Summary
Stigningen i molekylære biomarkører, der skal testes for ikke-pladeformet ikke-småcellet lungekræft (NS-NSCLC) plejestyring, har ført til udvikling af hurtige og pålidelige molekylære detektionsmetoder. Vi beskriver en arbejdsgang til genomisk ændringsvurdering for NS-NSCLC-patienter ved hjælp af en ultrahurtig næste generations sekventering (NGS) tilgang.
Abstract
Antallet af molekylære ændringer, der skal testes til målrettet behandling af ikke-pladeformede ikke-småcellet lungekræft (NS-NSCLC) patienter, er steget betydeligt de sidste par år. Påvisning af molekylære abnormiteter er obligatorisk for optimal pleje af avancerede eller metastatiske NS-NSCLC-patienter, hvilket gør det muligt at administrere målrettede terapier med en forbedring af den samlede overlevelse. Ikke desto mindre udvikler disse tumorer resistensmekanismer, der potentielt kan målrettes ved hjælp af nye terapier. Nogle molekylære ændringer kan også modulere behandlingsresponsen. Den molekylære karakterisering af NS-NSCLC skal udføres i en kort ekspeditionstid (TAT) på mindre end 10 arbejdsdage som anbefalet af de internationale retningslinjer. Derudover er oprindelsen af vævsbiopsier til genomisk analyse forskelligartet, og deres størrelse falder løbende med udviklingen af mindre invasive metoder og protokoller. Derfor udfordres patologer til at udføre effektive molekylære teknikker, samtidig med at de opretholder en effektiv og hurtig diagnosestrategi. Her beskriver vi den ultrahurtige ampliconbaserede næste generations sekventering (NGS) arbejdsgang, der anvendes i daglig rutinepraksis ved diagnose for NS-NSCLC-patienter. Vi viste, at dette system er i stand til at identificere de nuværende molekylære mål, der anvendes i præcisionsmedicin i thorax onkologi i en passende TAT.
Introduction
I løbet af det sidste årti har udviklingen af målrettede terapier og immunterapier signifikant øget den samlede overlevelse (OS) af ikke-pladeformet ikke-småcellet lungekræft (NS-NSCLC)1,2. I denne henseende er antallet af obligatoriske gener og molekylære mål, der skal analyseres ved behandling af NS-NSCLC, steget i løbet af de sidste par år 3,4.
Nuværende internationale retningslinjer anbefaler at teste EGFR, ALK, ROS1, BRAF, NTRK, RET og MET ved diagnosticering af avanceret NS-NSCLC5. Da nye lægemidler for nylig har givet meget lovende resultater i kliniske forsøg, vil yderligere genomiske ændringer desuden snart blive screenet i en række yderligere gener, især KRAS og HER2, sammen med BRAC1/BRAC2, PI3KA, NRG1 og NUT 6,7,8,9. Derudover kan status for forskellige associerede gener, såsom STK11, KEAP1 og TP53, være af stor interesse for en bedre forudsigelse af respons eller resistens over for nogle målrettede terapier og/eller immuncheckpointhæmmere (ICI'er)10,11,12.
Det er vigtigt, at de molekylære ændringer rapporteres uden væsentlig forsinkelse for at sikre omhyggelig klinisk beslutningstagning. Fraværet af molekylær karakterisering af en tumor kan føre til initiering af ikke-målrettede terapier såsom kemoterapi med/uden immunterapi, hvilket fører til en suboptimal behandlingsstrategi, da kemoterapirespons er begrænset hos patienter med handlingsrettede ændringer, såsom EGFR-mutationer eller genfusioner13.
Desuden kan den nuværende udvikling af målrettede terapier/immunterapier i neoadjuverende og/eller adjuverende miljøer føre til systematisk søgning efter i det mindste EGFR- og ALK-ændringer i NS-NSCLC i tidlige stadier, da ICI'er kun bør administreres i tumorer, der er vildtype for EGFR og ALK14. Det er nu også obligatorisk at teste for tilstedeværelsen af EGFR-mutationer i NS-NSCLC i tidlige stadier, da osimertinib (en tredje generations EGFR-tyrosinkinasehæmmer) kan anvendes som adjuverende behandling i EGFR-mutant NS-NSCLC 15.
Strategien for vurdering af de forskellige biomarkører til forudsigelse af respons på forskellige målrettede terapier og/eller immunterapier hos NS-NSCLC-patienter bevæger sig hurtigt, hvilket gør identifikationen af disse biomarkører sekventielt vanskelig 3,16. I denne henseende er Next-Generation Sequencing (NGS) nu den optimale tilgang til parallel vurdering af genændringer i NS-NSCLC 5,17 med høj kapacitet.
NGS-arbejdsgangen kan dog være vanskelig at mestre og kan føre til længere TAT 18,19. Således udfører mange centre stadig sekventielle tilgange (immunhistokemi (IHC), fluorescens in situ hybridisering (FISH) og / eller målrettet sekventering). Denne strategi er imidlertid begrænset i tilfælde af lille stikprøvestørrelse og frem for alt på grund af det øgede antal handlingsrettede mutationer, der skal testes i NS-NSCLC20. Således er ultrahurtige og enkle testmetoder, der muliggør hurtig vurdering af genændringer, blevet stadig vigtigere for optimal klinisk beslutningstagning. Desuden bliver godkendte og akkrediterede systemer til molekylær testning obligatoriske for ordination af specifikke målrettede terapier.
Her beskriver vi et ultrahurtigt og automatiseret ampliconbaseret DNA/RNA NGS-assay til molekylær test af NS-NSCLC, der anvendes i laboratoriet for klinisk og eksperimentel patologisk laboratorium (LPCE), Nice Universitetshospital, Frankrig og er akkrediteret i henhold til ISO 15189-normen af den franske akkrediteringskomité (COFRAC) (https://www.cofrac.fr/). COFRAC certificerer, at laboratoriet opfylder kravene i standarden ISO 15189 og COFRAC regler for anvendelse af test/kalibrering i molekylær analyse i automatiseret NGS på en sequencer med panelet udført af laboratoriet. Akkreditering i henhold til den anerkendte internationale standard ISO 15189 demonstrerer laboratoriets tekniske kompetence til et defineret omfang og korrekt drift af et passende styringssystem i dette laboratorium. Fordelene og begrænsningerne ved denne arbejdsgang, der starter fra forberedelsen af vævsbiopsiprøver til opnåelse af rapporten, diskuteres.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedurer er godkendt af den lokale etiske komité (Human Research Ethics Committee, Centre Hospitalier Universitaire de Nice, Tumorothèque BB-0033-00025). Der blev indhentet informeret samtykke fra alle patienter til at bruge prøver og genererede data. Alle prøver blev taget fra patienter diagnosticeret med NS-NSCLC i LPCE (Nice, Frankrig) mellem 20. september og 31. januar 2022 som en del af den medicinske behandling.
1. Forberedelse af FFPE DNA- og RNA-prøver ved hjælp af automatiseret oprensningsinstrument (API) (Behandlingstid: 5 timer og 15 min)
- Kør planificering på instrumentet.
- Tænd for instrumentet, og log ind med brugernavn og adgangskode (Materialefortegnelse). Opret en rensningskørselsplan ved at klikke på Kør, derefter Tilføj plan og ved at give kørselsplanen et navn.
- Vælg derefter det passende oprensningssæt og protokol til sekventiel rensning af DNA og RNA fra formalinfikserede paraffinindlejrede (FFPE) prøver. Aktivér kvantificering efter rensning.
- Vælg den ønskede elueringsvolumen (50 μL) på rullelisten, og klik derefter på Næste. Vælg antallet af prøver, der skal ekstraheres.
- Vælg derefter hvert eksempel, klik på Rediger, angiv Eksempel-id, og klik derefter på Gem.
- Forbered FFPE DNA- og RNA-prøver ved hjælp af GPI
- Forbered FFPE-vævsprøver (4 skæresektioner på 10 μm med et mikrotom) eller udfør makrodissektion direkte på FFPE-blokke. Anbring hver FFPE-vævsprøve i adskilte og identificerede FFPE-prøvebehandlingsrør (materialetabel).
- Der centrifugeres ved 2000 x g i 1 min for at opsamle vævet i bunden af glassene.
- Til hvert FFPE-prøvebehandlingsrør tilsættes en protease digest master-blanding fremstillet af et nukleinsyrerensningssæt og inkuberes ved 60 °C i mindst 60 minutter (materialetabel). Prøverne inkuberes ved 90 °C i 60 minutter.
- Efter inkubation afkøles prøverne i 5 minutter ved stuetemperatur (RT).
- For hvert FFPE-prøvebehandlingsrør løftes det indre rør, låses ved at dreje til venstre, og prøverne centrifugeres derefter ved 2000 x g i 10 minutter.
- Lås de indre rør op ved at dreje til højre, adskille dem fra de ydre rør og kassere dem. Opbevar prøverne i de ydre rør på is, indtil de lægges på API'en.
- Forbered en DNase-nedbrydningsmasterblanding og læg den i fyldt FFPE DNA- og RNA-oprensningsplade 2. Derefter indlæses de forberedte prøver i FFPE DNA- og RNA-oprensningsplade 1 (Materialetabel).
- Start rensningskørslen på API.
- Klik på Kør på API-skærmen, vælg Kør plan, og klik derefter på Næste.
- Følg indikationerne på skærmen for at indlæse API'en med de nødvendige forbrugsstoffer og reagenser, der er nødvendige for rensningskørslen (materialetabel).
- Når alle reagenserne er indlæst, skal du klikke på Næste. Luk API-døren, og klik på Start.
- I slutningen af kørslen skal du klikke på « losse » på berøringsskærmen og straks fjerne arkivpladen med 48-brønds nukleinsyre, der indeholder det rensede prøve-DNA og RNA.
- Eksportér kvantificeringsresultaterne. Pladen forsegles, og renseprøverne opbevares ved -80 °C. Overfør 96-brøndpladen til sequenceren, der skal analyseres.
- Opret et eksempel, og opret en kørsel.
- Åbn og log ind på softwaren, vælg derefter Eksempler på menulinjen, og klik på Opret eksempel.
- Indtast prøvens navn, køn og procentdel af tumorceller, og udfyld de krævede felter og valgfrie felter, hvis det er nødvendigt.
- Gem detaljerne (køn og procentdel af tumorceller er vigtige for analyse af kopinummervarianter [CNV'er]).
- Vælg Kørsler og nukleinsyre for at få resultatet på menulinjen.
- Angiv kørselsnavnet i trinnet Opsætning . Klik på Næste.
- Vælg assay i trinnet Assays . Klik på Næste.
- Vælg prøverne i trinnet Eksempler for at køre med analysen.
- Klik derefter på Tildel i ruden Valgte assays. Klik på Næste.
- Gennemse prøvepositionerne på prøveinputpladen. Klik på Næste.
- Gennemse oversigten over kørselsplanen, og vælg derefter Gem og udskriv eller Gem.
2. Automatiseret NGS på sequenceren (behandlingstid: 30 min)
- Ilæg prøvepladen.
BEMÆRK: Den optimale nukleinsyrekoncentration er 0,5 ng / μL. Det validerede nukleinsyrekoncentrationsområde er 0,33-1 ng/μL. For DNA og RNA blev 1 ng/μL koncentration valideret i laboratoriet.- Sequenceren kræver 20 μL totalvolumen. Sørg for, at der er tilstrækkelig volumen til prøvepåfyldning.
- Der tilsættes positive kontroller (DNA og RNA) og NTC (DNA og RNA) til 1. trin af oprensningsinstrumentet uden at blive ekstraheret. Brug DNA- og RNA-kontroller til hver kørsel for at validere kørslen og validere de anvendte batches. Føj DNA- og RNA-kontroller til pladen i slutningen af API-kørslen.
- Indlæs sequenceren og start et løb.
- Alle reagenserne tages ud af æskerne i køleskabet eller fryseren, og de tøes op ved RT i mindst 30 minutter (materialefortegnelse) og højst 12 timer.
- I laboratoriet skal sequenceren altid være tændt efter råd fra leverandøren under træningen på stedet. Log ind på systemet.
- Læg pladen fra rensningsinstrumentet, som indeholder prøver, efter forsegling af pladen med et ark klæbende PCR-pladefolie (materialetabel).
- Installer alle forbrugsstoffer i dækket. Sequenceren giver trinvise instruktioner til at indlæse hvert påkrævet forbrugsstof i en fremhævet position (materialetabel).
- Kontroller, at der ikke er udfældninger på rør 3 på strimlen 2-HD. Svip røret eller hvirvl forsigtigt strimlen for at opløse bundfaldet, hvis det er nødvendigt.
- Strip 1 og Strip 3 indeholder magnetiske perler. Dette trin er meget kritisk: Sørg for, at perlerne er ophængt igen. Der bør ikke være perler tilbage i den øverste del af røret.
- Vend strimlen på hovedet og tilbage 3-4 gange for at fjerne perlerne. Hold strimlen i den ene ende med strimlens tætning orienteret opad. Derefter svinges strimlen hurtigt nedad ved hjælp af en hurtig, centrifugal armbevægelse, og afslut med at give et skarpt svirp med håndleddet.
- Der centrifugeres ved 300 x g i 15 s. Gentag om nødvendigt. Centrifuger strimlerne med adaptere og stripholdere for at minimere fejl, der observeres tilfældigt i forbindelse med rester af kugler i den øverste del af strimlerne.
- Luk systemet, og klik på Næste. Installer sekventeringsreagensdørene (materialetabel). Luk døren. Sequenceren starter automatisk kørslen.
- Rensning
- For rengøring efter kørslen, når kørslen er færdig, skal du klikke på Næste.
- Døren åbnes successivt. Følg instruktionerne på skærmen for at tømme affaldet og fjerne alle forbrugsstoffer. Klik på Næste.
- Luk præsentationen, når du er færdig, klik på Næste. En 2 minutters UV-rengøring starter. Sequenceren er klar til at starte en ny kørsel.
3. Analyse af resultaterne ved hjælp af den integrerede software (Analysetid efter patient [prøver ADN og ARN]: 15 min)
BEMÆRK: Teknikken er akkrediteret af den franske akkrediteringskomité (COFRAC) ISO 15189 (https://www.cofrac.fr/)
- Data og resultater
- Vælg et kørselsresultat eller et eksempelresultat i menuen Resultater . På skærmbilledet Resultater/kørselsresultater vises alle kørsler.
- Søg på listen over resultater ved at filtrere i en kolonneoverskrift.
- Klik på Resultater , og klik på Eksempelresultater. Klik derefter på navnet på det pågældende eksempel i kolonnen Eksempelnavn for at få vist sekventeringsresultater for en entydig prøve.
- Klik på Kolonner i øverste venstre hjørne af skærmen, eller fravælg kolonnerne fra tabellen.
- Se QC-resultaterne, og se amplicon-dækningen.
- Klik på fanen QC på skærmbilledet Resultater .
- For DNA skal du sikre dig, at de mediane absolutte parvise forskelle (MAPD'er) er mellem 0 og 0,5 for at validere analysen af kopinummervarianter (CNV). De kortlagte læsninger skal være større end 1,5 millioner.
- For RNA skal du kontrollere, om de kortlagte aflæsninger er mellem 150.000 og 400.000. Under dette er der risiko for falske negativer, og ud over det er der risiko for falske positive.
- Klik på et eksempelnavn for at åbne fanen Nøgleresultater .
- Rul til amplicon dækningsgraferne.
- Gennemgå dækningsgraferne. Definer minimumstærsklen for amplicon dækning, da leverandøren ikke leverer den. Hvis du vil definere et interval og en tærskel, skal du blande en kontrolprøve og en prøve af vildtype (WT). Derefter observeres den mindste værdi af amplikondækningen for en eller flere udvalgte mutationer.
- Se variantresultater.
- Hvis du vil eksportere dataene i tabelformat, skal du klikke på Eksporter i øverste højre hjørne af skærmen.
- Hvis du vil se resultatet for SNV/INDEL (single nucleotid variant/insertion-deletion variant), skal du klikke på fanen Varianter og derefter klikke på SNV'er/Indels. Klik på Rediger filtre , og vælg Intet filter.
BEMÆRK: Følsomhedstærsklen er defineret til 5% i henhold til anbefalingerne fra INCA (French National Cancer Institute) gruppe (https://www.e-cancer.fr/Professionnels-de-sante/Les-therapies-ciblees/Les-plateformes-de-genetique-moleculaire-des-cancers/Le-programme-d-assurance-qualite-des-plateformes). - Se fusionsresultater , og se RNA Exon-varianter: Klik på fanen Varianter , og klik derefter på Fusioner.
- Klik på Visualisering og RNA Exon-variant øverst til højre, og gennemgå derefter plottet RNA Exon Variants .
- Med dette sæt kan exon spring over EGFR-, MET- og AR-generne detekteres. Klik på Visualisering; Det er lettere at analysere.
- Se RNA exon tile fusion ubalance: Klik på fanen Varianter , og klik derefter på Fusioner.
- Klik på Visualisering og RNA Exon Tile Fusion Imbalance øverst til højre, og gennemgå derefter RNA Exon Tile Fusion Imbalance-plottene . En ubalancefusion er en fusion mellem en kendt partner og en partner, der ikke er dækket af panelet.
- Se CNV-resultater: Klik på CNV'er på fanen Varianter for at få vist dataene.
BEMÆRK: Det er nødvendigt at være opmærksom på resultaterne af CNV ved at informere under forberedelsen af prøverne af kønnet og procentdelen af tumorceller i prøven. AR-genet bæres kun af X-kromosomet. Hvis kønnet ikke er specificeret, kan det mandlige køn støde på tab, hvilket fører til falske positive resultater hos mandlige patienter.
- Gennemgå plugin-resultater.
- Gennemgå plugin-resultater for dækningsanalyse : Klik øverst til højre, og vælg download filer.
- Pluginet Dækningsanalyse genererer en dækningsanalyserapport.
- Gennemgå molekylær dækningsanalyse plugin-resultater: Klik øverst til højre og vælg download filer. Denne analyse kontrollerer, om alle amplicons er dækket, og bekræfter resultaterne af kopinummervarianter (CNV'er), der leveres af softwaren.
- Få vist analysemetrics og kørselsrapporten
- Klik på fanen Kør rapport i kørselsoversigten.
- For at se kørselsrapporten skal du vælge indstillingen Vælg eksempel i rullemenuen.
- Assaymetrics og kørselsrapporten: Find sekventeringsmetrics øverst på skærmen efterfulgt af stikprøvespecifikke metrics i tabellen Kør eksempler .
BEMÆRK: Oplysninger i CSA-filen (Customer Support Archive) kan hjælpe med at foretage fejlfinding af resultater, men de kan ikke analyseres direkte. CSA-filerne opsummerer dataene for hele kørselsdataene og fremhæver årsagerne til et problem i tilfælde af en mislykket kørsel. - Download en kørselsrapport: Klik på fanen Rapporter .
- Klik på Download rapport for at downloade en kørselsrapportoversigt i PDF-format.
- Generer variantrapport.
- Aktivér Opret rapport i trinnet Opsætning for automatisk at generere en variantrapport for hvert eksempel under dataanalyse af en kørsel.
- Når du har genereret variantrapporten for en prøve, gør systemet rapporten tilgængelig to steder: Først gøres der et link tilgængeligt på skærmbilledet Resultater/prøveresultater . Klik på linket for at downloade PDF-filen.
- For det andet skal du gå til ruden Variantrapport på fanen Rapporter og klikke på knappen Download rapport . Underskriv variantrapporterne elektronisk eller manuelt.
BEMÆRK: Elektronisk signerede rapporter har (Log af) efter eksempelnavnet på skærmbilledet Eksempelresultater .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved hjælp af den procedure, der præsenteres her, beskrevet detaljeret i vores seneste publikationer21, udviklede vi en optimal arbejdsgang til vurdering af molekylær ændring som en reflekstest i rutinemæssigt udført klinisk praksis til diagnose hos patienter med NS-NSCLC ved hjælp af en ultrahurtig ampliconbaseret næste generations sekventeringsmetode. Metodens molekylære arbejdsgang er vist i figur 1. Listen over gener, der indgår i panelet, er vist i supplerende figur 1.
Molekylær analyse blev udført hos 259 patienter med NS-NSCLC. Det omfattede 153 bronchiale biopsier, 47 transthoracale biopsier, 39 kirurgiske prøver og 25 celleblokke fra 13 pleural effusion og 7 EBUS (tabel 1). Følgende drivermutantgener blev observeret i 242 gyldige eller tilgængelige NGS DNA/RNA-analyser: KRAS (25,4%), EGFR (18,2%), BRAF (6,3%), ERBB2 (1,7%) og MET (1,7%). Følgende genfusioner blev rapporteret: ALK (4,3 %), ROS1 (2,3 %), RET (1,9 %) og NTRK (0,8 %). Følgende ændringer blev påvist med en incidens under 1 % (f.eks. IDH1, CDKN2A, FGFR3, KIT, MTOR, FGFR4. NTRK3, NRAS, PIK3CA, IDH2, ERBB3, ERBB4, AR, CHECK2, SMO, PTEN). For DNA mislykkedes 10 tilfælde (4%), mens 5 tilfælde (2%) mislykkedes for RNA. Svigt skyldtes dårlig kvalitet af DNA / RNA og / eller lav mængde DNA / RNA. Mislykket analyse forekom kun med prøver med mindre end 10% tumorcellularitet. Således definerede vi tumorcellularitetsafskæringen ved 10%. For DNA NGS-resultater bestod 10 tilfælde (4%) ikke på grund af enten den lave kvalitet af nukleinsyrer (6 tilfælde) eller utilstrækkelige nukleinsyremængder (4 tilfælde med <13 ng DNA). Tilsvarende mislykkedes fem tilfælde (2%) for RNA-sekventeringsresultater på grund af både utilstrækkelig RNA-kvalitet og en lav mængde RNA (<13 ng RNA). Den gennemsnitlige andel af tumorceller i de mislykkede tilfælde var begrænset (15%, der spænder fra 10% til 20%), i modsætning til de vellykkede tilfælde, hvor tumorcelleprocenter varierede fra 30% til 90%. Blandt de 15 mislykkede prøver stammede 11 fra små vævsbiopsier (med et gennemsnitligt areal på 2 mm2), mens 4 var cytologiske prøver (såsom endobronchial ultralyd [EBUS]).
Følsomheden af metoden til påvisning af SNV'er og INDEL'er var 93,44%, for CNV'er var 100%, og for fusioner var 91,67% med et minimum tumorcelleindhold på 10% (tabel 1).
Den gennemsnitlige TAT fra endoskopiprøvetagning fra molekylrapporten var 72 timer (interval: 48-96 timer) med en gennemsnitlig TAT fra ekstraktion til rapport på 24 timer.
Den analytiske validering af det ovenfor beskrevne NGS-workflow blev udført på 30 NS-NSCLC-tilfælde. Valideringen demonstrerede 100% overensstemmelse med de guldstandardmetoder, der tidligere blev brugt på vores center og opført detaljeret i den originale publikation21: RT-PCR EGFR Mutation Test; RT-PCR KRAS MUTATIONSTEST; ALK IHC, ALK FISK; ROS1 IHC; ROS1 FISK; BRAFV600E; og DNA/RNA NGS-metoder.
Flertrinsproceduren fra prøveudtagning til molekylær rapport af et EGFR/TP53-mutant lungeadenokarcinom er afbildet i figur 2. Repræsentationen af mutationen fundet i biopsiprøven ved hjælp af IGV-software (integrativ genomisk fremviser) er vist i supplerende figur 2. Et eksempel på en genereret rapport fra rapporteringssoftwaren er vist i supplerende figur 3.
Figur 1: Diagram over panelets arbejdsgang, der bruges i denne undersøgelse. Dette tal er ændret med tilladelse fra Ilié et al.21. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Flere trin fra prøveudtagning til molekylærbiologisk rapport. (A) Tre bronkial biopsiprøver modtaget i laboratoriet fra endoskopirummet. (B) Hæmatoxylin / Eosin / Safra-farvet dias af bronchial biopsiprøven, der viser et lungeadenokarcinom med ca. 40% -50% tumorceller (100x forstørrelse). (C) Rapport fra rapporteringssoftwaren, der viser en EGFR-mutation forbundet med en TP53-mutation i tumorprøven. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Samlet antal patienter | 259 |
| Bronkial biopsier | 153 |
| Transthorax biopsier | 47 |
| Kirurgiske prøver | 39 |
| Pleural effusion | 13 |
| EBUS | 7 |
| Driver mutant gener | |
| KRAS | 25.40% |
| EGFR | 18.20% |
| BRAF | 6.30% |
| ERBB2 | 1.70% |
| MØDTE | 1.70% |
| Genfusioner | |
| ALK | 4.30% |
| ROS1 | 2.30% |
| RET | 1.95% |
| NTRK | 0.80% |
| Fejl - DNA-sager | 10 tilfælde (4 %) |
| Fejl - RNA-tilfælde | 5 tilfælde (2%) |
| Tumor cellularitet cut-off | 10% |
| Procentvis rækkevidde af tumorceller i de mislykkede tilfælde | 10%–20% |
| Procentvis rækkevidde af tumorceller i vellykkede tilfælde | 30%–90% |
| Metodens følsomhed | |
| Påvisning af SNV'er og INDEL'er | 93.44% |
| Påvisning af CNV'er | 100% |
| Påvisning af fusioner | 91.67% |
Tabel 1: Resultater af molekylær analyse. Molekylær analyse blev udført hos 259 patienter med NS-NSCLC, herunder 153 bronchiale biopsier, 47 transthoracale biopsier, 39 kirurgiske prøver og 25 celleblokke fra 13 pleural effusion og 7 EBUS.
Supplerende figur 1: Generne inkluderet i NGS oncomine præcisionsassay GX-panelet. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur 2: Repræsentation af genererede aflæsninger og mutationer fundet i biopsiprøven ved hjælp af IGV-software. A) EGFR-genet og B-TP53-genet. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur 3: Molekylær rapport genereret af rapporteringssoftwaren. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Udviklingen af en ultrahurtig ampliconbaseret NGS-tilgang som reflekstest til molekylær ændringsvurdering ved diagnose af ethvert trin NS-NSLC er en optimal mulighed for påvisning af alle retningslinjeanbefalede og nye biomarkører i NS-NSCLC 5,22,23. Mens sekventielle metoder (IHC, PCR, FISH) kun fokuserer på specifikke gener og kan resultere i udmattelse af vævsmateriale, tillader denne NGS-arbejdsgang en specifik og følsom evaluering af status for 50 gener, herunder mutationer, fusioner og amplifikationer, selv med en lav mængde nukleinsyre (minimum 13 ng for hver DNA- og RNA-sekventering ifølge denne undersøgelse).
Desuden giver denne metode hurtige og relevante resultater til behandling af patienter med NS-NSCLC. Sammenlignet med en skræddersyet tilgang giver fraværet af et indledende udvalg af sager, der skal analyseres, afhængigt af tumorstadiet og uden at vente på lægens anmodning, dem mulighed for at spare dyrebar tid. I denne linje har det vist sig, at NGS-test af avanceret NS-NSCLC direkte påvirker patientens samlede overlevelse24,25. Derudover opnås disse molekylære resultater ofte samtidigt fra IHC-resultaterne, især til evaluering af procentdelen af PD-L1-positive tumorceller26. Lægen kan få tumorens "molekylære profil" med alle de biomarkører, der kræves for det bedste terapeutiske valg af førstelinjebehandling27. I specifikke situationer kan lægen tilmelde patienterne til et klinisk forsøg i henhold til de genomiske resultater 28,29,30,31.
Både DNA- og RNA-analyse med panelet kan udføres på 2-14 patienter pr. kørsel, eksklusive kontroller (1 positiv og 1 negativ kontrol). Det er muligt at lave tre kørsler om ugen, hvilket betyder, at 42 patienter kan drage fordel af en ultrahurtig NGS-profilering af deres tumor. Oprensningssystemet, der udfører fuldautomatisk ekstraktion og kvantificering af DNA og RNA før biblioteksforberedelse, muliggør hurtig evaluering af gennemførligheden af sekventeringsanalyserne.
Evnen til at kvantificere det ekstraherede DNA og RNA før biblioteksforberedelse og muligheden for at arbejde med små mængder nukleinsyre (startende fra mindst 10 ng DNA eller RNA i henhold til specifikationerne) muliggør en hurtig vurdering af sekventeringsanalysens levedygtighed.
En NGS-tilgang kan hjælpe med at optimere styringen af prøvearbejdsgangen i thorax onkologi ved at være mere omfattende i påvisningen af handlingsmæssige biomarkører. Det har vist sig, at den PCR-baserede metode har iboende begrænsninger i påvisningen af nogle sjældne mutationer, især EGFR exon 20 insertionmutations 32. NGS-tilgangen gør det således muligt for en højere andel af patienterne at modtage biomarkørfokuserede terapier. I denne sammenhæng er det blevet påvist, at NGS-reflekstest for alle avancerede NS-NSCLC er omkostningseffektive33. Desuden er den fuldautomatiske nukleinsyreekstraktion, biblioteksforberedelse og sekventering integreret med dette ampliconbaserede NGS-system en betydelig tidsbesparelse for laboratoriepersonale.
Imidlertid kan implementering af ultrahurtig næste generations sekventering (NGS) som en reflekstest til diagnosticering af NS-NSCLC støde på visse begrænsninger i daglig klinisk praksis. Genpanelets omfang (der omfatter 50 gener) er færre sammenlignet med de omfattende paneler, der omfatter flere hundrede gener34. Panelet indeholder alle de anbefalede gener, der er forbundet med en målrettet terapi i thorax onkologi. Desuden er nogle gener af interesse med en potentiel prognostisk værdi ikke inkluderet. For eksempel er KEAP1, STK11, SMARCA4 og RB1 ikke til stede på det panel, der bruges i dette arbejde. Disse gener kan være vigtige i fremtiden for udvælgelsen af patienter til at drage fordel af de FDA-godkendte KRASG12C-hæmmere sotorasib9. Brugen af ultrahurtig NGS med amplicon sekventeringsteknologi kan også introducere potentialet for manglende sjældne fusionsgenpartnere35. Desuden afslørede ubalanceanalyserne nogle falsk positive ALK-omlægninger i første omgang36. Tærsklen for påvisning af ALK-ubalancefusioner blev forhøjet i det nye modificerede assay. Det anbefales dog at validere et ubalanceresultat med en ortogonal teknik (IHC og / eller FISH).
Frem for alt rejser denne arbejdsgang spørgsmål vedrørende den økonomiske bæredygtighed og godtgørelsen af NGS-testen, som kan variere meget afhængigt af landets sundhedssystem, især i Europa37. For omkostningseffektivitetstilgangen er det bydende nødvendigt at køre nok prøver på samme tid for at spare på forbrugsvarer, hvilket undertiden ikke er muligt, da det afhænger af prøverekrutteringen og laboratoriet35. Desuden bør muligheden for at generere en unødvendig ekstra arbejdsbyrde for laboratoriepersonalet diskuteres og kræver god kommunikation mellem læger, kirurger, patologer og teknisk personale.
Samtidig brug af både DNA og RNA NGS er ideel, men forbliver diskutabel. Når man ved, at de fleste genomiske ændringer til målrettet terapi udelukker hinanden38, kan det være muligt først at udføre DNA- og derefter RNA-sekventeringsanalyse. Denne strategi vil imidlertid føre til en længere TAT til at generere en rapport.
Tilstrækkeligheden af både mængden og kvaliteten af ekstraherede nukleinsyrer kan udgøre en begrænsning med hensyn til at sikre NGS-analysernes robusthed, især i tilfælde, der involverer hybrid capture-sekventeringsteknologi og omfattende paneler, der kræver en større mængde materiale med højere TAT6. I denne henseende tilbyder dette ampliconbaserede NGS-system fordelen ved kun at kræve 13 ng DNA og RNA til panelet og har en meget lav samlet fejlrate. Dette er meget værdifuldt i thorax onkologi, da størrelsen af prøver bliver mindre og mindre 20,39,40.
Indikationerne for molekylær testning ændrer sig løbende i thorax onkologi og anbefales nu i adjuverende indstillinger15. Efter vores mening er det meget sandsynligt, at der vil dukke flere yderligere målrettede terapier op til behandling af NS-NSCLC i tidlig fase i rutinemæssig klinisk praksis, hvilket forstærker behovet for straks at søge efter biomarkører ved diagnosen. Samlet set vil de nuværende fremskridt inden for præcisionsmedicin i lungekræft uundgåeligt favorisere en ultrahurtig NGS-tilgang, der muliggør en mere omfattende, hurtig og materialebesparende molekylær profilering af tumorer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Christophe Bontoux deltager i betalte højttaleraktiviteter og modtager fordele fra Thermo Fisher Scientific. Paul Hofman deltager i betalte højttaleraktiviteter og modtager fordele og finansiering fra Thermo Fisher Scientific.
Acknowledgments
Vi takker Thermo Fisher Scientific for at give os mulighed for at bruge deres enhed og materialer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 well hard shell plate clear | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | 4483354 | |
| Adhesive PCR Plate Foil | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | AB0626 | |
| AutoLys M tube | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | A38738 | FFPE sample processing tubes |
| Genexus Barcodes 1-32 HD | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | A40261 | |
| Genexus GX5 Chip and Genexus Coupler | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | A40269 | |
| Genexus Pipette Tips | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | A40266 | |
| Genexus Purification Instrument | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | A48148 | Automated purification instrument (API) |
| Genexus Sequencing Kit | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | A40271 | |
| Genexus Templating Strips 3-GX5 and 4 | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | A40263 | |
| Genexus Integrated Sequencer | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | A45727 | |
| Ion Torrent Genexus FFPE DNA/RNA Purification Combo Kit | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | A45539 | |
| Oncomine Precision Assay GX (OPA) Panel (included Strips 1 and 2-HD) | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | A46291 |
References
- Howlader, N., et al. The effect of advances in lung-cancer treatment on population mortality. New England Journal of Medicine. 383 (7), 640-649 (2020).
- Melosky, B., et al. The rapidly evolving landscape of novel targeted therapies in advanced non-small cell lung cancer. Lung Cancer. 160, 136-151 (2021).
- Hanna, N. H., et al. Therapy for stage IV non-small-cell lung cancer with driver alterations: ASCO and OH (CCO) joint guideline update. Journal of Clinical Oncology. 39 (9), 1040-1091 (2021).
- Kerr, K. M., et al. The evolving landscape of biomarker testing for non-small cell lung cancer in Europe. Lung Cancer. 154, 161-175 (2021).
- Mosele, F., et al. Recommendations for the use of next-generation sequencing (NGS) for patients with metastatic cancers: a report from the ESMO precision medicine working group. Annals of Oncology. 31 (11), 1491-1505 (2020).
- Kazdal, D., Hofman, V., Christopoulos, P., Ilié, M., Stenzinger, A., Hofman, P. Fusion-positive non-small cell lung carcinoma: Biological principles, clinical practice, and diagnostic implications. Genes Chromosomes and Cancer. 61 (5), 244-260 (2022).
- Li, B. T., et al. Trastuzumab deruxtecan in HER2 -mutant non-small-cell lung cancer. New England Journal of Medicine. 386 (3), 241-251 (2022).
- Bontoux, C., Hofman, V., Brest, P., Ilié, M., Mograbi, B., Hofman, P. Daily practice assessment of KRAS status in NSCLC patients: A new challenge for the thoracic pathologist is right around the corner. Cancers. 14 (7), 1628 (2022).
- Skoulidis, F., et al. Sotorasib for lung cancers with KRAS p.G12C mutation. New England Journal of Medicine. 384 (25), 2371-2381 (2021).
- Hellyer, J. A., et al. Impact of tumor suppressor gene co-mutations on differential response to EGFR TKI therapy in EGFR L858R and Exon 19 deletion lung cancer. Clinical Lung Cancer. 23 (3), 264-272 (2022).
- Mograbi, B., Heeke, S., Hofman, P. The importance of stk11/lkb1 assessment in non-small cell lung carcinomas. Diagnostics. 11 (2), 196 (2021).
- Nadal, E., et al. Two patients with advanced-stage lung adenocarcinoma with radiologic complete response to nivolumab treatment harboring an STK11/LKB1 mutation. JCO Precision Oncology. 4, 1239-1245 (2022).
- Smeltzer, M. P., et al. The international association for the study of lung cancer global survey on molecular testing in lung cancer. Journal of Thoracic Oncology. 15 (9), 1434-1448 (2020).
- Ahern, E., Solomon, B. J., Hui, R., Pavlakis, N., O'Byrne, K., Hughes, B. G. M. Neoadjuvant immunotherapy for non-small cell lung cancer: Right drugs, right patient, right time. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 9 (6), e002248 (2021).
- Wu, Y. -L., et al. Osimertinib in resected EGFR-mutated non-small-cell lung cancer. New England Journal of Medicine. 383 (18), 1711-1723 (2020).
- Hanna, N. H., et al. Therapy for stage IV non-small-cell lung cancer without driver alterations: ASCO and OH (CCO) joint guideline update. J Clin Oncol. 38 (14), 1608-1632 (2020).
- de Maglio, G., et al. The storm of NGS in NSCLC diagnostic-therapeutic pathway: How to sun the real clinical practice. Critical Reviews in Oncology/Hematology. 169, 103561 (2022).
- DiStasio, M., Chen, Y., Rangachari, D., Costa, D. B., Heher, Y. K., VanderLaan, P. A. Molecular testing turnaround time for non-small cell lung cancer in routine clinical practice confirms feasibility of CAP/IASLC/AMP guideline recommendations: A single-center analysis. Clinical Lung Cancer. 18 (5), e349-e356 (2017).
- Heeke, S., et al. Use of the ion PGM and the genereader NGS systems in daily routine practice for advanced lung adenocarcinoma patients: A practical point of view reporting a comparative study and assessment of 90 patients. Cancers. 10 (4), 88 (2018).
- Hofman, P. The challenges of evaluating predictive biomarkers using small biopsy tissue samples and liquid biopsies from non-small cell lung cancer patients. Journal of Thoracic Disease. 11, S57-S64 (2019).
- Ilié, M., et al. Setting up an ultra-fast next-generation sequencing approach as reflex testing at diagnosis of non-squamous non-small cell lung cancer; experience of a single center (LPCE, Nice, France). Cancers. 14 (9), 2258 (2022).
- Zacharias, M., et al. Reflex testing in non-small cell lung carcinoma using DNA-and RNA-based next-generation sequencing-a single-center experience. Translational Lung Cancer Research. 10 (11), 4221-4234 (2021).
- Miller, T. E., et al. Clinical utility of reflex testing using focused nextgeneration sequencing for management of patients with advanced lung adenocarcinoma. Journal of Clinical Pathology. 71 (12), 1108-1115 (2018).
- Al-Ahmadi, A., et al. Next generation sequencing of advanced non-small cell lung cancer: utilization based on race and impact on survival. Clinical Lung Cancer. 22 (1), 16.e1-22.e1 (2021).
- Kim, J. H., Yoon, S., Lee, D. H., Jang, S. J., Chun, S. M., Kim, S. W. Real-world utility of next-generation sequencing for targeted gene analysis and its application to treatment in lung adenocarcinoma. Cancer Medicine. 10 (10), 3197-3204 (2021).
- Sheffield, B. S., et al. Point of care molecular testing: Community-based rapid next-generation sequencing to support cancer care. Current Oncology. 29 (3), 1326-1334 (2022).
- Camidge, D. R., Doebele, R. C., Kerr, K. M. Comparing and contrasting predictive biomarkers for immunotherapy and targeted therapy of NSCLC. Nature Reviews Clinical Oncology. 16 (6), 341-355 (2019).
- Rosas, D., Raez, L. E., Russo, A., Rolfo, C. Neuregulin 1 gene (Nrg1). A potentially new targetable alteration for the treatment of lung cancer. Cancers. 13 (20), 5038 (2021).
- Shapiro, G. I., et al. A Phase 1 study of RO6870810, a novel bromodomain and extra-terminal protein inhibitor, in patients with NUT carcinoma, other solid tumours, or diffuse large B-cell lymphoma. British Journal of Cancer. 124 (4), 744-753 (2021).
- Schoenfeld, A. J., et al. The genomic landscape of SMARCA4 alterations and associations with outcomes in patients with lung cancer. Clinical Cancer Research. 26 (21), 5701-5708 (2021).
- Zhang, K., et al. Identification of deleterious NOTCH mutation as novel predictor to efficacious immunotherapy in NSCLC. Clinical Cancer Research. 26 (14), 3649-3661 (2020).
- Shen, C. I., et al. Real-world evidence of the intrinsic limitations of PCR-based EGFR mutation assay in non-small cell lung cancer. Scientific Reports. 12 (1), 13566 (2022).
- Zou, D., et al. Diagnostic value and cost-effectiveness of next-generation sequencing-based testing for treatment of patients with advanced/metastatic non-squamous non-small-cell lung cancer in the United States. Journal of Molecular Diagnostics. 24 (8), 901-914 (2022).
- Zhong, Y., Xu, F., Wu, J., Schubert, J., Li, M. M. Application of next generation sequencing in laboratory medicine. Annals of Laboratory Medicine. 41 (1), 25-43 (2020).
- Bruno, R., Fontanini, G. Next generation sequencing for gene fusion analysis in lung cancer: A literature review. Diagnostics. 10 (8), 521 (2020).
- Hofman, V., et al. Ultra-fast gene fusion assessment for non-squamous non-small cell lung cancer. JTO Clinical and Research Reports. 4 (2), 100457 (2022).
- Horgan, D., et al. Personalized medicine perspective identifying the steps required to effectively implement next-generation sequencing in oncology at a national level in Europe. Journal of Personalized Medicine. 12 (1), 72 (2022).
- Cohen, D., et al. Optimizing mutation and fusion detection in NSCLC by sequential DNA and RNA sequencing. Journal of Thoracic Oncology. 15 (6), 1000-1014 (2020).
- Goswami, R. S., et al. Identification of factors affecting the success of next-generation sequencing testing in solid tumors. American Journal of Clinical Pathology. 145 (2), 222-237 (2016).
- Ilie, M., Hofman, P. Pitfalls in Lung Cancer Molecular Pathology: How to Limit them in Routine Practice. Current Medicinal Chemistry. 19 (16), 2638-2651 (2012).
