Summary
single-cell/single-nuclei transcriptomics 및 multi-omics의 성공은 세포/핵의 품질에 크게 좌우됩니다. 따라서 조직에서 세포/핵을 분리하고 정제하는 것은 고도로 표준화되어야 합니다. 이 프로토콜은 다운스트림 단일 핵 다중체 분석을 위해 뇌와 골수에서 핵을 준비하는 방법을 설명합니다.
Abstract
단일 세포 분석은 단일 세포 분해능으로 치료 또는 감염에 대한 개별 세포 반응의 가변성을 평가해야 하는 생물학적 과정의 복잡성을 밝히기 위해 선택되는 접근 방식이 되었습니다.
지난 10년 동안 단세포 분자 프로파일링을 위한 많은 기술이 개발되었으며 여러 전용 기술이 상용화되었습니다. 10X Genomics 액적 기반 단일 세포 프로파일링은 전사체 및 다중 오믹 단일 세포 프로파일링에 즉시 사용할 수 있는 시약을 제공하는 광범위한 기술입니다. 이 기술에는 단일 세포 및 단일 핵 RNA 염기서열 분석(각각 scRNA-Seq 및 snRNA-Seq), scATAC-Seq, 단일 세포 면역 프로파일링(BCR/TCR 염기서열 분석) 및 멀티옴을 위한 워크플로우가 포함됩니다. 후자는 동일한 세포에서 나오는 전사 정보(scRNA-Seq)와 후성유전학적 정보(scATAC-Seq)를 결합합니다.
조직에서 분리되고 이러한 접근 방식으로 분석되는 단일 세포 또는 단일 핵 현탁액의 품질(생존력, 무결성, 순도)은 고품질 데이터를 생성하는 데 매우 중요합니다. 따라서 시료 전처리 프로토콜은 각 생물학적 조직의 특성에 맞게 조정되어야 하며 고품질 세포 및 핵 현탁액의 생성을 보장해야 합니다.
이 기사에서는 다운스트림 멀티오메 10X 유전체학 파이프라인을 위한 뇌 및 골수 샘플을 준비하기 위한 두 가지 프로토콜에 대해 설명합니다. 프로토콜은 단계적으로 수행되며 조직 해리, 세포 분류, 핵 분리 및 세포 분할 및 바코드, 라이브러리 준비 및 염기서열분석을 위한 출발 물질로 사용되는 준비된 핵 현탁액의 품질 관리를 다룹니다. 이러한 표준화된 프로토콜은 고품질 핵 라이브러리와 강력하고 신뢰할 수 있는 데이터를 생성합니다.
Introduction
수년 동안 단일 세포 기술은 생물학적 과정 분석의 황금 표준이었습니다. 처음에는 현미경, 유세포 분석 및 유사한 분석을 통한 단일 세포 표현형으로 제한되었습니다. 단일 세포 분석의 돌파구는 단일 세포 분자 프로파일링, 특히 개별 세포의 전체 전사체를 특성화할 수 있는 단일 세포 RNA 염기서열 분석(scRNA-Seq)을 위한 접근 방식의 개발과 함께 이루어졌습니다. 매우 강력한 scRNA-Seq는 특정 조건 및 시점에서 세포의 전사 상태에 대한 정보를 생성합니다. 그러나 전사를 유도하는 유전자 조절이나 시간이 지남에 따라 발생하는 분자 변형에 대한 가시성은 제공하지 않습니다. 이러한 한계를 극복하기 위해 동일한 세포 1,2,3,4에서 여러 요인과 과정을 분석할 수 있는 단일 세포 다중 오믹스 분석법 개발에 많은 노력을 기울였습니다. 단일 세포 내에서 두 가지 양식에 대한 최초의 성공적인 측정은 CITE-Seq 접근법5에서 다중 표면 단백질 발현 패턴을 개별 세포의 전체 전사체와 연결하는 것을 통해 이루어졌습니다. 보다 최근의 진화는 유전자 발현과 염색질 접근성(염기서열분석을 사용한 Transposase-Accessible Chromatin 분석, ATAC-Seq)을 결합하여 동일한 세포(예: sci-CAR)에서 전사체 및 후성유전체 양식을 동시에 포착합니다6. 전사체학을 세포 표현형 또는 동일한 세포의 후성유전학적 변화와 연관시킬 수 있는 최초의 상용 솔루션은 10X Genomics에서 나왔습니다.
단세포 분자 프로파일링을 위한 실험은 다음 단계를 포함한다: (1) 단세포 현탁액의 조직 해리 또는 준비; (2) 세포 정제 및/또는 핵 분리; (3) 분할 및 바코드; (4) 도서관 건설 및 품질 관리; (5) 차세대 염기서열분석; (6) 데이터 분석. 단계 (3)-(6)은 사용된 기술에 따라 크게 다를 수 있지만 초기 단계는 일반적으로 모든 기술에 공통적입니다. 준비된 세포/핵 현탁액의 품질은 실험의 전반적인 결과를 결정합니다. 조직의 유형에 따라 고품질 단세포/핵 현탁액을 얻는 것이 어려울 수 있습니다. 심장, 근육, 뇌, 폐, 장 등과 같은 일부 조직의 특이성으로 인해 분자 분석을 위한 고품질 핵 생성을 보장하기 위해 각 유형의 시료에 적합한 조직 파괴 및 핵 분리 방법이 필요합니다 7,8,9,10 . 조직 파괴 방법 및 해리 프로토콜은 기계적, 효소적(예: 콜라겐 분해 효소와 DNase의 혼합) 또는 이 둘의 조합일 수 있으며 수동으로 또는 기기(예: Qiagen DSC-400, gentleMACS)로 수행할 수 있습니다.
단세포 기술은 생물의학 연구를 위한 선택 도구가 되었습니다. 신경생물학에서 뇌의 세포 다양성과 기능의 복잡성은 희귀 세포 집단의 시각화와 이질성을 평가하기 위해 고해상도 및 고처리량 분석을 필요로 합니다 11,12,13,14. 개별 세포의 세포 정체성과 유전자 조절 메커니즘을 연결하면 뇌 발달 및 생리학에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다. 또 다른 예는 단일 세포 분석에 크게 의존하는 감염성, 자가면역 또는 암 질환의 맥락에서 면역 반응에 대한 연구입니다. 면역 세포 subset의 이질성과 그 활성의 복잡성 및 다른 세포 유형과의 상호 작용으로 인해 면역 반응의 기전을 해독하기 위해서는 단일 세포 분해능이 필요합니다. 면역 세포는 골수에서 유래하며, 조혈 전구 세포는 골수를 벗어나 말초의 집으로 이동하기 전에 단계적 과정을 통해 세포 표면 마커를 획득하고 잃는 점진적인 분화 세포로 구성됩니다. 단일 세포 분석을 통해 세포 발달 단계의 미세한 특성 분석이 가능합니다. 이는 단일 세포 표현형을 통해 달성할 수 있으며, 일반적으로 다중 파라미터 유세포 분석으로 수행됩니다. 그러나, 단일세포 전사체 서명은 전구세포 아형의 보다 정확한 식별을 나타내는 것으로 나타났는데, 이는 이들 세포가 서로 떨어지는 클러스터로 분포되어 있기 때문에 거친 세포 표면 마커 접근법15을 사용할 때 오식별될 수 있기 때문입니다. 점점 더 많은 연구에서 조혈모세포와 전구세포(HSPC)가 다양한 약제에 노출되어 면역체계의 장기적 반응성에 상당한 영향을 미칠 수 있는 후성유전학적 변형이 밝혀지고 있습니다 16,17,18,19. 새로운 다중 오믹스 기술을 통해 단일 세포 분해능으로 이러한 프로세스를 연구할 수 있습니다.
세포 및 핵 분리를 위한 많은 프로토콜이 뇌(11,20,21,22) 및 골수 샘플(23,24)에 대해 기술되어 있다. 실험적 변동성으로 인한 편향을 최소화하려면 공동 단세포 전사체 및 후성유전체 염기서열분석을 위해 최적화된 단핵항체 전처리 프로토콜을 검증하여 단세포 다중생물 분석의 재현성을 보장해야 합니다.
여기에서는 다운스트림 단일 세포 멀티옴 분석을 위한 (1) 신선 냉동 뇌 조직 및 (2) 신선 골수 HSPC에서 핵 준비를 위한 두 가지 강력한 프로토콜이 설명되어 있습니다(그림 1).
그림 1: 신선 냉동 뇌 및 골수 조직에서 핵 분리를 위한 프로토콜의 개략도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Protocol
실험 절차는 동물 실험 윤리 위원회(CETEA)에서 승인한 프로토콜의 엄격한 규정 준수에 따라 수행되었습니다. 뇌핵 분리를 위해 3개월 된 C57BL/6 마우스를 사용했습니다. 골수 분리를 위해, 18g 무게의 8주 된 암컷 C57BL/6J 마우스를 사용하였다.
1. 쥐의 뇌에서 핵의 정제
알림: 시술 중에는 항상 라텍스 또는 니트릴 장갑을 착용하십시오. 두 사람이 실험을 수행하고, 1-3단계(즉, 단일 핵 현탁액의 준비)는 한 사람이 수행하고, 4단계(즉, 분류기 준비)는 다른 사람이 병렬로 수행하는 것이 좋습니다. 프로토콜은 시간에 매우 민감하기 때문에 단일 핵 현탁액이 준비되는 즉시 분류기를 준비하여 샘플 처리 시간을 최소화하는 것이 중요합니다.
- 시약 및 재료 준비
- 오토클레이브로 해부 도구를 조심스럽게 살균하고(121°C에서 20분 동안) 사용 직전에 에탄올 70%로 세척합니다. 샘플당 하나의 페트리 접시를 준비하고 2-3mL의 얼음처럼 차가운 1x Dulbecco의 인산염 완충 식염수(DPBS)로 채웁니다.
- 마이크로 원심분리기를 4°C로 식히고 양동이에 얼음을 채운 다음 유리 dounce 균질화기를 얼음 위에 놓습니다.
- 최종 농도 0.01%, 샘플당 10mL의 디지토닌을 첨가하여 핵 용해 완충액을 준비합니다.
- RNase 억제제를 세포 염색 완충액에 첨가하여 최종 농도 0.2U/μL, 시료당 20mL로 염색 완충액을 준비합니다.
- 샘플당 0.2 U/μL, 2 mL의 최종 농도를 위해 RNase 억제제를 추가하여 DPBS 0.04% BSA를 준비합니다.
- Multiome 프로토콜25에 따라 희석된 핵 완충액 1mL를 준비합니다.
- 모든 시약과 샘플을 얼음 위에 보관하십시오.
- 조직 해부
- 기관에서 승인한 프로토콜을 사용하여 쥐를 희생합니다. 이 프로토콜에서 마우스는 케타민/자일라진 과다 복용 후 목이 잘렸습니다.
- Meyerhoff et al.26에 설명된 대로 가위로 쥐 머리를 자르고 두개골에서 뇌를 제거합니다. 발광 다이오드(LED) 조명 실체 현미경 아래에서 얼음처럼 차가운 1x DPBS로 준비한 페트리 접시에 뇌를 즉시 옮깁니다.
- 메스로 뇌 조직을 절단하여 뇌 관심 영역(예: 내측 피질, 해마, 전전두엽 피질)을 분리하고 각 영역을 얼음처럼 차가운 1x DPBS가 들어 있는 별도의 페트리 접시로 옮깁니다. 얼음 위에 보관하십시오.
- 메스를 사용하여 조직을 <0.5cm 조각으로 다져 다음 단계에서 균질화를 용이하게 합니다.
- P1000 마이크로피펫을 사용하여 다진 조직과 1x DPBS를 페트리 접시에서 1.5mL 튜브로 옮깁니다. 단백질 저결합 플라스틱으로 만든 튜브를 사용해야 합니다. 조직 조각이 중력에 의해 분리되도록 합니다. P1000 마이크로피펫을 사용하여 초과분인 1x DPBS를 조심스럽게 제거합니다.
참고: 이 단계 후에는 단백질 저결합 튜브를 드라이아이스로 옮긴 다음 핵 분리가 진행될 때까지 -80°C에서 보관하여 다진 조직을 스냅 동결할 수 있습니다.
- 핵 분리
- 0.01% 디지토닌이 함유된 2mL의 얼음처럼 차가운 핵 용해 완충액으로 유리 도운스를 채웁니다. dounce에 티슈 조각을 추가합니다.
알림: 신선 냉동 조직으로 작업하는 경우 다진 냉동 조직을 핵 용해 완충액 0.01% 디지토닌에 직접 추가합니다. 전에 조직을 해동하지 마십시오. - 유리 dounce 조직 균질기를 사용하여 유봉 A로 25회, 유봉 B로 25회 균질화합니다. 균질액을 15mL 튜브로 옮깁니다.
- 0.01% 디지토닌이 함유된 얼음처럼 차가운 핵 용해 완충액 2mL를 추가로 추가하고 얼음 위에서 5분 동안 배양합니다. 4°C에서 5분 동안 500 x g 에서 핵을 원심분리합니다.
- 마이크로피펫으로 상층액을 제거하고 0.01% 디지토닌이 함유된 얼음처럼 차가운 핵 용해 완충액 4mL를 추가합니다. 얼음 위에서 5분 동안 배양하고 40μm 세포 여과기를 통해 여과합니다.
- 4°C에서 5분 동안 500 x g 에서 핵을 원심분리하고 마이크로피펫으로 상층액을 제거합니다.
- 염색 완충액 4mL를 추가하여 핵을 세척하고 500 x g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다. 마이크로피펫으로 상층액을 제거하고 펠릿을 4mL의 염색 완충액에 재현탁시킵니다.
- 40μm 셀 스트레이너와 500 x g 의 원심분리기를 통해 4°C에서 5분 동안 여과합니다. 0.04% BSA가 있는 PBS 1mL에 재현탁합니다.
- 다양한 샘플에서 조직/핵 준비의 일관성을 보장하기 위해 핵을 계수합니다. 동일한 뇌 영역에서 유사한 핵 수를 얻을 것으로 예상됩니다.
- 빈 0.5mL 튜브에 0.4% 트리판 블루 10μL를 추가합니다. 10μL의 핵을 추가하고 피펫팅으로 5배 혼합합니다.
- 공급업체의 권장 사항에 따라 자동화된 세포 계수기를 사용하여 핵을 계수합니다. 핵을 얼음 위에 두십시오.
- 분류를 위해 핵을 준비합니다.
참고: 추출된 핵은 7-AAD를 통합하며, 이 염색은 형광 활성화 세포 분류기(FACS)에 의한 정제에 사용됩니다.- 염색되지 않은 대조군을 위해 100μL의 핵을 FACS 튜브로 옮깁니다. 나머지 핵에 10μL의 7-AAD를 추가하고 4°C에서 5분 동안 유지합니다.
- FACS로 최소 0.5 x 106 개의 핵을 분류하여 이중선과 파편을 제거합니다.
- 0.01% 디지토닌이 함유된 2mL의 얼음처럼 차가운 핵 용해 완충액으로 유리 도운스를 채웁니다. dounce에 티슈 조각을 추가합니다.
- FACS를 사용한 핵 분류
NOTE: 핵 분류는 다양한 cell sorter에서 수행할 수 있지만 BD FACSAria Fusion 또는 BD FACSAria III 기기를 사용하는 절차는 여기에 설명되어 있습니다. 셀 분류기의 교정 및 설정은 감독 하에 수행하거나 기기의 숙련된 사용자가 수행하는 것이 좋습니다. 시료 처리 시간을 줄이려면 단일 핵 현탁액이 준비되는 즉시 선별기를 준비하는 것이 중요합니다.- FACS 기기 교정
- 셀 분류기와 컴퓨터를 켭니다. 소프트웨어가 기기에 연결되면 유체 시동 절차를 시작합니다. 메인 메뉴에서 Cytometer(세포분석기) > Fluidic start-up(유체 시작)을 선택하고 4단계를 따릅니다. 각 완료를 완료한 후 완료 를 클릭합니다.
- 70μm 노즐을 삽입하고 스트림을 켠 다음 스트림이 안정화되도록 15분 동안 그대로 둡니다. 진폭을 조정하여 드롭 형성을 얻고 스위트 스폿을 클릭합니다.
- 중성 밀도(N.D) 필터 1.0을 넣고 세포분석기 설정 및 추적(CST) 인터페이스를 엽니다.
- 일일 품질 관리: CST 비드를 FACS 배지에 희석하고(공급업체의 권장 사항 참조) CST 제어를 수행합니다. 완료되면 ND 1.0을 ND 2.0으로 교체하십시오.
- FACS 배지에 Accudrops를 희석하고(공급업체의 권장 사항 참조) 6-10단계에 설명된 대로 낙하 지연을 수행합니다.
- 실험 템플릿에서 Accudrop Drop Delay 실험을 선택하고 튜브의 정렬 레이아웃 을 엽니다.
- 하단 카메라 창 내에서 Voltage(전압 )를 클릭한 다음 Optical Filter(광학 필터 )를 클릭하여 편향판에 전하를 적용하고 카메라 전면의 특정 광학 필터를 사용할 수 있습니다. 오른쪽의 사분면이 100을 나타내는지 확인합니다. 필요한 경우 빨간색 레이저 나사를 조정하여 레이저 충격을 최적화합니다.
- 초당 1,000개에서 3,000개 이벤트의 속도에 도달하도록 유속을 조정합니다.
- Sort and Cancel( 정렬 및 취소)을 클릭합니다. 왼쪽 사분면이 100이고 오른쪽 사분면이 0인지 확인합니다. 왼쪽 사분면이 95 미만이면 자동 지연을 수행합니다.
- Voltage( 전압)를 클릭한 다음 Test Sort(테스트 정렬)를 클릭합니다. 수집 튜브에 침전되는 측면 스트림의 품질을 제어합니다. 필요한 경우 슬라이더를 움직여 사이드 스트림의 위치를 조정합니다.
- 핵 분류를 위한 FACS 기기 설정.
- 염색되지 않은 핵의 획득을 시작합니다. 이는 순방향 및 측면 산란과 7-ADD 매개변수에 대한 검출기 전압을 정의하는 데 사용됩니다. 염색되지 않은 샘플의 7-AAD 신호가 점도표에서 로그 스케일의 처음 10년 안에 포함되도록 파라미터를 설정합니다.
- 7-AAD 염색 핵의 튜브 획득을 시작하고 크기 및 입도에 대한 (1) FSC-A/SCC-A 및 FSC-H/SSC-H, (2) 이중항 식별을 위한 FSC-H/FSC-A, (3) 7-AAD 양성 핵에 대한 SSC-A/7-AAD를 기반으로 하는 게이팅 전략을 사용하여 핵 집단을 정의합니다( 그림 2A 참조).
- 스트림과 편향이 안정적인지 확인하십시오.
- 사이드 스트림 카메라에서 테스트 정렬을 켜고 전압을 ON으로 설정하고 왼쪽에 장착된 1.5mL 튜브에서 정확한 방울 분류를 확인합니다.
- Sorting Layout(정렬 레이아웃) 창에서 2단계(위)에 정의된 대로 관심 있는 모집단을 선택합니다. Target Events(대상 이벤트)에서 Continuous(연속)에서 임계값을 선택하여 샘플당 최소 0.5 x 106개의 핵을 얻습니다. 정밀도(Precision)에서 4-Way Purity(4-Way Purity)를 선택합니다.
- 준비가 되면 Sort( 정렬 )와 OK(확인 )를 클릭하여 핵 정렬을 시작합니다.
- FACS 기기 교정
- 정제된 핵의 품질 관리 및 계수
참고: 이 단계는 10X 크롬 칩에 로드될 분류된 핵의 순도를 테스트하기 위해 시료 전처리 단계의 최적화를 위한 파일럿 실험 중에만 수행해야 합니다. 프로토콜이 완전히 최적화되면 적은 수로 사용할 수 있는 수집된 핵의 불필요한 낭비를 방지하기 위해 후속 실험에서 이 품질 관리 단계를 수행하지 않는 것이 좋습니다.- 유세포 분석에 의한 순도 제어
- 분류된 핵 10μL를 2% 열 비활성화 소 태아 혈청(HI-FBS)이 포함된 90μL의 DPBS가 포함된 새 FACS 튜브로 옮깁니다.
- 선별 후 데이터를 수집하고 기록하여 선별 순도와 생존력을 검증합니다. 핵의 최소 98%가 4.2에 정의된 대로 관심 게이트에 나타나도록 합니다( 그림 2B 참조).
- 정제된 핵 계수
- 원심분리기는 500 x g 및 4 °C에서 5분 동안 핵을 분류하고 마이크로피펫을 사용하여 상층액을 조심스럽게 완전히 제거합니다. 100μL의 희석된 핵 완충액에 재현탁합니다.
- 빈 0.5mL 튜브에 0.4% 트리판 블루 10μL를 추가합니다. 분류된 핵 10μL를 추가하고 피펫팅으로 5배 혼합합니다.
- 공급업체의 권장 사항에 따라 자동화된 세포 계수기를 사용하여 핵을 계수합니다. 핵 농도를 3.5 x 106/mL, 즉 5μL당 16,000개의 핵으로 조정합니다.
- 현미경 검사에 의한 정제된 핵의 품질 관리
참고: 이 단계는 10X 크롬 칩에 로드될 핵의 품질을 테스트하기 위한 샘플 준비 단계의 최적화를 위한 파일럿 실험 중에만 수행해야 합니다. 프로토콜이 완전히 최적화되면 적은 수로 사용할 수 있는 수집된 핵의 불필요한 낭비를 방지하기 위해 후속 실험에서 이 품질 관리 단계를 수행하지 않는 것이 좋습니다.- 현미경 슬라이드와 커버 슬립이 깨끗하고 먼지가 없는지 확인하십시오. 필요한 경우 커버슬립을 절대 에탄올로 씻고 헹구고 보푸라기가 없는 물티슈로 말리십시오.
- 사용할 슬라이드 웰에 25μL의 폴리-l-라이신을 분배하고 먼지로부터 보호되는 실온(RT)에서 10분 동안 배양합니다.
- 과잉 폴리-l-라이신을 제거하고 정제된 핵 현탁액 10μL를 추가합니다. 먼지로부터 보호하여 상온에서 5분 동안 배양합니다.
- 기포를 피하면서 각 웰에 장착 매체 한 방울을 추가합니다.
- 씨를 뿌린 우물 위에 커버슬립을 놓습니다. 종이 물티슈로 덮고 커버슬립을 단단히 눌러 여분의 장착 매체를 제거합니다. 커버슬립을 움직이지 않도록 주의하고 여분의 장착 매체를 청소하지 마십시오.
- 명시야광과 최소 배율 40x의 도립 현미경으로 여러 이미지를 촬영합니다.
- 유세포 분석에 의한 순도 제어
- 멀티오메 분석을 수행합니다.
- Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression User Guide (CG000338 - Rev F)25로 즉시 진행하십시오.
2. 마우스 골수, 조혈 줄기 및 전구 세포(HSPC)에서 핵 정제
참고 이 프로토콜은 골수 HSPC의 세 가지 하위 집합인 lineage-c-Kit+Sca-1+ 조혈모세포(HSC), lineage-c-Kit+Sca-1-CD34+FcγR- 일반 골수성 전구세포(CMP) 및 계통-c-Kit+Sca-1-CD34+FcγR+에서 핵을 정제하는 방법을 설명합니다 과립구-단핵구 전구세포(GMP). 시술 중에는 항상 라텍스 또는 니트릴 장갑을 착용하십시오. 이 프로토콜은 10X Genomics Proven Protocol - Nuclei Isolation for Single Cell Multiome ATAC + GEX sequencing (CG000365 - Rev C)27을 채택한 것입니다. 핵 회수를 극대화하기 위해 원래 프로토콜에 수정이 도입되었습니다. 1 단계를 수행하기 위해 두 사람이 실험을 수행하는 것이 좋습니다. 를 3으로 설정합니다. (즉, 단세포 용액의 제조)는 한 사람에 의해 수행되고, 단계 4(즉, 분류기의 제조)는 다른 사람에 의해 병렬로 수행된다. 프로토콜은 시간에 매우 민감하기 때문에 단일 셀 현탁액이 준비되는 즉시 선별기를 준비하여 샘플 처리 시간을 최소화하는 것이 중요합니다.
- 시약 및 재료 준비
- 양동이에 얼음을 채웁니다.
- FACS 완충액 준비: 2% HI-FBS 용액(샘플 6개당 약 500mL)으로 DPBS를 준비하고 0.2μm 필터를 통해 필터링합니다.
- 10% HI-FBS 용액(샘플당 500μL)으로 DPBS를 채취하고 0.2μm 필터를 통해 여과합니다.
- 골수 세포의 분리
- 기관에서 승인한 프로토콜을 사용하여 쥐를 희생합니다. 이 실험에서 쥐는 케타민/자일라진 과다 복용 후 자궁경부 탈구에 의해 희생되었습니다.
- 쥐의 복부와 뒷다리에 70% 에탄올을 뿌립니다.
- 멸균 겸자와 가위를 사용하여 하복부 중앙을 작게 절개하고 뒷다리 기저부에서 횡격막까지 복막을 엽니다(보충 그림 1).
- 열린 복막에 수직으로 각 뒷다리를 추가로 절개한 다음 이러한 추가 절개 중 하나의 양쪽을 잡고 당겨서 발목 관절을 지나 양쪽 뒷다리의 피부를 벗겨내어 양쪽 뒷다리의 근육을 노출시킵니다(보충 그림 1A).
- 한쪽 뒷다리의 고관절에서 척추를 따라 가위를 줄지어 대퇴골을 자르지 않고 다리를 잘라냅니다(보충 그림 1B, C). 다른 쪽 다리도 같은 과정을 반복한다.
- 대퇴골을 분리하려면 대부분의 근육 조직을 잘라낸 다음 관절에서 손가락 끝으로 대퇴골과 경골을 양손으로 잡습니다(보충 그림 1D, E). 다리를 자연스럽게 구부린 부분에 대고 부드럽게 접어 대퇴골에서 경골을 탈구시킨 다음(보충 그림 1E) 결합 조직을 가위로 조심스럽게 잘라 대퇴골과 경골을 분리합니다.
- 가볍게 비틀어 가위를 사용하여 대퇴골 상단에서 척추 부분을 탈구시킵니다(보충 그림 1E).
- 분리된 대퇴골을 티슈 페이퍼로 세척하여 남아 있는 근육과 결합 조직을 제거합니다.
- 2mL의 DMEM(1x) + GlutaMAX-I로 채워진 12웰 플레이트에 얼음을 차갑게 보관합니다.
- 모든 대퇴골이 채취되면 근육과 섬유 조직이 뼈에서 완전히 제거되었는지 확인합니다. (a) 골수를 멸균 상태로 유지하고 (b) 우물에서 세포가 손실되는 것을 방지하기 위해 뼈를 자르지 마십시오. Haag 및 Murthy28에서 채택된 한 마우스의 두 대퇴골에서 세포를 플러시하려면 다음 단계를 사용합니다.
- 1.5mL 튜브 1개와 0.5mL 튜브 1개를 준비합니다. 1.5 mL 튜브에 150 μL의 FACS 완충액을 추가한 다음 18 G 바늘을 사용하여 0.5 mL 튜브의 바닥에 구멍을 뚫고 0.5 mL 튜브를 1.5 mL 튜브에 끼웁니다.
- 마우스 수술용 가위를 사용하여 각 대퇴골의 원위부를 엽니다(보충 그림 1F): 칼날 사이의 원위 골단을 고정하고 가위를 뒤집으면서 부드러운 압력을 가하여 뼈를 거칠게 자르지 않고 원위 골단을 부드럽게 분리합니다. 성공하면 현재 노출된 물리 말단에 4개의 돌출부가 보여야 합니다(보충 그림 1G).
- FACS 완충액이 들어 있는 1.5mL 튜브 내부에 배치된 준비된 0.5mL 튜브에 끝이 아래쪽을 향하도록 두 개의 대퇴골을 끼웁니다(보충 그림 1H).
- 70μm 세포 스트레이너를 50mL 튜브에 놓고 2mL의 FACS 완충액으로 스트레이너를 사전 적십니다.
- 골수를 세척하려면 원심분리기가 12,000 x g 값에 도달할 때까지 12,000 x g에서 튜브(뚜껑 열림)를 원심분리한 다음 즉시 원심분리기를 중지합니다.
- 골수 세포가 1.5mL 튜브에서 펠릿화되고 대퇴골이 흰색(세포 플러싱 전에는 빨간색)인지 확인합니다(보충 그림 1I). 2개의 대퇴골이 있는 0.5mL 튜브를 폐기합니다.
- 피펫을 사용하여 150μL 상층액을 폐기합니다.
- 적혈구를 용해하기 위해 RT에서 1-2분 동안 1mL의 염화암모늄-염화물-칼륨(ACK) 용해 완충액에 마이크로피펫으로 펠릿을 재현탁시킵니다. 더 긴 배양 시간은 유핵 세포의 생존력을 저하시킬 수 있으므로 피하십시오.
- 사전 습윤된 70μm 셀 스트레이너를 통해 50mL 튜브로 옮깁니다.
- FACS 완충액 10mL를 첨가하여 ACK 용해 완충액을 희석하고 용해를 중지합니다.
- 400 x g 에서 4 °C에서 5분 동안 원심분리합니다. 먼저 1mL에 재현탁한 다음 9mL를 보충하여 10mL FACS 완충액에 재현탁합니다.
- 1.3.8에 설명된 대로 셀 계수를 준비합니다.
- 공급업체의 권장 사항에 따라 자동화된 세포 계수기를 사용하여 세포를 계수합니다. 2개의 대퇴골에서 약 4천만 개의 세포를 수집할 것으로 예상됩니다.
- 골수 HSPC의 염색
- 세포를 400 x g에서 4°C에서 5분 동안 원심분리하고 FACS 버퍼에서 마이크로피펫으로 펠릿을 1 x 107 cells/mL의 최종 농도로 재현탁시킵니다.
- P1000 마이크로피펫을 사용하여 현탁액을 FACS 튜브로 옮기고 35μm 셀 스트레이너 캡을 통해 여과합니다.
- 표 1에 나열된 각 항체에 대한 단일 염색 시험관 샘플을 준비하여 세포 분류기에서 형광 색소 보정을 설정합니다.
- 항체당 하나의 FACS 튜브를 준비하고 튜브에 200μL의 PBS를 채웁니다.
- 형광 색소 복합 항체의 각 FACS 튜브에 15μL의 형광 색소 보정 비드를 추가합니다. 염색되지 않은 세포와 Live/Dead 단일 염색 세포를 위한 FACS 튜브에서 비드 대신 500,000개의 세포를 추가합니다.
- 각 형광 크롬 접합 항체 1μL( 표 1 참조)를 해당 FACS 튜브에 추가합니다. 0.5μL의 Live/Dead 염색을 Live/Dead 단일 염색 FACS 튜브에 추가합니다.
- 빛으로부터 보호하여 15분 동안 얼음 위에 두십시오.
- 표 2에 표시된 대로 혼합물 1 및 2를 준비합니다.
참고: 표 2 에 표시된 항체 부피는 재료 표에 참조된 항체에 대해 유효합니다. 새로운 항체 참조 또는 동일한 항체 참조의 다른 로트에 맞게 최적화되어야 합니다. - 믹스 1 300μL를 시료 튜브에 넣고 재현탁한 후 빛으로부터 보호된 얼음 위에서 15분 동안 보관합니다.
- 300 μL의 믹스 2를 시료 튜브에 넣고 재현탁한 후 빛으로부터 보호된 얼음 위에서 20분 동안 보관합니다.
- FACS 완충액 3mL를 단일 염색 튜브와 혼합 염색 시료 튜브에 추가합니다. 4°C에서 5분 동안 400 x g 으로 스핀 다운합니다.
- 마이크로피펫을 사용하여 상층액을 조심스럽게 폐기하고 펠릿을 FACS 완충액 500μL에 재현탁시킵니다.
- 500μL의 수집 배지로 미리 채워진 1.5mL 튜브를 준비합니다.
알림: 믹스 1은 HI-FBS의 영향을 크게 받는 Live/Dead 얼룩을 포함하고 있기 때문에 DPBS로 준비됩니다. 세포가 Live/Dead에 의해 염색되면 HI-FBS를 포함하는 FACS 완충액에 재현탁된 형광 크롬 접합 항체를 포함하는 Mix 2가 추가됩니다. 유일한 예외는 Antibody Mix 1에 포함된 항-CD16/32 항체로, 다음 단계에서 추가된 다른 항체의 비특이적 결합을 방지하는 Fc 수용체 차단제 역할을 합니다.
- FACS를 사용한 세포 분류
NOTE: 셀 분류는 다양한 셀 분류기에서 수행할 수 있지만 여기서는 BD FACSAria Fusion 또는 BD FACSAria III 기기를 사용하는 절차에 대해 설명합니다. 세포 분류기의 교정 및 설정은 감독 하에 또는 숙련된 기기 사용자가 수행하는 것이 좋습니다.- FACS 기기 교정: 프로토콜 1 단계 4.1을 참조하십시오.
- 세포 분류를 위한 FACS 기기 설정:
- 염색되지 않은 세포의 수집을 시작합니다. 이는 순방향 및 측면 산란과 각 형광단에 대한 검출기 전압을 정의하는 데 사용됩니다. 각 형광단의 형광 신호가 점도표에서 로그 스케일의 처음 10년 안에 포함되도록 파라미터를 설정합니다.
- 단일 색상 컨트롤을 획득하여 수동으로 보정을 설정하거나(양성 및 음성 모집단의 중앙값을 정렬해야 함) 자동 계산 소프트웨어(기울기 측정)를 사용합니다. 보정 컨트롤이 실험 형광 색소 및 검출기 설정과 일치하는지 확인하십시오. 셀에 대해 10,000개의 이벤트를, 비드에 대해 5,000개의 이벤트를 기록합니다.
- 샘플 튜브(즉, 다중 염색 세포)를 사용하여 그림 3A에 표시된 게이팅 전략을 사용하여 관심 세포 집단을 정의합니다. 아래 4 - 6단계를 따릅니다.
- 관심 있는 3개의 골수 HSPC(HSC, CMP 및 GMP)를 식별하기 위해 크기(FSC-A) 및 세분성(SSC-A)을 사용하여 게이팅을 시작하여 백혈구를 게이트한 다음 FSC-H/FSC-A를 사용하여 이중세포를 구별합니다.
- SSC-A/dead cell marker를 기반으로 살아있는 세포를 게이트합니다. Lineage/c-Kit를 사용하여 계통 음성이고 중간에서 높은 수준의 c-Kit를 발현하는 세포를 선택합니다. c-Kit/Sca-1을 통해 계보-c-Kit+ Sca-1+ (LKS+) HSC의 게이트, 세 가지 관심 집단 중 하나.
- 골수성 전구 세포(lineage-c-Kit+Sca-1-) 중 FcγR/CD34를 사용하여 CD34-FcγR- 거핵세포 및 적혈구 전구세포(MEP)를 배제하는 동시에 CD34+ FcγR-CMP 및 CD34+FcγR+ GMP를 분류할 세포 집단에 포함합니다.
- 스트림과 편향이 안정적인지 확인하십시오.
- 사이드 스트림 카메라에서 테스트 정렬을 켜고 전압을 ON으로 설정하고 왼쪽에 장착된 1.5mL 튜브에서 정확한 방울 분류를 확인합니다.
- 정렬 레이아웃 창에서 관심 있는 모집단(예: 이 예에 표시된 "LKS+" 및 "CD34+ 골수성 전구 세포")을 선택합니다. Device(장치)에서 2 Tube(2 튜브)를 선택합니다. 정밀도(Precision)에서 순도(Purity)를 선택합니다. Target Events(대상 이벤트)에서 Continuous(연속)를 선택하여 160,000 및 200,000 LKS+ 및 CD34+ 골수성 전구 세포 사이를 정렬합니다.
- 세포 현탁액에 500μL의 FACS 완충액을 추가하고 새로운 35μm 세포 스트레이너 캡이 있는 FACS 튜브로 필터링하여 1mL의 시료를 이송하여 모든 세포가 획득 직전에 단일 현탁액에 있는지 확인합니다. 이렇게 하면 기기를 막을 수 있는 세포 덩어리가 제거됩니다.
- 준비가 되면 정렬 및 확인을 클릭하여 정렬을 시작합니다. Flow Rate(플로우 속도 )를 조정하여 속도를 초당 10,000개 이벤트 미만으로 유지합니다.
참고: LKS+ 와 CD34+ 골수성 전구 세포의 예상 비율은 정상 상태에서 성인(8-12주령) C57BL/6J 암컷 마우스의 경우 1:3입니다. 목표 정렬된 셀 수는 일반적으로 정렬 후 30분 이내에 도달합니다.
- 분류된 세포의 품질 관리 및 계수
참고: 이 단계는 핵 분리에 사용할 분류된 세포의 순도를 테스트하기 위한 샘플 준비 단계의 최적화를 위한 파일럿 실험 중에만 수행해야 합니다. 프로토콜이 완전히 최적화되면 핵 분리에 사용할 수 있는 적은 수의 시작 물질의 불필요한 낭비를 방지하기 위해 후속 실험에서 이 품질 관리 단계를 수행하지 않는 것이 좋습니다.- 유세포 분석에 의한 순도 제어
- 분류된 세포 10μL를 90μL의 FACS 완충액이 들어 있는 새 FACS 튜브로 옮깁니다.
- 선별 후 데이터를 수집하고 기록하여 선별 순도와 생존력을 검증합니다. 세포의 95% 이상이 3 - 6에 정의되고 그림 3B에 설명된 대로 관심 게이트에 나타나는지 확인합니다.
- 유세포 분석에 의한 순도 제어
- 분류된 골수 HSPC에서 핵 분리
- 핵 회수를 최적화하기 위해 다음과 같은 수정 사항과 함께 10X Genomics Proven Protocol - Nuclei Isolation for Single Cell Multiome ATAC + GEX sequencing (CG000365 - Rev C)27의 부록에 있는 "Low Cell Input Nuclei Isolation" 프로토콜을 사용합니다.
- 용해 시간: 이 프로토콜에 대한 파일럿 실험을 실행하여 핵 분리를 위한 최적의 용해 시간을 식별합니다. 온전한 핵을 유지하면서 완전한 세포 용해를 달성하십시오.
참고: 위에서 언급한 10X 게놈 프로토콜27 의 f 단계는 "얼음 위에서 3-5분 동안 [용해 완충액에서] 배양"하도록 지시합니다. 파일럿 실험 중에 최소 3분, 4분 및 5분 동안 테스트하고 유세포 분석 및 현미경 이미징으로 계수하고 품질을 통해 회수된 핵의 양을 평가하여 최적의 용해 기간을 선택합니다(아래 이러한 품질 관리 검사에 대한 설명 참조). 시약을 절약하려면 파일럿 실험에서 희석된 핵 완충액을 PBS 0.04% BSA로 교체하십시오. 골수 HSPC의 경우 3분이 최적의 용해 기간으로 확인되었습니다. - 세포 원심분리: 모든 세포 현탁액 원심분리의 경우, 4°C에서 300 x g 에서 7분 동안 원심분리합니다(CG000365 - Rev C에서 5분 대신)27 .
- 핵 원심분리: CG000365 - Rev C27에 따라 500 x g에서 5분 동안 모든 핵 현탁액 원심분리를 수행합니다.
- 핵 수집: b 단계에서 50μL의 PBS 0.04% BSA에 재현탁하고 0.2mL 튜브로 옮긴 후 50μL의 PBS 0.04% BSA를 원래 튜브에 추가하고 피펫을 혼합하여 남은 세포를 수집합니다. 0.2mL 튜브로 옮겨 총 100μL 부피에 도달합니다.
- 이제부터 총 부피는 프로토콜의 50μL 대신 100μL가 됩니다. 그에 따라 다운스트림 단계를 조정합니다(예: 단계 d의 경우 45μL 대신 90μL를 제거하고, 단계 e의 경우 45μL 대신 90μL의 용해 완충액을 추가).
- 단계 m의 경우, 핵 펠릿을 7μL 대신 12μL의 희석된 핵 완충액에 재현탁시킵니다.
- 분리된 핵을 계산합니다. 빈 0.5mL 튜브에 0.4% 트리판 블루 10μL와 PBS 0.04% BSA 8μL를 추가합니다.
- 튜브에 2μL의 핵을 추가하고 1.3.8에 설명된 대로 핵을 계산합니다. 공급업체의 권장 사항에 따라 자동화된 세포 카운터를 사용하십시오.
- 용해 시간: 이 프로토콜에 대한 파일럿 실험을 실행하여 핵 분리를 위한 최적의 용해 시간을 식별합니다. 온전한 핵을 유지하면서 완전한 세포 용해를 달성하십시오.
- 핵 회수를 최적화하기 위해 다음과 같은 수정 사항과 함께 10X Genomics Proven Protocol - Nuclei Isolation for Single Cell Multiome ATAC + GEX sequencing (CG000365 - Rev C)27의 부록에 있는 "Low Cell Input Nuclei Isolation" 프로토콜을 사용합니다.
- 유세포 분석에 의한 순도 제어
참고: 이 단계는 10X 크롬 칩에 로드될 핵의 순도를 테스트하기 위한 샘플 준비 단계의 최적화를 위한 파일럿 실험 중에만 수행해야 합니다. 프로토콜이 완전히 최적화되면 적은 수로 사용할 수 있는 수집된 핵의 불필요한 낭비를 방지하기 위해 후속 실험에서 이 품질 관리 단계를 수행하지 않는 것이 좋습니다.- 핵 분리를 완료한 후 150μL의 FACS 완충액으로 미리 채워진 새 FACS 튜브에 6μL의 핵 재현탁액을 전달합니다. 3μL의 7-AAD를 넣고 얼음 위에서 5분간 배양합니다.
- 선별 후 데이터를 수집하고 기록하여 선별 순도와 생존력을 검증합니다. 최소 95%의 핵이 프로토콜 1 단계 4.2에 정의된 대로 관심 게이트에 나타나도록 합니다( 그림 4 참조).
- 현미경 검사에 의한 정제된 핵의 품질 관리:
참고: 이 단계는 10X 크롬 칩에 로드될 핵의 품질을 테스트하기 위한 샘플 준비 단계의 최적화를 위한 파일럿 실험 중에만 수행해야 합니다. 프로토콜이 완전히 최적화되면 적은 수로 사용할 수 있는 수집된 핵의 불필요한 낭비를 방지하기 위해 후속 실험에서 이 품질 관리 단계를 수행하지 않는 것이 좋습니다.- 1.5.3단계에 설명된 대로 진행합니다.
- 멀티오메 분석 수행
- Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression User Guide (CG000338 - Rev F)25로 즉시 진행하십시오.
Representative Results
위에서 설명한 두 가지 프로토콜은 두 가지 다른 유형의 조직에서 시작하는 핵의 분리를 자세히 설명합니다. 두 프로토콜 간의 차이점과 유사점은 그림 1에 개략적으로 나와 있습니다.
쥐 뇌의 핵 정제
여기에 설명된 프로토콜에서는 뇌 샘플에서 핵을 준비하는 부드러운 방법을 제안합니다. 용해 완충액에서 뇌 조직을 기계적으로 해리하는 것으로 시작하여 현탁액에서 나머지 조직을 제거하는 세척 및 여과 단계가 이어집니다. 파편, 비용해 세포 및 작은 입자의 후속 제거는 FACS에 의해 달성되어 다운스트림 Multiome 프로토콜을 위해 정제된 핵만 로드되도록 보장합니다. 그림 2 는 분류 전과 후의 핵 프로파일을 보여줍니다. 여과 후 핵 분류 전에 샘플에는 많은 양의 파편이 포함되어 있으며, 핵 염색(7-AAD)에 대해 99% 이상의 "단일항"이 양성으로 나타나 최적의 세포 용해를 나타냅니다(그림 2A). 핵은 7-AAD 양성 게이트를 기준으로 분류됩니다. 준비된 핵의 순도를 확인하기 위해 분류된 물질의 일부를 획득합니다. 그림 2B 는 분류 후 뇌핵의 프로파일을 보여줍니다. 핵 분류를 통해 핵 순도가 초기 36%(그림 2A)에서 거의 100%(그림 2B)로 증가할 수 있었습니다.
그림 2: 핵 분류 및 분류 후 순도 테스트를 위한 게이팅 전략. 핵을 7-AAD로 염색하고 세포 분류기에 의해 획득하였다. (A) 핵은 먼저 크기와 입도(각각 FSC-A 및 SSC-A)에 따라 게이트됩니다. 그런 다음 FSC-A/FSC-H 특성 및 7-AAD 염색을 기반으로 단일 입자를 선택합니다. (B) 세포 분류 후, 수집 튜브에서 나온 핵의 일부를 A에서와 동일한 게이팅 전략을 사용하여 순도를 테스트합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
마우스 골수 조혈모세포 전구세포(HSPC) 정제
골수에서 분리할 때 그림 3A에 표시된 게이팅 전략에 따라 최대 2 x 105 HSPC가 FACS에 의해 분류됩니다. 분류 효율과 시료 순도를 평가합니다(그림 3B).
그림 3: 골수 HSPC의 분류를 위한 게이팅 전략. (A) 핵 분리를 위해 생존 가능한 LKS+ 조혈모세포와 CD34+ 골수성 전구세포를 분류하기 위한 대표적인 FACS 게이팅 전략. (B) 분류된 세포 집단 순도 검증에 사용되는 대표 FACS 플롯. 표시된 것은 부모 모집단에 대한 다른 세포 하위 집합의 비율입니다. *두 개의 정렬된 모집단. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
"Low Cell Input Nuclei Isolation" 프로토콜은 최대 105 개의 세포가 있는 샘플에서 핵 분리를 허용합니다. 여기에는 원심분리 단계 수가 적어 세포/핵 손실을 최소화합니다. 세포 입력에 비례하여 용해 및 세척 완충액의 부피를 조정하고 최대 핵 회수를 위해 원심분리 시간을 늘렸습니다. 우리는 계수를 통해 회수된 핵의 양과 유세포 분석 및 현미경 이미징을 통해 핵의 품질을 평가하기 위한 파일럿 실험을 수행했습니다. 그림 4 는 세포 용해 후의 HSPC 샘플을 보여줍니다. 이 프로토콜은 그림 5A에서 관찰된 바와 같이 다운스트림 멀티오메 프로토콜에 영향을 줄 수 있는 파편 없이 고품질 핵을 생성했습니다.
그림 4: 분리된 골수 HSPC 핵의 순도 테스트 분류. 핵을 7-AAD로 염색하고 세포 분류기에 의해 획득하였다. 시료의 순도를 평가하기 위해 먼저 핵의 크기와 입도(각각 FSC-A 및 SSC-A)를 기준으로 핵을 게이트했습니다. 핵의 비율은 부모 개체군에 대해 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 튜브 번호 | 튜브 이름 | 염색된 엔티티 | 염색된 개체의 양 | 항체/염료 (μL) | 수집 완충액(μL) |
| 1 | 얼룩지지 않음 | 셀 | 5,00,000 | 해당 없음 | 200 |
| 2 | LIVE/DEAD 고칠 수 있는 아쿠아 데드 셀 얼룩 | 셀 | 5,00,000 | 0.5 | |
| 3 | APC/시아닌 7 항마우스 CD16/32(FcγR) | OneComp eBead (원컴프 eBead) | 15 μL | 1 | |
| 4 | 퍼시픽 블루 안티 마우스 리니지 칵테일 | OneComp eBead (원컴프 eBead) | 15 μL | 1 | |
| 5 | PE 안티 마우스 Ly-6A/E(Sca-1) | OneComp eBead (원컴프 eBead) | 15 μL | 1 | |
| 6 | APC 안티 마우스 CD117 (c-Kit) | OneComp eBead (원컴프 eBead) | 15 μL | 1 | |
| 7 | FITC 안티 마우스 CD34 | OneComp eBead (원컴프 eBead) | 15 μL | 1 |
표 1: 유세포 분석기의 보정 설정을 위한 단일 염색 제어. 필요한 단일 염색 대조군, 염색할 세포 또는 비드의 수, 항체 양이 표시됩니다.
| 마스터 믹스 | 시약 | 최종 희석 | 항체/염료 (μL) | 버퍼 유형 | 완충액(μL) |
| 믹스 1 | APC/시아닌 7 항마우스 CD16/32(FcγR) | 1/500 | 1.2 | (주)디피에스 | 300 |
| LIVE/DEAD 고칠 수 있는 아쿠아 데드 셀 얼룩 | 1/250 | 2.4 | |||
| 믹스 2 | 퍼시픽 블루 안티 마우스 리니지 칵테일 | 1/20 | 30 | FACS 버퍼 | 300 |
| PE 안티 마우스 Ly-6A/E(Sca-1) | 1/200 | 3 | |||
| APC 안티 마우스 CD117 (c-Kit) | 1/200 | 3 | |||
| FITC 안티 마우스 CD34 | 1/50 | 12 | |||
| 총 염색량 | 600 |
표 2: 골수 HSPC에 대한 염색 혼합물의 조성. 표시된 것은 4천만 개의 세포가 들어 있는 하나의 샘플을 염색하는 데 필요한 시약의 양입니다. 더 많은 수의 시료를 염색하려면 표시된 부피에 필요한 시료 수를 곱하고 추가 시료 부피의 절반을 추가하여 마스터 혼합물의 충분한 부피를 확보합니다.
보충 그림 1: 골수 세포 분리 프로토콜. (A) 복막을 엽니다. 흰색 점선은 잘라낼 선을 나타냅니다. (B) 뒷다리의 피부를 벗겨낸 후 척추를 따라 고관절을 따라 가위를 늘어서 대퇴골을 자르지 않고 다리를 잘라냅니다. (C) 근육을 제거하기 전에 다리가 몸에서 분리된 모습. (D) 근육 제거 후 다리의 모습. (E) 무릎 관절에서 대퇴골을 분리한 다음 고관절에서 대퇴골을 절단하지 않도록 주의하는 절차. 흰색 곡선 화살표는 필요한 모션을 나타냅니다. 흰색 점선 화살표는 가위를 사용하여 조심스럽게 분리할 영역을 나타냅니다. (F) 대퇴골의 원위부(무릎 관절의 경골에 부착된 부분)를 가위로 단단히 잡고 뒤로 젖혀 골수를 노출시켜 개복하는 절차. (G) 검은색 화살표로 표시된 4개의 돌출부가 노출된 물리 끝에서 보여야 합니다. (H) 150μL의 FACS 완충액을 포함하는 1.5mL 튜브 내부에 배치된 준비된 0.5mL 튜브에 개방된 끝이 아래쪽을 향하는 대퇴골의 모양. (I) 펠릿화된 골수 세포와 12,000 x g에서 빠른 원심분리 후 현재 하얀 대퇴골의 모습. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
고품질 세포 또는 핵 현탁액의 준비는 단일 세포 또는 단일 핵 RNA-Seq 및 단일 세포 다중 오믹 분석의 성공에 매우 중요합니다 29,30,31. 여기에서는 뇌와 골수라는 두 가지 유형의 조직에서 다중종 분석을 위한 샘플 준비 및 핵 분리를 위한 프로토콜을 설명했습니다.
이 논문에 기술된 뇌 프로토콜은 갓 얼어붙은 뇌 조직에서 고품질 핵을 회수할 수 있게 해줍니다. 여기에는 동결 조직 파괴, 핵 분리, 핵 정제 및 준비된 물질의 품질 관리 단계가 포함됩니다. 뇌 조직은 다양한 세포 유형으로 구성되어 있으며, 조직 해리 및 핵 분리 절차는 초기 조직에 존재하는 세포 집단의 비율을 보존해야 합니다. 여기서, 용해 완충액 조성 및 배양 시간은 조직을 구성하는 모든 세포 집단의 완전하고 부드러운 용해가 가능하도록 최적화되었습니다.
골수 HSPC 프로토콜은 이질적인 세포 현탁액에서 관심 세포 집단을 분리하기 위해 실험 시작 시 한 가지 추가 단계가 필요하기 때문에 다소 다릅니다. 신선한 조직을 채취한 후 적혈구를 용해하고 관심 세포 하위 집합에 대해 샘플을 농축합니다. 표적 세포를 용해하고, 핵을 분리하고, 준비된 물질의 품질을 제어합니다.
10X Genomics는 다양한 조직에서 핵 분리를 위해 검증된 여러 프로토콜을 제공합니다32,33. 이 회사는 또한 검증된 조직으로부터 핵을 분리하기 위한 간단한 파이프라인을 갖춘 핵 분리 키트를 상용화한다34. 그러나 이러한 프로토콜은 특정 샘플의 특성을 조정하기 위해 추가 최적화가 필요합니다. 예를 들어 낮은 셀 입력으로 작업해야 하는 샘플이 있습니다. 이러한 샘플의 경우 가장 어려운 단계는 샘플을 세척할 수 있을 만큼 엄격하고 세포/핵 손실을 방지할 수 있을 만큼 부드러워야 하는 원심분리입니다. 여기에 설명된 프로토콜을 통해 당사는 이 두 가지 요구 사항 간의 미세한 균형을 찾기 위해 단일 세포 멀티옴 ATAC + GEX 염기서열분석(CG000365 - Rev C)27을 위한 10X Genomics Proven Protocol - Nuclei Isolation을 채택했습니다. 분류된 HSPC에서 핵을 준비하는 예에서 입증된 바와 같이, 당사는 샘플의 품질에 영향을 미치지 않으면서 핵 회수율을 개선했습니다.
또 다른 과제는 핵 분리를 위해 정제된 세포를 용해하는 단계입니다. 더 가혹한 용해 조건과 더 긴 배양 시간은 핵을 손상시켜 염기서열분석 데이터의 품질에 영향을 미칠 수 있습니다. 그림 5 는 용해 완충액을 사용한 다양한 배양 시간에 골수 샘플의 대표적인 핵 이미징을 보여주며 세포 용해에 따라 핵의 상태가 얼마나 다를 수 있는지 보여줍니다. HSPC의 예에서, 우리는 3분 용해가 건강해 보이는 온전한 핵의 비율이 가장 높고 손상된 핵의 비율이 가장 낮은 조건으로 식별되었습니다. 용해 배양 시간은 각각의 새로운 유형의 시료에 맞게 최적화되어야 합니다.
그림 5: 현미경에 의한 핵 품질 관리. (A)는 온전하고 (B)는 손상된 핵이 있는 쥐 골수에서 분리된 핵의 대표적인 명시야 이미지입니다. 눈금 막대 5 μm. 이미지는 40x ELWD NA 0.60 대물렌즈와 1.5x 디지털 줌을 사용하여 도립 현미경으로 촬영했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
이 연구에서 자세히 설명된 두 프로토콜 모두 고처리량 FACS 기기로 표적 세포 또는 핵을 정제하는 데 의존합니다. 이 단계는 세포의 희귀 하위 집합이 이종 현탁액에서 분리되어야 하는 단일 세포/핵 준비 프로토콜에 매우 중요합니다. HSPC 분류를 위해 여기에 표시된 예에서와 같이 이러한 경우, 관심 세포 집단에서 "게이팅"을 활성화하기 위해 고차원 유세포 분석 패널이 필요할 수 있습니다. 분류는 매우 빠르고 정확하여 분류된 세포 subset의 순도가 95% 이상입니다. 이 접근법은 세포 현탁액을 최대 70psi의 압력에 노출시키며, 따라서 세포막의 파열을 유발할 수 있기 때문에 깨지기 쉬운 세포(예: 수지상 세포, 호중구)의 분류에 제한될 수 있습니다. 이러한 경우 자기 분류, 차세대 기기(예: CellenOne, Cellenion; MACSQuant Tyto, Miltenyi)35,36 또는 액적 기반 시스템(예: ODIN, Sensific)37. 그럼에도 불구하고, 몇 분이 아닌 몇 시간 동안 지속되는 세포 분류와 함께 이러한 기술의 느린 분류 속도는 Multiome 및 큰 세포 수 분석을 기반으로 하는 기타 단일 세포 응용 분야를 위한 생존 가능한 세포 준비에 이러한 접근 방식을 적용하는 데 있어 강력한 제한 요소입니다.
조직에서 분리된 핵의 정제를 위해 FACS는 처리량과 분리된 물질의 순도로 인해 선택되는 방법입니다. 핵은 압력에 민감하지 않으며, 여과된 조직 분리물은 세포 분류기를 통해 쉽게 정제할 수 있습니다. 실험실에 FACS 기기가 장착되어 있지 않은 경우 효율성은 다소 떨어지지만 충분히 좋은 다른 대안이 있습니다. 예를 들어 초원심분리 또는 음파를 사용하여 크기 차이에 따라 입자를 분리하는 MARS(Applied Cell)와 같은 소형 장비의 사용이 있습니다. 세포/핵 현탁액의 소수성 특성을 사용하는 CURIOX 층류 와셔; 또는 세포의 물리적 특성(공중 부양)에 의존하여 파편에서 세포를 분리하는 LEVITAS bio.
여기에서는 다운스트림 Multiome 프로토콜에 대해 많은 수의 핵과 최상의 순도를 얻기 위한 프로토콜에 대해 설명합니다. FACS 분류 및 반복적인 원심분리 단계는 초기 물질의 상당한 손실을 초래합니다. 이러한 이유로, 우리가 여기에 기술하는 뇌로부터의 핵 준비를 위한 프로토콜에서, FACS 분류 후 적어도 500,000개의 핵의 수집을 초래하기 위해 충분히 풍부한 출발 물질이 필요하다. 이 기준이 일치하지 않는 경우 대체 프로토콜을 적용해야 합니다. 희귀 세포 집단 또는 작은 조직 절편으로 작업할 때 사용 가능한 초기 물질의 양이 제한 요인이 될 수 있습니다. 이 문제를 해결하기 위해 (a) 용해량을 줄이고, (b) 세척량을 줄이고, (c) 원심분리 시간이 연장된 단일 세척을 사용하여 낮은 세포 입력 핵 분리를 위한 10X Genomics 프로토콜에 표시된 대로 회수율을 개선함으로써 핵 회수를 개선할 수 있습니다. 저함량 물질의 멀티오믹 분석의 경우, 훨씬 적은 수의 입력 샘플이 필요한 scNMT, SNARE-seq 및 Paired-seq38 과 같은 플레이트 기반 애플리케이션을 고려하는 것이 좋습니다.
요약하면, 다운스트림 멀티옴 분석을 위해 뇌와 골수 HSPC에서 핵을 준비하기 위한 두 가지 강력한 프로토콜에 대해 설명했습니다. 이러한 프로토콜은 제기된 과학적 질문에 관계없이 이 두 가지 유형의 조직에서 고품질 단일 핵 현탁액을 필요로 하는 모든 과학 프로젝트에 적용할 수 있습니다. 우리 그룹은 다양한 표적 유전자의 비활성화에 따른 뇌 발달 연구와 신경 질환의 맥락에서 면역 반응 연구에 뇌핵 분리 프로토콜을 적용해 왔습니다. 우리는 면역 체계 구축에 다양한 조혈 하위 집단의 참여를 해독하기 위해 골수 핵 분리 프로토콜을 사용하고 있습니다.
Disclosures
저자는 공개할 것이 없습니다.
Acknowledgments
Ana Jeemin Choi는 파스퇴르 파리 대학교(PPU) 국제 박사 프로그램의 급여를 지원받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18 G x 1 ½ (1.2 mm x 38 mm) Agani needles | Terumo | AN*1838S1 | |
| 15 mL tubes | Falcon | 352097 | |
| 5 mL round bottom FACS tube with cell strainer cap 35 µm | falcon | 352235 | |
| 50 mL tubes | Falcon | 352070 | |
| 7-AAD | BD pharmagen | 559925 | |
| ACK Lysing Buffer | Gibco | A10492-01 | |
| APC anti-mouse CD117 (c-Kit) | BioLegend | 105812 | Clone: 2B8 |
| APC/Cyanine 7 anti-mouse CD16/32 (FcγR) | BioLegend | 101328 | Clone: 93 |
| BD FACSAria III | BD Biosciences | non-applicable | |
| BD FACSDiva Software v8.0.1 | BD Biosciences | non-applicable | |
| Bovine Serum Albumin stock solution 10% | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
| Cell staining buffer | Biolegend | 420201 | |
| CFI Suprplan Fluor ELWD 40XC ON 0.6 | Nikon | non-applicable | |
| CMOS camera Prime 95B 25 mm | Photometrix | non-applicable | |
| Countess II FL Automated Cell Counter | Invitrogen | AMQAF1000 | |
| Countess cell counting chamber slide | Invitrogen | C10283 | |
| Coverglass 24 mm x 24 mm 0.13-0.17 mm | Brand | BR470819 | |
| Digitonine 5% | Invitrogen | BN2006 | |
| Disposable Scalpels | Swann-Morton | 0508 | |
| DMEM (1x) + GlutaMAX-I | Gibco | 31966-021 | |
| DPBS (10x) | Gibco | 14200-067 | |
| DTT | Sigma aldrich | 646563 | |
| Epifluorescence inverted microscope Nikon Ti2 -E | Nikon | non-applicable | |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes 0.5 mL | Eppendorf | 30123603 | |
| Ethanol 70% | VWR | 83801.290 | |
| FITC anti-mouse CD34 | Invitrogen | 11-0341-85 | Clone: RAM34 |
| Forceps for dissection | FST | 11152-10 | |
| Heat-inactivated Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 11533387 | |
| Dounce Homogeniser 2 mL | Bellco glass | 1984-10002 | Pestle “A” Large Clearance: .0030-.0050″ and Pestle “B” Small Clearance: .0005-.0025″ |
| LIVE/DEAD fixable aqua dead cell stain kit | Invitrogen | L34957 | |
| Magnesium chloride solution 1 M | Sigma aldrich | M1028 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5424R | |
| Mounting medium Fluoromount-G | invitrogen | 00-4958-02 | |
| Nonidet P40 substitute | Sigma aldrich | 74385 | |
| Nuclease free water | ThermoFischer | AM9932 | |
| Nuclei buffer 20x | 10X Genomics | 2000153/2000207 | |
| Nuclei isolation kit EZ prep | Sigma Aldrich | NUC-101 | |
| OneComp eBeads compensation beads | Invitrogen | 01-1111-41 | |
| Pacific Blue anti-mouse lineage cocktail (including anti-mouse CD3, Ly-6G/Ly-6C, CD11b, CD45R/B220, TER-119) |
BioLegend | 133310 | Clones (in the same order as the antibodies listed): 17A2, RB6-8C5, M1/70, RA3-6B2, Ter-119 |
| PCR Tube Strips 0.2 mL | Eppendorf | 951010022 | |
| PE anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) | BioLegend | 122507 | Clone: E13-161.7 |
| Petri dish 100 mm x 20 mm OPTILUX | Falcon | 353003 | |
| Ply-L-lysine 0.01% sterile-filtered suitable for cell culture | Sigma | P4707 | |
| Printed microscope slides 8 well 6 mm numbered | Epredia | ER-301B-CE24 | |
| Protein LoBind Tubes 1.5 mL | Eppendorf | 30108116 | |
| Recombinant Rnase inhibitor 5000 U | Takara | 2313A | |
| Scissors for dissection | FST | 14090-09 | |
| Sodium chloride solution 5 M | Sigma aldrich | 59222C | |
| Syringe filters, PES, 0.2 µm | Fisher Scientific | 15206869 | |
| Transparent nail polish | any | non-applicable | |
| Trizma Hydrochloride solution pH 7.4 | Sigma aldrich | T2194 | |
| Trypan Blue 0.4% | gibco | 15250061 | |
| Tween 20 | Biorad | 1662404 | |
| UltraPure Distilated Water Dnase/Rnase Free | Invitrogen | 10977-035 |
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