Summary
用于非鳞状非小细胞肺癌 （NS-NSCLC） 护理管理的分子生物标志物的增加促使了快速可靠的分子检测方法的发展。我们描述了使用超快速下一代测序 （NGS） 方法对 NS-NSCLC 患者进行基因组改变评估的工作流程。
Abstract
在过去几年中，用于非鳞状非小细胞肺癌 （NS-NSCLC） 患者靶向治疗的分子改变数量显着增加。对于晚期或转移性NS-NSCLC患者的最佳护理，必须检测分子异常，从而可以进行靶向治疗，从而改善总生存期。然而，这些肿瘤会产生耐药机制，这些机制可能使用新疗法靶向。一些分子改变也可以调节治疗反应。NS-NSCLC的分子表征必须在短时间内完成，在不到10个工作日的时间内完成，这是国际指南所建议的。此外，用于基因组分析的组织活检的来源是多种多样的，并且随着侵入性较小的方法和方案的发展，其尺寸不断减小。因此，病理学家面临的挑战是执行有效的分子技术，同时保持高效和快速的诊断策略。在这里，我们描述了基于超快速扩增子的下一代测序 （NGS） 工作流程，用于诊断 NS-NSCLC 患者的日常实践。我们发现，该系统能够在适当的TAT中识别当前用于胸部肿瘤学精准医学的分子靶点。
Introduction
在过去十年中，靶向和免疫疗法的发展显著提高了非鳞状非小细胞肺癌 （NS-NSCLC） 的总生存期 （OS）1,2。在这方面，在过去几年中，治疗NS-NSCLC时需要分析的强制性基因和分子靶点的数量有所增加3,4。
目前的国际指南建议在诊断晚期 NS-NSCLC5 时检测 EGFR、ALK、ROS1、BRAF、NTRK、RET 和 MET。此外，由于新药最近在临床试验中取得了非常有希望的结果，因此不久将在许多其他基因中筛选出额外的基因组改变，特别是KRAS和HER2，以及BRAC1/BRAC2，PI3KA，NRG1和NUT 6,7,8,9。此外，不同相关基因（如 STK11、KEAP1 和 TP53）的状态可能有助于更好地预测对某些靶向治疗和/或免疫检查点抑制剂 （ICI） 的反应或耐药性10,11,12。
重要的是，必须立即报告分子改变，以确保谨慎的临床决策。缺乏肿瘤的分子特征可能导致开始非靶向治疗，例如化疗联合/不联合免疫治疗，导致次优治疗策略，因为化疗反应在具有可操作改变的患者中受到限制，例如 EGFR 突变或基因融合13。
此外，目前在新辅助和/或辅助治疗中靶向治疗/免疫疗法的发展可能导致系统地寻找，至少在早期NS-NSCLC中寻找EGFR和ALK的改变，因为ICI应该只在EGFR和ALK14的野生型肿瘤中给药。由于奥希替尼（第三代EGFR酪氨酸激酶抑制剂）可用作EGFR突变NS-NSCLC的辅助治疗15，因此现在还必须检测早期NS-NSCLC中是否存在EGFR突变。
评估不同生物标志物以预测NS-NSCLC患者对不同靶向治疗和/或免疫治疗的反应的策略正在快速发展，这使得这些生物标志物的顺序识别变得困难3,16。在这方面，下一代测序 （NGS） 现在是 NS-NSCLC 5,17 中基因改变的高通量并行评估的最佳方法。
然而，NGS 工作流程可能难以掌握，并且可能需要更长的 TAT18,19。因此，许多中心仍然采用序贯方法（免疫组化 （IHC）、荧光原位杂交 （FISH） 和/或靶向测序）。然而，在样本量小的情况下，这种策略是有限的，最重要的是，因为在NS-NSCLC20中需要测试的可操作突变数量增加。因此，允许快速评估基因改变的超快速和直接的检测方法对于最佳临床决策变得越来越重要。此外，经批准和认可的分子检测系统正成为特定靶向治疗处方的强制性要求。
在这里，我们描述了一种用于NS-NSCLC分子检测的超快速和自动化的基于扩增子的DNA/RNA NGS测定，该测定用于法国尼斯大学医院临床和实验病理学实验室（LPCE），并根据ISO 15189标准获得法国认可委员会（COFRAC）（https://www.cofrac.fr/）的认可。COFRAC 证明该实验室符合标准 ISO 15189 和 COFRAC 应用规则的要求，即在实验室执行的测序仪上对自动 NGS 分子分析中的测试/校准活动进行测试/校准。根据公认的国际标准 ISO 15189 的认证证明了实验室在规定范围内的技术能力以及该实验室中适当管理体系的正确运行。讨论了该工作流程的优点和局限性，从组织活检样本的制备到获得报告。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
所有程序均已获得当地伦理委员会（人类研究伦理委员会，尼斯大学医院中心，Tumorothèque BB-0033-00025）的批准。获得所有患者的知情同意，使用样本和生成的数据。所有样本均来自2022年9月20日至1月31日期间在LPCE（法国尼斯）诊断为NS-NSCLC的患者，作为医疗护理的一部分。
1. 使用自动纯化仪器（API）制备FFPE DNA和RNA样品（处理时间：5小时15分钟）
- 在仪器上运行平面化。
- 打开仪器电源并使用用户名和密码登录（材料表）。通过单击 “运行”，然后单击 “添加计划”，并为运行计划命名，创建净化运行计划。
- 然后，选择合适的纯化试剂盒和方案，从福尔马林固定石蜡包埋 （FFPE） 样品中顺序纯化 DNA 和 RNA。纯化后进行定量分析。
- 从下拉列表中选择所需的洗脱体积 （50 μL），然后单击 下一步。选择要提取的样本数。
- 然后选择每个样本，单击 “编辑”，输入 “样本 ID”，然后单击“ 保存”。
- 使用 GPI 制备 FFPE DNA 和 RNA 样品
- 制备FFPE组织样品（4个10μm的切片，切片机）或直接在FFPE块上进行宏观切割。将每个FFPE组织样品放入分离和鉴定的FFPE样品处理管（材料表）中。
- 以2000× g 离心1分钟以收集管底部的组织。
- 向每个FFPE样品处理管中加入由核酸纯化试剂盒制备的蛋白酶消化预混液，并在60°C下孵育至少60分钟（材料表）。将样品在90°C孵育60分钟。
- 孵育后，让样品在室温（RT）下冷却5分钟。
- 对于每个FFPE样品处理管，提起内管，向左转动将其锁定，然后以2000× g 离心样品10分钟。
- 右转解锁内胎，将它们与外胎分开，然后丢弃。将外管中的样品保持在冰上，直到加载到 API 上。
- 制备 DNase 消化预混液并将其加载到预填充的 FFPE DNA 和 RNA 纯化板 2 中。然后，将制备的样品加载到 FFPE DNA 和 RNA 纯化板 1（材料表）中。
- 在 API 上启动纯化运行。
- 在“API”屏幕上，单击“ 运行”，选择 “运行计划”，然后单击 “下一步”。
- 按照屏幕上的指示，将纯化运行所需的耗材和试剂加载到 API（材料表）。
- 加载完所有试剂后，单击 下一步。关闭 API 门，然后单击 启动。
- 运行结束时，单击触摸屏上的 “卸载” ，并立即取出含有纯化样品DNA和RNA的48孔核酸存档板。
- 导出定量结果。密封板并将纯化的样品储存在-80°C。 将96孔板转移到测序仪进行分析。
- 创建示例并创建运行。
- 打开并登录软件，然后在菜单栏中选择 “示例” ，然后单击 “创建示例”。
- 输入样本的名称、性别和肿瘤细胞百分比，并根据需要填写必填字段和可选字段。
- 保存详细信息（肿瘤细胞的性别和百分比对于分析拷贝数变异 [CNV] 很重要）。
- 在菜单栏中选择 Runs 和 Nucleic Acid to Result 。
- 在 “设置 ”步骤中输入运行名称。单击 “下一步”。
- 在 “检测 ”步骤中选择检测。单击 “下一步”。
- 在 “样品” 步骤中选择样品以与检测一起运行。
- 然后，在 “所选检测 ”窗格中，单击 “分配”。单击 “下一步”。
- 查看样品输入板上的样品位置。单击 “下一步”。
- 查看运行计划摘要，然后查看“ 保存并打印” 或“ 保存”。
2. 测序仪上的自动NGS（处理时间：30分钟）
- 装入样品板。
注：最佳核酸浓度为 0.5 ng/μL。经验证的核酸浓度范围为 0.33-1 ng/μL。对于 DNA 和 RNA，在实验室中验证了 1 ng/μL 浓度。- 测序仪需要 20 μL 总体积。确保有足够的体积用于样品加载。
- 将阳性对照（DNA 和 RNA）和 NTC（DNA 和 RNA）添加到纯化仪器的第一阶段，无需提取。对每次运行使用 DNA 和 RNA 对照来验证运行并验证使用的批次。在 API 运行结束时将 DNA 和 RNA 对照添加到板中。
- 加载音序器并开始运行。
- 从冰箱或冰柜的盒子中取出所有试剂，并在室温下解冻至少30分钟（材料表），最多12小时。
- 在实验室中，在现场培训期间，应按照供应商的建议始终打开测序仪。登录到系统。
- 用粘合剂PCR板箔（材料表）密封板后，从包含样品的纯化仪器中加载板。
- 在甲板上安装所有耗材。定序器提供分步说明，将每个必需的耗材加载到突出显示的位置（材料表）。
- 检查 Strip 2-HD 的管 3 上是否有沉淀。 如果需要，轻弹管或轻轻涡旋管以溶解沉淀物。
- 条带 1 和条带 3 包含磁珠。这一步非常关键：确保珠子被重新悬浮。管子的上部不应有珠子。
- 将条带倒置并倒置 3-4 次以取出珠子。握住条带的一端，条带密封件朝上。然后，使用快速的离心臂运动迅速向下摆动条带，然后用手腕猛烈一弹来完成。
- 以300× g 离心15秒。如果需要，重复上述步骤。用适配器和试纸夹离心试纸，以尽量减少与试纸上部球残留物相关的随机故障。
- 关闭系统，然后单击 下一步。安装测序试剂舱门（材料表）。关门。排序器自动开始运行。
- 清洗
- 若要在运行后进行清理，请在运行完成后单击 “下一步”。
- 门陆续打开。按照屏幕上的说明清空废物并取出所有耗材。单击 “下一步”。
- 完成后关闭甲板，单击 下一步。开始 2 分钟的紫外线清洁。排序器已准备好开始新的运行。
3. 使用集成软件分析结果（患者分析时间[样本 ADN 和 ARN]：15 分钟）
注意：该技术已获得法国认证委员会 （COFRAC） ISO 15189 （https://www.cofrac.fr/） 的认可
- 数据和结果
- 在 “结果” 菜单中选择运行结果或示例结果。在 “结果/运行结果” 屏幕中，将列出所有运行。
- 通过在列标题中进行筛选来搜索结果列表。
- 单击 “结果” ，然后单击 “示例结果”。然后，单击“样品名称”列中目标样品的名称，以查看唯一样品的测序结果。
- 单击屏幕左上角 的列 ，或从表格中取消选择列。
- 查看 QC 结果并查看扩增子覆盖率。
- 单击“结果”屏幕中的“QC”选项卡。
- 对于 DNA，确保中位绝对成对差异 （MAPAD） 介于 0 和 0.5 之间，以验证拷贝数变异 （CNV） 分析。映射的读取数必须大于 150 万。
- 对于 RNA，检查映射的读数是否在 150,000 到 400,000 之间。低于此值，存在漏报的风险，除此之外，还有误报的风险。
- 单击示例名称以打开 “关键发现 ”选项卡。
- 滚动到扩增子 覆盖图。
- 查看覆盖率图表。定义扩增子覆盖率的最小阈值，因为供应商不提供该阈值。若要定义范围和阈值，请混合对照和野生型 （WT） 样本。然后，观察一个或多个选定突变的扩增子覆盖率的最小值。
- 查看变体结果。
- 若要以表格格式导出数据，请单击屏幕右上角的 “导出 ”。
- 要查看单核苷变异/插入-缺失变异 （SNV/INDEL） 结果，请单击“ 变体 ”选项卡，然后单击“ SNV/插入缺失”。单击 “编辑过滤器 ”，然后选择 “无过滤器”。
注意：根据 INCA（法国国家癌症研究所）小组 （https://www.e-cancer.fr/Professionnels-de-sante/Les-therapies-ciblees/Les-plateformes-de-genetique-moleculaire-des-cancers/Le-programme-d-assurance-qualite-des-plateformes） 的建议，敏感性阈值已定义为 5%。 - 查看 融合 结果并查看 RNA 外显子变异：点按 “变异 ”标签，然后点按 “融合”。
- 在右上角，单击 可视化 和 RNA 外显子变体，然后查看 RNA 外显子变体 图。
- 使用该试剂盒，可以检测 EGFR、MET 和 AR 基因的外显子跳跃。单击可视化;它更容易分析。
- 查看 RNA 外显子瓦片融合不平衡：点按 “变体 ”选项卡，然后点按 “融合”。
- 在右上角，单击 可视化 和 RNA 外显子瓦片融合失衡，然后查看 RNA 外显子瓦片融合失衡 图。不平衡融合是已知伴侣与专家组未涵盖的伴侣之间的融合。
- 查看 CNV 结果：单击“变体”选项卡中的“CNV”以显示数据。
注意：有必要通过在制备样本期间告知性别和样本肿瘤细胞百分比的样本来警惕CNV的结果。 AR 基因仅由 X 染色体携带。如果未指定性别，男性可能会遇到损失，导致男性患者的假阳性结果。
- 查看插件结果。
- 查看 覆盖率分析 插件结果：点击右上角，选择下载文件。
- 覆盖率分析插件会生成覆盖率分析报告。
- 查看分子 覆盖率分析 插件结果：单击右上角，选择下载文件。该分析验证是否覆盖了所有扩增子，并确认了软件提供的拷贝数变异 （CNV） 结果。
- 查看检测指标和运行报告
- 单击“运行摘要”中的“运行报告”选项卡。
- 若要查看 “运行报告”，请在下拉菜单中选择 “选择示例 ”选项。
- 检测指标和运行报告：在屏幕顶部找到测序指标，然后在 “运行样品 ”表中找到特定于样品的指标。
注意：客户支持存档 （CSA） 文件中的信息可以帮助对结果进行故障排除，但无法直接分析它们。CSA 文件汇总了整个运行数据的数据，并在运行失败时突出显示了问题的原因。 - 下载运行报告：单击 “报告 ”选项卡。
- 单击 “下载报告 ”以下载 PDF 格式的运行报告摘要。
- 生成变体报告。
- 在“设置”步骤中启用“生成报告”，以在运行数据分析期间为每个样本自动生成变体报告。
- 为样本生成变体报告后，系统会在两个位置提供报告：首先，在 “结果/样品结果 ”屏幕中提供链接。单击链接下载 PDF。
- 其次，转到“报告”选项卡中的“变体报告”窗格，然后单击“下载报告”按钮。以电子方式或手动方式签署变体报告。
注意：电子签名报告在“样品结果”屏幕中的样品名称后面有（签字）。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
使用我们最近的出版物21 中详细描述的此处介绍的程序，我们开发了一种最佳工作流程，用于评估分子改变，作为常规临床实践中的反射测试，用于使用基于超快速扩增子的下一代测序方法诊断 NS-NSCLC 患者。该方法的分子工作流程如 图1所示。该组合中包含的基因列表如 补充图1所示。
对259例NS-NSCLC患者进行了分子分析。它包括 153 例支气管活检、47 例经胸活检、39 例手术标本和 25 例细胞阻滞，来自 13 例胸腔积液和 7 例 EBUS（表 1）。在 242 个有效或可用的 NGS DNA/RNA 分析中观察到以下驱动突变基因：KRAS （25.4%）、EGFR （18.2%）、BRAF （6.3%）、ERBB2 （1.7%） 和 MET （1.7%）。报告了以下基因融合：ALK （4.3%）、ROS1 （2.3%）、RET （1.9%） 和 NTRK （0.8%）。检测到发生率低于 1% 的以下改变（例如，IDH1、CDKN2A、FGFR3、KIT、MTOR、FGFR4。NTRK3、NRAS、PIK3CA、IDH2、ERBB3、ERBB4、AR、CHECK2、SMO、PTEN）。对于 DNA，10 例 （4%） 失败，而 5 例 （2%） 失败 RNA。失败是由于 DNA/RNA 质量差和/或 DNA/RNA 含量低。仅当肿瘤细胞数小于 10% 的样品时，分析失败。因此，我们将肿瘤细胞度临界值定义为 10%。DNA NGS结果中，10例（4%）因核酸质量低（6例）或核酸含量不足（4例DNA<13 ng）未通过。同样，由于RNA质量不足和RNA数量少（<13 ng RNA），5例（2%）的RNA测序结果失败。在未成功病例中，肿瘤细胞的平均比例有限（15%，范围从10%到20%），而成功病例的肿瘤细胞百分比在30%到90%之间。在 15 个失败样本中，11 个来自小组织活检（平均面积为 2 mm2），而 4 个是细胞学标本（如支气管内超声 [EBUS]）。
该方法检测SNVs和INDELs的灵敏度为93.44%，CNVs的灵敏度为100%，融合的灵敏度为91.67%，最小肿瘤细胞含量为10%（表1）。
从分子报告中取样的内窥镜采样的平均 TAT 为 72 小时（范围：48-96 小时），从提取到报告的平均 TAT 为 24 小时。
对30例NS-NSCLC病例进行了上述NGS工作流程的分析验证。验证结果表明，该方法与我们中心之前使用的金标准方法100%一致，并在原始出版物21中详细列出：RT-PCR EGFR 突变测试;RT-PCR KRAS 突变检测;ALK IHC，ALK 鱼;ROS1 免疫组化; ROS1 的鱼; 布拉夫V600E;和 DNA/RNA NGS 方法。
从取样到 EGFR/TP53 突变型肺腺癌的分子报告的多步骤过程如图 2 所示。使用综合基因组查看器（IGV）软件在活检样本中发现的突变表示如补充图2所示。从报告软件生成的报告示例如补充图 3 所示。
图 1：本研究中使用的面板工作流程图。 此图经 Ilié 等人许可进行了修改21。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 2：从采样到分子生物学报告的多个步骤。 （A） 实验室从内窥镜室收到的三个支气管活检样本。（B） 支气管活检样本的苏木精/伊红/赛峰染色载玻片，显示肺腺癌，肿瘤细胞约为 40%-50%（100 倍放大倍数）。（C） 来自报告软件的报告显示肿瘤样本中与 TP53 突变相关的 EGFR 突变。请点击这里查看此图的较大版本.
| 患者总数 | 259 |
| 支气管活检 | 153 |
| 经胸活检 | 47 |
| 手术标本 | 39 |
| 胸腔积液 | 13 |
| EBUS的 | 7 |
| 驱动突变基因 | |
| 克拉斯 | 25.40% |
| EGFR型 | 18.20% |
| 布拉夫 | 6.30% |
| ERBB2型 | 1.70% |
| 遇到 | 1.70% |
| 基因融合 | |
| 酒精含量 | 4.30% |
| ROS1的 | 2.30% |
| RET系列 | 1.95% |
| NTRK公司 | 0.80% |
| 失败 - DNA 案例 | 10 案例 （4%） |
| 失败 - RNA 案例 | 5 病例 （2%） |
| 肿瘤细胞截止值 | 10% |
| 失败病例中肿瘤细胞的百分比范围 | 10%–20% |
| 成功病例中肿瘤细胞的百分比范围 | 30%–90% |
| 方法的灵敏度 | |
| 检测 SNV 和 INDEL | 93.44% |
| CNV的检测 | 100% |
| 融合检测 | 91.67% |
表1：分子分析结果。 对 259 例 NS-NSCLC 患者进行了分子分析，包括 153 例支气管活检、47 例经胸活检、39 例手术标本和 13 例胸腔积液和 7 例 EBUS 的 25 个细胞阻滞。
补充图1：NGS肿瘤精密检测GXpanel中包含的基因。请点击这里下载此文件。
补充图2：使用IGV软件表示在活检样本中发现的生成读数和突变。 （A） EGFR 基因和 （B） TP53 基因。 请点击这里下载此文件。
补充图3：报告软件生成的分子报告。请点击这里下载此文件。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
开发一种基于超快速扩增子的 NGS 方法作为反射测试，用于诊断任何阶段的 NS-NSLC 的分子改变评估，是检测 NS-NSCLC中所有指南推荐和新兴生物标志物的最佳选择5,22,23。虽然序贯方法（IHC、PCR、FISH）仅关注特定基因并可能导致组织材料耗尽，但这种 NGS 工作流程允许对 50 个基因的状态进行特异性和灵敏的评估，包括突变、融合和扩增，即使核酸量较低（根据这项研究，每个 DNA 和 RNA 测序至少 13 ng）。
此外，该方法为NS-NSCLC患者的管理提供了快速和相关的结果。与定制方法相比，无需根据肿瘤分期对要分析的病例进行初步选择，并且无需等待医生的要求，从而节省了宝贵的时间。在这条线上，已经表明晚期 NS-NSCLC 的 NGS 检测直接影响患者的总生存期24,25。此外，这些分子结果经常从 IHC 结果中同时获得，特别是用于评估 PD-L1 阳性肿瘤细胞的百分比 26。医生可以获得肿瘤的“分子图谱”，其中包含一线治疗的最佳治疗选择所需的所有生物标志物27.在特定情况下，医生可以根据基因组结果28,29,30,31将患者纳入临床试验。
每次运行可对 2-14 名患者进行 DNA 和 RNA 分析，不包括对照组（1 例阳性对照和 1 例阴性对照）。每周可以进行三次运行，这意味着 42 名患者可以从肿瘤的超快速 NGS 分析中受益。纯化器系统可在文库制备前对 DNA 和 RNA 进行全自动提取和定量分析，从而能够快速评估测序分析的可行性。
在文库制备之前对提取的 DNA 和 RNA 进行定量分析的能力，以及使用少量核酸（根据规范从至少 10 ng DNA 或 RNA 开始）的选项，可以快速评估测序分析的可行性。
NGS方法可以更全面地检测可操作的生物标志物，从而帮助优化胸部肿瘤学样本工作流程的管理。研究表明，基于PCR的方法在检测一些罕见突变方面具有固有的局限性，尤其是 EGFR 外显子20插入突变32。因此，NGS方法使更高比例的患者能够接受以生物标志物为重点的治疗。在这种情况下，已经证明对所有晚期NS-NSCLC进行NGS反射检测具有成本效益33。此外，与这种基于扩增子的 NGS 系统集成的全自动核酸提取、文库制备和测序为实验室工作人员节省了大量时间。
然而，实施超快速二代测序 （NGS） 作为诊断 NS-NSCLC 的反射测试在日常临床实践中可能会遇到某些限制。与包含数百个基因的广泛panel相比，基因panel的范围（包含50个基因）较少34。该组合包括与胸部肿瘤学靶向治疗相关的所有推荐基因。此外，一些具有潜在预后价值的感兴趣的基因不包括在内。例如， KEAP1、 STK11、 SMARCA4 和 RB1 不存在于本工作中使用的面板上。这些基因在未来对于选择患者从FDA批准的KRASG12C 抑制剂sotorasib9中受益可能很重要。使用超快速NGS和扩增子测序技术也可能引入缺失罕见融合基因伴侣的可能性35。此外，不平衡分析显示最初存在一些假阳性 ALK 重排36。在新的改良测定法中，检测 ALK 不平衡融合的阈值增加。但是，建议使用正交技术（IHC 和/或 FISH）验证不平衡结果。
最重要的是，这种工作流程提出了与经济可持续性和 NGS 检测报销相关的问题，这些问题可能因该国的卫生系统而异，尤其是在欧洲37.对于成本效益方法，必须同时运行足够的样品以节省耗材，这有时是不可能的，因为这取决于样品招募和实验室35.此外，应讨论为实验室工作人员产生不必要的额外工作量的可能性，并需要医生、外科医生、病理学家和技术人员之间的良好沟通。
同时使用 DNA 和 RNA NGS 是理想的，但仍有待商榷。知道靶向治疗的大多数基因组改变是相互排斥的38，可以首先进行 DNA 和 RNA 测序分析。但是，这种策略将导致生成报告所需的时间更长。
提取核酸的数量和质量是否充分可能限制了确保NGS分析的稳健性，特别是在涉及混合捕获测序技术和需要更多材料和更高TAT6的广泛panel的情况下。在这方面，这种基于扩增子的 NGS 系统的优势在于检测组合仅需要 13 ng 的 DNA 和 RNA，并且总体失败率非常低。这在胸部肿瘤学中非常有价值，因为样本的大小越来越小 20,39,40。
在胸部肿瘤学中，分子检测的适应症在不断变化，对于某些基因改变，现在建议在辅助治疗中进行15。我们认为，在常规临床实践中，极有可能出现几种额外的靶向疗法来治疗早期NS-NSCLC，这加强了在诊断时及时寻找生物标志物的必要性。综上所述，目前肺癌精准医学的进展将不可避免地有利于超快速的NGS方法，这种方法可以更全面、更快速、更节省材料地对肿瘤进行分子分析。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Christophe Bontoux 参加付费演讲者活动，并从赛默飞世尔科技获得福利。Paul Hofman 参加付费演讲者活动，并从赛默飞世尔科技获得福利和资金。
Acknowledgments
我们感谢赛默飞世尔科技为我们提供了使用其设备和材料的可能性。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 well hard shell plate clear | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | 4483354 | |
| Adhesive PCR Plate Foil | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | AB0626 | |
| AutoLys M tube | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | A38738 | FFPE sample processing tubes |
| Genexus Barcodes 1-32 HD | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | A40261 | |
| Genexus GX5 Chip and Genexus Coupler | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | A40269 | |
| Genexus Pipette Tips | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | A40266 | |
| Genexus Purification Instrument | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | A48148 | Automated purification instrument (API) |
| Genexus Sequencing Kit | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | A40271 | |
| Genexus Templating Strips 3-GX5 and 4 | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | A40263 | |
| Genexus Integrated Sequencer | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | A45727 | |
| Ion Torrent Genexus FFPE DNA/RNA Purification Combo Kit | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | A45539 | |
| Oncomine Precision Assay GX (OPA) Panel (included Strips 1 and 2-HD) | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | A46291 |
References
- Howlader, N., et al. The effect of advances in lung-cancer treatment on population mortality. New England Journal of Medicine. 383 (7), 640-649 (2020).
- Melosky, B., et al. The rapidly evolving landscape of novel targeted therapies in advanced non-small cell lung cancer. Lung Cancer. 160, 136-151 (2021).
- Hanna, N. H., et al. Therapy for stage IV non-small-cell lung cancer with driver alterations: ASCO and OH (CCO) joint guideline update. Journal of Clinical Oncology. 39 (9), 1040-1091 (2021).
- Kerr, K. M., et al. The evolving landscape of biomarker testing for non-small cell lung cancer in Europe. Lung Cancer. 154, 161-175 (2021).
- Mosele, F., et al. Recommendations for the use of next-generation sequencing (NGS) for patients with metastatic cancers: a report from the ESMO precision medicine working group. Annals of Oncology. 31 (11), 1491-1505 (2020).
- Kazdal, D., Hofman, V., Christopoulos, P., Ilié, M., Stenzinger, A., Hofman, P. Fusion-positive non-small cell lung carcinoma: Biological principles, clinical practice, and diagnostic implications. Genes Chromosomes and Cancer. 61 (5), 244-260 (2022).
- Li, B. T., et al. Trastuzumab deruxtecan in HER2 -mutant non-small-cell lung cancer. New England Journal of Medicine. 386 (3), 241-251 (2022).
- Bontoux, C., Hofman, V., Brest, P., Ilié, M., Mograbi, B., Hofman, P. Daily practice assessment of KRAS status in NSCLC patients: A new challenge for the thoracic pathologist is right around the corner. Cancers. 14 (7), 1628 (2022).
- Skoulidis, F., et al. Sotorasib for lung cancers with KRAS p.G12C mutation. New England Journal of Medicine. 384 (25), 2371-2381 (2021).
- Hellyer, J. A., et al. Impact of tumor suppressor gene co-mutations on differential response to EGFR TKI therapy in EGFR L858R and Exon 19 deletion lung cancer. Clinical Lung Cancer. 23 (3), 264-272 (2022).
- Mograbi, B., Heeke, S., Hofman, P. The importance of stk11/lkb1 assessment in non-small cell lung carcinomas. Diagnostics. 11 (2), 196 (2021).
- Nadal, E., et al. Two patients with advanced-stage lung adenocarcinoma with radiologic complete response to nivolumab treatment harboring an STK11/LKB1 mutation. JCO Precision Oncology. 4, 1239-1245 (2022).
- Smeltzer, M. P., et al. The international association for the study of lung cancer global survey on molecular testing in lung cancer. Journal of Thoracic Oncology. 15 (9), 1434-1448 (2020).
- Ahern, E., Solomon, B. J., Hui, R., Pavlakis, N., O'Byrne, K., Hughes, B. G. M. Neoadjuvant immunotherapy for non-small cell lung cancer: Right drugs, right patient, right time. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 9 (6), e002248 (2021).
- Wu, Y. -L., et al. Osimertinib in resected EGFR-mutated non-small-cell lung cancer. New England Journal of Medicine. 383 (18), 1711-1723 (2020).
- Hanna, N. H., et al. Therapy for stage IV non-small-cell lung cancer without driver alterations: ASCO and OH (CCO) joint guideline update. J Clin Oncol. 38 (14), 1608-1632 (2020).
- de Maglio, G., et al. The storm of NGS in NSCLC diagnostic-therapeutic pathway: How to sun the real clinical practice. Critical Reviews in Oncology/Hematology. 169, 103561 (2022).
- DiStasio, M., Chen, Y., Rangachari, D., Costa, D. B., Heher, Y. K., VanderLaan, P. A. Molecular testing turnaround time for non-small cell lung cancer in routine clinical practice confirms feasibility of CAP/IASLC/AMP guideline recommendations: A single-center analysis. Clinical Lung Cancer. 18 (5), e349-e356 (2017).
- Heeke, S., et al. Use of the ion PGM and the genereader NGS systems in daily routine practice for advanced lung adenocarcinoma patients: A practical point of view reporting a comparative study and assessment of 90 patients. Cancers. 10 (4), 88 (2018).
- Hofman, P. The challenges of evaluating predictive biomarkers using small biopsy tissue samples and liquid biopsies from non-small cell lung cancer patients. Journal of Thoracic Disease. 11, S57-S64 (2019).
- Ilié, M., et al. Setting up an ultra-fast next-generation sequencing approach as reflex testing at diagnosis of non-squamous non-small cell lung cancer; experience of a single center (LPCE, Nice, France). Cancers. 14 (9), 2258 (2022).
- Zacharias, M., et al. Reflex testing in non-small cell lung carcinoma using DNA-and RNA-based next-generation sequencing-a single-center experience. Translational Lung Cancer Research. 10 (11), 4221-4234 (2021).
- Miller, T. E., et al. Clinical utility of reflex testing using focused nextgeneration sequencing for management of patients with advanced lung adenocarcinoma. Journal of Clinical Pathology. 71 (12), 1108-1115 (2018).
- Al-Ahmadi, A., et al. Next generation sequencing of advanced non-small cell lung cancer: utilization based on race and impact on survival. Clinical Lung Cancer. 22 (1), 16.e1-22.e1 (2021).
- Kim, J. H., Yoon, S., Lee, D. H., Jang, S. J., Chun, S. M., Kim, S. W. Real-world utility of next-generation sequencing for targeted gene analysis and its application to treatment in lung adenocarcinoma. Cancer Medicine. 10 (10), 3197-3204 (2021).
- Sheffield, B. S., et al. Point of care molecular testing: Community-based rapid next-generation sequencing to support cancer care. Current Oncology. 29 (3), 1326-1334 (2022).
- Camidge, D. R., Doebele, R. C., Kerr, K. M. Comparing and contrasting predictive biomarkers for immunotherapy and targeted therapy of NSCLC. Nature Reviews Clinical Oncology. 16 (6), 341-355 (2019).
- Rosas, D., Raez, L. E., Russo, A., Rolfo, C. Neuregulin 1 gene (Nrg1). A potentially new targetable alteration for the treatment of lung cancer. Cancers. 13 (20), 5038 (2021).
- Shapiro, G. I., et al. A Phase 1 study of RO6870810, a novel bromodomain and extra-terminal protein inhibitor, in patients with NUT carcinoma, other solid tumours, or diffuse large B-cell lymphoma. British Journal of Cancer. 124 (4), 744-753 (2021).
- Schoenfeld, A. J., et al. The genomic landscape of SMARCA4 alterations and associations with outcomes in patients with lung cancer. Clinical Cancer Research. 26 (21), 5701-5708 (2021).
- Zhang, K., et al. Identification of deleterious NOTCH mutation as novel predictor to efficacious immunotherapy in NSCLC. Clinical Cancer Research. 26 (14), 3649-3661 (2020).
- Shen, C. I., et al. Real-world evidence of the intrinsic limitations of PCR-based EGFR mutation assay in non-small cell lung cancer. Scientific Reports. 12 (1), 13566 (2022).
- Zou, D., et al. Diagnostic value and cost-effectiveness of next-generation sequencing-based testing for treatment of patients with advanced/metastatic non-squamous non-small-cell lung cancer in the United States. Journal of Molecular Diagnostics. 24 (8), 901-914 (2022).
- Zhong, Y., Xu, F., Wu, J., Schubert, J., Li, M. M. Application of next generation sequencing in laboratory medicine. Annals of Laboratory Medicine. 41 (1), 25-43 (2020).
- Bruno, R., Fontanini, G. Next generation sequencing for gene fusion analysis in lung cancer: A literature review. Diagnostics. 10 (8), 521 (2020).
- Hofman, V., et al. Ultra-fast gene fusion assessment for non-squamous non-small cell lung cancer. JTO Clinical and Research Reports. 4 (2), 100457 (2022).
- Horgan, D., et al. Personalized medicine perspective identifying the steps required to effectively implement next-generation sequencing in oncology at a national level in Europe. Journal of Personalized Medicine. 12 (1), 72 (2022).
- Cohen, D., et al. Optimizing mutation and fusion detection in NSCLC by sequential DNA and RNA sequencing. Journal of Thoracic Oncology. 15 (6), 1000-1014 (2020).
- Goswami, R. S., et al. Identification of factors affecting the success of next-generation sequencing testing in solid tumors. American Journal of Clinical Pathology. 145 (2), 222-237 (2016).
- Ilie, M., Hofman, P. Pitfalls in Lung Cancer Molecular Pathology: How to Limit them in Routine Practice. Current Medicinal Chemistry. 19 (16), 2638-2651 (2012).
