Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Högkvalitativ hjärn- och benmärgskärnförberedelse för Single Nuclei Multiome-analyser

Published: December 22, 2023 doi: 10.3791/65715
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1, 1,3, 1
1Cytometry and Biomarkers UTechS, C2RT, Institut Pasteur, Université Paris Cité, 2Microenvironment and Immunity Unit, Institut Pasteur, Université Paris Cité, INSERM U1224, 3Istituto Superiore di Sanità

Summary

Framgången för transkriptomik med en cell/en kärna och multi-omik beror till stor del på kvaliteten på celler/kärnor. Därför måste isolering av celler/kärnor från vävnad och rening av dem vara mycket standardiserad. Detta protokoll beskriver beredningen av kärnor från hjärnan och benmärgen för nedströms single-nuclei multiome-analys.

Abstract

Encellsanalys har blivit det bästa tillvägagångssättet för att reda ut komplexiteten i biologiska processer som kräver att man bedömer variabiliteten hos individuella cellulära svar på behandling eller infektion med encellsupplösning.

Många tekniker för molekylär profilering av enskilda celler har utvecklats under de senaste 10 åren, och flera dedikerade tekniker har kommersialiserats. 10X Genomics droppbaserad encellsprofilering är en utbredd teknik som erbjuder färdiga reagenser för transkriptomisk och multi-omisk encellsprofilering. Tekniken inkluderar arbetsflöden för encells- och enkelkärns-RNA-sekvensering (scRNA-Seq respektive snRNA-Seq), scATAC-Seq, encellsimmunprofilering (BCR/TCR-sekvensering) och multiome. Den senare kombinerar transkriptionell (scRNA-Seq) och epigenetisk information (scATAC-Seq) som kommer från samma cell.

Kvaliteten (viabilitet, integritet, renhet) hos encells- eller enkärnssuspensioner som isolerats från vävnader och analyserats med någon av dessa metoder är avgörande för att generera data av hög kvalitet. Protokollen för provberedning bör därför anpassas till varje biologisk vävnads särdrag och säkerställa att cell- och kärnsuspensioner av hög kvalitet genereras.

I den här artikeln beskrivs två protokoll för att förbereda hjärn- och benmärgsprover för den underordnade multiome 10X Genomics-pipelinen. Protokollen utförs stegvis och omfattar vävnadsdissociation, cellsortering, cellkärnisolering och kvalitetskontroll av preparerad cellkärnesuspension som används som utgångsmaterial för cellpartitionering och streckkodning, biblioteksberedning och sekvensering. Dessa standardiserade protokoll producerar högkvalitativa kärnbibliotek och robusta och tillförlitliga data.

Introduction

Under många år har encellstekniker varit guldstandarden för analys av biologiska processer. De var till en början begränsade till fenotypning av enskilda celler genom mikroskopi, flödescytometri och liknande analyser. Ett genombrott inom encellsanalys kom med utvecklingen av metoder för molekylär profilering av enskilda celler, i synnerhet encells-RNA-sekvensering (scRNA-Seq) som möjliggjorde karakterisering av hela transkriptomet hos enskilda celler. ScRNA-Seq är mycket kraftfull och genererar information om transkriptionsstatusen för en cell i ett specifikt tillstånd och vid en viss tidpunkt. Det ger dock ingen insyn i den genreglering som driver transkriptionen, eller i de molekylära modifieringar som sker över tid. För att övervinna denna begränsning har många ansträngningar investerats i utvecklingen av encells-multi-omics-analyser som möjliggör analys av flera faktorer och processer från samma cell 1,2,3,4. Den första framgångsrika mätningen av två modaliteter inom enskilda celler kom genom att länka multiplexa ytproteinuttrycksmönster med det fullständiga transkriptomet av enskilda celler i CITE-Seq-metoden5. Nyare evolutioner kombinerar genuttryck med kromatintillgänglighet (Assay for Transposase-Accessible Chromatin using sequencing, ATAC-Seq), och fångar därmed samtidigt transkriptomiska och epigenomiska modaliteter i samma celler (t.ex. sci-CAR)6. De första kommersiella lösningarna som gjorde det möjligt att associera transkriptomik med cellfenotyp eller med epigenetiska förändringar i samma cell kom från 10X Genomics.

Experiment för molekylär profilering av enskilda celler omfattar följande steg: 1) dissociation av vävnad eller beredning av encellssuspensioner, 2. Cellrening och/eller isolering av kärnor. (3) partitionering och streckkodning; (4) bibliotekskonstruktion och kvalitetskontroll; (5) Nästa generations sekvensering. (6) Analys av data. Även om steg (3)-(6) kan variera avsevärt beroende på vilken teknik som används, är de inledande stegen i allmänhet gemensamma för dem alla. Kvaliteten på den beredda cell/kärnsuspensionen kommer att avgöra det övergripande resultatet av experimentet. Beroende på typ av vävnad kan det vara svårt att få fram högkvalitativa encells-/kärnsuspensioner. Särdragen hos vissa vävnader, såsom hjärta, muskler, hjärna, lungor, tarmar och andra, kräver metoder för vävnadsstörning och isolering av kärnor som är anpassade till varje typ av prov för att garantera produktion av kärnor av hög kvalitet för molekylär analys 7,8,9,10 . Vävnadsstörningsmetoderna och dissociationsprotokollen kan vara mekaniska, enzymatiska (t.ex. en blandning av kollagenaser och DNase), eller en kombination av de två, och kan utföras manuellt eller med instrument (t.ex. Qiagen DSC-400, gentleMACS).

Encellstekniker har blivit ett populärt verktyg för biomedicinsk forskning. Inom neurobiologin kräver celldiversiteten i hjärnan och komplexiteten i deras funktioner högupplöst analys med hög genomströmning för visualisering av sällsynta cellpopulationer och för att bedöma deras heterogenitet 11,12,13,14. Att koppla samman cellulär identitet och genregleringsmekanismer i enskilda celler ger insikter i hjärnans utveckling och fysiologi. Ett annat exempel är studier av immunsvar i samband med infektions-, autoimmuna eller cancersjukdomar, som är starkt beroende av encellsanalyser. Heterogeniteten hos immuncellernas undergrupper och komplexiteten i deras aktivitet och interaktioner med andra celltyper kräver encellsupplösning för att dechiffrera de mekanismer som ligger till grund för immunsvaret. Immuncellerna härstammar från benmärgen, där hematopoetiska stamceller består av gradvis differentierande celler som förvärvar och förlorar cellytemarkörer genom en stegvis process innan de lämnar benmärgen för att ta sig hem i periferin. Encellsanalys möjliggör minutiös karakterisering av cellulära utvecklingsstadier. Det kan uppnås genom fenotypning av en cell, som konventionellt utförs med flödescytometri med flera parametrar. Transkriptomiska signaturer i enskilda celler har dock visat sig avslöja en mer exakt identifiering av subtyper av stamceller eftersom dessa celler är fördelade i kluster som faller in i varandra och därför kan felidentifieras när man använder en grov cellytemarkör15. Ett ökande antal studier avslöjar de epigenetiska modifieringar som hematopoetiska stam- och stamceller (HSPC) kan förvärva från exponering för olika medel, vilket leder till en betydande inverkan på immunsystemets långsiktiga respons 16,17,18,19. De nya multi-omics-teknikerna gör det möjligt att studera dessa processer med encellsupplösning.

Många protokoll för cell- och kärnisolering har beskrivits för hjärna 11,20,21,22 och benmärgsprover23,24. För att minimera bias på grund av experimentell variabilitet är det nödvändigt att validera optimerade protokoll för beredning av enskilda kärnor för gemensam transkriptomisk och epigenomisk sekvensering av enskilda celler, och därigenom säkerställa reproducerbarheten av encellsmultiomiska analyser.

Här beskrivs två robusta protokoll för kärnpreparering från (1) färskfryst hjärnvävnad och (2) färsk benmärg HSPC för nedströms encellig Multiome-analys (Figur 1).

Figure 1
Figur 1: Schematisk representation av protokoll för isolering av kärnor från färskfrysta hjärn- och benmärgsvävnader. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Protocol

Försöksmetoderna utfördes i enlighet med de protokoll som godkänts av kommittén för djurförsöksetik (CETEA). För isolering av hjärnkärnor användes 3 månader gamla C57BL/6-möss. För benmärgsisoleringen användes 8 veckor gamla C57BL/6J-möss av honkön som vägde 18 g.

1. Rening av kärnor från mushjärna

OBS: Använd latex- eller nitrilhandskar hela tiden under proceduren. Det rekommenderas starkt att ha två personer som utför experimentet, att låta steg 1 till 3 (dvs. beredning av suspensionen av enstaka kärnor) utföras av en person, och steg 4 (dvs. förberedelse av sorteraren) utförs parallellt av en annan person. Eftersom protokollet är mycket tidskänsligt är det viktigt att minimera provbearbetningstiden genom att ha sorteraren redo så snart suspensionen med enstaka kärnor har förberetts.

  1. Beredning av reagenser och material
    1. Sterilisera dissektionsverktygen försiktigt i autoklav (vid 121 °C i 20 minuter) och tvätta dem med etanol 70 % strax före användning. Förbered en petriskål per prov, fylld med 2-3 ml iskall 1x Dulbeccos fosfatbuffrade saltlösning (DPBS).
    2. Kyl mikrocentrifugen till 4 °C, fyll en hink med is och lägg glashomogenisatorn på is.
    3. Förbered nuclei lysis buffer genom att tillsätta digitonin för en slutlig koncentration på 0,01 %, 10 ml per sample.
    4. Bered färgningsbufferten genom att tillsätta RNashämmare till cellfärgningsbufferten för en slutlig koncentration på 0,2 E/μL, 20 ml per prov.
    5. Bered DPBS 0,04 % BSA genom att tillsätta RNashämmare för en slutlig koncentration på 0,2 E/μL, 2 ml per prov.
    6. Bered 1 ml utspädd kärnbuffert enligt Multiome-protokollet25.
    7. Förvara alla reagenser och prover på is.
  2. Dissektion av vävnad
    1. Offra möss med hjälp av protokoll som godkänts av institutionen. I detta protokoll halshöggs mössen efter en överdos av ketamin/xylazin.
    2. Klipp av mushuvudet med en sax och ta bort hjärnan från skallen enligt beskrivningen i Meyerhoff et al.26. Överför omedelbart hjärnan till en petriskål tillagad med den iskalla 1x DPBS under ett lysdiodbelyst (LED)-belyst stereomikroskop.
    3. Skär hjärnvävnaden med en skalpell för att separera hjärnområden av intresse (t.ex. Entorhinal cortex, hippocampus, prefrontal cortex) och överför varje region till en separat petriskål som innehåller iskall 1x DPBS. Håll dig på isen.
    4. Finhacka vävnaden i <0,5 cm stora bitar med en skalpell för att underlätta homogeniseringen i nästa steg.
    5. Med en P1000 mikropipett överför du den malda vävnaden och 1x DPBS från petriskålen till ett 1,5 ml rör. Se till att använda tuber av plast med låg proteinbindningsgrad. Låt vävnadsbitarna separeras av gravitationen. Ta försiktigt bort överskottet av 1x DPBS med en P1000 mikropipett.
      OBS: Efter detta steg är det möjligt att snäppfrysa den malda vävnaden genom att överföra proteinets lågbindande rör till torris och sedan förvara vid -80 °C tills kärnisoleringen fortsätter.
  3. Isolering av kärnor
    1. Fyll glaset med 2 ml iskall nuclei lysis buffer med 0,01 % digitonin. Tillsätt vävnadsbitarna i dounce.
      OBS: om du arbetar med färskfryst vävnad, tillsätt den malda frysta vävnaden direkt till kärnlysbufferten 0.01 % digitonin; Låt inte näsduken tina innan.
    2. Homogenisera med hjälp av en homogenisator av glasduk 25 gånger med mortelstöt A och sedan 25 gånger med mortelstöt B. Överför homogenatet till ett 15 ml rör.
    3. Tillsätt ytterligare 2 ml iskall nuclei lysis buffer med 0,01 % digitonin och inkubera på is i 5 min. Centrifugera kärnorna vid 500 x g i 5 minuter vid 4 °C.
    4. Ta bort supernatanten med en mikropipett och tillsätt 4 ml iskall nuclei lysis buffer med 0,01 % digitonin. Inkubera på is i 5 minuter och filtrera genom en 40 μm cellsil.
    5. Centrifugera kärnorna vid 500 x g i 5 minuter vid 4 °C och avlägsna supernatanten med en mikropipett.
    6. Tillsätt 4 ml färgningsbuffert för att tvätta kärnorna och centrifugera vid 500 x g i 5 minuter vid 4 °C. Ta bort supernatanten med en mikropipett och återsuspendera pelleten i 4 ml färgningsbuffert.
    7. Filtrera genom en 40 μm cellsil och centrifugera vid 500 x g i 5 minuter vid 4 °C. Återsuspendera i 1 ml PBS med 0,04 % BSA.
    8. Räkna kärnor för att säkerställa konsistens i vävnads-/kärnberedningen över olika prover. Den förväntas få liknande antal kärnor från samma hjärnregioner:
      1. Tillsätt 10 μL 0,4 % trypanblå till en tom 0,5 ml tub. Tillsätt 10 μl av kärnorna och blanda 5 gånger genom pipettering.
      2. Räkna kärnor med hjälp av en automatiserad cellräknare enligt leverantörens rekommendationer. Håll kärnorna på is.
    9. Förbered kärnor för sortering.
      OBS: De extraherade kärnorna innehåller 7-AAD, och denna färgning används för rening av fluorescensaktiverad cellsorterare (FACS).
      1. Överför 100 μL kärnor till ett FACS-rör för ofärgad kontroll. Tillsätt 10 μl 7-AAD till de återstående kärnorna och håll 5 minuter vid 4 °C.
      2. Sortera minst 0,5 x 106 kärnor efter FACS för att eliminera dubbletter och skräp.
  4. Sortering av kärnor med hjälp av en FACS
    OBS: Kärnsortering kan utföras på en mängd olika cellsorterare, men proceduren för att använda instrumenten BD FACSAria Fusion eller BD FACSAria III beskrivs här. Det rekommenderas starkt att kalibreringen och installationen av cellsorteraren utförs under överinseende eller av en erfaren användare av instrumentet. För att minska bearbetningstiden för proverna är det viktigt att ha sorteraren redo så snart suspensionen med enstaka kärnor har beretts.
    1. Kalibrering av FACS-instrument
      1. Slå på cellsorteraren och datorn. När programvaran är ansluten till instrumentet, starta den fluidiska startproceduren. Välj Cytometer > vätskestart i huvudmenyn och följ de fyra stegen. Klicka på Klar när du har slutfört varje.
      2. Sätt i 70 μm-munstycket, slå på strömmen och låt strömmen stabiliseras i 15 minuter. Justera amplituden för att få droppbildning och klicka på Sweet Spot.
      3. Sätt i neutraldensitetsfiltret (ND) 1.0 och öppna gränssnittet för cytometerinställning och spårning (CST).
      4. Daglig kvalitetskontroll: Späd ut CST-pärlor i FACS-medium (se leverantörens rekommendationer) och utför CST-kontroll. När du är klar, byt ut ND 1.0 mot ND 2.0.
      5. Späd ut accudrops i FACS-medium (se leverantörens rekommendationer) och utför droppfördröjning enligt beskrivningen i steg 6 till 10.
      6. I experimentmallen väljer du experimentet Accudrop Drop Delay och öppnar sorteringslayouten för röret.
      7. Inuti det nedre kamerafönstret klickar du på Voltage och sedan på Optiskt filter för att göra det möjligt att applicera laddning på avböjningsplattorna och använda ett specifikt optiskt filter framför kameran. Se till att kvadranten på höger sida visar 100. Justera vid behov den röda laserskruven för att optimera lasereffekten.
      8. Justera flödeshastigheten för att nå en hastighet på 1 000 till 3 000 händelser per sekund.
      9. Klicka på Sortera och avbryt. Se till att den vänstra kvadranten är lika med 100 och att den högra kvadranten är 0. Om den vänstra kvadranten är under 95, utför Auto Delay.
      10. Klicka på Spänning och sedan på Testsortering. Kontrollera kvaliteten på sidoströmmarna som deponeras i uppsamlingsrören. Om det behövs, justera sidoströmmarnas position genom att flytta reglagen.
    2. Uppsättning av FACS-instrument för sortering av kärnor.
      1. Börja samla in de ofärgade kärnorna. Dessa används för att definiera de främre och sidospridningarna och detektorspänningen för 7-ADD-parametern. Ställ in parametrarna så att 7-AAD-signalen för det ofärgade provet faller inom det första decenniet av logaritmningsskalan på punktdiagrammet.
      2. Börja förvärva röret med 7-AAD-färgade kärnor och definiera kärnpopulationerna genom att använda en gating-strategi baserad på (1) FSC-A/SCC-A och sedan FSC-H/SSC-H för storlek och granularitet, (2) FSC-H/FSC-A för dubblettdiskriminering och (3) SSC-A/7-AAD för 7-AAD-positiva kärnor (se figur 2A).
      3. Se till att strömmen och avböjningen är stabila.
      4. I sidoströmskameran, slå på testsorteringen, voltage PÅ, och bekräfta den korrekta droppsorteringen i ett 1.5 ml rör monterat på vänster sida.
      5. I fönstret Sorteringslayout väljer du den population som är av intresse, enligt definitionen i steg 2 (ovan). I Målhändelser väljer du tröskelvärdet i Kontinuerlig för att få minst 0,5 x 106 kärnor per prov. Under Precision väljer du 4-vägs renhet.
      6. När du är klar klickar du på Sortera och OK för att börja med kärnsorteringen.
  5. Kvalitetskontroll och räkning av renade kärnor
    OBS: Detta steg ska endast göras under pilotexperimentet för optimering av provberedningsstegen, med målet att testa renheten hos de sorterade kärnorna som ska laddas på 10X kromchipet. När protokollet är helt optimerat rekommenderas det inte att utföra detta kvalitetskontrollsteg i uppföljningsexperimenten för att undvika onödigt slöseri med insamlade kärnor som kan finnas tillgängliga i litet antal.
    1. Renhetskontroll med flödescytometri
      1. Överför 10 μL av de sorterade kärnorna till ett nytt FACS-rör som innehåller 90 μL DPBS med 2 % värmeinaktiverat fetalt bovint serum (HI-FBS).
      2. Samla in och registrera eftersorteringsdata för att verifiera sorteringens renhet och genomförbarhet. Se till att minst 98 % av kärnorna visas i grinden av intresse, enligt definitionen i 4.2 (se figur 2B).
    2. Räkna de renade kärnorna
      1. Centrifugera sorterade kärnor i 5 minuter vid 500 x g och vid 4 °C och avlägsna försiktigt supernatanten helt med hjälp av en mikropipett. Återsuspendera i 100 μl utspädd kärnbuffert.
      2. Tillsätt 10 μL 0,4 % trypanblå till en tom 0,5 ml tub. Tillsätt 10 μl av de sorterade kärnorna och blanda 5 gånger genom pipettering.
      3. Räkna kärnor med hjälp av en automatiserad cellräknare enligt leverantörens rekommendationer. Justera kärnkoncentrationen till 3,5 x 106/ml, dvs 16 000 kärnor per 5 μL.
    3. Kvalitetskontroll av renade kärnor med mikroskopi
      OBS: Detta steg ska endast göras under pilotexperimentet för optimering av provberedningsstegen för att testa kvaliteten på kärnorna som ska laddas på 10X-kromchipet. När protokollet är helt optimerat rekommenderas det inte att utföra detta kvalitetskontrollsteg i uppföljningsexperimenten för att undvika onödigt slöseri med insamlade kärnor som kan finnas tillgängliga i litet antal.
      1. Se till att objektglas och täckglas är rena och dammfria. Tvätta och skölj vid behov täckglasen med absolut etanol och torka dem med luddfria våtservetter.
      2. Fördela 25 μL poly-l-lysin i de glasbrunnar som ska användas och inkubera i 10 minuter vid rumstemperatur (RT), skyddad från damm.
      3. Ta bort överskottet av poly-l-lysin och tillsätt 10 μl av den renade kärnsuspensionen. Inkubera i 5 minuter vid RT, skyddad från damm.
      4. Tillsätt en droppe monteringsmedium i varje brunn och undvik bubblor.
      5. Placera ett täckglas ovanpå de sådda brunnarna. Täck med pappersservetter och tryck fast täckglaset ordentligt för att ta bort överflödigt monteringsmedium. Var försiktig så att du inte flyttar täckglaset och rengör inte överflödigt monteringsmedium.
      6. Ta flera bilder med ett inverterat mikroskop med ljusfältsljus och en förstoring på minst 40x.
  6. Utför multiome-analys.
    1. Fortsätt omedelbart till Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression User Guide (CG000338 - Rev F)25.

2. Rening av kärnor från hematopoetiska stamceller och stamceller från musbenmärg (HSPC)

OBS Detta protokoll beskriver rening av kärnor från tre undergrupper av benmärgens HSPC: härstamning-c-Kit+Sca-1+ hematopoetiska stamceller (HSC), härstamning-c-Kit+Sca-1-CD34+FcγR- vanliga myeloida stamceller (CMP) och härstamning- c-Kit+Sca-1-CD34+FcγR+ granulocyt-monocytprogenitorer (GMP). Använd latex- eller nitrilhandskar hela tiden under proceduren. Detta protokoll är en anpassning av 10X Genomics Shown Protocol - Nuclei Isolation for Single Cell Multiome ATAC + GEX-sekvensering (CG000365 - Rev C)27. Modifieringar har införts i det ursprungliga protokollet för att maximera kärnåtervinningen. Det rekommenderas starkt att ha två personer som utför experimentet, för att ha steg 1. till 3. (dvs. beredning av encellslösningen) utförs av en person, och steg 4 (dvs. beredning av sorteraren) utförs parallellt av en annan person. Eftersom protokollet är mycket tidskänsligt är det viktigt att minimera provbearbetningstiden genom att ha sorteraren redo så snart encellssuspensionen är förberedd.

  1. Beredning av reagenser och material
    1. Fyll en hink med is.
    2. Förbered FACS-bufferten: DPBS med 2 % HI-FBS-lösning (cirka 500 ml för 6 prover) och filtrera genom ett 0,2 μm filter.
    3. Förbered uppsamlingsmediet: DPBS med 10 % HI-FBS-lösning (500 μL per sample) och filtrera genom ett 0.2 μm filter.
  2. Isolering av benmärgsceller
    1. Offra möss med hjälp av protokoll som godkänts av institutionen. I detta experiment offrades mössen genom livmoderhalsluxation efter en överdos av ketamin/xylazin.
    2. Spraya mössens buk och bakben med 70% etanol.
    3. Använd en steril pincett och sax för att göra ett litet snitt i mitten av nedre delen av buken och öppna bukhinnan från basen av bakbenen till diafragman (tilläggsfigur 1).
    4. Gör ett extra snitt för varje bakben vinkelrätt mot den öppnade bukhinnan, ta sedan tag i vardera sidan av ett av dessa ytterligare snitt och dra isär det för att dra av huden från båda bakbenen förbi fotleden för att exponera musklerna i båda bakbenen (tilläggsfigur 1A).
    5. Rikta saxen längs ryggraden vid höftleden på ett bakben för att klippa ut benet utan att skära genom lårbenet (tilläggsfigur 1B, C). Upprepa samma sak för det andra benet.
    6. För att isolera lårbenet, skär ut det mesta av muskelvävnaden och håll sedan lårbenet och skenbenet i varje hand med fingertopparna vid leden (tilläggsfigur 1D, E). Vik försiktigt benet mot den naturliga böjningen för att flytta skenbenet från lårbenet (tilläggsfigur 1E) och klipp sedan försiktigt av bindväven med en sax för att separera lårbenet och skenbenet.
    7. Använd saxen med lätta vridande rörelser för att flytta ryggraden från lårbenets övre ände (tilläggsfigur 1E).
    8. Rengör det isolerade lårbenet med silkespapper för att ta bort kvarvarande muskler och bindväv.
    9. Förvara kallt på is i en 12-brunnars plattbrunn fylld med 2 ml DMEM (1x) + GlutaMAX-I.
    10. När alla lårben har samlats in, se till att muskel- och fibrösa vävnader är helt borttagna från benet. Skär inte upp benet för att (a) hålla märgen inuti steril och (b) undvika att förlora celler i brunnen. Använd följande steg för att spola cellerna från två lårben på en mus, anpassad från Haag och Murthy28.
    11. Förbered ett 1.5 ml och ett 0.5 ml rör. Tillsätt 150 μl FACS-buffert till 1,5 ml-röret, stick sedan ett hål i botten av 0,5 ml-röret med en 18 G-nål och sätt in 0,5 ml-röret i 1,5 ml-röret.
    12. Öppna den distala delen av varje lårben med en muskirurgisk sax (kompletterande figur 1F): Lås in den distala epifysen mellan bladen och tryck försiktigt samtidigt som du vänder saxen för att smidigt lossa den distala epifysen utan att skära upp benet hårt. Om det lyckas bör 4 utsprång vara synliga i den nu exponerade fysisänden (tilläggsfigur 1G).
    13. Montera de två lårbenen med den öppna änden nedåt i det förberedda 0,5 ml-röret som placeras inuti ett 1,5 ml-rör som innehåller FACS-buffert (tilläggsfigur 1H).
    14. Placera en 70 μm cellsil på ett 50 ml rör och förfukta silen med 2 ml FACS-buffert.
    15. För att spola benmärgen, centrifugera rören (öppna lock) vid 12 000 x g tills centrifugen når värdet 12 000 x g , stoppa sedan omedelbart centrifugen.
    16. Kontrollera att benmärgscellerna är pelleterade i 1,5 ml-röret och att lårbenen är vita (före cellspolning är de röda) (tilläggsfigur 1I). Kassera 0.5 ml-rören med de 2 lårbenen.
    17. Kassera supernatanten på 150 μl med en pipett.
    18. Återsuspendera pelleten med en mikropipett i 1 ml ammonium-klorid-kalium (ACK) lyseringsbuffert i 1-2 minuter vid RT för att lysera röda blodkroppar. Undvik längre inkubationstider eftersom de kan leda till minskad livskraft hos kärnförsedda celler.
    19. Överför till 50 ml-röret genom den förfuktade 70 μm cellsilen.
    20. Tillsätt 10 ml FACS-buffert för att späda ut ACK-lyseringsbufferten och stoppa därmed lyseringen.
    21. Centrifugera vid 400 x g i 5 minuter vid 4 °C. Återsuspendera i 10 ml FACS-buffert genom att först suspendera i 1 ml och sedan fylla på med 9 ml.
    22. Förbered cellerna för räkning enligt beskrivningen i 1.3.8.
    23. Räkna cellerna med hjälp av en automatiserad cellräknare enligt leverantörens rekommendationer. Den förväntas samla in cirka 40 miljoner celler från 2 lårben.
  3. Färgning av benmärg HSPC
    1. Centrifugera cellerna vid 400 x g i 5 minuter vid 4 °C och återsuspendera pelleten med en mikropipett i FACS-buffert till en slutlig koncentration av 1 x 107 celler/ml.
    2. Med en P1000-mikropipett överför du suspensionen till ett FACS-rör och filtrerar genom ett 35 μm cellsillock.
    3. Bered provrörsprover med en enda färgning för varje antikropp som anges i tabell 1 för att ställa in kompensationer av fluorokromer på cellsorteraren:
      1. Bered ett FACS-rör per antikropp och fyll rören med 200 μL PBS.
      2. Tillsätt 15 μL fluorokromkompensationskulor i varje FACS-rör med fluorkromkonjugerad antikropp. I FACS-rören för ofärgade och för levande/döda enfärgade celler, lägg till 500 000 celler i stället för pärlor.
      3. Tillsätt 1 μl av varje fluorokromkonjugerad antikropp (se tabell 1) i motsvarande FACS-rör. Tillsätt 0,5 μL levande/död fläck i levande/död FACS-rör med enkel fläck.
      4. Håll på isen i 15 minuter skyddad från ljus.
    4. Förbered blandning 1 och 2 enligt tabell 2.
      OBS: De antikroppsvolymer som anges i tabell 2 gäller för de antikroppar som refereras till i materialförteckningen. De måste optimeras för alla nya antikroppsreferenser eller ett annat parti av samma antikroppsreferens.
    5. Tillsätt 300 μL Mix 1 i provröret, sätt upp den och låt den stå i 15 minuter på is skyddad från ljus.
    6. Tillsätt 300 μL Mix 2 i provröret, sätt upp den och låt den stå i 20 minuter på is skyddad från ljus.
    7. Tillsätt 3 ml FACS-buffert till de enkelfärgade rören och de mixfärgade provrören. Centrifugera i 400 x g i 5 minuter vid 4 °C.
    8. Kassera försiktigt supernatanten med en mikropipett och återsuspendera pelleten i 500 μL FACS-bufferten.
    9. Förbered ett 1,5 ml rör förfyllt med 500 μl uppsamlingsmedium.
      OBS: Mix 1 är beredd i DPBS eftersom den innehåller Live/Dead-fläcken som påverkas avsevärt av HI-FBS. När cellerna är färgade av Live/Dead tillsätts Mix 2, som innehåller de fluorokromkonjugerade antikropparna resuspenderade i FACS-buffert innehållande HI-FBS. Det enda undantaget är anti-CD16/32-antikroppen som ingår i Antibody Mix 1 för att fungera som Fc-receptorblockerare som förhindrar icke-specifik bindning av de andra antikropparna som tillsätts i följande steg.
  4. Cellsortering med hjälp av en FACS
    OBS: Cellsortering kan utföras på en mängd olika cellsorterare, men här beskrivs proceduren för att använda instrumenten BD FACSAria Fusion eller BD FACSAria III. Det rekommenderas starkt att kalibreringen och installationen av cellsorteraren utförs under övervakning eller av en erfaren användare av instrumentet.
    1. Kalibrering av FACS-instrument: Se protokoll 1 steg 4.1.
    2. Uppsättning av FACS-instrument för cellsortering:
      1. Börja förvärva de ofärgade cellerna. Dessa används för att definiera framåt- och sidospridningen och detektorspänningen för varje fluorofor. Ställ in parametrarna så att den fluorescerande signalen för varje fluorofor faller inom det första decenniet av logaritmningsskalan på punktdiagrammet.
      2. Skaffa enfärgskontroller för att ställa in kompensationer manuellt (medianen för positiva och negativa populationer bör justeras) eller använd det automatiska beräkningsprogrammet (lutningsmätningar). Se till att kompensationskontrollerna matchar de experimentella fluorokromerna och detektorinställningarna. Spela in 10 000 händelser för celler och 5 000 händelser för pärlor.
      3. Använd provröret (dvs. flerfärgade celler) för att definiera cellpopulationer av intresse genom att använda grindstrategin som visas i figur 3A. Följ steg 4–6 (nedan).
      4. För att identifiera de tre benmärgs-HSPC:erna av intresse (HSC, CMP och GMP), starta grinden genom att använda storleken (FSC-A) och granulariteten (SSC-A) för att grinda på leukocyter, sedan FSC-H/FSC-A för att diskriminera dubbletter.
      5. Baserat på SSC-A/dödcellsmarkör, grinda levande celler. Använd Lineage/c-Kit för att välja celler som är ursprungsnegativa och uttrycker mellanliggande till höga nivåer av c-Kit. Genom c-Kit/Sca-1, grind på lineage-c-Kit+ Sca-1+ (LKS+) HSCs, en av de tre populationerna av intresse.
      6. Bland de myeloida stamfäderna (lineage-c-Kit+Sca-1-), använd FcγR/CD34 för att utesluta CD34-FcγR- megakaryocyt och erytroida progenitorer (MEP), samtidigt som CD34+ FcγR- CMP, samt CD34+FcγR+ GMP inkluderas i cellpopulationerna som ska sorteras.
      7. Se till att strömmen och avböjningen är stabila.
      8. I sidoströmskameran, slå på testsorteringen, voltage PÅ och bekräfta den korrekta droppsorteringen i ett 1.5 ml rör monterat på vänster sida.
      9. I fönstret Sorteringslayout väljer du den eller de populationer som är av intresse (t.ex. "LKS+" och "CD34+ myeloida förfäder" som visas i det här exemplet). Under Enhet väljer du 2 Tube. Under Precision väljer du Renhet. I Målhändelser väljer du Kontinuerlig för att sortera mellan 160 000 och 200 000 LKS+ och CD34+ myeloida förfäder.
      10. Tillsätt 500 μl FACS-buffert till cellsuspensionen och överför 1 ml av provet genom filtrering till ett nytt 35 μm-celltäckt FACS-rör med sil för att säkerställa att alla celler är i en enda suspension strax före upptaget. Detta eliminerar cellklumpar som kan täppa till instrumentet.
      11. När du är klar klickar du på Sortera och OK för att börja sortera. Justera flödeshastigheten för att hålla hastigheten under 10 000 händelser per sekund.
        OBS: Det förväntade förhållandet mellan LKS+ och CD34+ myeloida stamceller är 1:3 för en vuxen (8-12 veckor gammal) C57BL/6J honmus i steady state. De sorterade cellnumren nås vanligtvis inom 30 minuter efter sorteringen.
  5. Kvalitetskontroll och räkning av sorterade celler
    OBS: Detta steg ska endast göras under pilotexperimentet för optimering av provberedningsstegen, med målet att testa renheten hos de sorterade cellerna som ska användas för kärnisolering. När protokollet är helt optimerat rekommenderas det inte att utföra detta kvalitetskontrollsteg i uppföljningsexperimenten för att undvika onödigt slöseri med utgångsmaterial som kan finnas tillgängligt i litet antal för isolering av kärnor.
    1. Renhetskontroll med flödescytometri
      1. Överför 10 μL av de sorterade cellerna till ett nytt FACS-rör som innehåller 90 μL FACS-buffert.
      2. Samla in och registrera eftersorteringsdata för att verifiera sorteringens renhet och genomförbarhet. Se till att minst 95 % av cellerna visas i grinden av intresse, enligt definitionen i 3 - 6 och illustrerad i figur 3B.
  6. Isolering av kärnor från sorterade benmärgs-HSPC
    1. Använd protokollet "Low Cell Input Nuclei Isolation" i bilagan från 10X Genomics Shown Protocol - Nuclei Isolation for Single Cell Multiome ATAC + GEX-sekvensering (CG000365 - Rev C)27, med följande ändringar gjorda för att optimera kärnåtervinningen:
      1. Lystid: Kör ett pilotexperiment för det här protokollet för att identifiera den bästa lystiden för kärnisolering. Se till att uppnå en fullständig celllys samtidigt som du bibehåller intakta kärnor.
        OBS: Steg f i det ovan nämnda 10X Genomics-protokollet27 instruerar att "inkubera [i Lysis Buffer] i 3-5 minuter på is". Under pilotexperimentet, testa minst 3 minuter, 4 minuter och 5 minuter och bedöm den återvunna kärnkvantiteten genom räkning och kvalitet genom flödescytometri och mikroskopiavbildning för att välja den optimala lystiden (se beskrivningen av dessa kvalitetskontrollkontroller nedan). För att spara reagens, byt ut den utspädda kärnbufferten mot PBS 0,04 % BSA i pilotexperimentet. För HSPC i benmärgen identifierades 3 min som den optimala lystiden.
      2. Cellcentrifugering: För alla cellsuspensionscentrifugeringar, centrifugera vid 300 x g i 7 minuter (i stället för 5 minuter i CG000365 - Rev C)27 vid 4 °C.
      3. Kärncentrifugeringar: Utför alla kärnsuspensionscentrifugeringar vid 500 x g i 5 minuter enligt CG000365 - Rev C27.
      4. Kärnuppsamling: I steg b, efter att ha suspenderat i 50 μl PBS 0,04 % BSA och överfört till ett 0,2 ml rör, tillsätt 50 μL PBS 0,04 % BSA till det ursprungliga röret och pipettblandningen för att samla upp eventuella överblivna celler. Överför till 0,2 ml röret för att nå en total volym på 100 μL.
      5. Hädanefter kommer den totala volymen att vara 100 μL i stället för 50 μL i protokollet. Justera stegen nedströms i enlighet med detta (t.ex. för steg d, ta bort 90 μL istället för 45 μL; för steg e, tillsätt 90 μL lysbuffert istället för 45 μL).
      6. För steg m återsuspenderas kärnpelleten i 12 μl utspädd kärnbuffert i stället för 7 μl.
      7. Räkna de isolerade kärnorna. Tillsätt 10 μL 0,4 % trypanblå och 8 μL PBS 0,04 % BSA i ett tomt 0,5 ml rör.
      8. Tillsätt 2 μl kärnor till röret och räkna kärnorna enligt beskrivningen i 1.3.8. Använd en automatiserad cellräknare enligt leverantörens rekommendationer.
  7. Renhetskontroll med flödescytometri
    OBS: Detta steg ska endast göras under pilotexperimentet för optimering av provberedningsstegen för att testa renheten hos kärnorna som ska laddas på 10X kromchipet. När protokollet är helt optimerat rekommenderas det inte att utföra detta kvalitetskontrollsteg i uppföljningsexperimenten för att undvika onödigt slöseri med insamlade kärnor som kan finnas tillgängliga i litet antal.
    1. Efter avslutad kärnisolering, överför 6 μL kärnresuspension till ett nytt FACS-rör förfyllt med 150 μL FACS-buffert. Tillsätt 3 μL 7-AAD och inkubera i 5 minuter på is.
    2. Samla in och registrera eftersorteringsdata för att verifiera sorteringens renhet och genomförbarhet. Se till att minst 95 % av kärnorna visas i grinden av intresse, enligt definitionen i protokoll 1 steg 4.2 (se figur 4).
  8. Kvalitetskontroll av renade kärnor med mikroskopi:
    OBS: Detta steg ska endast göras under pilotexperimentet för optimering av provberedningsstegen för att testa kvaliteten på kärnorna som ska laddas på 10X kromchipet. När protokollet är helt optimerat rekommenderas det inte att utföra detta kvalitetskontrollsteg i uppföljningsexperimenten för att undvika onödigt slöseri med insamlade kärnor som kan finnas tillgängliga i litet antal.
    1. Fortsätt enligt beskrivningen i steg 1.5.3.
  9. Utför multiome-analys
    1. Fortsätt omedelbart till Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression User Guide (CG000338 - Rev F)25.

Representative Results

De två protokollen som beskrivs ovan beskriver isoleringen av kärnor med utgångspunkt från två olika typer av vävnad. Skillnaderna och likheterna mellan de två protokollen visas schematiskt i figur 1.

Rening av kärnor från mushjärna
I det protokoll som beskrivs här föreslår vi en skonsam metod för kärnpreparering från hjärnprover. Det börjar med en mekanisk dissociation av hjärnvävnaden i en lysbuffert, följt av tvättning och silfiltrering som tar bort den återstående vävnaden från suspensionen. Det efterföljande avlägsnandet av skräp, icke-lyserade celler och små partiklar uppnås av FACS för att garantera att endast renade kärnor laddas för nedströms Multiome-protokollet. Figur 2 visar kärnans profil före och efter sortering. Efter filtreringen och före kärnsortering innehåller provet en stor mängd skräp, med mer än 99 % av "singleterna" positiva för kärnfärgning (7-AAD), vilket indikerar optimal celllys (figur 2A). Kärnor sorteras baserat på den 7-AAD-positiva grinden. En bråkdel av det sorterade materialet förvärvas för att verifiera renheten hos de beredda kärnorna. Figur 2B visar hjärnkärnornas profil efter sortering. Kärnsorteringen möjliggjorde en ökning av kärnornas renhet från de ursprungliga 36 % (figur 2A) till nästan 100 % (figur 2B).

Figure 2
Figur 2: Regleringsstrategi för kärnsortering och renhetstest efter sortering. Kärnorna färgades med 7-AAD och förvärvades av cellsorteraren. (A) Kärnor är först reglerade baserat på deras storlek och granularitet (FSC-A respektive SSC-A). Enstaka partiklar väljs sedan baserat på deras FSC-A/FSC-H-egenskaper och 7-AAD-färgning. (B) Efter cellsortering testas en fraktion av kärnorna från uppsamlingsröret med avseende på renhet med samma regleringsstrategi som i A. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Rening av hematopoetiska stamcellsstamceller i benmärg hos möss
Vid isolering från benmärgen sorteras upp till 2 x 105 HSPC efter FACS, enligt den regleringsstrategi som visas i figur 3A. Sorteringseffektiviteten och provets renhet bedöms (figur 3B).

Figure 3
Figur 3: Regleringsstrategi för sortering av benmärgs-HSPC. (A) En representativ FACS-regleringsstrategi för sortering av livskraftiga LKS+ hematopoetiska stamceller och CD34+ myeloida stamceller för kärnisolering. B) Representativa FACS-ytor som används för kontroll av sorterad renhet i cellpopulationen. Proportionerna mellan olika celldelmängder visas i förhållande till den överordnade populationen. *De två sorterade populationerna. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Protokollet "Low Cell Input Nuclei Isolation" tillåter kärnisolering från prover med högst 105 celler. Den innehåller ett lågt antal centrifugeringssteg, vilket minimerar cell-/kärnförlusten. Vi har justerat volymen av lys- och tvättbuffertar proportionellt mot cellens ingång och ökat centrifugeringstiden för maximal kärnåtervinning. Vi har utfört ett pilotexperiment för att bedöma mängden återvunna kärnor genom räkning och deras kvalitet genom flödescytometri och mikroskopiavbildning. Figur 4 visar HSPC-provet efter celllys. Detta protokoll genererade kärnor av hög kvalitet, som observerats i figur 5A, utan något skräp som skulle kunna påverka nedströms multiome-protokollet.

Figure 4
Figur 4: Renhetstestsortering av isolerade HSPC-kärnor i benmärgen. Kärnorna färgades med 7-AAD och förvärvades av cellsorteraren. Kärnorna styrdes först baserat på deras storlek och granularitet (FSC-A respektive SSC-A) för att bedöma provets renhet. Andelen kärnor anges i förhållande till moderpopulationen. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Rörets nummer Rörets namn Fläckad entitet Mängd färgad enhet Antikropp/färgämne (μL) Uppsamlingsbuffert (μL)
1 Ofärgad Celler 5,00,000 N/A 200
2 LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Celler 5,00,000 0.5
3 APC/Cyanine 7 anti-mus CD16/32 (FcγR) OneComp eBeads 15 μL 1
4 Pacific Blå anti-mus Lineage Cocktail OneComp eBeads 15 μL 1
5 PE anti-mus Ly-6A/E (Sca-1) OneComp eBeads 15 μL 1
6 APC anti-mus CD117 (c-Kit) OneComp eBeads 15 μL 1
7 FITC anti-mus CD34 OneComp eBeads 15 μL 1

Tabell 1: Kontroller för enstaka fläckar för kompensationsinställningar på flödescytometern. Angivna är de nödvändiga kontrollerna av enstaka fläckar, antalet celler eller pärlor som ska färgas och antikroppsmängderna.

Master Mix Reagens Slutlig utspädning Antikropp/färgämne (μL) Typ av buffert Buffert (μL)
Blandning 1 APC/Cyanine 7 anti-mus CD16/32 (FcγR) 1/500 1.2 DPBS 300
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain 1/250 2.4
Blandning 2 Pacific Blå anti-mus Lineage Cocktail 1/20 30 FACS-buffert 300
PE anti-mus Ly-6A/E (Sca-1) 1/200 3
APC anti-mus CD117 (c-Kit) 1/200 3
FITC anti-mus CD34 1/50 12
Total färgningsvolym 600

Tabell 2: Sammansättning av färgningsblandningen för benmärg HSPC. Här visas de volymer av reagenser som krävs för färgning av ett prov som innehåller 40 miljoner celler. För färgning av ett högre antal samples, multiplicera den angivna volymen med det erforderliga antalet samples och lägg till hälften av en extra sample volym för att säkerställa en tillräcklig volym av mastermixen.

Kompletterande figur 1: Protokoll för isolering av benmärgsceller. (A) Öppna bukhinnan. Vita prickade linjer indikerar linjen som ska klippas längs. (B) Efter att ha skalat av huden från bakbenet, dra saxen längs ryggraden vid höftleden för att klippa ut benet utan att skära igenom lårbenet. (C) Utseendet på benet som är skilt från kroppen innan muskeln avlägsnas. (D) Benets utseende efter avlägsnande av muskel. E) Förfarandet för att separera lårbenet vid knäleden och sedan vid höftleden, varvid man skall se till att lårbenet inte skärs upp. Vita böjda pilar visar vilken rörelse som krävs. Vita prickade pilar visar vilket område som ska separeras försiktigt med hjälp av en sax för att nypa av. (F) Procedur för att öppna den distala delen av lårbenet (dvs. den del som tidigare var fäst vid skenbenet vid knäleden) genom att ta tag i brosket och distala epifysen med en sax och vända tillbaka den för att exponera benmärgen. G) Fyra utskjutande delar, markerade med svarta pilar, ska vara synliga i den exponerade fysisänden. H) Utseendet på ett lårben med den öppna änden vänd nedåt i det förberedda 0,5 ml-röret som placerats inuti ett 1,5 ml-rör som innehåller 150 μl FACS-buffert. (I) Utseendet på de pelleterade benmärgscellerna och det nu vita lårbenet efter snabb centrifugering vid 12 000 x g. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Discussion

Beredning av högkvalitativ cell- eller kärnsuspension är av avgörande betydelse för framgången för encells- eller enkärns-RNA-Seq- och encellsmulti-omic-analyser 29,30,31. Här har vi beskrivit protokoll för provberedning och cellkärneisolering för multiomanalyser från två typer av vävnad: hjärna och benmärg.

Hjärnprotokollet som beskrivs i detta dokument gör det möjligt att återvinna kärnor av hög kvalitet från färskfryst hjärnvävnad. Den innehåller följande steg: fryst vävnadsstörning, isolering av kärnor, rening av kärnor och kvalitetskontroll av det beredda materialet. Hjärnvävnaden består av många olika celltyper, och proceduren för vävnadsdissociation och isolering av kärnor bör bevara de proportioner av cellpopulationer som finns i den ursprungliga vävnaden. Här optimerades lysbuffertens sammansättning och inkubationstid för att möjliggöra fullständig och skonsam lys av alla cellpopulationer som utgör vävnaden.

Benmärgens HSPC-protokoll är något annorlunda eftersom det krävs ytterligare ett steg i början av experimentet för att isolera den aktuella cellpopulationen från en heterogen cellulär suspension. Efter insamling av färsk vävnad lyseras röda blodkroppar och provet anrikas för den cellundergrupp som är av intresse. Målcellerna lyseras, kärnorna isoleras och kvaliteten på det beredda materialet kontrolleras.

10X Genomics tillhandahåller flera protokoll som validerats för cellkärneisolering i många olika vävnader32,33. Bolaget kommersialiserar också ett kärnisoleringskit med en enkel pipeline för att isolera kärnor från validerade vävnader34. Dessa protokoll behöver dock ytterligare optimering för att skräddarsy särdragen hos vissa prover. Ett exempel är de exempel som kräver att du arbetar med låg cellindata. För dessa prover är de mest utmanande stegen centrifugeringar som måste vara tillräckligt stränga för att rengöra provet och tillräckligt skonsamma för att undvika cell-/kärnförlust. Med det protokoll som beskrivs här har vi anpassat 10X Genomics Shown Protocol - Nuclei Isolation for Single Cell Multiome ATAC + GEX Sequencing (CG000365 - Rev C)27 för att hitta en fin balans mellan dessa två krav. Som visas i exemplet med beredning av kärnor från sorterade HSPC:er har vi förbättrat kärnåtervinningen utan att provets kvalitet påverkas.

En ytterligare utmaning är steget med lys av renade celler för cellkärnisolering. Hårdare lysförhållanden och längre inkubationstider kan skada kärnor och därmed påverka kvaliteten på sekvenseringsdata. Figur 5 visar representativ avbildning av kärnor från benmärgsprover vid olika inkubationstider med lysbuffert och illustrerar hur olika cellkärnornas tillstånd kan vara beroende på celllysen. I exemplet med HSPC:erna har vi identifierat 3 minuters lys som det tillstånd som resulterar i den högsta andelen friska, intakta kärnor och den lägsta andelen skadade kärnor. Inkubationstiderna för lys bör optimeras för varje ny typ av prov.

Figure 5
Figur 5: Kvalitetskontroll av kärnor med mikroskopi. Bilden visar representativa ljusfältsbilder av isolerade kärnor från benmärg hos möss med (A) intakta och (B) skadade kärnor. Skalstreck 5 μm. Bilderna togs med ett inverterat mikroskop med ett 40x ELWD NA 0,60 objektiv och 1,5x digital zoom. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Båda protokollen som beskrivs i detta arbete bygger på att man renar målceller eller kärnor med hjälp av FACS-instrument med hög kapacitet. Detta steg är av avgörande betydelse för protokoll för framställning av encelliga/kärnor där sällsynta undergrupper av celler ska isoleras från heterogena suspensioner. I dessa, som i exemplet som visas här för HSPC-sortering, kan en högdimensionell flödescytometripanel krävas för att möjliggöra "gating" på den cellpopulation som är av intresse. Sorteringen är extremt snabb och exakt, vilket leder till över 95 % renhet hos de sorterade celldelmängderna. Detta tillvägagångssätt utsätter den cellulära suspensionen för ett tryck på upp till 70 psi och kan därför vara begränsande för sortering av ömtåliga celler (t.ex. dendritiska celler, neutrofiler) eftersom det kan orsaka bristning av deras cellmembran. I dessa fall bör alternativa lösningar väljas för cellulär rening, inklusive magnetisk sortering, tillämpning av den nya generationens instrument (t.ex. CellenOne, Cellenion; MACSQuant Tyto, Miltenyi)35,36, eller droppbaserade system (t.ex. ODIN, Sensific)37. Icke desto mindre är den långsamma sorteringshastigheten hos dessa tekniker, med cellsortering som varar i timmar istället för minuter, en starkt begränsande faktor för tillämpningen av dessa metoder vid framställning av livskraftiga celler för Multiome och andra encellsapplikationer baserade på analys av stora cellantal.

För rening av kärnor isolerade från vävnaden är FACS den bästa metoden på grund av dess genomströmning och renheten hos det isolerade materialet. Kärnor är inte känsliga för tryck, och filtrerade vävnadsisolat kan enkelt renas genom cellsorteraren. Om laboratoriet inte är utrustat med ett FACS-instrument finns andra alternativ, något mindre effektiva men tillräckligt bra. Exempel på detta är ultracentrifugering eller användning av liten utrustning som MARS (Applied Cell) som separerar partiklar baserat på deras skillnad i storlek, med hjälp av akustiska vågor; CURIOX laminär bricka som använder hydrofoba egenskaper hos cell-/kärnsuspensioner; eller LEVITAS bio som förlitar sig på cellernas fysiska egenskaper (levitation) för att separera dem från skräpet.

Här beskriver vi protokoll för att erhålla ett stort antal kärnor och den bästa renheten för nedströms Multiome-protokollet. FACS-sortering och upprepade centrifugeringssteg resulterar i en betydande förlust av det ursprungliga materialet. Av denna anledning kräver protokollet för kärnpreparering från hjärnan som vi beskriver här tillräckligt rikligt med utgångsmaterial för att resultera i insamling av minst 500 000 kärnor efter FACS-sorteringen. Alternativa protokoll bör användas om detta kriterium inte kan uppfyllas. När man arbetar med sällsynta cellpopulationer eller små vävnadssnitt kan den tillgängliga mängden utgångsmaterial vara en begränsande faktor. För att ta itu med detta problem är det möjligt att förbättra kärnåtervinningen genom att (a) minska lysvolymen, (b) minska tvättvolymen, (c) använda en enda tvätt med förlängd centrifugeringstid för att försöka förbättra återhämtningen enligt 10X Genomics-protokoll för isolering av kärnor med låg cellingång. För multiomisk analys av material med lågt innehåll är det värt att överväga plattbaserade applikationer som scNMT, SNARE-seq och Paired-seq38 som kräver mycket färre indataprover.

Sammanfattningsvis har vi beskrivit två robusta protokoll för beredning av kärnor från hjärnan och benmärgens HSPC för nedströms Multiome-analys. Dessa protokoll är tillämpliga i alla vetenskapliga projekt som kräver högkvalitativa suspensioner av enskilda kärnor från dessa två typer av vävnad, oavsett vilken vetenskaplig fråga som ställs. Vår grupp har tillämpat protokollet för isolering av hjärnkärnor i studier av hjärnans utveckling vid inaktivering av olika målgener och i studier av immunsvar i samband med neurologiska sjukdomar. Vi använder protokollet för isolering av benmärgskärnor för att dechiffrera deltagandet av olika hematopoetiska subpopulationer i etableringen av immunsystemet.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Ana Jeemin Choi fick stöd av ett stipendium från Pasteur - Paris University (PPU) International Ph.D. Program.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
18 G x 1 ½ (1.2 mm x 38 mm) Agani needles Terumo AN*1838S1
15 mL tubes Falcon 352097
5 mL round bottom FACS tube with cell strainer cap 35 µm falcon 352235
50 mL tubes Falcon 352070
7-AAD BD pharmagen 559925
ACK Lysing Buffer Gibco A10492-01
APC anti-mouse CD117 (c-Kit) BioLegend 105812 Clone: 2B8
APC/Cyanine 7 anti-mouse CD16/32 (FcγR) BioLegend 101328 Clone: 93
BD FACSAria III BD Biosciences non-applicable
BD FACSDiva Software v8.0.1 BD Biosciences non-applicable
Bovine Serum Albumin  stock solution 10% Miltenyi Biotec 130-091-376
Cell staining buffer Biolegend 420201
CFI Suprplan Fluor ELWD 40XC ON 0.6 Nikon  non-applicable
CMOS camera Prime 95B 25 mm Photometrix non-applicable
Countess II FL Automated Cell Counter Invitrogen AMQAF1000
Countess cell counting chamber slide Invitrogen C10283
Coverglass 24 mm x 24 mm 0.13-0.17 mm Brand BR470819
Digitonine 5% Invitrogen BN2006
Disposable Scalpels  Swann-Morton  0508
DMEM (1x) + GlutaMAX-I Gibco 31966-021
DPBS (10x) Gibco 14200-067
DTT Sigma aldrich 646563
Epifluorescence inverted microscope Nikon Ti2 -E Nikon  non-applicable
Eppendorf Safe-Lock Tubes 0.5 mL Eppendorf 30123603
Ethanol 70% VWR 83801.290
FITC anti-mouse CD34 Invitrogen 11-0341-85 Clone: RAM34
Forceps for dissection FST 11152-10
Heat-inactivated Fetal Bovine Serum (FBS) Gibco 11533387
Dounce Homogeniser 2 mL Bellco glass 1984-10002 Pestle “A” Large Clearance: .0030-.0050″ and Pestle “B” Small Clearance: .0005-.0025″
LIVE/DEAD fixable aqua dead cell stain kit Invitrogen L34957
Magnesium chloride solution 1 M Sigma aldrich M1028
Microcentrifuge  Eppendorf 5424R
Mounting medium Fluoromount-G  invitrogen 00-4958-02
Nonidet P40 substitute Sigma aldrich 74385
Nuclease free water ThermoFischer AM9932
Nuclei buffer 20x  10X Genomics 2000153/2000207
Nuclei isolation kit EZ prep Sigma Aldrich NUC-101
OneComp eBeads compensation beads Invitrogen 01-1111-41
Pacific Blue anti-mouse lineage cocktail
(including anti-mouse CD3, Ly-6G/Ly-6C, CD11b, CD45R/B220, TER-119)		 BioLegend 133310 Clones (in the same order as the antibodies listed): 17A2, RB6-8C5, M1/70, RA3-6B2, Ter-119
PCR Tube Strips 0.2 mL Eppendorf 951010022
PE anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) BioLegend 122507 Clone: E13-161.7
Petri dish 100 mm x 20 mm OPTILUX Falcon 353003
Ply-L-lysine 0.01% sterile-filtered suitable for cell culture Sigma P4707
Printed microscope slides 8 well 6 mm numbered Epredia ER-301B-CE24
Protein LoBind Tubes 1.5 mL Eppendorf 30108116
Recombinant Rnase inhibitor 5000 U Takara 2313A
Scissors for dissection FST 14090-09
Sodium chloride solution 5 M Sigma aldrich 59222C
Syringe filters, PES, 0.2 µm Fisher Scientific 15206869
Transparent nail polish  any non-applicable
Trizma Hydrochloride solution pH 7.4 Sigma aldrich T2194
Trypan Blue 0.4% gibco 15250061
Tween 20 Biorad  1662404
UltraPure Distilated Water Dnase/Rnase Free Invitrogen 10977-035

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Clark, S. J., et al. scNMT-seq enables joint profiling of chromatin accessibility DNA methylation and transcription in single cells. Nature Communications. 9 (1), 781 (2018).
  2. Lee, J., Hyeon, D. Y., Hwang, D. Single-cell multiomics: technologies and data analysis methods. Experimental & Molecular Medicine. 52 (9), 1428-1442 (2020).
  3. Cerrizuela, S., et al. High-throughput scNMT protocol for multiomics profiling of single cells from mouse brain and pancreatic organoids. STAR Protocols. 3 (3), 101555 (2022).
  4. Dimitriu, M. A., Lazar-Contes, I., Roszkowski, M., Mansuy, I. M. Single-cell multiomics techniques: From conception to applications. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 854317 (2022).
  5. Stoeckius, M., et al. Simultaneous epitope and transcriptome measurement in single cells. Nature Methods. 14 (9), 865-868 (2017).
  6. Cao, J., et al. Joint profiling of chromatin accessibility and gene expression in thousands of single cells. 361 (6409), Science. New York, N.Y. 1380-1385 (2018).
  7. Narayanan, A., et al. Nuclei Isolation from Fresh Frozen Brain Tumors for Single-Nucleus RNA-seq and ATAC-seq.Journal of Visualized Experiments. JoVE. 162, 61542 (2020).
  8. Kim, M., et al. Single-nucleus transcriptomics reveals functional compartmentalization in syncytial skeletal muscle cells. Nature Communications. 11 (1), 6375 (2020).
  9. Santos, M. D., et al. Extraction and sequencing of single nuclei from murine skeletal muscles. STAR Protocols. 2 (3), 100694 (2021).
  10. Safabakhsh, S., et al. Isolating nuclei from frozen human heart tissue for single-nucleus RNA sequencing. Current Protocols. 2 (7), (2022).
  11. Lau, S. -F., Cao, H., Fu, A. K. Y., Ip, N. Y. Single-nucleus transcriptome analysis reveals dysregulation of angiogenic endothelial cells and neuroprotective glia in Alzheimer's disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (41), 25800-25809 (2020).
  12. Armand, E. J., Li, J., Xie, F., Luo, C., Mukamel, E. A. Single-cell sequencing of brain cell transcriptomes and epigenomes. Neuron. 109 (1), 11-26 (2021).
  13. Morabito, S., et al. Single-nucleus chromatin accessibility and transcriptomic characterization of Alzheimer's disease. Nature Genetics. 53 (8), 1143-1155 (2021).
  14. Chen, S., et al. Spatially resolved transcriptomics reveals genes associated with the vulnerability of middle temporal gyrus in Alzheimer's disease. Acta Neuropathologica Communications. 10 (1), (2022).
  15. Paul, F., et al. Transcriptional heterogeneity and lineage commitment in myeloid progenitors. Cell. 163 (7), 1663-1677 (2015).
  16. Kaufmann, E., et al. BCG educates hematopoietic stem cells to generate protective innate immunity against tuberculosis. Cell. 172 (1-2), 176-190 (2018).
  17. Christ, A., et al. diet triggers NLRP3-dependent innate immune reprogramming. Cell. 172 (1-2), 162-175 (2018).
  18. Moorlag, S. J. C. F. M., et al. β-Glucan Induces protective trained immunity against mycobacterium tuberculosis infection: A key role for IL-1. Cell Reports. 31 (7), 107634 (2020).
  19. de Laval, B., et al. C/EBPβ-dependent epigenetic memory induces trained immunity in hematopoietic stem cells. Cell Stem Cell. 26 (5), 657-674 (2020).
  20. Renthal, W., et al. Characterization of human mosaic Rett syndrome brain tissue by single-nucleus RNA sequencing. Nature Neuroscience. 21 (12), 1670-1679 (2018).
  21. Yang, A. C., et al. A human brain vascular atlas reveals diverse mediators of Alzheimer's risk. Nature. 603 (7903), 885-892 (2022).
  22. Lee, D. R., Zhang, Y., Rhodes, C. T., Petros, T. J. Generation of single-cell and single-nuclei suspensions from embryonic and adult mouse brains. STAR Protocols. 4 (1), 101944 (2022).
  23. Corces, M. R., et al. Lineage-specific and single-cell chromatin accessibility charts human hematopoiesis and leukemia evolution. Nature Genetics. 48 (10), 1193-1203 (2016).
  24. Ranzoni, A. M., et al. Integrative single-cell RNA-seq and ATAC-seq analysis of human developmental hematopoiesis. Cell Stem Cell. 28 (3), 472-487 (2021).
  25. 10X Genomics Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression User Guide. Document Number CG000338 Rev F. At. , (2022).
  26. J,, et al. Microdissection of mouse brain into functionally and anatomically different regions. Journal of Visualized Experiments: JoVE. 168, 61941 (2021).
  27. 10X Genomics 10X Genomics Demonstrated Protocol - Nuclei Isolation for Single Cell Multiome ATAC + GEX sequencing (CG000365 - Rev C). At. , (2022).
  28. Haag, S., Murthy, A. Murine monocyte and macrophage culture. Bio-Protocol. 11 (6), (2021).
  29. Haque, A., Engel, J., Teichmann, S. A., Lönnberg, T. A practical guide to single-cell RNA-sequencing for biomedical research and clinical applications. Genome Medicine. 9 (1), (2017).
  30. Jiang, P. Quality control of single-cell RNA-seq. Methods in Molecular Biology. , Clifton, N.J. 1-9 (1935).
  31. Regan, C., Preall, J. Practical considerations for single-cell genomics. Current Protocols. 2 (8), (2022).
  32. 10X Genomics 10X Genomics Demonstrated Protocol - Nuclei Isolation for Single Cell ATAC Sequencing (CG000169 - Rev E). At. , (2022).
  33. 10X Genomics 10X Genomics Demonstrated Protocol - Nuclei Isolation from Complex Tissues for Single Cell Multiome. ATAC + Gene Expression Sequencing. (CG000375 - Rev C). At. , (2022).
  34. 10X Genomics 10X Genomics - Chromium Nuclei Isolation Kit (CG000505 - Rev A). AT. , (2022).
  35. Shomroni, O., et al. A novel single-cell RNA-sequencing approach and its applicability connecting genotype to phenotype in ageing disease. Scientific Reports. 12 (1), 4091 (2022).
  36. Ocañas, S. R., Pham, K. D., Blankenship, H. E., Machalinski, A. H., Chucair-Elliott, A. J., Freeman, W. M. Minimizing the ex vivo confounds of cell-isolation techniques on transcriptomic and translatomic profiles of purified microglia. 9 (2), 0348-0321 (2022).
  37. Gérard, A., et al. High-throughput single-cell activity-based screening and sequencing of antibodies using droplet microfluidics. Nature Biotechnology. 38 (6), 715-721 (2020).
  38. Vandereyken, K., Sifrim, A., Thienpont, B., Voet, T. Methods and applications for single-cell and spatial multi-omics. Nature Reviews. Genetics. 24, 494-515 (2023).

Tags

Denna månad i JoVE nummer 202
Högkvalitativ hjärn- och benmärgskärnförberedelse för Single Nuclei Multiome-analyser
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Moraes Cabé, C., Novault, S.,… More

Moraes Cabé, C., Novault, S., Jeemin Choi, A., Seffer, V., Barrio Cano, L., Libri, V., Hasan, M. High-Quality Brain and Bone Marrow Nuclei Preparation for Single Nuclei Multiome Assays. J. Vis. Exp. (202), e65715, doi:10.3791/65715 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter