएसपीसी का धुंधला होना
    1. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए 400 x ग्राम पर कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें और 1 x 107 कोशिकाओं/एमएल की अंतिम एकाग्रता के लिए एफएसीएस बफर में माइक्रोपिपेट के साथ गोली को फिर से निलंबित करें।
    2. P1000 माइक्रोपिपेट के साथ, निलंबन को FACS ट्यूब में स्थानांतरित करें, 35 माइक्रोन सेल स्ट्रेनर कैप के माध्यम से फ़िल्टर करें।
    3. सेल सॉर्टर पर फ्लोरोक्रोम के मुआवजे को स्थापित करने के लिए तालिका 1 में सूचीबद्ध प्रत्येक एंटीबॉडी के लिए एकल दाग टेस्ट ट्यूब नमूने तैयार करें:
      1. एंटीबॉडी प्रति एक FACS ट्यूब तैयार करें और ट्यूबों को पीबीएस के 200 माइक्रोन से भरें।
      2. फ्लोरोक्रोम-संयुग्मित एंटीबॉडी के प्रत्येक एफएसीएस ट्यूब में फ्लोरोक्रोम-मुआवजा मोतियों के 15 माइक्रोन जोड़ें। FACS ट्यूबों में बेदाग और लाइव/डेड सिंगल स्टेन्ड कोशिकाओं के लिए, मोतियों के बजाय 500,000 सेल जोड़ें।
      3. प्रत्येक फ्लोरोक्रोम-संयुग्मित एंटीबॉडी ( तालिका 1 देखें) के 1 माइक्रोन को इसके संबंधित एफएसीएस ट्यूब में जोड़ें। लाइव/डेड सिंगल स्टेन FACS ट्यूब में 0.5 माइक्रोन लाइव/डेड स्टेन जोड़ें।
      4. प्रकाश से सुरक्षित 15 मिनट के लिए बर्फ पर रखें.
    4. मिक्स 1 और 2 के रूप में तालिका 2 में संकेत तैयार करें.
      नोट: तालिका 2 में इंगित एंटीबॉडी वॉल्यूम सामग्री की तालिका में संदर्भित एंटीबॉडी के लिए मान्य हैं। उन्हें किसी भी नए एंटीबॉडी संदर्भ या एक ही एंटीबॉडी संदर्भ के एक अलग लॉट के लिए अनुकूलित करने की आवश्यकता है।
    5. नमूना ट्यूब में मिक्स 1 के 300 माइक्रोन जोड़ें, पुनर्वसन, और प्रकाश से संरक्षित बर्फ पर 15 मिनट के लिए रखें।
    6. नमूना ट्यूब में मिक्स 2 के 300 माइक्रोन जोड़ें, पुनर्वसन, और प्रकाश से संरक्षित बर्फ पर 20 मिनट के लिए रखें।
    7. एकल दाग ट्यूबों और मिश्रण सना हुआ नमूना ट्यूबों के लिए FACS बफर के 3 एमएल जोड़ें. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 400 x ग्राम पर नीचे स्पिन।
    8. ध्यान से एक micropipette का उपयोग सतह पर तैरनेवाला त्यागें और FACS बफर के 500 माइक्रोन में गोली resuspended है.
    9. संग्रह माध्यम के 500 माइक्रोन के साथ पहले से भरा एक 1.5 एमएल ट्यूब तैयार करें।
      नोट: मिक्स 1 डीपीबीएस में तैयार किया जाता है क्योंकि इसमें एचआई-एफबीएस द्वारा लाइव/डेड स्टेन काफी प्रभावित होता है। एक बार जब कोशिकाओं को लाइव/डेड द्वारा दाग दिया जाता है, तो मिक्स 2 को जोड़ा जाता है, जिसमें फ्लोरोक्रोम-संयुग्मित एंटीबॉडी होते हैं जो एफएसीएस बफर में एचआई-एफबीएस युक्त होते हैं। एकमात्र अपवाद एंटी-सीडी 16/32 एंटीबॉडी है जो एफसी रिसेप्टर अवरोधक के रूप में काम करने के लिए एंटीबॉडी मिक्स 1 में शामिल है जो निम्नलिखित चरण में जोड़े गए अन्य एंटीबॉडी के गैर-विशिष्ट बंधन को रोकता है।
  4. FACS का उपयोग करके सेल सॉर्टिंग
    नोट: जबकि सेल सॉर्टिंग सेल सॉर्टर्स की एक विस्तृत विविधता पर किया जा सकता है, यहां, BD FACSAria फ्यूजन या BD FACSAria III उपकरणों का उपयोग करने की प्रक्रिया का वर्णन किया गया है। यह दृढ़ता से अनुशंसा की जाती है कि अंशांकन और सेल सॉर्टर का सेटअप पर्यवेक्षण के तहत या उपकरण के एक अनुभवी उपयोगकर्ता द्वारा किया जाए।
    1. FACS साधन का अंशांकन: प्रोटोकॉल 1 चरण 4.1 देखें।
    2. सेल छँटाई के लिए FACS उपकरण की स्थापना:
      1. दाग कोशिकाओं के अधिग्रहण शुरू करो. इनका उपयोग प्रत्येक फ्लोरोफोर के लिए आगे और साइड स्कैटर और डिटेक्टर वोल्टेज को परिभाषित करने के लिए किया जाता है। मापदंडों को सेट करें ताकि प्रत्येक फ्लोरोफोर का फ्लोरोसेंट सिग्नल डॉट प्लॉट पर लॉग स्केल के पहले दशक के अंदर गिर जाए।
      2. मैन्युअल रूप से क्षतिपूर्ति स्थापित करने के लिए एकल रंग नियंत्रण प्राप्त करें (सकारात्मक और नकारात्मक आबादी का औसत गठबंधन किया जाना चाहिए) या स्वचालित गणना सॉफ्टवेयर (ढलान माप) का उपयोग करें। सुनिश्चित करें कि मुआवजा नियंत्रण प्रयोगात्मक फ्लोरोक्रोम और डिटेक्टर सेटिंग्स से मेल खाता है। कोशिकाओं के लिए 10,000 घटनाओं और मोतियों के लिए 5,000 घटनाओं को रिकॉर्ड करें।
      3. चित्रा 3 ए में दिखाए गए गेटिंग रणनीति का उपयोग करके ब्याज की सेल आबादी को परिभाषित करने के लिए नमूना ट्यूब (यानी, बहु दाग कोशिकाओं) का उपयोग करें। चरण 4 - 6 (नीचे) का पालन करें।
      4. ब्याज के तीन अस्थि मज्जा एचएसपीसी (एचएससी, सीएमपी, और जीएमपी) की पहचान करने के लिए, ल्यूकोसाइट्स पर गेट करने के लिए आकार (एफएससी-ए) और ग्रैन्युलैरिटी (एसएससी-ए) का उपयोग करके गेटिंग शुरू करें, फिर एफएससी-एच /
      5. मृत सेल मार्कर के आधार पर, गेट लाइव सेल। वंश-नकारात्मक कोशिकाओं का चयन करने के लिए वंश/सी-किट का उपयोग करें और सी-किट के उच्च स्तर के मध्यवर्ती को व्यक्त करते हैं। सी-किट/एससीए-1 के माध्यम से, वंश-सी-किट+ एससीए-1+ (एलकेएस+) एचएससी पर गेट, ब्याज की तीन आबादी में से एक।
      6. माइलॉयड पूर्वज (वंश-सी-किट + एससीए -1-) के बीच, सीडी 34-एफसीआर को बाहर करने के लिए एफसीआर / सीडी 34 का उपयोग करें- मेगाकारियोसाइट और एरिथ्रोइड पूर्वज (एमईपी), जबकि सीडी 34 + एफसीγआर- सीएमपी सहित, साथ ही सेल आबादी में सीडी 34 + एफसीγआर + जीएमपी को क्रमबद्ध किया जाना है।
      7. सुनिश्चित करें कि धारा और विक्षेपण स्थिर हैं।
      8. साइड स्ट्रीम कैमरे में, परीक्षण सॉर्ट चालू करें, वोल्टेज ऑन, और बाईं ओर लगे 1.5 एमएल ट्यूब में सटीक ड्रॉप सॉर्टिंग की पुष्टि करें।
      9. सॉर्टिंग लेआउट विंडो में, रुचि की जनसंख्या (जनसंख्याओं) का चयन करें (यानी, "LKS+" और "CD34+ माइलॉयड पूर्वज" इस उदाहरण में दिखाया गया है)। डिवाइस के अंतर्गत, 2 ट्यूब का चयन करें. परिशुद्धता के अंतर्गत, शुद्धता का चयन करें. लक्ष्य ईवेंट में, 160,000 और 200,000 LKS+ और CD34+ मायलॉयड पूर्वज के बीच सॉर्ट करने के लिए निरंतर का चयन करें।
      10. सेल निलंबन में एफएसीएस बफर के 500 माइक्रोन जोड़ें और अधिग्रहण से ठीक पहले सभी कोशिकाओं को एक ही निलंबन में सुनिश्चित करने के लिए एक नए 35 माइक्रोन-सेल स्ट्रेनर-कैप्ड एफएसीएस ट्यूब में फ़िल्टर करके नमूने के 1 एमएल को स्थानांतरित करें। यह सेल क्लंप को समाप्त करता है जो उपकरण को रोक सकता है।
      11. एक बार तैयार होने के बाद, सॉर्ट करें और ठीक करें सॉर्टिंग शुरू करने के लिए क्लिक करें। प्रति सेकंड 10,000 घटनाओं से नीचे की गति बनाए रखने के लिए प्रवाह दर को समायोजित करें।
        नोट: LKS+ से CD34+ मायलोइड पूर्वज का अपेक्षित अनुपात एक वयस्क (8-3 सप्ताह पुराने) C57BL/6J महिला माउस के लिए स्थिर अवस्था में 1:6 है। लक्षित क्रमबद्ध सेल नंबर आमतौर पर छँटाई के 30 मिनट के भीतर पहुंच जाते हैं।
  5. गुणवत्ता नियंत्रण और क्रमबद्ध कोशिकाओं की गिनती
    नोट: यह कदम केवल नमूना तैयार करने के चरणों के अनुकूलन के लिए पायलट प्रयोग के दौरान किया जाना है, नाभिक अलगाव के लिए उपयोग की जाने वाली क्रमबद्ध कोशिकाओं की शुद्धता का परीक्षण करने के लक्ष्य के साथ। एक बार प्रोटोकॉल पूरी तरह से अनुकूलित है, यह नाभिक अलगाव के लिए कम संख्या में उपलब्ध हो सकता है कि शुरू सामग्री के अनावश्यक अपशिष्ट से बचने के लिए अनुवर्ती प्रयोगों में इस गुणवत्ता नियंत्रण कदम प्रदर्शन करने के लिए सलाह नहीं दी है.
    1. प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा शुद्धता नियंत्रण
      1. छांटी गई कोशिकाओं के 10 माइक्रोन को एक नई एफएसीएस ट्यूब में स्थानांतरित करें जिसमें एफएसीएस बफर के 90 माइक्रोन होते हैं।
      2. सॉर्टिंग शुद्धता और व्यवहार्यता को सत्यापित करने के लिए पोस्ट-सॉर्ट डेटा प्राप्त करें और रिकॉर्ड करें। सुनिश्चित करें कि कोशिकाओं के कम से कम 95% ब्याज के गेट में दिखाई देते हैं, जैसा कि 3 - 6 में परिभाषित किया गया है और चित्र 3 बी में सचित्र है।
  6. क्रमबद्ध अस्थि मज्जा HSPCs से नाभिक अलगाव
    1. 10X जीनोमिक्स प्रदर्शित प्रोटोकॉल से परिशिष्ट के "लो सेल इनपुट नाभिक अलगाव" प्रोटोकॉल का उपयोग करें - सिंगल सेल मल्टीओम एटीएसी + जीईएक्स अनुक्रमण (CG000365 - रेव सी)27 के लिए नाभिक अलगाव, नाभिक वसूली को अनुकूलित करने के लिए किए गए निम्नलिखित संशोधनों के साथ:
      1. Lysis समय: नाभिक अलगाव के लिए सबसे अच्छा lysis समय की पहचान करने के लिए इस प्रोटोकॉल के लिए एक पायलट प्रयोग चलाएँ. बरकरार नाभिक को बनाए रखते हुए एक पूर्ण सेल lysis प्राप्त करने के लिए सुनिश्चित करें.
        नोट: उपर्युक्त 10X जीनोमिक्स प्रोटोकॉल27 का चरण च "बर्फ पर 3-5 मिनट के लिए [लिसिस बफर में] सेते हैं" का निर्देश देता है। पायलट प्रयोग के दौरान, कम से कम 3 मिनट, 4 मिनट, और 5 मिनट के लिए परीक्षण और इष्टतम lysis अवधि का चयन करने के लिए प्रवाह cytometry और माइक्रोस्कोपी इमेजिंग द्वारा गिनती और गुणवत्ता द्वारा बरामद नाभिक मात्रा का आकलन (इन गुणवत्ता नियंत्रण जांच नीचे का विवरण देखें). अभिकर्मकों को छोड़ने के लिए, पायलट प्रयोग में पीबीएस 0.04% बीएसए के साथ पतला नाभिक बफर बदलें। अस्थि मज्जा एचएसपीसी के लिए, 3 मिनट को इष्टतम लसीका अवधि के रूप में पहचाना गया था।
      2. सेल centrifugations: सभी सेल निलंबन centrifugations के लिए, 7 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र (CG000365 में 5 मिनट के बजाय - रेव सी)27 4 डिग्री सेल्सियस पर.
      3. नाभिक centrifugations: CG000365 के अनुसार 5 मिनट के लिए 500 x ग्राम पर सभी नाभिक निलंबन centrifugations प्रदर्शन - रेव सी27.
      4. नाभिक संग्रह: चरण बी पर, पीबीएस 0.04% बीएसए के 50 माइक्रोन में निलंबित करने और 0.2 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करने के बाद, पीबीएस 0.04% बीएसए के 50 माइक्रोन को मूल ट्यूब और विंदुक-मिश्रण में किसी भी बचे हुए कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए जोड़ें। कुल 100 माइक्रोन वॉल्यूम तक पहुंचने के लिए 0.2 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें।
      5. इसके बाद, कुल मात्रा प्रोटोकॉल के 50 माइक्रोन के बजाय 100 माइक्रोन होगी। तदनुसार डाउनस्ट्रीम चरणों को समायोजित करें (उदाहरण के लिए, चरण डी के लिए, 45 माइक्रोन के बजाय 90 माइक्रोन को हटा दें; चरण ई के लिए, 45 माइक्रोन के बजाय लिसिस बफर के 90 माइक्रोन जोड़ें)।
      6. चरण मीटर के लिए, 7 माइक्रोन के बजाय पतला नाभिक बफर के 12 माइक्रोन में नाभिक गोली को फिर से निलंबित करें।
      7. पृथक नाभिक की गणना करें। एक खाली 0.5 एमएल ट्यूब में, 0.4% ट्राइपैन ब्लू के 10 माइक्रोन और पीबीएस 0.04% बीएसए के 8 माइक्रोन जोड़ें।
      8. ट्यूब में नाभिक के 2 माइक्रोन जोड़ें और नाभिक की गणना करें जैसा कि 1.3.8 में वर्णित है। आपूर्तिकर्ता की सिफारिशों के बाद एक स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग करें।
  7. प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा शुद्धता नियंत्रण
    नोट: यह कदम केवल 10X क्रोमियम चिप पर लोड किए जाने वाले नाभिक की शुद्धता का परीक्षण करने के लिए नमूना तैयारी चरणों के अनुकूलन के लिए पायलट प्रयोग के दौरान किया जाना है। एक बार प्रोटोकॉल पूरी तरह से अनुकूलित है, यह कम संख्या में उपलब्ध हो सकता है कि एकत्रित नाभिक के अनावश्यक अपशिष्ट से बचने के लिए अनुवर्ती प्रयोगों में इस गुणवत्ता नियंत्रण कदम प्रदर्शन करने के लिए सलाह नहीं दी है.
    1. नाभिक अलगाव को पूरा करने के बाद, FACS बफर के 150 μL के साथ पहले से भरी एक नई FACS ट्यूब में नाभिक resuspension के 6 माइक्रोन को स्थानांतरित करें। 7-एएडी के 3 माइक्रोन जोड़ें और बर्फ पर 5 मिन के लिए इनक्यूबेट करें।
    2. सॉर्टिंग शुद्धता और व्यवहार्यता को सत्यापित करने के लिए पोस्ट-सॉर्ट डेटा प्राप्त करें और रिकॉर्ड करें। सुनिश्चित करें कि नाभिक का कम से कम 95% ब्याज के गेट में दिखाई देते हैं, जैसा कि प्रोटोकॉल 1 चरण 4.2 में परिभाषित किया गया है (चित्र 4 देखें)।
  8. माइक्रोस्कोपी द्वारा शुद्ध नाभिक का गुणवत्ता नियंत्रण:
    नोट: यह कदम केवल 10X क्रोमियम चिप पर लोड किए जाने वाले नाभिक की गुणवत्ता का परीक्षण करने के लिए नमूना तैयार करने के चरणों के अनुकूलन के लिए पायलट प्रयोग के दौरान किया जाना है। एक बार प्रोटोकॉल पूरी तरह से अनुकूलित है, यह कम संख्या में उपलब्ध हो सकता है कि एकत्रित नाभिक के अनावश्यक अपशिष्ट से बचने के लिए अनुवर्ती प्रयोगों में इस गुणवत्ता नियंत्रण कदम प्रदर्शन करने के लिए सलाह नहीं दी है.
    1. चरण 1.5.3 में वर्णित के रूप में आगे बढ़ें।
  9. मल्टीओम परख करें
    1. क्रोमियम नेक्स्ट GEM सिंगल सेल मल्टीओम ATAC + जीन एक्सप्रेशन यूजर गाइड (CG000338 - रेव एफ)25 के लिए तुरंत आगे बढ़ें।

Representative Results

ऊपर वर्णित दो प्रोटोकॉल दो अलग-अलग प्रकार के ऊतकों से शुरू होने वाले नाभिक के अलगाव का विवरण देते हैं। दो प्रोटोकॉल के बीच अंतर और समानताएं योजनाबद्ध रूप से चित्रा 1 में प्रतिनिधित्व कर रहे हैं.

माउस मस्तिष्क से नाभिक की शुद्धि
यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल में, हम मस्तिष्क के नमूनों से नाभिक तैयारी के लिए एक कोमल विधि का प्रस्ताव. यह एक lysis बफर में मस्तिष्क के ऊतकों के यांत्रिक पृथक्करण के साथ शुरू होता है, इसके बाद धोने और छलनी फ़िल्टरिंग चरणों के बाद जो निलंबन से शेष ऊतक को हटा देते हैं। मलबे, गैर-lysed कोशिकाओं और छोटे कणों को हटाने के बाद FACS द्वारा यह गारंटी देने के लिए प्राप्त किया जाता है कि केवल शुद्ध नाभिक डाउनस्ट्रीम मल्टीओम प्रोटोकॉल के लिए लोड किए जाते हैं। चित्रा 2 छँटाई से पहले और बाद में नाभिक की प्रोफ़ाइल से पता चलता है. फ़िल्टरिंग के बाद और नाभिक छँटाई से पहले, नमूने में मलबे की एक उच्च मात्रा होती है, जिसमें परमाणु दाग (7-एएडी) के लिए सकारात्मक "सिंगलेट" का 99% से अधिक होता है, जो इष्टतम सेल लसीका(चित्रा 2ए)का संकेत देता है। नाभिक को 7-एएडी पॉजिटिव गेट के आधार पर क्रमबद्ध किया जाता है। तैयार नाभिक की शुद्धता को सत्यापित करने के लिए क्रमबद्ध सामग्री का एक अंश प्राप्त किया जाता है। चित्रा 2 बी छँटाई के बाद मस्तिष्क नाभिक की प्रोफ़ाइल से पता चलता है. नाभिक छँटाई प्रारंभिक 36% (चित्रा 2 ए) से लगभग 100% (चित्रा 2 बी) तक नाभिक शुद्धता में वृद्धि की अनुमति दी।

Figure 2
चित्रा 2: छँटाई के बाद नाभिक छँटाई और शुद्धता परीक्षण के लिए गेटिंग रणनीति। नाभिक को 7-एएडी के साथ दाग दिया गया था और सेल सॉर्टर द्वारा अधिग्रहित किया गया था। (ए) नाभिक को पहले उनके आकार और ग्रैन्युलैरिटी (एफएससी-ए और एसएससी-ए, क्रमशः) के आधार पर गेट किया जाता है। एकल कणों तो उनके एफएससी-ए / एफएससी-एच गुणों और 7-एएडी धुंधला हो जाना के आधार पर चुना जाता है. (बी) सेल छँटाई के बाद, संग्रह ट्यूब से नाभिक का एक अंश ए के रूप में एक ही गेटिंग रणनीति का उपयोग कर शुद्धता के लिए परीक्षण किया है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

माउस अस्थि मज्जा हेमटोपोइएटिक स्टेम सेल पूर्वज (एचएसपीसी) की शुद्धि
अस्थि मज्जा से अलगाव पर, 2 x 105 एचएसपीसी तक एफएसीएस द्वारा क्रमबद्ध किया जाता है, चित्रा 3 ए में दिखाए गए गेटिंग रणनीति के अनुसार। छँटाई प्रभावकारिता और नमूना शुद्धता का आकलन कर रहे हैं(चित्रा 3 बी).

Figure 3
चित्रा 3: अस्थि मज्जा एचएसपीसी की छंटाई के लिए गेटिंग रणनीति। (ए) नाभिक अलगाव के लिए व्यवहार्य एलकेएस + हेमटोपोइएटिक स्टेम सेल और सीडी 34 + मायलोइड पूर्वज को छांटने के लिए एक प्रतिनिधि एफएसीएस गेटिंग रणनीति। (बी) प्रतिनिधि एफएसीएस भूखंडों का उपयोग सॉर्ट किए गए सेल जनसंख्या शुद्धता के सत्यापन के लिए किया जाता है। दिखाया गया मूल आबादी के संबंध में विभिन्न सेल सबसेट के अनुपात हैं। * दो क्रमबद्ध आबादी। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

"लो सेल इनपुट न्यूक्ली आइसोलेशन" प्रोटोकॉल अधिकतम 105 कोशिकाओं वाले नमूनों से नाभिक अलगाव की अनुमति देता है। इसमें कम संख्या में सेंट्रीफ्यूजेशन चरण शामिल हैं, जिससे सेल/नाभिक हानि कम होती है। हमने सेल इनपुट के लिए आनुपातिक रूप से lysis और धोने के बफ़र्स की मात्रा को समायोजित किया है और अधिकतम नाभिक वसूली के लिए centrifugation समय में वृद्धि हुई है। हमने गिनती द्वारा बरामद नाभिक की मात्रा और प्रवाह साइटोमेट्री और माइक्रोस्कोपी इमेजिंग द्वारा उनकी गुणवत्ता का आकलन करने के लिए एक पायलट प्रयोग किया है। चित्रा 4 सेल lysis के बाद HSPCs नमूना से पता चलता है. इस प्रोटोकॉल ने उच्च गुणवत्ता वाले नाभिक उत्पन्न किए, जैसा कि चित्रा 5 ए में देखा गया है, बिना किसी मलबे के जो डाउनस्ट्रीम मल्टीओम प्रोटोकॉल को प्रभावित कर सकता है।

Figure 4
चित्रा 4: पृथक अस्थि मज्जा एचएसपीसी नाभिक की शुद्धता परीक्षण छँटाई। नाभिक को 7-एएडी के साथ दाग दिया गया था और सेल सॉर्टर द्वारा अधिग्रहित किया गया था। नमूने की शुद्धता का आकलन करने के लिए नाभिक को पहले उनके आकार और ग्रैन्युलैरिटी (एफएससी-ए और एसएससी-ए, क्रमशः) के आधार पर गेट किया गया था। नाभिक का अनुपात मूल आबादी के संबंध में इंगित किया गया है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

ट्यूब नंबर ट्यूब का नाम सना हुआ इकाई दाग वाली इकाई की मात्रा एंटीबॉडी/डाई (μL) संग्रह बफर (μL)
1 बेदाग कोशिकाएँ 5,00,000 एन/ए 200
2 LIVE/DEAD फिक्सेबल एक्वा डेड सेल स्टेन कोशिकाएँ 5,00,000 0.5
3 APC/सायनिन 7 एंटी-माउस CD16/32 (FcγR) वनकॉम्प ईबीड्स 15 माइक्रोन 1
4 पैसिफिक ब्लू एंटी-माउस वंश कॉकटेल वनकॉम्प ईबीड्स 15 माइक्रोन 1
5 PE एंटी-माउस Ly-6A/E (Sca-1) वनकॉम्प ईबीड्स 15 माइक्रोन 1
6 APC एंटी-माउस CD117 (सी-किट) वनकॉम्प ईबीड्स 15 माइक्रोन 1
7 FITC एंटी-माउस CD34 वनकॉम्प ईबीड्स 15 माइक्रोन 1

तालिका 1: प्रवाह साइटोमीटर पर मुआवजा सेटिंग्स के लिए एकल दाग नियंत्रण। संकेत आवश्यक एकल दाग नियंत्रण, कोशिकाओं या मोतियों की संख्या को दागने के लिए, और एंटीबॉडी मात्रा हैं।

मास्टर मिक्स अभिकर्मक (दूसरे तत्वों की खोज में सहायक पदार्थ) अंतिम कमजोर पड़ने एंटीबॉडी/डाई (μL) बफर प्रकार बफर (μL)
मिक्स 1 APC/सायनिन 7 एंटी-माउस CD16/32 (FcγR) 1/500 1.2 डीपीबीएस 300
LIVE/DEAD फिक्सेबल एक्वा डेड सेल स्टेन 1/250 2.4
मिक्स 2 पैसिफिक ब्लू एंटी-माउस वंश कॉकटेल 1/20 30 FACS बफर 300
PE एंटी-माउस Ly-6A/E (Sca-1) 1/200 3
APC एंटी-माउस CD117 (सी-किट) 1/200 3
FITC एंटी-माउस CD34 1/50 12
कुल धुंधला मात्रा 600

तालिका 2: अस्थि मज्जा एचएसपीसी के लिए धुंधला मिश्रण की संरचना। दिखाया गया है कि 40 मिलियन कोशिकाओं वाले एक नमूने के धुंधला होने के लिए आवश्यक अभिकर्मकों की मात्रा है। नमूनों की एक बड़ी संख्या धुंधला के लिए, नमूने की आवश्यक संख्या से संकेत मात्रा गुणा और मास्टर मिश्रण की एक पर्याप्त मात्रा सुनिश्चित करने के लिए एक अतिरिक्त नमूना मात्रा के आधे जोड़ें.

अनुपूरक चित्रा 1: अस्थि मज्जा सेल अलगाव प्रोटोकॉल। (ए) पेरिटोनियम खोलें। सफेद बिंदीदार रेखाएं लाइन को काटने के लिए इंगित करती हैं। (बी) हिंद पैर से त्वचा को छीलने के बाद, फीमर के माध्यम से काटने के बिना पैर को काटने के लिए कूल्हे के जोड़ पर रीढ़ की हड्डी के साथ कैंची को लाइन करें। (सी) मांसपेशियों को हटाने से पहले पैर की उपस्थिति शरीर से अलग हो गई। (डी) मांसपेशियों को हटाने के बाद पैर की उपस्थिति। (ई) घुटने के जोड़ पर फीमर को अलग करने की प्रक्रिया, फिर कूल्हे के जोड़ पर, ध्यान रखना कि फीमर को खुला न काटें। सफेद घुमावदार तीर आवश्यक गति दिखाते हैं। सफेद बिंदीदार तीर धीरे कैंची का उपयोग करके अलग करने के लिए क्षेत्र को इंगित करते हैं। (एफ) प्रक्रिया सुरक्षित रूप से कैंची के साथ उपास्थि और बाहर का एपिफेसिस हथियाने और अस्थि मज्जा का पर्दाफाश करने के लिए वापस फ़्लिप करके फीमर के बाहर का हिस्सा (यानी, पहले घुटने के जोड़ पर टिबिया से जुड़ा हिस्सा) खोलने के लिए. (जी) काले तीरों द्वारा इंगित चार प्रोट्रूशियंस, उजागर काया अंत में दिखाई देना चाहिए। (एच) एफएसीएस बफर के 150 माइक्रोन युक्त 1.5 एमएल ट्यूब के अंदर रखी गई तैयार 0.5 एमएल ट्यूब में नीचे की ओर खुले अंत के साथ एक फीमर की उपस्थिति। (I) 12,000 x g पर त्वरित सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद पेलेट अस्थि मज्जा कोशिकाओं और अब सफेद फीमर की उपस्थिति। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

उच्च गुणवत्ता वाले सेल या नाभिक निलंबन की तैयारी एकल कोशिका या एकल नाभिक आरएनए-सेक और एकल कोशिका बहु ओमिक विश्लेषण 29,30,31 की सफलता के लिए महत्वपूर्ण महत्व का है. यहां, हमने दो प्रकार के ऊतकों से मल्टीओम परख के लिए नमूना तैयार करने और नाभिक अलगाव के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन किया है: मस्तिष्क और अस्थि मज्जा।

इस पत्र में वर्णित मस्तिष्क प्रोटोकॉल ताजा जमे हुए मस्तिष्क के ऊतकों से उच्च गुणवत्ता वाले नाभिक की वसूली की अनुमति देता है। इसमें निम्नलिखित चरण शामिल हैं: जमे हुए ऊतक व्यवधान, नाभिक का अलगाव, नाभिक की शुद्धि और तैयार सामग्री का गुणवत्ता नियंत्रण। मस्तिष्क के ऊतक कई अलग-अलग सेल प्रकारों से बना होता है, और ऊतक पृथक्करण और नाभिक अलगाव की प्रक्रिया को प्रारंभिक ऊतक में मौजूद सेल आबादी के अनुपात को संरक्षित करना चाहिए। यहां, लाइसिस बफर संरचना और इनक्यूबेशन समय को ऊतक की रचना करने वाले सभी सेल आबादी के पूर्ण और कोमल लसीका को सक्षम करने के लिए अनुकूलित किया गया था।

अस्थि मज्जा एचएसपीसी प्रोटोकॉल कुछ अलग है क्योंकि इसे एक विषम सेलुलर निलंबन से ब्याज की सेल आबादी को अलग करने के लिए प्रयोग की शुरुआत में एक अतिरिक्त कदम की आवश्यकता होती है। ताजा ऊतक के संग्रह के बाद, लाल रक्त कोशिकाओं lysed रहे हैं, और नमूना ब्याज की सेल सबसेट के लिए समृद्ध है. लक्षित कोशिकाओं को lysed किया जाता है, नाभिक को अलग किया जाता है, और तैयार सामग्री की गुणवत्ता को नियंत्रित किया जाता है।

10X जीनोमिक्स कई अलग ऊतकों32,33 में नाभिक अलगाव के लिए मान्य कई प्रोटोकॉल प्रदान करता है. कंपनी भी मान्य ऊतकों34 से नाभिक को अलग करने के लिए एक सीधी पाइपलाइन के साथ एक नाभिक अलगाव किट commercializes. हालांकि, इन प्रोटोकॉल को कुछ नमूनों की विशिष्टताओं को तैयार करने के लिए अतिरिक्त अनुकूलन की आवश्यकता होती है। एक उदाहरण नमूने हैं जिन्हें कम सेल इनपुट के साथ काम करने की आवश्यकता होती है। इन नमूनों के लिए, सबसे चुनौतीपूर्ण कदम सेंट्रीफ्यूजेशन हैं जिन्हें नमूना को साफ करने के लिए पर्याप्त रूप से कठोर होना चाहिए और सेल / नाभिक हानि से बचने के लिए पर्याप्त कोमल होना चाहिए। यहां वर्णित प्रोटोकॉल के साथ, हमने इन दो आवश्यकताओं के बीच एक अच्छा संतुलन खोजने के लिए सिंगल सेल मल्टीओम एटीएसी + जीईएक्स सीक्वेंसिंग (CG000365 - रेव सी)27 के लिए 10X जीनोमिक्स प्रदर्शित प्रोटोकॉल - नाभिक अलगाव को अनुकूलित किया है। जैसा कि क्रमबद्ध एचएसपीसी से नाभिक की तैयारी के उदाहरण में दिखाया गया है, हमने नमूने की गुणवत्ता पर कोई प्रभाव नहीं पड़ने के साथ नाभिक वसूली में सुधार किया है।

एक अतिरिक्त चुनौती नाभिक अलगाव के लिए शुद्ध कोशिकाओं के lysis का कदम है। कठोर lysis की स्थिति और लंबे समय तक इनक्यूबेशन समय नाभिक को नुकसान पहुंचा सकता है और इस तरह अनुक्रमण डेटा की गुणवत्ता को प्रभावित कर सकता है। चित्रा 5 लसीका बफर के साथ अलग-अलग इनक्यूबेशन समय पर अस्थि मज्जा के नमूनों से प्रतिनिधि नाभिक इमेजिंग दिखाता है और दिखाता है कि सेल लसीका के आधार पर नाभिक की स्थिति कितनी अलग हो सकती है। एचएसपीसी के उदाहरण में, हमने 3 मिनट लसीका को उस स्थिति के रूप में पहचाना है जिसके परिणामस्वरूप स्वस्थ दिखने वाले, बरकरार नाभिक का उच्चतम अनुपात और क्षतिग्रस्त नाभिक का सबसे कम अनुपात होता है। lysis इनक्यूबेशन बार नमूना के प्रत्येक नए प्रकार के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए.

Figure 5
चित्रा 5: माइक्रोस्कोपी द्वारा नाभिक गुणवत्ता नियंत्रण। दिखाया गया है (ए) बरकरार और (बी) क्षतिग्रस्त नाभिक के साथ माउस अस्थि मज्जा से पृथक नाभिक के प्रतिनिधि ब्राइटफील्ड चित्र हैं। स्केल बार 5 माइक्रोन। छवियों को 40x ELWD NA, 0.60 उद्देश्य और 1.5x डिजिटल ज़ूम का उपयोग करके एक उल्टे माइक्रोस्कोप के साथ लिया गया था। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

इस काम में विस्तृत दोनों प्रोटोकॉल उच्च throughput FACS उपकरणों द्वारा लक्षित कोशिकाओं या नाभिक शुद्ध करने पर भरोसा करते हैं. यह कदम एकल-कोशिका / नाभिक तैयारी प्रोटोकॉल के लिए महत्वपूर्ण महत्व का है जहां कोशिकाओं के दुर्लभ सबसेट को विषम निलंबन से अलग किया जाना है। इनमें एचएसपीसी छँटाई के लिए यहां दिखाए गए उदाहरण की तरह, ब्याज की सेल आबादी पर "गेटिंग" को सक्षम करने के लिए एक उच्च-आयामी प्रवाह साइटोमेट्री पैनल की आवश्यकता हो सकती है। छँटाई बेहद तेज और सटीक है, जिससे सॉर्ट किए गए सेल सबसेट की 95% से अधिक शुद्धता होती है। यह दृष्टिकोण सेलुलर निलंबन को 70 साई तक के दबाव में उजागर करता है और इसलिए, नाजुक कोशिकाओं (जैसे, डेंड्राइटिक कोशिकाओं, न्यूट्रोफिल) की छंटाई के लिए सीमित हो सकता है क्योंकि यह उनके कोशिका झिल्ली के टूटने का कारण बन सकता है। इन मामलों में, सेलुलर शुद्धि के लिए वैकल्पिक समाधानों का चयन किया जाना चाहिए, जिसमें चुंबकीय छँटाई, नई पीढ़ी के उपकरणों के अनुप्रयोग (जैसे, सेलेनवन, सेलेनियन; MACSQuant Tyto, Miltenyi)35,36, या छोटी बूंद-आधारित सिस्टम (जैसे, ODIN, Sensific)37. फिर भी, इन प्रौद्योगिकियों की धीमी छँटाई गति, सेल सॉर्टिंग के साथ जो मिनटों के बजाय घंटों तक चलती है, बड़े सेल नंबरों के विश्लेषण के आधार पर मल्टीओम और अन्य एकल-सेल अनुप्रयोगों के लिए व्यवहार्य कोशिकाओं की तैयारी में इन दृष्टिकोणों के आवेदन के लिए एक मजबूत सीमित कारक है।

ऊतक से पृथक नाभिक की शुद्धि के लिए, FACS अपने थ्रूपुट और पृथक सामग्री की शुद्धता के कारण पसंद की विधि है। नाभिक दबाव के प्रति संवेदनशील नहीं होते हैं, और फ़िल्टर्ड ऊतक आइसोलेट्स को सेल सॉर्टर के माध्यम से आसानी से शुद्ध किया जा सकता है। यदि प्रयोगशाला एफएसीएस उपकरण से सुसज्जित नहीं है, तो अन्य विकल्प मौजूद हैं, कुछ हद तक कम कुशल लेकिन पर्याप्त रूप से अच्छे हैं। उदाहरणों में अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन या मार्स (एप्लाइड सेल) जैसे छोटे उपकरणों का उपयोग शामिल है जो ध्वनिक तरंगों का उपयोग करके आकार में उनके अंतर के आधार पर कणों को अलग करता है; CURIOX लामिना वॉशर जो सेल/नाभिक निलंबन के हाइड्रोफोबिक गुणों का उपयोग करता है; या लेविटास बायो जो मलबे से उन्हें अलग करने के लिए कोशिकाओं (उत्तोलन) के भौतिक गुणों पर निर्भर करता है।

यहां, हम उच्च संख्या में नाभिक और डाउनस्ट्रीम मल्टीओम प्रोटोकॉल के लिए सर्वोत्तम शुद्धता प्राप्त करने के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। एफएसीएस छँटाई और बार-बार सेंट्रीफ्यूजेशन चरणों के परिणामस्वरूप प्रारंभिक सामग्री का पर्याप्त नुकसान होता है। इस कारण से, मस्तिष्क से नाभिक तैयारी के लिए प्रोटोकॉल में जिसका हम यहां वर्णन करते हैं, एफएसीएस छँटाई के बाद कम से कम 500,000 नाभिक के संग्रह के परिणामस्वरूप पर्याप्त प्रचुर मात्रा में प्रारंभिक सामग्री की आवश्यकता होती है। वैकल्पिक प्रोटोकॉल लागू किया जाना चाहिए यदि इस मानदंड का मिलान नहीं किया जा सकता है। दुर्लभ कोशिका आबादी या छोटे ऊतक वर्गों के साथ काम करते समय, प्रारंभिक सामग्री की उपलब्ध मात्रा एक सीमित कारक हो सकती है। इस मुद्दे को हल करने के लिए, (ए) लाइसिस की मात्रा को कम करके, (बी) धोने की मात्रा को कम करके, (सी) विस्तारित सेंट्रीफ्यूजेशन समय के साथ एकल धोने का उपयोग करके वसूली में सुधार करने की कोशिश करना संभव है जैसा कि 10X जीनोमिक्स प्रोटोकॉल में संकेत दिया गया है कम सेल इनपुट नाभिक अलगाव के लिए। कम-सामग्री सामग्री के बहु-स्तरीय विश्लेषण के लिए, प्लेट-आधारित अनुप्रयोगों जैसे कि scNMT, SNARE-seq, और Paired-seq38 पर विचार करना उचित है, जिनके लिए बहुत कम इनपुट नमूनों की आवश्यकता होती है।

सारांश में, हम मस्तिष्क और डाउनस्ट्रीम Multiome विश्लेषण के लिए अस्थि मज्जा HSPCs से नाभिक की तैयारी के लिए दो मजबूत प्रोटोकॉल का वर्णन किया है. ये प्रोटोकॉल किसी भी वैज्ञानिक परियोजना में लागू होते हैं जिसके लिए इन दो प्रकार के ऊतकों से उच्च गुणवत्ता वाले एकल नाभिक निलंबन की आवश्यकता होती है, भले ही वैज्ञानिक प्रश्न सामने आए हों। हमारा समूह विभिन्न लक्षित जीनों की निष्क्रियता पर मस्तिष्क के विकास के अध्ययन में और न्यूरोलॉजिकल रोगों के संदर्भ में प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के अध्ययन में मस्तिष्क नाभिक अलगाव प्रोटोकॉल को लागू कर रहा है। हम प्रतिरक्षा प्रणाली की स्थापना में विभिन्न हेमटोपोइएटिक उप-जनसंख्या की भागीदारी को समझने के लिए अस्थि मज्जा नाभिक अलगाव प्रोटोकॉल का उपयोग कर रहे हैं।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

एना जेमिन चोई को पाश्चर - पेरिस यूनिवर्सिटी (पीपीयू) इंटरनेशनल पीएचडी प्रोग्राम से एक वजीफा द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
18 G x 1 ½ (1.2 mm x 38 mm) Agani needles Terumo AN*1838S1
15 mL tubes Falcon 352097
5 mL round bottom FACS tube with cell strainer cap 35 µm falcon 352235
50 mL tubes Falcon 352070
7-AAD BD pharmagen 559925
ACK Lysing Buffer Gibco A10492-01
APC anti-mouse CD117 (c-Kit) BioLegend 105812 Clone: 2B8
APC/Cyanine 7 anti-mouse CD16/32 (FcγR) BioLegend 101328 Clone: 93
BD FACSAria III BD Biosciences non-applicable
BD FACSDiva Software v8.0.1 BD Biosciences non-applicable
Bovine Serum Albumin  stock solution 10% Miltenyi Biotec 130-091-376
Cell staining buffer Biolegend 420201
CFI Suprplan Fluor ELWD 40XC ON 0.6 Nikon  non-applicable
CMOS camera Prime 95B 25 mm Photometrix non-applicable
Countess II FL Automated Cell Counter Invitrogen AMQAF1000
Countess cell counting chamber slide Invitrogen C10283
Coverglass 24 mm x 24 mm 0.13-0.17 mm Brand BR470819
Digitonine 5% Invitrogen BN2006
Disposable Scalpels  Swann-Morton  0508
DMEM (1x) + GlutaMAX-I Gibco 31966-021
DPBS (10x) Gibco 14200-067
DTT Sigma aldrich 646563
Epifluorescence inverted microscope Nikon Ti2 -E Nikon  non-applicable
Eppendorf Safe-Lock Tubes 0.5 mL Eppendorf 30123603
Ethanol 70% VWR 83801.290
FITC anti-mouse CD34 Invitrogen 11-0341-85 Clone: RAM34
Forceps for dissection FST 11152-10
Heat-inactivated Fetal Bovine Serum (FBS) Gibco 11533387
Dounce Homogeniser 2 mL Bellco glass 1984-10002 Pestle “A” Large Clearance: .0030-.0050″ and Pestle “B” Small Clearance: .0005-.0025″
LIVE/DEAD fixable aqua dead cell stain kit Invitrogen L34957
Magnesium chloride solution 1 M Sigma aldrich M1028
Microcentrifuge  Eppendorf 5424R
Mounting medium Fluoromount-G  invitrogen 00-4958-02
Nonidet P40 substitute Sigma aldrich 74385
Nuclease free water ThermoFischer AM9932
Nuclei buffer 20x  10X Genomics 2000153/2000207
Nuclei isolation kit EZ prep Sigma Aldrich NUC-101
OneComp eBeads compensation beads Invitrogen 01-1111-41
Pacific Blue anti-mouse lineage cocktail
(including anti-mouse CD3, Ly-6G/Ly-6C, CD11b, CD45R/B220, TER-119)		 BioLegend 133310 Clones (in the same order as the antibodies listed): 17A2, RB6-8C5, M1/70, RA3-6B2, Ter-119
PCR Tube Strips 0.2 mL Eppendorf 951010022
PE anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) BioLegend 122507 Clone: E13-161.7
Petri dish 100 mm x 20 mm OPTILUX Falcon 353003
Ply-L-lysine 0.01% sterile-filtered suitable for cell culture Sigma P4707
Printed microscope slides 8 well 6 mm numbered Epredia ER-301B-CE24
Protein LoBind Tubes 1.5 mL Eppendorf 30108116
Recombinant Rnase inhibitor 5000 U Takara 2313A
Scissors for dissection FST 14090-09
Sodium chloride solution 5 M Sigma aldrich 59222C
Syringe filters, PES, 0.2 µm Fisher Scientific 15206869
Transparent nail polish  any non-applicable
Trizma Hydrochloride solution pH 7.4 Sigma aldrich T2194
Trypan Blue 0.4% gibco 15250061
Tween 20 Biorad  1662404
UltraPure Distilated Water Dnase/Rnase Free Invitrogen 10977-035

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References

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Moraes Cabé, C., Novault, S.,… More

Moraes Cabé, C., Novault, S., Jeemin Choi, A., Seffer, V., Barrio Cano, L., Libri, V., Hasan, M. High-Quality Brain and Bone Marrow Nuclei Preparation for Single Nuclei Multiome Assays. J. Vis. Exp. (202), e65715, doi:10.3791/65715 (2023).

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