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गैर-स्क्वैमस गैर-छोटे सेल फेफड़ों के कैंसर में अल्ट्रा-फास्ट एम्पलीकॉन-आधारित अगली पीढ़ी का अनुक्रमण

Published: September 8, 2023 doi: 10.3791/65190
Automatic Translation
1,2,3,4,5, 1,2,3,4, 1,2,3,4, 1,2,3,4, 1,2,3,4, 1,2,3,4, 1,2,3,4, 1,2,3,4, 3,4,5,6, 3,4,5,6, 1,2,3,4,5, 1,2,3,4,5, 1,2,3,4,5
1Laboratory of Clinical and Experimental Pathology, Centre Hospitalier Universitaire de Nice, Université Côte d’Azur, CHU de Nice, 2Hospital-Integrated Biobank (BB-0033-00025), Université Côte d'Azur, Hôpital Pasteur, CHU de Nice, 3Institut Hospitalo-Universitaire (IHU), RespirERA, Université Côte d'Azur, Hôpital Pasteur, CHU de Nice, 4FHU OncoAge, Université Côte d'Azur, 5Team 4, Institute of Research on Cancer and Aging (IRCAN), CNRS INSERM, Centre Antoine-Lacassagne, Université Côte d'Azur, 6Department of Pulmonary Medicine and Thoracic Oncology, Centre Hospitalier Universitaire de Nice, Université Côte d'Azur

Summary

गैर-स्क्वैमस गैर-छोटे सेल फेफड़ों के कैंसर (एनएस-एनएससीएलसी) देखभाल प्रबंधन के लिए परीक्षण किए जाने वाले आणविक बायोमार्कर की वृद्धि ने तेजी से और विश्वसनीय आणविक पहचान विधियों के विकास को प्रेरित किया है। हम अल्ट्रा-फास्ट-अगली पीढ़ी के अनुक्रमण (एनजीएस) दृष्टिकोण का उपयोग करके एनएस-एनएससीएलसी रोगियों के लिए जीनोमिक परिवर्तन मूल्यांकन के लिए एक वर्कफ़्लो का वर्णन करते हैं।

Abstract

गैर-स्क्वैमस गैर-छोटे सेल फेफड़ों के कैंसर (एनएस-एनएससीएलसी) रोगियों के लक्षित चिकित्सा के लिए परीक्षण किए जाने वाले आणविक परिवर्तनों की संख्या में पिछले कुछ वर्षों में काफी वृद्धि हुई है। उन्नत या मेटास्टैटिक एनएस-एनएससीएलसी रोगियों की इष्टतम देखभाल के लिए आणविक असामान्यताओं का पता लगाना अनिवार्य है, जिससे लक्षित उपचारों को समग्र अस्तित्व में सुधार के साथ प्रशासित किया जा सकता है। फिर भी, ये ट्यूमर प्रतिरोध के तंत्र विकसित करते हैं जो उपन्यास उपचारों का उपयोग करके संभावित रूप से लक्षित होते हैं। कुछ आणविक परिवर्तन भी उपचार प्रतिक्रिया को संशोधित कर सकते हैं। NS-NSCLC के आणविक लक्षण वर्णन को अंतर्राष्ट्रीय दिशानिर्देशों द्वारा अनुशंसित 10 कार्य दिवसों से कम समय में थोड़े टर्नअराउंड समय (TAT) में किया जाना है। इसके अलावा, जीनोमिक विश्लेषण के लिए ऊतक बायोप्सी की उत्पत्ति विविध है, और कम आक्रामक तरीकों और प्रोटोकॉल के विकास के साथ उनका आकार लगातार कम हो रहा है। नतीजतन, पैथोलॉजिस्ट को एक कुशल और तेजी से निदान रणनीति बनाए रखते हुए प्रभावी आणविक टेकनीक करने के लिए चुनौती दी जा रही है। यहां, हम एनएस-एनएससीएलसी रोगियों के निदान पर दैनिक दिनचर्या अभ्यास में उपयोग किए जाने वाले अल्ट्रा-फास्ट एम्पलीकॉन-आधारित अगली पीढ़ी के अनुक्रमण (एनजीएस) वर्कफ़्लो का वर्णन करते हैं। हमने दिखाया कि यह प्रणाली एक उपयुक्त टीएटी में थोरैसिक ऑन्कोलॉजी में सटीक चिकित्सा में उपयोग किए जाने वाले वर्तमान आणविक लक्ष्यों की पहचान करने में सक्षम है।

Introduction

पिछले दशक में, लक्षित और इम्यूनो-थेरेपी के विकास ने गैर-स्क्वैमस गैर-छोटे सेल फेफड़ों के कैंसर (एनएस-एनएससीएलसी)1,2के समग्र अस्तित्व (ओएस) में काफी वृद्धि की है। इस संबंध में, एनएस-एनएससीएलसी का इलाज करते समय विश्लेषण करने के लिए अनिवार्य जीन और आणविक लक्ष्यों की संख्या पिछले कुछ वर्षों में 3,4 बढ़ गई है।

वर्तमान अंतरराष्ट्रीय दिशानिर्देश उन्नत एनएस-एनएससीएलसी5 के निदान पर ईजीएफआर, एएलके, आरओएस 1, बीआरएएफ, एनटीआरके, आरईटी और एमईटी के परीक्षण की सलाह देते हैं। इसके अलावा, जैसा कि नई दवाओं ने हाल ही में नैदानिक परीक्षणों में बहुत ही आशाजनक परिणाम दिए हैं, अतिरिक्त जीनोमिक परिवर्तनों को जल्द ही कई अतिरिक्त जीन, विशेष रूप से KRAS और HER2, BRAC1/BRAC2, PI3KA, NRG1, और NUT 6,7,8,9 के साथ जांचा जाएगा। इसके अलावा, एसटीके 11, केईएपी 1, और टीपी 53 जैसे विभिन्न संबद्ध जीनों की स्थिति कुछ लक्षित उपचारों और / या प्रतिरक्षा चेकपॉइंट इनहिबिटर (आईसीआई) 10,11,12के लिए प्रतिक्रिया या प्रतिरोध की बेहतर भविष्यवाणी के लिए मजबूत रुचि हो सकती है।

महत्वपूर्ण रूप से, सावधानीपूर्वक नैदानिक निर्णय लेने को सुनिश्चित करने के लिए आणविक परिवर्तनों को महत्वपूर्ण देरी के बिना सूचित किया जाना चाहिए। एक ट्यूमर के आणविक लक्षण वर्णन की अनुपस्थिति इस तरह के साथ / इम्यूनोथेरेपी के बिना कीमोथेरेपी के रूप में गैर लक्षित चिकित्सा की दीक्षा के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, एक उप-इष्टतम उपचार रणनीति के लिए अग्रणी, के रूप में कीमोथेरेपी प्रतिक्रिया कार्रवाई योग्य परिवर्तन के साथ रोगियों में सीमित है, जैसे ईजीएफआर उत्परिवर्तन या जीन संलयन13.

इसके अलावा, नियोएडजुवेंट और/या सहायक सेटिंग्स में लक्षित उपचार/इम्यूनोथेरेपी के वर्तमान विकास से प्रारंभिक चरण एनएस-एनएससीएलसी में कम से कम, ईजीएफआर और एएलके परिवर्तनों की व्यवस्थित रूप से तलाश हो सकती है क्योंकि आईसीआई को केवल ट्यूमर में प्रशासित किया जाना चाहिए जो ईजीएफआर और एएलके14 के लिए जंगली-प्रकार हैं। प्रारंभिक चरण एनएस-एनएससीएलसी में ईजीएफआर उत्परिवर्तन की उपस्थिति के लिए परीक्षण करना अब भी अनिवार्य है, क्योंकि ओसिमर्टिनिब (तीसरी पीढ़ी के ईजीएफआर टाइरोसिन किनसे अवरोधक) का उपयोग ईजीएफआर-उत्परिवर्ती एनएस-एनएससीएलसी15 में सहायक चिकित्सा के रूप में किया जा सकता है।

एनएस-एनएससीएलसी रोगियों में विभिन्न लक्षित उपचारों और/या इम्यूनोथेरेपी की प्रतिक्रिया की भविष्यवाणी करने में विभिन्न बायोमार्करों के आकलन की रणनीति तेजी से आगे बढ़ रही है, जिससे इन बायोमार्कर की पहचान क्रमिक रूप से कठिन 3,16 हो जाती है। इस संबंध में, अगली पीढ़ी अनुक्रमण (एनजीएस) अब एनएस-एनएससीएलसी 5,17 में जीन परिवर्तन के उच्च थ्रूपुट समानांतर मूल्यांकन के लिए इष्टतम दृष्टिकोण है।

हालाँकि, NGS वर्कफ़्लो में महारत हासिल करना मुश्किल हो सकता है और TAT18,19 तक काम कर सकता है। इस प्रकार, कई केंद्र अभी भी अनुक्रमिक दृष्टिकोण (इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (आईएचसी), स्वस्थानी संकरण (मछली) और / या लक्षित अनुक्रमण में प्रतिदीप्ति करते हैं। हालांकि, यह रणनीति छोटे नमूने के आकार के मामले में सीमित है और सबसे ऊपर, एनएस-एनएससीएलसी20 में परीक्षण करने के लिए आवश्यक कार्रवाई योग्य उत्परिवर्तनों की बढ़ती संख्या के कारण। इस प्रकार, जीन परिवर्तनों के तेजी से मूल्यांकन की अनुमति देने वाली अल्ट्रा-फास्ट और सीधी परीक्षण विधियां इष्टतम नैदानिक निर्णय लेने के लिए तेजी से महत्वपूर्ण हो गई हैं। इसके अलावा, आणविक परीक्षण के लिए अनुमोदित और मान्यता प्राप्त सिस्टम विशिष्ट लक्षित उपचारों के पर्चे के लिए अनिवार्य होते जा रहे हैं।

यहां, हम एनएस-एनएससीएलसी के आणविक परीक्षण के लिए एक अल्ट्रा-फास्ट और स्वचालित एम्पलीकॉन-आधारित डीएनए/आरएनए एनजीएस परख का वर्णन करते हैं जिसका उपयोग क्लिनिकल एंड एक्सपेरिमेंटल पैथोलॉजी लेबोरेटरी (एलपीसीई), नाइस यूनिवर्सिटी हॉस्पिटल, फ्रांस की प्रयोगशाला में किया जाता है और फ्रेंच प्रत्यायन समिति (सीओएफआरएसी) (https://www.cofrac.fr/) द्वारा आईएसओ 15189 मानदंड के अनुसार मान्यता प्राप्त है। COFRAC प्रमाणित करता है कि प्रयोगशाला द्वारा किए गए पैनल के साथ एक अनुक्रमक पर स्वचालित NGS में आणविक विश्लेषण में परीक्षण/अंशांकन की गतिविधियों के लिए आवेदन के मानक ISO 15189 और COFRAC नियमों की आवश्यकताओं को पूरा करती है। मान्यता प्राप्त अंतरराष्ट्रीय मानक आईएसओ 15189 के अनुसार प्रत्यायन एक परिभाषित दायरे और इस प्रयोगशाला में एक उपयुक्त प्रबंधन प्रणाली के उचित संचालन के लिए प्रयोगशाला की तकनीकी क्षमता को प्रदर्शित करता है। इस वर्कफ़्लो के लाभ और सीमाएं, रिपोर्ट प्राप्त करने के लिए ऊतक बायोप्सी नमूनों की तैयारी से शुरू होती हैं, पर चर्चा की जाती है।

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Protocol

सभी प्रक्रियाओं को स्थानीय नैतिकता समिति (मानव अनुसंधान आचार समिति, सेंटर हॉस्पिटलियर यूनिवर्सिटेयर डी नाइस, ट्यूमरोथेक बीबी-0033-00025) द्वारा अनुमोदित किया गया है। नमूनों और उत्पन्न डेटा का उपयोग करने के लिए सभी रोगियों से सूचित सहमति प्राप्त की गई थी। सभी नमूने चिकित्सा देखभाल के हिस्से के रूप में 20 सितंबर और 31 जनवरी 2022 के बीच LPCE (नाइस, फ्रांस) में NS-NSCLC के निदान वाले रोगियों से प्राप्त किए गए थे।

1. स्वचालित शुद्धि उपकरण (एपीआई) का उपयोग करके एफएफपीई डीएनए और आरएनए नमूनों की तैयारी (प्रसंस्करण समय: 5 घंटे 15 मिनट)

  1. उपकरण पर योजना चलाएं।
    1. उपकरण को चालू करें और उपयोगकर्ता नाम और पासवर्ड (सामग्री की तालिका) के साथ साइन इन करें। चलाएँ, फिर योजना जोड़ें पर क्लिक करके और चलाएँ योजना को कोई नाम देकर शुद्धिकरण चलाएँ योजना बनाएँ.
    2. फिर, फॉर्मेलिन-फिक्स्ड पैराफिन-एम्बेडेड (एफएफपीई) नमूनों से डीएनए और आरएनए को क्रमिक रूप से शुद्ध करने के लिए उपयुक्त शुद्धि किट और प्रोटोकॉल का चयन करें। शुद्धिकरण के बाद मात्रा निर्धारित करें।
    3. ड्रॉपडाउन सूची से वांछित क्षालन मात्रा (50 μL) का चयन करें, फिर अगला क्लिक करें। निकाले जाने वाले नमूनों की संख्या का चयन करें।
    4. फिर प्रत्येक नमूने का चयन करें, संपादित करें पर क्लिक करें, नमूना ID दर्ज करें और फिर सहेजें पर क्लिक करें.
  2. GPI का उपयोग करके FFPE डीएनए और RNA नमूनों को प्रीपेरेट करें
    1. FFPE ऊतक नमूने (एक microtome के साथ 10 माइक्रोन के 4 काटने अनुभागों) तैयार या FFPE ब्लॉक पर सीधे macrodissection प्रदर्शन. प्रत्येक एफएफपीई ऊतक नमूना को अलग और पहचाने गए एफएफपीई नमूना प्रसंस्करण ट्यूबों (सामग्री की तालिका) में रखें।
    2. ट्यूबों के तल पर ऊतक को इकट्ठा करने के लिए 1 मिनट के लिए 2000 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र।
    3. प्रत्येक एफएफपीई नमूना प्रसंस्करण ट्यूब में एक न्यूक्लिक एसिड शुद्धि किट से तैयार एक प्रोटीज डाइजेस्ट मास्टर मिक्स जोड़ें और कम से कम 60 मिनट (सामग्री की तालिका) के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। 60 मिनट के लिए 90 डिग्री सेल्सियस पर नमूने सेते हैं.
    4. इनक्यूबेशन बाद, नमूने कमरे के तापमान (आरटी) पर 5 मिनट के लिए शांत करते हैं.
    5. प्रत्येक एफएफपीई नमूना प्रसंस्करण ट्यूब के लिए, आंतरिक ट्यूब उठाएं, इसे बाएं मोड़कर लॉक करें, और फिर नमूनों को 10 मिनट के लिए 2000 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र करें।
    6. दाएं मुड़कर आंतरिक ट्यूबों को अनलॉक करें, उन्हें बाहरी ट्यूबों से अलग करें और उन्हें त्याग दें। एपीआई पर लोड होने तक बर्फ पर बाहरी ट्यूबों में नमूने रखें।
    7. एक DNase पाचन मास्टर मिश्रण तैयार करें और इसे पहले से भरे हुए FFPE डीएनए और आरएनए शुद्धि प्लेट 2 में लोड करें। फिर, एफएफपीई डीएनए और आरएनए शुद्धि प्लेट 1 (सामग्री की तालिका) में तैयार नमूने लोड करें।
  3. एपीआई पर शुद्धिकरण रन शुरू करें।
    1. API स्क्रीन पर, चलाएँ पर क्लिक करें, योजना चलाएँ चुनें, फिर अगला पर क्लिक करें।
    2. शुद्धिकरण रन (सामग्री की तालिका) के लिए आवश्यक उपभोग्य सामग्रियों और अभिकर्मकों के साथ एपीआई लोड करने के लिए ऑन-स्क्रीन संकेतों का पालन करें।
    3. जब सभी अभिकर्मकों लोड होते हैं, तो अगला क्लिक करें। एपीआई दरवाजा बंद करें और स्टार्ट पर क्लिक करें।
    4. रन के अंत में, टचस्क्रीन पर «अनलोड» पर क्लिक करें और तुरंत शुद्ध नमूना डीएनए और आरएनए युक्त 48-अच्छी तरह से न्यूक्लिक एसिड संग्रह प्लेट को हटा दें।
    5. मात्रा के परिणाम निर्यात करें। प्लेट को सील करें और शुद्ध नमूनों को -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। विश्लेषण किया जा sequencer के लिए 96 अच्छी तरह से थाली स्थानांतरण.
  4. एक नमूना बनाएँ और एक रन बनाएँ.
    1. सॉफ़्टवेयर खोलें और साइन इन करें, फिर मेनू बार में नमूने चुनें और नमूना बनाएँ पर क्लिक करें।
    2. नमूने का नाम, लिंग, और ट्यूमर कोशिकाओं का प्रतिशत दर्ज करें, और यदि आवश्यक हो तो आवश्यक फ़ील्ड और वैकल्पिक फ़ील्ड को पूरा करें।
    3. विवरण सहेजें (कॉपी नंबर वेरिएंट [सीएनवी] का विश्लेषण करने के लिए लिंग और ट्यूमर कोशिकाओं का प्रतिशत महत्वपूर्ण है)।
    4. मेनू बार में परिणाम के लिए रन और न्यूक्लिक एसिड चुनें।
    5. सेटअप चरण में रन नाम दर्ज करें। अगला पर क्लिक करें.
    6. परख चरण में परख का चयन करें। अगला पर क्लिक करें.
    7. परख के साथ चलाने के लिए नमूने चरण में नमूनों का चयन करें।
    8. फिर, चयनित Assays फलक में, असाइन करें क्लिक करें. अगला पर क्लिक करें.
    9. नमूना इनपुट प्लेट पर नमूना पदों की समीक्षा करें। अगला पर क्लिक करें.
    10. चलाएँ योजना सारांश की समीक्षा करें और फिर सहेजें & मुद्रित करें या सहेजें.

2. अनुक्रमक पर स्वचालित एनजीएस (प्रसंस्करण समय: 30 मिनट)

  1. नमूना प्लेट लोड करें।
    नोट: इष्टतम न्यूक्लिक एसिड एकाग्रता 0.5 एनजी / मान्य न्यूक्लिक एसिड एकाग्रता सीमा 0.33-1 ng/μL है। डीएनए और आरएनए के लिए, प्रयोगशाला में 1 एनजी /
    1. अनुक्रमक को 20 माइक्रोन कुल मात्रा की आवश्यकता होती है। सुनिश्चित करें कि नमूना लोड करने के लिए पर्याप्त मात्रा है।
    2. निकाले बिना शुद्धि उपकरण के पहले चरण में सकारात्मक नियंत्रण (डीएनए और आरएनए) और एनटीसी (डीएनए और आरएनए) जोड़ें। रन को मान्य करने और उपयोग किए गए बैचों को मान्य करने के लिए प्रत्येक रन के लिए डीएनए और आरएनए नियंत्रण का उपयोग करें। एपीआई चलाने के अंत में प्लेट में डीएनए और आरएनए नियंत्रण जोड़ें।
  2. सीक्वेंसर लोड करें और एक रन शुरू करें।
    1. रेफ्रिजरेटर या फ्रीजर में अपने बक्से से सभी अभिकर्मकों निकालें और 30 मिनट (सामग्री की तालिका) की एक न्यूनतम अवधि और 12 घंटे की एक अधिकतम के लिए आरटी पर पिघलना.
    2. प्रयोगशाला में, साइट पर प्रशिक्षण के दौरान आपूर्तिकर्ता द्वारा दी गई सलाह का पालन करते हुए सीक्वेंसर को हमेशा चालू रखें। सिस्टम में साइन इन करें.
    3. शुद्धि उपकरण से प्लेट लोड करें, जिसमें नमूने होते हैं, चिपकने वाली पीसीआर प्लेट पन्नी (सामग्री की तालिका) की शीट के साथ प्लेट को सील करने के बाद।
    4. डेक में सभी उपभोग्य सामग्रियों को स्थापित करें। अनुक्रमक एक हाइलाइट की गई स्थिति (सामग्री की तालिका) में प्रत्येक आवश्यक उपभोज्य को लोड करने के लिए चरण-दर-चरण निर्देश प्रदान करता है।
    5. जांचें कि स्ट्रिप 2-एचडी के ट्यूब 3 पर कोई वर्षा नहीं हो रही है। यदि आवश्यक हो तो अवक्षेप को भंग करने के लिए ट्यूब को झटका दें या धीरे से पट्टी को भंवर करें।
    6. पट्टी 1 और पट्टी 3 में चुंबकीय मोती होते हैं। यह कदम बहुत महत्वपूर्ण है: सुनिश्चित करें कि मोतियों को फिर से निलंबित कर दिया गया है। ट्यूब के ऊपरी हिस्से में कोई मोती नहीं छोड़ा जाना चाहिए।
    7. मोतियों को हटाने के लिए पट्टी को उल्टा और पीछे 3-4 बार घुमाएं। पट्टी सील के साथ एक छोर पर पट्टी को पकड़ो ऊपर की ओर उन्मुख है। बाद में, एक त्वरित, केन्द्रापसारक हाथ आंदोलन का उपयोग करके पट्टी को तेजी से नीचे की ओर घुमाएं, और कलाई की एक तेज झटका देकर समाप्त करें।
    8. 15 एस के लिए 300 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र। यदि आवश्यक हो तो दोहराएं। स्ट्रिप्स के ऊपरी हिस्से में गेंदों के अवशेषों के संबंध में बेतरतीब ढंग से देखी गई विफलताओं को कम करने के लिए एडेप्टर और स्ट्रिप धारकों के साथ स्ट्रिप्स को सेंट्रीफ्यूज करें।
    9. सिस्टम बंद करें और अगला क्लिक करें। अनुक्रमण अभिकर्मकों बे दरवाजे (सामग्री की तालिका) स्थापित करें। दरवाज़ा बंद करो। सीक्वेंसर स्वचालित रूप से रन शुरू करता है।
  3. प्रक्षालन
    1. रन के बाद सफाई के लिए, जब रन पूरा हो जाए, तो अगला क्लिक करें।
    2. दरवाजा क्रमिक रूप से खुलता है। कचरे को खाली करने और सभी उपभोग्य सामग्रियों को हटाने के लिए ऑन-स्क्रीन निर्देशों का पालन करें। अगला पर क्लिक करें.
    3. समाप्त होने पर डेक बंद करें, अगला क्लिक करें। एक 2 मिनट यूवी सफाई शुरू होता है। sequencer एक नया रन शुरू करने के लिए तैयार है.

3. एकीकृत सॉफ्टवेयर का उपयोग कर परिणामों का विश्लेषण (रोगी द्वारा विश्लेषण समय [नमूने एडीएन और एआरएन]: 15 मिनट)

नोट: तकनीक फ्रेंच प्रत्यायन समिति (COFRAC) आईएसओ 15189 (https://www.cofrac.fr/) द्वारा मान्यता प्राप्त है

  1. डेटा और परिणाम
    1. परिणाम मेनू में किसी रन परिणाम या नमूना परिणाम का चयन करें. परिणाम / रन परिणाम स्क्रीन में, सभी रन सूचीबद्ध हैं।
    2. स्तंभ शीर्ष लेख में फ़िल्टर करके परिणामों की सूची खोजें.
    3. परिणाम क्लिक करें और नमूना परिणाम क्लिक करें. फिर, किसी अद्वितीय नमूने के अनुक्रमण परिणाम देखने के लिए नमूना नाम स्तंभ में रुचि के नमूने के नाम पर क्लिक करें.
    4. स्क्रीन के ऊपरी बाएँ कोने में स्तंभ पर क्लिक करें या तालिका से स्तंभों का चयन रद्द करें.
  2. QC परिणाम देखें और amplicon कवरेज देखें।
    1. परिणाम स्क्रीन में QC टैब पर क्लिक करें।
    2. डीएनए के लिए, सुनिश्चित करें कि कॉपी नंबर वेरिएंट (सीएनवी) विश्लेषण को मान्य करने के लिए औसत पूर्ण जोड़ीदार अंतर (एमएपीडी) 0 और 0.5 के बीच हैं। मैप किए गए पठन 1.5 मिलियन से अधिक होने चाहिए।
    3. आरएनए के लिए, जांचें कि क्या मैप किए गए रीड 150,000 और 400,000 के बीच हैं। इसके नीचे, झूठी नकारात्मक का खतरा है, और इससे परे, झूठी सकारात्मकता का खतरा है।
    4. मुख्य निष्कर्ष टैब खोलने के लिए नमूना नाम क्लिक करें.
    5. एम्प्लिकॉन कवरेज ग्राफ़ तक स्क्रॉल करें।
    6. कवरेज ग्राफ़ की समीक्षा करें। एम्प्लिकॉन कवरेज के लिए न्यूनतम सीमा को परिभाषित करें, क्योंकि आपूर्तिकर्ता इसे प्रदान नहीं करता है। एक सीमा और एक सीमा को परिभाषित करने के लिए, एक नियंत्रण और एक जंगली प्रकार (WT) नमूना मिश्रण. फिर, एक या अधिक चयनित उत्परिवर्तन के लिए एम्पलीकॉन कवरेज के सबसे छोटे मूल्य का निरीक्षण करें।
  3. विविधता परिणाम देखें।
    1. डेटा को तालिका स्वरूप में निर्यात करने के लिए, स्क्रीन के ऊपरी दाएँ कोने में निर्यात करें क्लिक करें.
    2. एकल न्यूक्लियोटिड संस्करण/सम्मिलन-हटाने संस्करण (SNV/INDEL) परिणाम देखने के लिए, वेरिएंट टैब क्लिक करें, फिर SNVs/Indels क्लिक करें। फ़िल्टर संपादित करें पर क्लिक करें और कोई फ़िल्टर नहीं चुनें.
      नोट: संवेदनशीलता सीमा को आईएनसीए (फ्रेंच नेशनल कैंसर इंस्टीट्यूट) समूह (https://www.e-cancer.fr/Professionnels-de-sante/Les-therapies-ciblees/Les-plateformes-de-genetique-moleculaire-des-cancers/Le-programme-d-assurance-qualite-des-plateformes) की सिफारिशों के अनुसार 5% पर परिभाषित किया गया है।
    3. फ़्यूज़न परिणाम देखें और RNA Exon वेरिएंट देखें : वेरिएंट टैब पर क्लिक करें, फिर फ़्यूज़न पर क्लिक करें।
    4. ऊपर दाईं ओर, विज़ुअलाइज़ेशन और आरएनए एक्सॉन वेरिएंट पर क्लिक करें, फिर आरएनए एक्सॉन वेरिएंट प्लॉट की समीक्षा करें।
    5. इस किट के साथ, ईजीएफआर, एमईटी और एआर जीन के एक्सॉन लंघन का पता लगाया जा सकता है। विज़ुअलाइज़ेशन पर क्लिक करें; विश्लेषण करना आसान है।
    6. RNA एक्सॉन टाइल फ़्यूज़न असंतुलन देखें : वेरिएंट टैब पर क्लिक करें, फिर फ़्यूज़न पर क्लिक करें।
    7. ऊपर दाईं ओर, विज़ुअलाइज़ेशन और आरएनए एक्सॉन टाइल फ्यूजन असंतुलन पर क्लिक करें, फिर आरएनए एक्सॉन टाइल फ्यूजन असंतुलन प्लॉट की समीक्षा करें। एक असंतुलन संलयन एक ज्ञात साथी और एक साथी के बीच एक संलयन है जो पैनल द्वारा कवर नहीं किया गया है।
    8. CNV परिणाम देखें : डेटा प्रदर्शित करने के लिए वेरिएंट टैब में CNV पर क्लिक करें।
      नोट: लिंग के नमूनों की तैयारी और नमूने के ट्यूमर कोशिकाओं के प्रतिशत के दौरान सूचित करके सीएनवी के परिणामों के साथ सतर्क रहना आवश्यक है। एआर जीन केवल एक्स गुणसूत्र द्वारा किया जाता है। यदि लिंग निर्दिष्ट नहीं है, तो पुरुष सेक्स को नुकसान हो सकता है, जिससे पुरुष रोगियों में झूठे सकारात्मक परिणाम हो सकते हैं।
  4. प्लगइन परिणामों की समीक्षा करें।
    1. कवरेज विश्लेषण प्लगइन परिणामों की समीक्षा करें: ऊपर दाईं ओर, डाउनलोड फ़ाइलों पर क्लिक करें और चुनें।
    2. कवरेज विश्लेषण प्लगइन एक कवरेज विश्लेषण रिपोर्ट उत्पन्न करता है।
    3. आणविक कवरेज विश्लेषण प्लगइन परिणामों की समीक्षा करें: सबसे ऊपर दाईं ओर, फ़ाइलें डाउनलोड करें पर क्लिक करें और चुनें. यह विश्लेषण सत्यापित करता है कि क्या सभी एम्प्लिकॉन कवर किए गए हैं और सॉफ़्टवेयर द्वारा प्रदान किए गए कॉपी नंबर वेरिएंट (सीएनवी) परिणामों की पुष्टि करता है।
  5. परख मेट्रिक्स और रन रिपोर्ट देखें
    1. रन सारांश में रिपोर्ट चलाएँ टैब क्लिक करें।
    2. रन रिपोर्ट देखने के लिए, ड्रॉपडाउन मेनू में नमूना चुनें विकल्प चुनें।
    3. परख मेट्रिक और रन रिपोर्ट: स्क्रीन के शीर्ष पर अनुक्रमण मीट्रिक ढूंढें, उसके बाद रन सैंपल्स तालिका में नमूना-विशिष्ट मीट्रिक खोजें।
      नोट:: ग्राहक समर्थन संग्रह (CSA) फ़ाइल में जानकारी परिणामों का समस्या निवारण मदद कर सकते हैं, लेकिन वे सीधे विश्लेषण नहीं किया जा सकता। सीएसए फाइलें पूरे रन डेटा के डेटा को सारांशित करती हैं और असफल रन के मामले में किसी समस्या के कारणों को उजागर करती हैं।
    4. रन रिपोर्ट डाउनलोड करें : रिपोर्ट टैब पर क्लिक करें।
    5. PDF प्रारूप में रन रिपोर्ट सारांश डाउनलोड करने के लिए रिपोर्ट डाउनलोड करें पर क्लिक करें।
  6. विविधता रिपोर्ट जनरेट करें।
    1. किसी रन के डेटा विश्लेषण के दौरान प्रत्येक नमूने के लिए स्वचालित रूप से भिन्न रिपोर्ट जनरेट करने के लिए सेटअप चरण में रिपोर्ट जनरेट करें सक्षम करें.
    2. नमूने के लिए भिन्न रिपोर्ट उत्पन्न करने के बाद, सिस्टम रिपोर्ट को दो स्थानों पर उपलब्ध कराता है: सबसे पहले, परिणाम/नमूना परिणाम स्क्रीन में एक लिंक उपलब्ध कराया जाता है। पीडीएफ डाउनलोड करने के लिए लिंक पर क्लिक करें।
    3. दूसरा, रिपोर्ट टैब में वेरिएंट रिपोर्ट पेन पर जाएं और डाउनलोड रिपोर्ट बटन पर क्लिक करें। विविधता रिपोर्ट पर इलेक्ट्रॉनिक रूप से या मैन्युअल रूप से हस्ताक्षर करें.
      नोट: इलेक्ट्रॉनिक रूप से हस्ताक्षरित रिपोर्ट में नमूना नाम के बाद (साइन ऑफ) है नमूना परिणाम स्क्रीन।

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Representative Results

यहां प्रस्तुत प्रक्रिया का उपयोग करते हुए, हमारे हाल के प्रकाशनों21 में विस्तार से वर्णित है, हमने अल्ट्रा-फास्ट एम्पलीकॉन-आधारित अगली पीढ़ी के अनुक्रमण दृष्टिकोण का उपयोग करके एनएस-एनएससीएलसी के रोगियों में निदान के लिए नियमित रूप से किए गए नैदानिक अभ्यास में एक पलटा परीक्षण के रूप में आणविक परिवर्तन के आकलन के लिए एक इष्टतम वर्कफ़्लो विकसित किया है। विधि के आणविक कार्यप्रवाह चित्रा 1 में दिखाया गया है. पैनल में शामिल जीन की सूची पूरक चित्रा 1 में दिखाया गया है.

एनएस-एनएससीएलसी के साथ 259 रोगियों में आणविक विश्लेषण किया गया था। इसमें 153 ब्रोन्कियल बायोप्सी, 47 ट्रांसथोरासिक बायोप्सी, 39 सर्जिकल नमूने और 13 फुफ्फुस बहाव और 7 ईबीयूएस(तालिका 1)से 25 सेलब्लॉक शामिल थे। निम्नलिखित चालक उत्परिवर्ती जीन 242 वैध या उपलब्ध एनजीएस डीएनए / आरएनए विश्लेषण में देखे गए: केआरएएस (25.4%), ईजीएफआर (18.2%), बीआरएफ (6.3%), ईआरबीबी 2 (1.7%) और एमईटी (1.7%)। निम्नलिखित जीन फ्यूजन की सूचना दी गई: ALK (4.3%), ROS1 (2.3%), RET (1.9%) और NTRK (0.8%)। निम्नलिखित परिवर्तनों का पता 1% से कम की घटना के साथ लगाया गया था (उदाहरण के लिए, IDH1, CDKN2A, FGFR3, KIT, MTOR, FGFR4। NTRK3, NRAS, PIK3CA, IDH2, ERBB3, ERBB4, AR, CHECK2, SMO, PTEN)। डीएनए के लिए, 10 मामले (4%) विफल रहे, जबकि 5 मामले (2%) आरएनए के लिए विफल रहे। विफलता डीएनए/आरएनए की खराब गुणवत्ता और/या डीएनए/आरएनए की कम मात्रा के कारण थी। असफल विश्लेषण केवल 10% से कम ट्यूमर सेल्युलरिटी वाले नमूनों के साथ हुआ। इस प्रकार, हमने ट्यूमर सेल्युलरिटी कट-ऑफ को 10% पर परिभाषित किया। डीएनए एनजीएस परिणामों के लिए, 10 मामलों (4%) या तो न्यूक्लिक एसिड की कम गुणवत्ता (6 मामलों) या अपर्याप्त न्यूक्लिक एसिड मात्रा (डीएनए के <13 एनजी के साथ 4 मामलों) के कारण पारित नहीं हुआ। इसी तरह, अपर्याप्त आरएनए गुणवत्ता और आरएनए की कम मात्रा (आरएनए के <13 एनजी) दोनों के कारण आरएनए अनुक्रमण परिणामों के लिए पांच मामले (2%) विफल रहे। असफल मामलों में ट्यूमर कोशिकाओं का औसत अनुपात सीमित था (15%, 10% से 20% तक), सफल मामलों के विपरीत जहां ट्यूमर सेल प्रतिशत 30% से 90% तक था। 15 असफल नमूनों में से, 11 छोटे ऊतक बायोप्सी (2 मिमी 2 के औसत क्षेत्र के साथ) से उत्पन्न हुए, जबकि 4 साइटोलॉजिकल नमूने (जैसे एंडोब्रोनचियल अल्ट्रासाउंड [ईबीयूएस]) थे।

एसएनवी और इंडेल का पता लगाने के लिए विधि की संवेदनशीलता 93.44% थी, सीएनवी के लिए 100% थी, और फ्यूजन के लिए 10% (तालिका 1) की न्यूनतम ट्यूमर सेल सामग्री के साथ 91.67% थी।

आणविक रिपोर्ट से एंडोस्कोपी नमूने से औसत टीएटी 72 घंटे (रेंज: 48-96 एच) था, निष्कर्षण से 24 घंटे की रिपोर्ट तक औसत टीएटी के साथ।

ऊपर वर्णित एनजीएस वर्कफ़्लो का विश्लेषणात्मक सत्यापन 30 एनएस-एनएससीएलसी मामलों पर किया गया था। सत्यापन ने हमारे केंद्र में पहले इस्तेमाल किए गए सोने के मानक तरीकों के साथ 100% सामंजस्य का प्रदर्शन किया और मूल प्रकाशन21 में विस्तार से सूचीबद्ध किया: आरटी-पीसीआर ईजीएफआर म्यूटेशन टेस्ट; आरटी-पीसीआर केआरएएस म्यूटेशन टेस्ट; एएलके आईएचसी, एल्क मछली; आरओएस 1 आईएचसी; आरओएस 1 मछली; बीआरएफवी 600 ई; और डीएनए /

एक ईजीएफआर / टीपी 53-उत्परिवर्ती फेफड़े के एडेनोकार्सिनोमा की आणविक रिपोर्ट के नमूने से बहु-चरण प्रक्रिया चित्रा 2 में चित्रित की गई है। एकीकृत जीनोमिक दर्शक (आईजीवी) सॉफ्टवेयर का उपयोग कर बायोप्सी नमूने में पाया उत्परिवर्तन का प्रतिनिधित्व पूरक चित्रा 2 में दिखाया गया है. रिपोर्टिंग सॉफ्टवेयर से उत्पन्न रिपोर्ट का एक उदाहरण पूरक चित्रा 3 में दिखाया गया है।

Figure 1
चित्रा 1: इस अध्ययन में प्रयुक्त पैनल वर्कफ़्लो का आरेख। यह आंकड़ा Ilié et al.21 की अनुमति से संशोधित किया गया है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: आणविक जीव विज्ञान रिपोर्ट के लिए नमूने से कई कदम। (ए) एंडोस्कोपी कक्ष से प्रयोगशाला में प्राप्त तीन ब्रोन्कियल बायोप्सी नमूने। (बी) ब्रोन्कियल बायोप्सी नमूने की हेमेटोक्सिलिन / ईोसिन / सफ्रान-सना हुआ स्लाइड लगभग 40% -50% ट्यूमर कोशिकाओं (100x आवर्धन) के साथ फेफड़े के एडेनोकार्सिनोमा दिखा रहा है। (सी) रिपोर्टिंग सॉफ्टवेयर से रिपोर्ट ट्यूमर नमूने में टीपी 53 उत्परिवर्तन से जुड़े ईजीएफआर उत्परिवर्तन दिखा रही है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

मरीजों की कुल संख्या 259
ब्रोन्कियल बायोप्सी 153
ट्रान्सथोरेसिक बायोप्सी 47
सर्जिकल नमूने 39
फुफ्फुस बहाव 13
ईबीयूएस 7
चालक उत्परिवर्ती जीन
केआरएएस 25.40%
ईजीएफआर 18.20%
बीआरएफ 6.30%
ईआरबीबी 2 1.70%
रूप 1.70%
जीन फ्यूजन
एएलके 4.30%
आरओएस 1 2.30%
आरईटी 1.95%
एनटीआरके 0.80%
विफलता - डीएनए मामले 10 मामले (4%)
विफलता - आरएनए मामले 5 मामले (2%)
ट्यूमर सेल्युलरिटी कट-ऑफ 10%
असफल मामलों में ट्यूमर कोशिकाओं की प्रतिशत सीमा 10%–20%
सफल मामलों में ट्यूमर कोशिकाओं की प्रतिशत सीमा 30%–90%
विधि की संवेदनशीलता
एसएनवी और आईएनडीईएल का पता लगाना 93.44%
CNV का पता लगाना 100%
फ्यूजन का पता लगाना 91.67%

तालिका 1: आणविक विश्लेषण के परिणाम। एनएस-एनएससीएलसी के साथ 259 रोगियों में आणविक विश्लेषण किया गया था, जिसमें 153 ब्रोन्कियल बायोप्सी, 47 ट्रांसथोरासिक बायोप्सी, 39 सर्जिकल नमूने और 13 फुफ्फुस बहाव और 7 ईबीयूएस से 25 सेलब्लॉक शामिल थे।

अनुपूरक चित्रा 1: एनजीएस ऑनकोमाइन सटीक परख जीएक्स पैनल में शामिल जीन। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक चित्रा 2: आईजीवी सॉफ्टवेयर का उपयोग करके बायोप्सी नमूने में पाए गए उत्पन्न रीड्स और म्यूटेशन का प्रतिनिधित्व। (ए) ईजीएफआर जीन और (बी) टीपी 53 जीन। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक चित्रा 3: रिपोर्टिंग सॉफ्टवेयर द्वारा उत्पन्न आणविक रिपोर्ट। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

किसी भी चरण एनएस-एनएसएलसी के निदान पर आणविक परिवर्तन मूल्यांकन के लिए रिफ्लेक्स परीक्षण के रूप में अल्ट्रा-फास्ट एम्पलीकॉन-आधारित एनजीएस दृष्टिकोण का विकास एनएस-एनएससीएलसी 5,22,23 में सभी दिशानिर्देश-अनुशंसित और उभरते बायोमार्कर का पता लगाने के लिए एक इष्टतम विकल्प है। जबकि अनुक्रमिक तरीके (आईएचसी, पीसीआर, मछली) केवल विशिष्ट जीन पर ध्यान केंद्रित करते हैं और ऊतक सामग्री थकावट में परिणाम कर सकते हैं, इस एनजीएस वर्कफ़्लो उत्परिवर्तन, संलयन और प्रवर्धन सहित 50 जीन की स्थिति का एक विशिष्ट और संवेदनशील मूल्यांकन की अनुमति देता है, यहां तक कि न्यूक्लिक एसिड की कम मात्रा के साथ (प्रत्येक डीएनए और आरएनए अनुक्रमण के लिए न्यूनतम 13 एनजी इस अध्ययन के अनुसार)।

इसके अलावा, यह विधि एनएस-एनएससीएलसी के रोगियों के प्रबंधन के लिए त्वरित और प्रासंगिक परिणाम प्रदान करती है। एक bespoke दृष्टिकोण की तुलना में, ट्यूमर चरण के आधार पर, विश्लेषण किए जाने वाले मामलों के प्रारंभिक चयन की अनुपस्थिति, और चिकित्सक के अनुरोध की प्रतीक्षा किए बिना उन्हें कीमती समय बचाने में सक्षम बनाता है। इस पंक्ति में, यह दिखाया गया है कि उन्नत एनएस-एनएससीएलसी के एनजीएस परीक्षण सीधे रोगी समग्र अस्तित्व24,25 को प्रभावित करता है। इसके अलावा, इन आणविक परिणाम अक्सर आईएचसी परिणामों से एक साथ प्राप्त कर रहे हैं, विशेष रूप से पीडी-एल 1 सकारात्मक ट्यूमर कोशिकाओं26 के प्रतिशत के मूल्यांकन के लिए. चिकित्सक पहली पंक्ति उपचार27 का सबसे अच्छा चिकित्सीय विकल्प के लिए आवश्यक सभी biomarkers के साथ ट्यूमर के "आणविक प्रोफ़ाइल" प्राप्त कर सकते हैं. विशिष्ट स्थितियों में, चिकित्सक जीनोमिक परिणामों 28,29,30,31 के अनुसार नैदानिक परीक्षण में रोगियों को नामांकित कर सकते हैं।

पैनल के साथ डीएनए और आरएनए विश्लेषण दोनों नियंत्रण (1 सकारात्मक और 1 नकारात्मक नियंत्रण) को छोड़कर, प्रति रन 2-14 रोगियों पर किया जा सकता है। प्रति सप्ताह तीन रन बनाना संभव है, जिसका अर्थ है कि 42 रोगी अपने ट्यूमर के अल्ट्रा-फास्ट एनजीएस प्रोफाइलिंग से लाभ उठा सकते हैं। शोधक प्रणाली, जो पुस्तकालय की तैयारी से पहले डीएनए और आरएनए की पूरी तरह से स्वचालित निष्कर्षण और मात्रा का ठहराव करती है, अनुक्रमण विश्लेषण की व्यवहार्यता के तेजी से मूल्यांकन को सक्षम बनाती है।

पुस्तकालय की तैयारी से पहले निकाले गए डीएनए और आरएनए की मात्रा निर्धारित करने की क्षमता, और न्यूक्लिक एसिड की छोटी मात्रा के साथ काम करने का विकल्प (डीएनए या आरएनए के न्यूनतम 10 एनजी से शुरू, विनिर्देशों के अनुसार) अनुक्रमण विश्लेषण व्यवहार्यता का तेजी से मूल्यांकन करने की अनुमति देता है।

एक एनजीएस दृष्टिकोण कार्रवाई योग्य बायोमार्कर का पता लगाने में अधिक व्यापक होने से थोरैसिक ऑन्कोलॉजी में नमूना वर्कफ़्लो के प्रबंधन को अनुकूलित करने में मदद कर सकता है। यह दिखाया गया है कि पीसीआर-आधारित विधि में कुछ दुर्लभ उत्परिवर्तन, विशेष रूप से ईजीएफआर एक्सॉन 20 सम्मिलन उत्परिवर्तन32 का पता लगाने में आंतरिक सीमाएं हैं। इस प्रकार, एनजीएस दृष्टिकोण रोगियों के उच्च अनुपात को बायोमार्कर-केंद्रित उपचार प्राप्त करने में सक्षम बनाता है। इस संदर्भ में, यह प्रदर्शित किया गया है कि सभी उन्नत एनएस-एनएससीएलसी के लिए एनजीएस रिफ्लेक्स परीक्षण लागत प्रभावीहै। इसके अलावा, पूरी तरह से स्वचालित न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण, पुस्तकालय की तैयारी, और इस एम्पलीकॉन-आधारित एनजीएस सिस्टम के साथ एकीकृत अनुक्रमण प्रयोगशाला कर्मचारियों के लिए एक महत्वपूर्ण समय बचाने वाला है।

हालांकि, एनएस-एनएससीएलसी के निदान के लिए एक रिफ्लेक्स परीक्षण के रूप में अल्ट्रा-फास्ट अगली पीढ़ी के अनुक्रमण (एनजीएस) को लागू करने से दैनिक नैदानिक अभ्यास में कुछ बाधाओं का सामना करना पड़ सकता है। जीन पैनल का दायरा (50 जीन शामिल है) व्यापक पैनलों की तुलना में कम है जिसमें कई सौ जीन34 शामिल हैं। पैनल में सभी अनुशंसित जीन शामिल हैं जो थोरैसिक ऑन्कोलॉजी में लक्षित चिकित्सा से जुड़े हैं। इसके अलावा, संभावित रोगनिरोधी मूल्य के साथ ब्याज के कुछ जीन शामिल नहीं हैं। उदाहरण के लिए, KEAP1, STK11, SMARCA4 और RB1 वर्तमान कार्य में उपयोग किए गए पैनल पर मौजूद नहीं हैं। एफडीए द्वारा अनुमोदित KRASG12C इनहिबिटर सोटोरसिब9 से लाभान्वित होने के लिए रोगियों के चयन के लिए ये जीन भविष्य में महत्वपूर्ण हो सकते हैं। एम्प्लिकॉन अनुक्रमण प्रौद्योगिकी के साथ अल्ट्रा फास्ट एनजीएस का उपयोग भी लापता दुर्लभ संलयन जीन भागीदारों35 के लिए क्षमता का परिचय हो सकता है. इसके अलावा, असंतुलन विश्लेषण कुछ झूठी सकारात्मक ALK पुनर्व्यवस्था शुरू में36. ALK असंतुलन संलयन का पता लगाने के लिए दहलीज नए संशोधित परख में वृद्धि हुई थी. हालांकि, ऑर्थोगोनल तकनीक (IHC और/या FISH) के साथ असंतुलन परिणाम को मान्य करने की अनुशंसा की जाती है।

इन सबसे ऊपर, यह वर्कफ़्लो आर्थिक स्थिरता और एनजीएस परीक्षण की प्रतिपूर्ति से संबंधित प्रश्न उठाता है, जो देश की स्वास्थ्य प्रणाली के आधार पर बहुत भिन्न हो सकता है, विशेष रूप से यूरोप37 में। लागत-प्रभावशीलता दृष्टिकोण के लिए, उपभोग्य सामग्रियों को बचाने के लिए एक ही समय में पर्याप्त नमूने चलाना अनिवार्य है, जो कभी-कभी संभव नहीं होता है, क्योंकि यह नमूना भर्ती और प्रयोगशाला35 पर निर्भर करता है। इसके अलावा, प्रयोगशाला कर्मचारियों के लिए एक अनावश्यक अतिरिक्त कार्यभार उत्पन्न करने की संभावना पर चर्चा की जानी चाहिए और चिकित्सकों, सर्जनों, रोगविज्ञानी और तकनीकी कर्मचारियों के बीच अच्छे संचार की आवश्यकता होती है।

डीएनए और आरएनए एनजीएस दोनों का एक साथ उपयोग आदर्श है लेकिन बहस योग्य है। यह जानते हुए कि लक्षित चिकित्सा के लिए अधिकांश जीनोमिक परिवर्तन परस्पर अनन्य38 हैं, पहले डीएनए और फिर आरएनए अनुक्रमण विश्लेषण करना संभव हो सकता है। हालांकि, इस रणनीति के परिणामस्वरूप रिपोर्ट तैयार करने के लिए एक लंबा टीएटी होगा।

निकाले गए न्यूक्लिक एसिड की मात्रा और गुणवत्ता दोनों की पर्याप्तता एनजीएस विश्लेषण की मजबूती सुनिश्चित करने में एक सीमा का प्रतिनिधित्व कर सकती है, विशेष रूप से हाइब्रिड कैप्चर अनुक्रमण तकनीक और व्यापक पैनलों से जुड़े मामलों में जिन्हें उच्च टीएटी6 के साथ अधिक मात्रा में सामग्री की आवश्यकता होती है। इस संबंध में, इस एम्पलीकॉन आधारित एनजीएस प्रणाली पैनल के लिए डीएनए और शाही सेना के केवल 13 एनजी की आवश्यकता का लाभ प्रदान करता है और एक बहुत कम समग्र विफलता दर है. यह थोरैसिक ऑन्कोलॉजी में अत्यधिक मूल्यवान है क्योंकि नमूनों का आकार छोटा और छोटा 20,39,40 हो रहा है।

आणविक परीक्षण के संकेत लगातार वक्ष ऑन्कोलॉजी में बदल रहे हैं और, कुछ जीन परिवर्तन के लिए, अब सहायक सेटिंग्स15 में सिफारिश कर रहे हैं. हमारी राय में, यह अत्यधिक संभावना है कि नियमित नैदानिक अभ्यास में प्रारंभिक चरण एनएस-एनएससीएलसी के उपचार के लिए कई अतिरिक्त लक्षित उपचार सामने आएंगे, जो निदान पर बायोमार्कर की तुरंत खोज करने की आवश्यकता को मजबूत करते हैं। एक साथ लिया गया, फेफड़ों के कैंसर में सटीक दवा में वर्तमान प्रगति एक अल्ट्रा-फास्ट एनजीएस दृष्टिकोण का पक्ष लेगी जो ट्यूमर के अधिक व्यापक, तेजी से और सामग्री-बचत आणविक रूपरेखा की अनुमति देता है।

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Disclosures

क्रिस्टोफ़ बोंटॉक्स पेड स्पीकर गतिविधियों में भाग लेता है और थर्मो फिशर साइंटिफिक से लाभ प्राप्त करता है। पॉल हॉफमैन पेड स्पीकर गतिविधियों में भाग लेते हैं और थर्मो फिशर साइंटिफिक से लाभ और धन प्राप्त करते हैं।

Acknowledgments

हम थर्मो फिशर साइंटिफिक को धन्यवाद देते हैं कि उन्होंने हमें अपने उपकरण और सामग्रियों का उपयोग करने की संभावना दी।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96 well hard shell plate clear Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) 4483354
Adhesive PCR Plate Foil Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) AB0626
AutoLys M tube  Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) A38738 FFPE sample processing tubes
Genexus Barcodes 1-32 HD Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) A40261
Genexus GX5 Chip and Genexus Coupler Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) A40269
Genexus Pipette Tips Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) A40266
Genexus Purification Instrument Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) A48148 Automated purification instrument (API)
Genexus Sequencing Kit Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) A40271
Genexus Templating Strips 3-GX5 and 4 Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) A40263
Genexus Integrated Sequencer Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) A45727
Ion Torrent  Genexus FFPE DNA/RNA Purification Combo Kit Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) A45539
Oncomine  Precision Assay GX (OPA) Panel (included Strips 1 and 2-HD) Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) A46291

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अल्ट्रा-फास्ट एम्पलीकॉन-आधारित अगली पीढ़ी के अनुक्रमण गैर-स्क्वैमस गैर-छोटे सेल फेफड़ों के कैंसर आणविक परिवर्तन लक्षित चिकित्सा आणविक असामान्यताओं का पता लगाना उन्नत या मेटास्टैटिक एनएस-एनएससीएलसी लक्षित चिकित्सा समग्र उत्तरजीविता प्रतिरोध के तंत्र उपन्यास चिकित्सा उपचार प्रतिक्रिया आणविक लक्षण वर्णन लघु बदलाव समय (टीएटी) अंतर्राष्ट्रीय दिशानिर्देश ऊतक बायोप्सी जीनोमिक विश्लेषण कम इनवेसिव तरीके और प्रोटोकॉल पैथोलॉजिस्ट कुशल और तेजी से निदान रणनीति
गैर-स्क्वैमस गैर-छोटे सेल फेफड़ों के कैंसर में अल्ट्रा-फास्ट एम्पलीकॉन-आधारित अगली पीढ़ी का अनुक्रमण
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Bontoux, C., Lespinet-Fabre, V.,… More

Bontoux, C., Lespinet-Fabre, V., Bordone, O., Tanga, V., Allegra, M., Salah, M., Lalvée, S., Goffinet, S., Benzaquen, J., Marquette, C. H., Ilié, M., Hofman, V., Hofman, P. Ultra-Fast Amplicon-Based Next-Generation Sequencing in Non-Squamous Non-Small Cell Lung Cancer. J. Vis. Exp. (199), e65190, doi:10.3791/65190 (2023).

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