Summary
העלייה של סמנים ביולוגיים מולקולריים להיבדק עבור סרטן ריאה לא קשקשי של תאים לא קטנים (NS-NSCLC) ניהול הטיפול הניע את הפיתוח של שיטות זיהוי מולקולרי מהיר ואמין. אנו מתארים זרימת עבודה להערכת שינויים גנומיים עבור חולי NS-NSCLC באמצעות גישת ריצוף הדור הבא (NGS) מהירה במיוחד.
Abstract
מספר השינויים המולקולריים שייבדקו לטיפול ממוקד בחולי סרטן ריאות מסוג תאים לא קטנים שאינם קשקשיים (NS-NSCLC) גדל משמעותית בשנים האחרונות. זיהוי הפרעות מולקולריות הוא הכרחי לטיפול מיטבי בחולי NS-NSCLC מתקדמים או גרורתיים, ומאפשר מתן טיפולים ממוקדים עם שיפור בהישרדות הכוללת. עם זאת, גידולים אלה מפתחים מנגנוני עמידות שעשויים להיות ממוקדים באמצעות טיפולים חדשניים. שינויים מולקולריים מסוימים יכולים גם לווסת את תגובת הטיפול. האפיון המולקולרי של NS-NSCLC צריך להתבצע בזמן אספקה קצר (TAT), תוך פחות מ-10 ימי עבודה, בהתאם להמלצות ההנחיות הבינלאומיות. בנוסף, מקורן של ביופסיות הרקמה לניתוח גנומי הוא מגוון, וגודלן הולך ופוחת עם התפתחות שיטות ופרוטוקולים פחות פולשניים. כתוצאה מכך, פתולוגים מאותגרים לבצע טכניקה מולקולרית יעילה תוך שמירה על אסטרטגיית אבחון יעילה ומהירה. במאמר זה, אנו מתארים את זרימת העבודה של ריצוף הדור הבא (NGS) המבוססת על אמפליקון מהיר במיוחד המשמשת בתרגול שגרתי יומיומי בעת האבחנה עבור חולי NS-NSCLC. הראינו כי מערכת זו מסוגלת לזהות את המטרות המולקולריות הנוכחיות המשמשות ברפואה מדויקת באונקולוגיה של בית החזה ב- TAT מתאים.
Introduction
במהלך העשור האחרון, הפיתוח של טיפולים ממוקדים ואימונותרפיה הגדיל באופן משמעותי את ההישרדות הכוללת (OS) של סרטן ריאות של תאים לא קטנים שאינם קשקשיים (NS-NSCLC)1,2. בהקשר זה, מספר הגנים ההכרחיים והמטרות המולקולריות לנתח בעת טיפול NS-NSCLC גדל בשנים האחרונות 3,4.
ההנחיות הבינלאומיות הנוכחיות ממליצות לבדוק EGFR, ALK, ROS1, BRAF, NTRK, RET ו- MET בעת אבחון NS-NSCLC5 מתקדם. יתר על כן, מכיוון שתרופות חדשות נתנו לאחרונה תוצאות מבטיחות מאוד בניסויים קליניים, שינויים גנומיים נוספים ייבדקו בקרוב במספר גנים נוספים, בעיקר KRAS ו- HER2, יחד עם BRAC1/BRAC2, PI3KA, NRG1 ו- NUT 6,7,8,9. בנוסף, מצבם של גנים קשורים שונים, כגון STK11, KEAP1 ו-TP53 עשוי להיות בעל עניין רב לחיזוי טוב יותר של התגובה או העמידות לטיפולים ממוקדים מסוימים ו/או מעכבי בקרה חיסונית (ICIs)10,11,12.
חשוב לציין, יש לדווח על השינויים המולקולריים ללא דיחוי משמעותי כדי להבטיח קבלת החלטות קלינית זהירה. היעדר אפיון מולקולרי של הגידול עלול להוביל להתחלת טיפולים לא ממוקדים כגון כימותרפיה עם/בלי אימונותרפיה, מה שיוביל לאסטרטגיית טיפול לא אופטימלית, שכן התגובה הכימותרפית מוגבלת בחולים עם שינויים מעשיים, כגון מוטציות EGFR או איחוי גנים13.
יתר על כן, הפיתוח הנוכחי של טיפולים ממוקדים / אימונותרפיה בסביבה ניאו-אדג'ובנטית ו / או אדג'ובנטית יכול להוביל לחיפוש שיטתי, לפחות, שינויים ב- EGFR ו- ALK בשלב מוקדם NS-NSCLC מכיוון ש- ICIs צריכים להינתן רק בגידולים מסוג פראי עבור EGFR ו- ALK14. כעת חובה גם לבדוק נוכחות של מוטציות EGFR בשלב מוקדם NS-NSCLC, שכן אוסימרטיניב (מעכב EGFR טירוזין קינאז מהדור השלישי) יכול לשמש כטיפול אדג'ובנטי ב- NS-NSCLC15 מוטנטי EGFR.
האסטרטגיה להערכת הסמנים הביולוגיים השונים בחיזוי התגובה לטיפולים ממוקדים שונים ו / או אימונותרפיה בחולי NS-NSCLC נעה במהירות, מה שהופך את זיהוי הסמנים הביולוגיים הללו לקשה ברצף 3,16. בהקשר זה, ריצוף הדור הבא (NGS) הוא כעת הגישה האופטימלית להערכה מקבילית בתפוקה גבוהה של שינויים גנטיים ב- NS-NSCLC 5,17.
עם זאת, זרימת עבודה של NGS עשויה להיות קשה לשליטה ועשויה להתבצע לזמן ארוך יותר של TAT18,19. לפיכך, מרכזים רבים עדיין מבצעים גישות רציפות (אימונוהיסטוכימיה (IHC), הכלאה פלואורסצנטית באתרו (FISH) ו / או ריצוף ממוקד). עם זאת, אסטרטגיה זו מוגבלת במקרה של גודל מדגם קטן, ומעל לכל, בגלל מספר גדל של מוטציות מעשיות הנדרשות להיבדק NS-NSCLC20. לפיכך, שיטות בדיקה מהירות ופשוטות במיוחד המאפשרות הערכה מהירה של שינויים גנטיים הפכו חשובות יותר ויותר לקבלת החלטות קליניות אופטימליות. יתר על כן, מערכות מאושרות ומוסמכות לבדיקות מולקולריות הופכות לחובה עבור מרשם של טיפולים ממוקדים ספציפיים.
כאן, אנו מתארים בדיקת DNA/RNA NGS מבוססת אמפליקון מהירה ואוטומטית במיוחד לבדיקה מולקולרית של NS-NSCLC המשמשת במעבדה לפתולוגיה קלינית וניסויית (LPCE), בית החולים האוניברסיטאי ניס, צרפת ומוסמכת על פי הנורמה ISO 15189 על ידי ועדת ההסמכה הצרפתית (COFRAC) (https://www.cofrac.fr/). ה- COFRAC מאשר כי המעבדה עומדת בדרישות התקן ISO 15189 וכללי היישום של COFRAC לפעילות בדיקה/כיול באנליזה מולקולרית ב- NGS אוטומטי על רצף עם הפאנל המבוצע על ידי המעבדה. הסמכה לפי התקן הבינלאומי המוכר ISO 15189 מדגימה את יכולתה הטכנית של המעבדה בהיקף מוגדר ואת פעולתה התקינה של מערכת ניהול מתאימה במעבדה זו. היתרונות והמגבלות של זרימת עבודה זו, החל מהכנת דגימות ביופסיית רקמות ועד לקבלת הדו"ח, נדונים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הנהלים אושרו על ידי ועדת האתיקה המקומית (Human Research Ethics Committee, Centre Hospitalier Universitaire de Nice, Tumorothèque BB-0033-00025). הסכמה מדעת התקבלה מכל החולים להשתמש בדגימות ובנתונים שנוצרו. כל הדגימות נלקחו מחולים שאובחנו עם NS-NSCLC ב- LPCE (ניס, צרפת) בין התאריכים 20 בספטמבר עד 31 בינואר 2022 כחלק מהטיפול הרפואי.
1. הכנת דגימות DNA ו-RNA מסוג FFPE באמצעות מכשיר טיהור אוטומטי (API) (זמן עיבוד: 5 שעות ו-15 דקות)
- הפעל פלניפיקציה על המכשיר.
- הפעל את המכשיר והיכנס באמצעות שם המשתמש והסיסמה (רשימת חומרים). צור תוכנית הפעלה לטיהור על-ידי לחיצה על הפעלה, לאחר מכן על הוסף תוכנית, ועל-ידי מתן שם לתוכנית ההפעלה.
- לאחר מכן, בחר את ערכת הטיהור והפרוטוקול המתאימים לטיהור רציף של DNA ו- RNA מדגימות משובצות פרפין קבועות פורמלין (FFPE). אפשר כימות לאחר טיהור.
- בחר את אמצעי האחסון הרצוי (50 μL) מהרשימה הנפתחת ולאחר מכן לחץ על הבא. בחר את מספר הדגימות שיחולצו.
- לאחר מכן בחר כל דוגמה, לחץ על ערוך, הזן מזהה לדוגמה ולאחר מכן לחץ על שמור.
- הכנת דגימות DNA ו-RNA מסוג FFPE באמצעות GPI
- הכינו דגימות רקמת FFPE (4 חתכי חיתוך של 10 מיקרומטר עם מיקרוטום) או בצעו מקרודיסקציה ישירות על בלוקי FFPE. מקם כל דגימת רקמת FFPE בצינורות עיבוד מדגם FFPE נפרדים ומזוהים (רשימת חומרים).
- צנטריפוגה ב 2000 x גרם למשך דקה אחת כדי לאסוף את הרקמה בתחתית הצינורות.
- יש להוסיף לכל צינור עיבוד מדגם FFPE תערובת אב לעיכול פרוטאז שהוכנה מערכת טיהור חומצות גרעין ולדגור בטמפרטורה של 60°C למשך 60 דקות לפחות (טבלת חומרים). לדגור את הדגימות ב 90 ° C במשך 60 דקות.
- לאחר הדגירה, תנו לדגימות להתקרר במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
- עבור כל צינור עיבוד דגימות FFPE, הרם את הצינור הפנימי, נעל אותו על ידי פנייה שמאלה, ולאחר מכן צנטריפואט את הדגימות ב 2000 x גרם למשך 10 דקות.
- פתח את הצינורות הפנימיים על ידי פנייה ימינה, הפרד אותם מהצינורות החיצוניים והשלך אותם. שמור את הדגימות בצינורות החיצוניים על קרח עד להעמסה על ה- API.
- הכינו תערובת אב לעיכול DNase והעמיסו אותה בצלחת טיהור FFPE DNA ו-RNA ממולאת מראש 2. לאחר מכן, טען את הדגימות המוכנות ב- FFPE DNA ו- RNA טיהור צלחת 1 (טבלה של חומרים).
- התחל את הפעלת הטיהור ב- API.
- במסך ה- API, לחץ על הפעל, בחר את הפעל תוכנית ולאחר מכן לחץ על הבא.
- עקוב אחר המחוונים שעל המסך כדי לטעון את ה- API עם החומרים המתכלים והריאגנטים הדרושים להפעלת הטיהור (רשימת חומרים).
- כאשר כל הריאגנטים נטענים, לחץ על הבא. סגור את דלת ה- API ולחץ על התחל.
- בסוף הריצה, לחץ על «פריקה» במסך המגע והסר מיד את צלחת ארכיון חומצות הגרעין 48 בארות המכילה את ה- DNA וה- RNA של הדגימה המטוהרים.
- יצא את תוצאות הכמות. אטמו את הצלחת ואחסנו דגימות מטוהרות בטמפרטורה של -80°C. מעבירים את צלחת הבאר 96 לרצף לניתוח.
- צור דוגמה וצור ריצה.
- פתח את התוכנה והיכנס אליה, ולאחר מכן בחר בשורת התפריטים דוגמאות ולחץ על צור דוגמה.
- הזן את שם הדגימה, מין ואחוז תאי הגידול, ומלא את השדות הנדרשים והשדות האופציונליים במידת הצורך.
- שמור את הפרטים (המין ואחוז תאי הגידול חשובים לניתוח גרסאות מספר העתק [CNVs]).
- בחרו 'הפעלות' ו'חומצת גרעין' כדי ליצור את שורת התפריטים.
- הזן את שם ההפעלה בשלב ההתקנה . לחץ על הבא.
- בחר assay בשלב Assays . לחץ על הבא.
- בחר את הדגימות בשלב דוגמאות כדי לפעול עם הבדיקה.
- לאחר מכן, בחלונית בדיקות שנבחרו , לחץ על הקצה. לחץ על הבא.
- סקור את מיקומי הדגימה בלוח הקלט לדוגמה. לחץ על הבא.
- סקור את סיכום תוכנית ההפעלה ולאחר מכן שמור והדפס או שמור.
2. NGS אוטומטי על הרצף (זמן עיבוד: 30 דקות)
- טען את צלחת הדגימה.
הערה: הריכוז האופטימלי של חומצות גרעין הוא 0.5 ננוגרם/מיקרוליטר. טווח הריכוז המאומת של חומצות גרעין הוא 0.33-1 ננוגרם/מיקרוליטר. עבור DNA ו-RNA, ריכוז של 1 ng/μL אומת במעבדה.- הרצף דורש נפח כולל של 20 μL. ודא שיש נפח מספיק לטעינת דגימה.
- הוסף בקרות חיוביות (DNA ו- RNA) ו- NTC (DNA ו- RNA) לשלב הראשון של מכשיר הטיהור מבלי לחלץ. השתמש בפקדי DNA ו- RNA עבור כל ריצה כדי לאמת את הריצה ולאמת את האצוות שבהן נעשה שימוש. הוסף פקדי DNA ו- RNA ללוח בסוף ריצת ה- API.
- טען את הרצף והתחל ריצה.
- מוציאים את כל הריאגנטים מהקופסאות שלהם במקרר או במקפיא ומפשירים ב-RT לפרק זמן מינימלי של 30 דקות (טבלת חומרים) ומקסימום 12 שעות.
- במעבדה, שמור על רצף תמיד מופעל בעקבות העצה שניתנה על ידי הספק במהלך ההדרכה באתר. היכנס למערכת.
- יש להעמיס את הצלחת ממכשיר הטיהור, המכיל דגימות, לאחר אטימת הצלחת ביריעת נייר אלומיניום PCR דביקה (טבלת חומרים).
- התקן את כל החומרים המתכלים בסיפון. הרצף מספק הוראות שלב אחר שלב לטעינת כל חומר מתכלה נדרש במיקום מסומן (Table of Materials).
- בדקו שאין משקעים בצינור 3 של הרצועה 2-HD. העבירו את הצינור או סובבו בעדינות את הרצועה כדי להמיס את המשקע במידת הצורך.
- רצועה 1 ורצועה 3 מכילות חרוזים מגנטיים. שלב זה הוא קריטי מאוד: לוודא כי החרוזים הם resuspended. לא אמורים להישאר חרוזים בחלק העליון של הצינור.
- הופכים את הרצועה לאחור 3-4 פעמים כדי להסיר את החרוזים. החזיקו את הרצועה בקצה אחד כשחותם הרצועה מכוון כלפי מעלה. לאחר מכן, הניפו במהירות את הרצועה כלפי מטה באמצעות תנועת זרוע צנטריפוגלית מהירה, וסיימו על ידי תנועה חדה של פרק כף היד.
- צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 15 שניות. חזור על הפעולה במידת הצורך. צנטריפוגו את הרצועות עם מתאמים ומחזיקי רצועות כדי למזער כשלים שנצפו באופן אקראי בקשר לשאריות של כדורים בחלק העליון של הרצועות.
- סגור את המערכת ולחץ על הבא. התקן את דלתות מפרץ ריאגנטים רצפים (טבלה של חומרים). סגור את הדלת. הרצף מתחיל את ההפעלה באופן אוטומטי.
- ניקוי
- לניקוי לאחר הריצה, לאחר השלמת הריצה, לחץ על הבא.
- הדלת נפתחת ברצף. בצע את ההוראות המופיעות על המסך כדי לרוקן את הפסולת ולהסיר את כל החומרים המתכלים. לחץ על הבא.
- סגור את החבילה בסיום, לחץ על הבא. ניקוי UV של 2 דקות מתחיל. הרצף מוכן להתחיל ריצה חדשה.
3. ניתוח התוצאות באמצעות התוכנה המשולבת (זמן ניתוח לפי מטופל [דגימות ADN ו-ARN]: 15 דקות)
הערה: הטכניקה מוכרת על ידי ועדת ההסמכה הצרפתית (COFRAC) ISO 15189 (https://www.cofrac.fr/)
- נתונים ותוצאות
- בחר תוצאת הפעלה או תוצאה לדוגמה בתפריט תוצאות . במסך תוצאות/הפעלת תוצאות , כל הריצות מפורטות.
- חפש ברשימת התוצאות על-ידי סינון בכותרת עמודה.
- לחץ על תוצאות ולחץ על תוצאות לדוגמה. לאחר מכן, לחץ על שם המדגם המעניין בעמודת שם המדגם כדי להציג תוצאות רצף עבור מדגם ייחודי.
- לחץ על עמודות בפינה הימנית העליונה של המסך או בטל את הבחירה בעמודות מהטבלה.
- הצג את תוצאות QC והצג את כיסוי האמפליקון.
- לחץ על הכרטיסיה QC במסך תוצאות .
- עבור DNA, ודא שההבדלים הזוגיים המוחלטים החציוניים (MAPD) הם בין 0 ל- 0.5 כדי לאמת את ניתוח גרסאות מספר ההעתקה (CNV). מספר הקריאות הממופות חייב להיות גדול מ-1.5 מיליון.
- עבור RNA, בדוק אם הקריאות הממופות הן בין 150,000 ל- 400,000. מתחת לזה, קיים סיכון לתוצאות שליליות שגויות, ומעבר לכך, קיים סיכון לתוצאות חיוביות שגויות.
- לחץ על שם לדוגמה כדי לפתוח את הכרטיסיה ממצאים עיקריים .
- גלול אל תרשימי כיסוי האמפליקון.
- סקור את גרפי הכיסוי. הגדר את הסף המינימלי לכיסוי האמפליקון, מכיוון שהספק אינו מספק אותו. כדי להגדיר טווח וסף, ערבב פקד ומדגם מסוג פראי (WT). לאחר מכן, שימו לב לערך הקטן ביותר של כיסוי האמפליקון עבור מוטציה נבחרת אחת או יותר.
- הצג תוצאות משתנות.
- כדי לייצא את הנתונים בתבנית טבלאית, לחץ על יצא בפינה השמאלית העליונה של המסך.
- כדי להציג את התוצאה של וריאנט נוקלאוטיד יחיד/וריאנט הכנסה-מחיקה (SNV/INDEL), לחץ/י על הכרטיסיה וריאנטים ולאחר מכן לחץ/י על SNVs/Indels. לחץ על ערוך מסננים ובחר ללא מסנן.
הערה: סף הרגישות הוגדר על 5% על פי המלצות קבוצת INCA (המכון הלאומי הצרפתי לסרטן) (https://www.e-cancer.fr/Professionnels-de-sante/Les-therapies-ciblees/Les-plateformes-de-genetique-moleculaire-des-cancers/Le-programme-d-assurance-qualite-des-plateformes). - הצגת תוצאות מיזוג והצגת גרסאות RNA Exon: לחץ/י על הכרטיסיה ״וריאנטים ״ ולאחר מכן לחץ/י על ״פיוזים״.
- בפינה השמאלית העליונה, לחץ על פריטים חזותיים ועל RNA Exon Variant ולאחר מכן סקור את התוויית RNA Exon Variants .
- בעזרת ערכה זו ניתן לזהות דילוג אקסון על הגנים EGFR, MET ו-AR . לחץ על פריט חזותי; קל יותר לנתח.
- הצגת חוסר איזון בהיתוך אריח RNA exon: לחץ/י על הכרטיסיה ״וריאנטים ״ ולאחר מכן לחץ/י על ״פיוזים״.
- בפינה השמאלית העליונה, לחץ/י על ״תצוגה חזותית וחוסר איזון במיזוג אריח RNA Exon״ ולאחר מכן עיין/י בתרשימי אי-איזון של אריח RNA Exon . מיזוג חוסר איזון הוא מיזוג בין שותף ידוע לבן זוג שאינו מכוסה על ידי הפאנל.
- הצג תוצאות CNV: לחץ על CNV בכרטיסייה וריאנטים כדי להציג את הנתונים.
הערה: יש צורך להיות ערניים עם התוצאות של CNV על ידי יידוע במהלך הכנת הדגימות של המין ואת אחוז תאי הגידול של המדגם. הגן AR נישא רק על ידי כרומוזום X . אם המין אינו מוגדר, המין הגברי עלול להיתקל בהפסדים, מה שיוביל לתוצאות חיוביות כוזבות אצל מטופלים גברים.
- סקור את תוצאות התוסף.
- סקירת תוצאות תוסף ניתוח כיסוי : בפינה השמאלית העליונה, לחץ ובחר הורדת קבצים.
- תוסף ניתוח הכיסוי יוצר דוח ניתוח כיסוי.
- סקירת תוצאות תוסף ניתוח כיסוי מולקולרי: בפינה השמאלית העליונה, לחץ ובחר קבצי הורדה. ניתוח זה מוודא אם כל האמפליקונים מכוסים ומאשר את תוצאות גרסאות מספר ההעתקה (CNV) שסופקו על ידי התוכנה.
- הצגת מדדי assay ודוח ההפעלה
- לחץ על הכרטיסיה הפעל דוח בסיכום הפעלה.
- כדי להציג את הפעל דוח, בחר באפשרות בחר דוגמה בתפריט הנפתח.
- מדדי Assay ודוח ההפעלה: מצא את מדדי הרצף בחלק העליון של המסך, ולאחר מכן את המדדים הספציפיים למדגם בטבלה Run Samples .
הערה: מידע בקובץ ארכיון תמיכת הלקוחות (CSA) יכול לסייע בפתרון בעיות בתוצאות, אך לא ניתן לנתח אותן ישירות. קבצי CSA מסכמים את הנתונים של כל נתוני ההפעלה ומדגישים את הגורמים לבעיה במקרה של הפעלה כושלת. - הורדת דוח הפעלה: לחץ/י על הכרטיסיה ״דוחות ״.
- לחץ על הורד דוח כדי להוריד סיכום דוח הפעלה בתבנית PDF.
- הפקת דוח וריאנטים.
- אפשר הפקת דוח בשלב ההתקנה כדי ליצור באופן אוטומטי דוח משתנה עבור כל דגימה במהלך ניתוח נתונים של ריצה.
- לאחר הפקת דוח הווריאנט עבור מדגם, המערכת הופכת את הדוח לזמין בשני מקומות: ראשית, קישור זמין במסך תוצאות/תוצאות מדגם . לחצו על הקישור להורדת קובץ PDF.
- שנית, עבור לחלונית דוח וריאנט בכרטיסייה דוחות ולחץ על הלחצן הורד דוח . חתמו על דוחות הווריאנטים באופן אלקטרוני או ידני.
הערה: דוחות חתומים אלקטרונית כוללים (חתום) אחרי שם הדגימה במסך תוצאות לדוגמה .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
באמצעות ההליך המוצג כאן, המתואר בפירוט בפרסומים האחרונים שלנו21, פיתחנו זרימת עבודה אופטימלית להערכת שינוי מולקולרי כבדיקת רפלקס בפרקטיקה קלינית שגרתית לאבחון בחולים עם NS-NSCLC באמצעות גישת ריצוף הדור הבא מבוססת אמפליקון מהיר במיוחד. תהליך העבודה המולקולרי של השיטה מוצג באיור 1. רשימת הגנים הכלולים בפאנל מוצגת באיור משלים 1.
אנליזה מולקולרית בוצעה ב-259 חולים עם NS-NSCLC. הוא כלל 153 ביופסיות סימפונות, 47 ביופסיות טרנס-חזה, 39 דגימות כירורגיות ו-25 בלוקים של תאים מ-13 אפילציה פלאורלית ו-7 EBUS (טבלה 1). הגנים המוטנטיים הבאים נצפו ב-242 ניתוחי NGS DNA/RNA תקפים או זמינים: KRAS (25.4%), EGFR (18.2%), BRAF (6.3%), ERBB2 (1.7%) ו-MET (1.7%). איחוי הגנים הבאים דווח: ALK (4.3%), ROS1 (2.3%), RET (1.9%) ו- NTRK (0.8%). השינויים הבאים זוהו עם שכיחות נמוכה מ-1% (למשל, IDH1, CDKN2A, FGFR3, KIT, MTOR, FGFR4. NTRK3, NRAS, PIK3CA, IDH2, ERBB3, ERBB4, AR, CHECK2, SMO, PTEN). עבור DNA, 10 מקרים (4%) נכשלו, בעוד 5 מקרים (2%) נכשלו עבור RNA. הכשל נבע מאיכות ירודה של DNA/RNA ו/או כמות נמוכה של DNA/RNA. ניתוח כושל התרחש רק עם דגימות בעלות פחות מ -10% תאים סרטניים. לכן, הגדרנו את חתך התאיות של הגידול ב-10%. עבור תוצאות DNA NGS, 10 מקרים (4%) לא חלפו בגלל האיכות הנמוכה של חומצות גרעין (6 מקרים) או כמויות לא מספיקות של חומצות גרעין (4 מקרים עם <13 ננוגרם של DNA). באופן דומה, חמישה מקרים (2%) נכשלו בתוצאות ריצוף RNA הן בשל איכות RNA לקויה והן בשל כמות נמוכה של RNA (<13 ng של RNA). השיעור הממוצע של תאי הגידול במקרים הלא מוצלחים היה מוגבל (15%, נע בין 10% ל-20%), בניגוד למקרים המוצלחים שבהם אחוז תאי הגידול נע בין 30% ל-90%. מבין 15 הדגימות הכושלות, 11 מקורן בביופסיות של רקמות קטנות (בשטח ממוצע של 2 מ"מ2), ואילו 4 היו דגימות ציטולוגיות (כגון אולטרסאונד אנדוברונכיאלי [EBUS]).
הרגישות של השיטה לזיהוי SNV ו- INDELs הייתה 93.44%, עבור CNV הייתה 100%, ועבור איחוי הייתה 91.67% עם תכולת תאי גידול מינימלית של 10% (טבלה 1).
ה-TAT הממוצע מדגימת אנדוסקופיה מהדו"ח המולקולרי היה 72 שעות (טווח: 48-96 שעות), עם TAT ממוצע ממיצוי לדיווח של 24 שעות.
האימות האנליטי של זרימת העבודה המתוארת לעיל של NGS בוצע ב- 30 מקרי NS-NSCLC. התיקוף הוכיח התאמה של 100% לשיטות תקן הזהב שהיו בשימוש בעבר במרכז שלנו ופורטו בפירוט בפרסום המקורי21: בדיקת מוטציה RT-PCR EGFR ; בדיקת מוטציה RT-PCR KRAS ; ALK IHC, ALK דגים; ROS1 IHC; ROS1 דג; BRAFV600E; ושיטות DNA/RNA NGS.
התהליך הרב-שלבי מהדגימה ועד לדיווח המולקולרי של אדנוקרצינומה ריאתית מוטנטית ב-EGFR/TP53 מוצג באיור 2. ייצוג המוטציה שנמצאה בדגימת הביופסיה באמצעות תוכנת הצופה הגנומי האינטגרטיבי (IGV) מוצג באיור משלים 2. דוגמה לדוח שהופק מתוכנת הדיווח מוצגת באיור משלים 3.
איור 1: דיאגרמה של זרימת העבודה של הלוח ששימשה במחקר זה. נתון זה שונה באישור Ilié et al.21. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: שלבים מרובים מהדגימה לדוח הביולוגיה המולקולרית. (A) שלוש דגימות ביופסיה של הסימפונות שהתקבלו במעבדה מחדר האנדוסקופיה. (B) שקופית המוכתמת בהמטוקסילין/אאוסין/ספרן של דגימת ביופסיית הסימפונות המראה אדנוקרצינומה ריאתית עם כ-40%-50% מתאי הגידול (הגדלה פי 100). (C) דיווח מתוכנת הדיווח המציג מוטציה ב-EGFR הקשורה למוטציה TP53 בדגימת הגידול. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
| סה"כ מספר חולים | 259 |
| ביופסיות סימפונות | 153 |
| ביופסיות טרנס-חזיות | 47 |
| דגימות כירורגיות | 39 |
| התפשטות פלאורלית | 13 |
| EBUS | 7 |
| גנים מוטנטיים מניעים | |
| קראס | 25.40% |
| EGFR | 18.20% |
| בראף | 6.30% |
| ERBB2 | 1.70% |
| פגשתי | 1.70% |
| איחוי גנים | |
| ALK | 4.30% |
| ROS1 | 2.30% |
| רט | 1.95% |
| NTRK | 0.80% |
| כישלון - מקרי DNA | 10 מקרים (4%) |
| כשל - מקרי RNA | 5 מקרים (2%) |
| חיתוך תאי הגידול | 10% |
| טווח אחוזים של תאי גידול במקרים שנכשלו | 10%–20% |
| טווח אחוזים של תאי גידול במקרים מוצלחים | 30%–90% |
| רגישות השיטה | |
| איתור SNV ו- INDELs | 93.44% |
| איתור CNV | 100% |
| איתור איחוי | 91.67% |
טבלה 1: תוצאות אנליזה מולקולרית. אנליזה מולקולרית בוצעה ב-259 חולים עם NS-NSCLC, כולל 153 ביופסיות סימפונות, 47 ביופסיות טרנס-חזה, 39 דגימות כירורגיות ו-25 תאי בלוקים מ-13 אפילציה פלאורלית ו-7 EBUS.
איור משלים 1: הגנים הכלולים בלוח GX של בדיקת דיוק אונקומינים של NGS. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
תרשים משלים 2: ייצוג קריאות ומוטציות שנוצרו בדגימת הביופסיה באמצעות תוכנת IGV. (A) גן EGFR ו-(B) גן TP53 . אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
תרשים משלים 3: דוח מולקולרי שנוצר על-ידי תוכנת הדיווח. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פיתוח גישת NGS מבוססת אמפליקון אולטרה-מהיר כבדיקת רפלקס להערכת שינויים מולקולריים בעת אבחון של כל שלב NS-NSLC היא אפשרות אופטימלית לזיהוי כל הסמנים הביולוגיים המומלצים והמתפתחים ב- NS-NSCLC 5,22,23. בעוד ששיטות רציפות (IHC, PCR, FISH) מתמקדות רק בגנים ספציפיים ויכולות לגרום לתשישות חומרי רקמות, זרימת עבודה זו של NGS מאפשרת הערכה ספציפית ורגישה של מצבם של 50 גנים, כולל מוטציות, איחוי והגברה, אפילו עם כמות נמוכה של חומצת גרעין (מינימום 13 ננוגרם לכל ריצוף DNA ו- RNA על פי מחקר זה).
בנוסף, שיטה זו מספקת תוצאות מהירות ורלוונטיות לניהול חולים עם NS-NSCLC. לעומת גישה מותאמת אישית, היעדר בחירה ראשונית של מקרים לניתוח, בהתאם לשלב הגידול, וללא המתנה לבקשת הרופא מאפשר להם לחסוך זמן יקר. בשורה זו, הוכח כי בדיקות NGS של NS-NSCLC מתקדם משפיעות ישירות על ההישרדות הכוללת של המטופל24,25. בנוסף, תוצאות מולקולריות אלה מתקבלות לעתים קרובות בו זמנית מתוצאות IHC, במיוחד להערכת אחוז תאי הגידול החיוביים PD-L126. הרופא יכול לקבל את "הפרופיל המולקולרי" של הגידול עם כל הסמנים הביולוגיים הדרושים לבחירה הטיפולית הטובה ביותר של טיפול קו ראשון27. במצבים ספציפיים, הרופא יכול לרשום את החולים לניסוי קליני על פי התוצאות הגנומיות 28,29,30,31.
ניתוח DNA ו-RNA עם הפאנל יכול להתבצע על 2-14 חולים בכל ריצה, למעט קבוצת ביקורת (1 ביקורת חיובית ו-1 שלילית). ניתן לבצע שלוש ריצות בשבוע, מה שאומר ש-42 חולים יכולים להפיק תועלת מפרופיל NGS מהיר במיוחד של הגידול שלהם. מערכת המטהרים, המבצעת מיצוי וכימות אוטומטיים לחלוטין של דנ"א ורנ"א לפני הכנת הספרייה, מאפשרת הערכה מהירה של היתכנות ניתוחי הריצוף.
היכולת לכמת את הדנ"א והרנ"א שחולצו לפני הכנת הספרייה, והאפשרות לעבוד עם כמויות קטנות של חומצת גרעין (החל ממינימום של 10 ננוגרם דנ"א או רנ"א, בהתאם למפרט) מאפשרת הערכה מהירה של כדאיות ניתוח הריצוף.
גישת NGS יכולה לסייע באופטימיזציה של ניהול זרימת העבודה של הדגימה באונקולוגיה של בית החזה על ידי היותה מקיפה יותר בזיהוי סמנים ביולוגיים הניתנים לפעולה. הוכח כי לשיטה מבוססת PCR יש מגבלות מהותיות באיתור כמה מוטציות נדירות, במיוחד מוטציות החדרת EGFR exon 2032. לפיכך, גישת ה- NGS מאפשרת לשיעור גבוה יותר של חולים לקבל טיפולים ממוקדי סמנים ביולוגיים. בהקשר זה, הוכח כי בדיקת רפלקס NGS עבור כל NS-NSCLC המתקדם היא חסכונית33. יתר על כן, מיצוי אוטומטי לחלוטין של חומצות גרעין, הכנת הספרייה וריצוף המשולבים במערכת NGS מבוססת אמפליקון זו חוסכים זמן משמעותי עבור צוות המעבדה.
עם זאת, יישום ריצוף אולטרה-מהיר של הדור הבא (NGS) כבדיקת רפלקס לאבחון NS-NSCLC עלול להיתקל באילוצים מסוימים בפרקטיקה הקלינית היומיומית. היקף פאנל הגנים (הכולל 50 גנים) קטן בהשוואה לפאנלים הנרחבים הכוללים כמה מאות גנים34. הפאנל כולל את כל הגנים המומלצים הקשורים לטיפול ממוקד באונקולוגיה של בית החזה. יתר על כן, כמה גנים מעניינים עם ערך פרוגנוסטי פוטנציאלי אינם נכללים. לדוגמה, KEAP1, STK11, SMARCA4 ו - RB1 אינם נוכחים בלוח המשמש בעבודה הנוכחית. גנים אלה יכולים להיות חשובים בעתיד לבחירת חולים שייהנו ממעכבי KRASG12C שאושרו על ידי ה- FDA sotorasib9. השימוש ב-NGS אולטרה-מהיר עם טכנולוגיית ריצוף אמפליקון עשוי גם להציג את הפוטנציאל להיעדר שותפים גנטיים נדירים של היתוך35. בנוסף, ניתוחי חוסר האיזון חשפו כמה סידורים מחדש של ALK חיוביים כוזבים בתחילה36. הסף לגילוי איחוי חוסר איזון ALK הוגדל בניסוי החדש ששונה. עם זאת, מומלץ לאמת תוצאה של חוסר איזון בטכניקה אורתוגונלית (IHC ו/או FISH).
מעל לכל, זרימת עבודה זו מעלה שאלות הקשורות לקיימות הכלכלית ואת ההחזר של מבחן NGS, אשר יכול להשתנות מאוד בהתאם למערכת הבריאות של המדינה, במיוחד באירופה37. עבור גישת עלות-תועלת, זה הכרחי כדי להפעיל מספיק דגימות בו זמנית כדי לשמור על מתכלים, אשר לפעמים לא אפשרי, כפי שהוא תלוי גיוס מדגםהמעבדה 35. כמו כן, יש לדון באפשרות ליצור עומס עבודה נוסף ומיותר לצוות המעבדה ולדרוש תקשורת טובה בין רופאים, מנתחים, פתולוגים וצוות טכני.
השימוש בו זמנית הן ב- DNA והן ב- RNA NGS הוא אידיאלי, אך נותר שנוי במחלוקת. בידיעה שרוב השינויים הגנומיים לטיפול ממוקד הם בלעדיים זה לזה38, ייתכן שניתן יהיה לבצע תחילה ניתוח ריצוף DNA ולאחר מכן RNA. עם זאת, אסטרטגיה זו תוביל כתוצאה מכך ל- TAT ארוך יותר להפקת דוח.
הלימות הכמות והאיכות של חומצות הגרעין המופקות עשויה להוות מגבלה בהבטחת החוסן של ניתוחי NGS, במיוחד במקרים הכוללים טכנולוגיית ריצוף לכידה היברידית ופאנלים נרחבים הדורשים כמות גבוהה יותר של חומר עם TAT6 גבוה יותר. בהקשר זה, מערכת NGS מבוססת אמפליקון זו מציעה את היתרון של דרישת 13 ננוגרם בלבד של DNA ו- RNA עבור הפאנל ויש לה שיעור כשל כולל נמוך מאוד. זה בעל ערך רב באונקולוגיה של בית החזה מכיוון שגודל הדגימות הולך וקטן 20,39,40.
האינדיקציות לבדיקות מולקולריות משתנות ללא הרף באונקולוגיה של בית החזה, ועבור שינויים גנטיים מסוימים, מומלצות כעת בהגדרות אדג'ובנטיות15. לדעתנו, קיימת סבירות גבוהה כי מספר טיפולים ממוקדים נוספים יצוצו לטיפול ב- NS-NSCLC בשלב מוקדם בפרקטיקה קלינית שגרתית, מה שמחזק את הצורך בחיפוש מיידי אחר סמנים ביולוגיים בעת האבחון. יחד, ההתקדמות הנוכחית ברפואה מדויקת בסרטן ריאות תעדיף באופן בלתי נמנע גישה אולטרה-מהירה של NGS המאפשרת פרופיל מולקולרי מקיף, מהיר וחוסך חומרים יותר של גידולים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
כריסטוף בונטו משתתף בפעילויות דוברים בתשלום ומקבל הטבות מ- Thermo Fisher Scientific. פול הופמן משתתף בפעילויות דוברים בתשלום ומקבל הטבות ומימון מחברת Thermo Fisher Scientific.
Acknowledgments
אנו מודים ל-Thermo Fisher Scientific שנתנו לנו את האפשרות להשתמש במכשיר ובחומרים שלהם.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 well hard shell plate clear | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | 4483354 | |
| Adhesive PCR Plate Foil | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | AB0626 | |
| AutoLys M tube | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | A38738 | FFPE sample processing tubes |
| Genexus Barcodes 1-32 HD | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | A40261 | |
| Genexus GX5 Chip and Genexus Coupler | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | A40269 | |
| Genexus Pipette Tips | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | A40266 | |
| Genexus Purification Instrument | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | A48148 | Automated purification instrument (API) |
| Genexus Sequencing Kit | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | A40271 | |
| Genexus Templating Strips 3-GX5 and 4 | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | A40263 | |
| Genexus Integrated Sequencer | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | A45727 | |
| Ion Torrent Genexus FFPE DNA/RNA Purification Combo Kit | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | A45539 | |
| Oncomine Precision Assay GX (OPA) Panel (included Strips 1 and 2-HD) | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | A46291 |
References
- Howlader, N., et al. The effect of advances in lung-cancer treatment on population mortality. New England Journal of Medicine. 383 (7), 640-649 (2020).
- Melosky, B., et al. The rapidly evolving landscape of novel targeted therapies in advanced non-small cell lung cancer. Lung Cancer. 160, 136-151 (2021).
- Hanna, N. H., et al. Therapy for stage IV non-small-cell lung cancer with driver alterations: ASCO and OH (CCO) joint guideline update. Journal of Clinical Oncology. 39 (9), 1040-1091 (2021).
- Kerr, K. M., et al. The evolving landscape of biomarker testing for non-small cell lung cancer in Europe. Lung Cancer. 154, 161-175 (2021).
- Mosele, F., et al. Recommendations for the use of next-generation sequencing (NGS) for patients with metastatic cancers: a report from the ESMO precision medicine working group. Annals of Oncology. 31 (11), 1491-1505 (2020).
- Kazdal, D., Hofman, V., Christopoulos, P., Ilié, M., Stenzinger, A., Hofman, P. Fusion-positive non-small cell lung carcinoma: Biological principles, clinical practice, and diagnostic implications. Genes Chromosomes and Cancer. 61 (5), 244-260 (2022).
- Li, B. T., et al. Trastuzumab deruxtecan in HER2 -mutant non-small-cell lung cancer. New England Journal of Medicine. 386 (3), 241-251 (2022).
- Bontoux, C., Hofman, V., Brest, P., Ilié, M., Mograbi, B., Hofman, P. Daily practice assessment of KRAS status in NSCLC patients: A new challenge for the thoracic pathologist is right around the corner. Cancers. 14 (7), 1628 (2022).
- Skoulidis, F., et al. Sotorasib for lung cancers with KRAS p.G12C mutation. New England Journal of Medicine. 384 (25), 2371-2381 (2021).
- Hellyer, J. A., et al. Impact of tumor suppressor gene co-mutations on differential response to EGFR TKI therapy in EGFR L858R and Exon 19 deletion lung cancer. Clinical Lung Cancer. 23 (3), 264-272 (2022).
- Mograbi, B., Heeke, S., Hofman, P. The importance of stk11/lkb1 assessment in non-small cell lung carcinomas. Diagnostics. 11 (2), 196 (2021).
- Nadal, E., et al. Two patients with advanced-stage lung adenocarcinoma with radiologic complete response to nivolumab treatment harboring an STK11/LKB1 mutation. JCO Precision Oncology. 4, 1239-1245 (2022).
- Smeltzer, M. P., et al. The international association for the study of lung cancer global survey on molecular testing in lung cancer. Journal of Thoracic Oncology. 15 (9), 1434-1448 (2020).
- Ahern, E., Solomon, B. J., Hui, R., Pavlakis, N., O'Byrne, K., Hughes, B. G. M. Neoadjuvant immunotherapy for non-small cell lung cancer: Right drugs, right patient, right time. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 9 (6), e002248 (2021).
- Wu, Y. -L., et al. Osimertinib in resected EGFR-mutated non-small-cell lung cancer. New England Journal of Medicine. 383 (18), 1711-1723 (2020).
- Hanna, N. H., et al. Therapy for stage IV non-small-cell lung cancer without driver alterations: ASCO and OH (CCO) joint guideline update. J Clin Oncol. 38 (14), 1608-1632 (2020).
- de Maglio, G., et al. The storm of NGS in NSCLC diagnostic-therapeutic pathway: How to sun the real clinical practice. Critical Reviews in Oncology/Hematology. 169, 103561 (2022).
- DiStasio, M., Chen, Y., Rangachari, D., Costa, D. B., Heher, Y. K., VanderLaan, P. A. Molecular testing turnaround time for non-small cell lung cancer in routine clinical practice confirms feasibility of CAP/IASLC/AMP guideline recommendations: A single-center analysis. Clinical Lung Cancer. 18 (5), e349-e356 (2017).
- Heeke, S., et al. Use of the ion PGM and the genereader NGS systems in daily routine practice for advanced lung adenocarcinoma patients: A practical point of view reporting a comparative study and assessment of 90 patients. Cancers. 10 (4), 88 (2018).
- Hofman, P. The challenges of evaluating predictive biomarkers using small biopsy tissue samples and liquid biopsies from non-small cell lung cancer patients. Journal of Thoracic Disease. 11, S57-S64 (2019).
- Ilié, M., et al. Setting up an ultra-fast next-generation sequencing approach as reflex testing at diagnosis of non-squamous non-small cell lung cancer; experience of a single center (LPCE, Nice, France). Cancers. 14 (9), 2258 (2022).
- Zacharias, M., et al. Reflex testing in non-small cell lung carcinoma using DNA-and RNA-based next-generation sequencing-a single-center experience. Translational Lung Cancer Research. 10 (11), 4221-4234 (2021).
- Miller, T. E., et al. Clinical utility of reflex testing using focused nextgeneration sequencing for management of patients with advanced lung adenocarcinoma. Journal of Clinical Pathology. 71 (12), 1108-1115 (2018).
- Al-Ahmadi, A., et al. Next generation sequencing of advanced non-small cell lung cancer: utilization based on race and impact on survival. Clinical Lung Cancer. 22 (1), 16.e1-22.e1 (2021).
- Kim, J. H., Yoon, S., Lee, D. H., Jang, S. J., Chun, S. M., Kim, S. W. Real-world utility of next-generation sequencing for targeted gene analysis and its application to treatment in lung adenocarcinoma. Cancer Medicine. 10 (10), 3197-3204 (2021).
- Sheffield, B. S., et al. Point of care molecular testing: Community-based rapid next-generation sequencing to support cancer care. Current Oncology. 29 (3), 1326-1334 (2022).
- Camidge, D. R., Doebele, R. C., Kerr, K. M. Comparing and contrasting predictive biomarkers for immunotherapy and targeted therapy of NSCLC. Nature Reviews Clinical Oncology. 16 (6), 341-355 (2019).
- Rosas, D., Raez, L. E., Russo, A., Rolfo, C. Neuregulin 1 gene (Nrg1). A potentially new targetable alteration for the treatment of lung cancer. Cancers. 13 (20), 5038 (2021).
- Shapiro, G. I., et al. A Phase 1 study of RO6870810, a novel bromodomain and extra-terminal protein inhibitor, in patients with NUT carcinoma, other solid tumours, or diffuse large B-cell lymphoma. British Journal of Cancer. 124 (4), 744-753 (2021).
- Schoenfeld, A. J., et al. The genomic landscape of SMARCA4 alterations and associations with outcomes in patients with lung cancer. Clinical Cancer Research. 26 (21), 5701-5708 (2021).
- Zhang, K., et al. Identification of deleterious NOTCH mutation as novel predictor to efficacious immunotherapy in NSCLC. Clinical Cancer Research. 26 (14), 3649-3661 (2020).
- Shen, C. I., et al. Real-world evidence of the intrinsic limitations of PCR-based EGFR mutation assay in non-small cell lung cancer. Scientific Reports. 12 (1), 13566 (2022).
- Zou, D., et al. Diagnostic value and cost-effectiveness of next-generation sequencing-based testing for treatment of patients with advanced/metastatic non-squamous non-small-cell lung cancer in the United States. Journal of Molecular Diagnostics. 24 (8), 901-914 (2022).
- Zhong, Y., Xu, F., Wu, J., Schubert, J., Li, M. M. Application of next generation sequencing in laboratory medicine. Annals of Laboratory Medicine. 41 (1), 25-43 (2020).
- Bruno, R., Fontanini, G. Next generation sequencing for gene fusion analysis in lung cancer: A literature review. Diagnostics. 10 (8), 521 (2020).
- Hofman, V., et al. Ultra-fast gene fusion assessment for non-squamous non-small cell lung cancer. JTO Clinical and Research Reports. 4 (2), 100457 (2022).
- Horgan, D., et al. Personalized medicine perspective identifying the steps required to effectively implement next-generation sequencing in oncology at a national level in Europe. Journal of Personalized Medicine. 12 (1), 72 (2022).
- Cohen, D., et al. Optimizing mutation and fusion detection in NSCLC by sequential DNA and RNA sequencing. Journal of Thoracic Oncology. 15 (6), 1000-1014 (2020).
- Goswami, R. S., et al. Identification of factors affecting the success of next-generation sequencing testing in solid tumors. American Journal of Clinical Pathology. 145 (2), 222-237 (2016).
- Ilie, M., Hofman, P. Pitfalls in Lung Cancer Molecular Pathology: How to Limit them in Routine Practice. Current Medicinal Chemistry. 19 (16), 2638-2651 (2012).
