Summary
Økningen av molekylære biomarkører som skal testes for ikke-plateepitel ikke-småcellet lungekreft (NS-NSCLC) omsorgsstyring har ført til utvikling av raske og pålitelige molekylære deteksjonsmetoder. Vi beskriver en arbeidsflyt for genomisk endringsvurdering for NS-NSCLC-pasienter ved hjelp av en ultra-rask-neste generasjons sekvensering (NGS) tilnærming.
Abstract
Antall molekylære endringer som skal testes for målrettet terapi av ikke-plateepitel ikke-småcellet lungekreft (NS-NSCLC) pasienter har økt betydelig de siste årene. Påvisning av molekylære abnormiteter er obligatorisk for optimal behandling av avanserte eller metastatiske NS-NSCLC-pasienter, slik at målrettede behandlinger kan administreres med en forbedring i total overlevelse. Likevel utvikler disse svulstene resistensmekanismer som potensielt kan målrettes ved hjelp av nye terapier. Noen molekylære endringer kan også modulere behandlingsresponsen. Den molekylære karakteriseringen av NS-NSCLC må utføres på kort behandlingstid (TAT), på mindre enn 10 virkedager, som anbefalt av de internasjonale retningslinjene. I tillegg er opprinnelsen til vevsbiopsiene for genomisk analyse mangfoldig, og deres størrelse reduseres kontinuerlig med utviklingen av mindre invasive metoder og protokoller. Følgelig blir patologer utfordret til å utføre effektiv molekylær teknikk samtidig som de opprettholder en effektiv og rask diagnosestrategi. Her beskriver vi den ultraraske amplikonbaserte arbeidsflyten for neste generasjons sekvensering (NGS) som brukes i daglig rutinepraksis ved diagnose for NS-NSCLC-pasienter. Vi viste at dette systemet er i stand til å identifisere de nåværende molekylære målene som brukes i presisjonsmedisin i thorax onkologi i en passende TAT.
Introduction
I løpet av det siste tiåret har utviklingen av målrettede og immunterapier signifikant økt den totale overlevelsen (OS) av ikke-plateepitel ikke-småcellet lungekreft (NS-NSCLC)1,2. I denne forbindelse har antall obligatoriske gener og molekylære mål for å analysere ved behandling av NS-NSCLC økt de siste årene 3,4.
Gjeldende internasjonale retningslinjer anbefaler å teste EGFR, ALK, ROS1, BRAF, NTRK, RET og MET ved diagnostisering av avansert NS-NSCLC5. Dessuten, ettersom nye legemidler nylig har gitt svært lovende resultater i kliniske studier, vil ytterligere genomiske endringer snart bli screenet i en rekke tilleggsgener, spesielt KRAS og HER2, sammen med BRAC1 / BRAC2, PI3KA, NRG1 og NUT 6,7,8,9. I tillegg kan statusen til forskjellige assosierte gener, som STK11, KEAP1 og TP53, være av sterk interesse for en bedre prediksjon av respons eller motstand mot noen målrettede terapier og/eller immunkontrollpunkthemmere (ICI)10,11,12.
Det er viktig at de molekylære endringene rapporteres uten betydelig forsinkelse for å sikre nøye klinisk beslutningstaking. Fraværet av molekylær karakterisering av en svulst kan føre til initiering av ikke-målrettede terapier som kjemoterapi med / uten immunterapi, noe som fører til en suboptimal behandlingsstrategi, da kjemoterapirespons er begrenset hos pasienter med handlingsbare endringer, som EGFR-mutasjoner eller genfusjoner13.
Videre kan den nåværende utviklingen av målrettede terapier / immunterapier i neoadjuvante og / eller adjuvante innstillinger føre til systematisk å lete etter, i det minste, EGFR - og ALK-endringer i tidlig stadium NS-NSCLC, da ICI bare skal administreres i svulster som er villtype for EGFR og ALK14. Det er nå også obligatorisk å teste for tilstedeværelse av EGFR-mutasjoner i tidlig stadium NS-NSCLC, siden osimertinib (en tredjegenerasjons EGFR-tyrosinkinasehemmer ) kan brukes som adjuvant behandling ved EGFR-mutert NS-NSCLC15.
Strategien for vurdering av de ulike biomarkørene for å forutsi respons på ulike målrettede terapier og/eller immunterapier hos NS-NSCLC-pasienter går raskt, noe som gjør identifiseringen av disse biomarkørene sekvensielt vanskelig 3,16. I denne forbindelse er Next-Generation Sequencing (NGS) nå den optimale tilnærmingen for parallell vurdering av genendringer med høy gjennomstrømning i NS-NSCLC 5,17.
NGS-arbeidsflyten kan imidlertid være vanskelig å mestre og kan utføre til lengre TAT 18,19. Dermed utfører mange sentre fortsatt sekvensielle tilnærminger (immunhistokjemi (IHC), fluorescens in situ hybridisering (FISH) og / eller målrettet sekvensering). Denne strategien er imidlertid begrenset i tilfelle av liten prøvestørrelse og fremfor alt på grunn av det økte antallet handlingsbare mutasjoner som kreves for å bli testet i NS-NSCLC20. Dermed har ultra-raske og enkle testmetoder som tillater rask vurdering av genendringer, blitt stadig viktigere for optimal klinisk beslutningstaking. Videre blir godkjente og akkrediterte systemer for molekylær testing obligatorisk for forskrivning av spesifikke målrettede terapier.
Her beskriver vi en ultrarask og automatisert forsterkerbasert DNA / RNA NGS-analyse for molekylær testing av NS-NSCLC som brukes i laboratoriet for klinisk og eksperimentell patologilaboratorium (LPCE), Nice universitetssykehus, Frankrike og er akkreditert i henhold til ISO 15189-normen av den franske akkrediteringskomiteen (COFRAC) (https://www.cofrac.fr/). COFRAC sertifiserer at laboratoriet oppfyller kravene i standarden ISO 15189 og COFRAC-bruksregler for aktivitetene testing / kalibrering i molekylær analyse i automatisert NGS på en sequencer med panelet utført av laboratoriet. Akkreditering i henhold til anerkjent internasjonal standard ISO 15189 demonstrerer laboratoriets tekniske kompetanse for et definert omfang og riktig drift av et passende styringssystem i dette laboratoriet. Fordelene og begrensningene ved denne arbeidsflyten, fra utarbeidelse av vevsbiopsiprøver til innhenting av rapporten, diskuteres.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prosedyrer er godkjent av den lokale etiske komiteen (Human Research Ethics Committee, Centre Hospitalier Universitaire de Nice, Tumorothèque BB-0033-00025). Det ble innhentet informert samtykke fra alle pasientene til å bruke prøver og genererte data. Alle prøver ble innhentet fra pasienter diagnostisert med NS-NSCLC i LPCE (Nice, Frankrike) mellom 20 september og 31 januar 2022 som en del av den medisinske behandlingen.
1. Fremstilling av FFPE DNA- og RNA-prøver ved hjelp av automatisert renseinstrument (API) (Behandlingstid: 5 t 15 min)
- Kjør planlegging på instrumentet.
- Slå på instrumentet og logg på med brukernavn og passord (materialfortegnelse). Opprett en plan for rensingskjøring ved å klikke på Kjør, deretter Legg til plan og ved å gi kjøreplanen et navn.
- Velg deretter riktig rensesett og protokoll for sekvensiell rensing av DNA og RNA fra formalinfaste parafin-innebygde (FFPE) prøver. Aktiver kvantifisering etter rensing.
- Velg ønsket elueringsvolum (50 μL) fra rullegardinlisten, og klikk deretter på Neste. Velg antall prøver som skal trekkes ut.
- Merk deretter hvert eksempel, klikk Rediger, skriv inn eksempel-ID, og klikk deretter Lagre.
- Forbered FFPE DNA- og RNA-prøver ved hjelp av GPI
- Forbered FFPE-vevsprøver (4 skjæreseksjoner à 10 μm med mikrotom) eller utfør makrodisseksjon direkte på FFPE-blokker. Plasser hver FFPE-vevsprøve i separerte og identifiserte FFPE-prøvebehandlingsrør (materialfortegnelse).
- Sentrifuge ved 2000 x g i 1 min for å samle vevet i bunnen av rørene.
- Legg til hvert FFPE-prøvebehandlingsrør en protease-sammendragsmasterblanding fremstilt fra et nukleinsyrerensesett og inkuber ved 60 °C i minst 60 minutter (materialfortegnelse). Inkuber prøvene ved 90 °C i 60 minutter.
- Etter inkubering, la prøvene avkjøles i 5 minutter ved romtemperatur (RT).
- For hvert FFPE-prøvebehandlingsrør, løft det indre røret, lås det ved å dreie til venstre, og sentrifugere deretter prøvene ved 2000 x g i 10 minutter.
- Lås opp de indre rørene ved å vri til høyre, skille dem fra de ytre rørene, og kast dem. Oppbevar prøvene i de ytre rørene på is til de legges på API-en.
- Forbered en DNase fordøyelse master mix og legg den i ferdigfylt FFPE DNA og RNA rensing plate 2. Legg deretter de preparerte prøvene i FFPE DNA og RNA renseplate 1 (materialfortegnelse).
- Start rensekjøringen på API.
- Klikk på Kjør på API-skjermen, velg Kjør plan og klikk deretter på Neste.
- Følg indikasjonene på skjermen for å laste API-en med de nødvendige forbruksvarer og reagenser som trengs for rensekjøringen (materialfortegnelse).
- Når alle reagensene er lastet, klikker du Neste. Lukk API-døren og klikk på Start.
- På slutten av løpet, klikk « losse » på berøringsskjermen og umiddelbart fjerne 48-brønns nukleinsyre arkivplate som inneholder renset prøve DNA og RNA.
- Eksporter kvantifiseringsresultatene. Forsegl platen og oppbevar rensede prøver ved -80 °C. Overfør 96-brønnplaten til sequenceren som skal analyseres.
- Opprett et eksempel, og opprett et løp.
- Åpne og logg på programvaren, velg deretter i menylinjen Eksempler og klikk Opprett eksempel.
- Skriv inn prøvens navn, kjønn og prosentandel av tumorceller, og fyll ut de obligatoriske feltene og valgfrie feltene om nødvendig.
- Lagre detaljene (kjønn og prosentandel av tumorceller er viktige for å analysere kopinummervarianter [CNV]).
- Velg Løp og nukleinsyre for å resultere i menylinjen.
- Skriv inn kjørenavnet i installasjonstrinnet . Klikk på Neste.
- Velg analysen i analysetrinnet. Klikk på Neste.
- Velg eksemplene i Prøver-trinnet som skal kjøres med analysen.
- Deretter klikker du Tilordne i ruten Valgte analyser. Klikk på Neste.
- Se gjennom prøveposisjonene på prøveinndataplaten. Klikk på Neste.
- Se gjennom sammendraget av kjøreplanen, og deretter Lagre og skriv ut eller Lagre.
2. Automatisert NGS på sequenceren (Behandlingstid: 30 min)
- Legg prøveplaten.
MERK: Den optimale nukleinsyrekonsentrasjonen er 0,5 ng / μL. Det validerte nukleinsyrekonsentrasjonsområdet er 0,33-1 ng / μL. For DNA og RNA ble 1 ng / μL konsentrasjon validert i laboratoriet.- Sequenceren krever 20 μL totalt volum. Forsikre deg om at det er tilstrekkelig volum for prøvelasting.
- Legg til positive kontroller (DNA og RNA) og NTC (DNA og RNA) til 1. trinn av renseinstrumentet uten å bli ekstrahert. Bruk DNA- og RNA-kontroller for hver kjøring for å validere kjøringen og validere partiene som brukes. Legg til DNA- og RNA-kontroller på platen på slutten av API-kjøringen.
- Last inn sequenceren og start en løpetur.
- Fjern alle reagensene fra boksene i kjøleskapet eller fryseren og tine ved RT i minst 30 minutter (materialfortegnelse) og maksimalt 12 timer.
- I laboratoriet må du alltid holde sequenceren slått PÅ i henhold til rådene fra leverandøren under opplæringen på stedet. Logg på systemet.
- Legg platen fra renseinstrumentet, som inneholder prøver, etter å ha forseglet platen med et ark med selvklebende PCR-platefolie (materialfortegnelse).
- Installer alle forbruksvarer i dekk. Sequenceren gir trinnvise instruksjoner for å laste hver nødvendig forbruksvare i en uthevet posisjon (materialfortegnelse).
- Kontroller at det ikke er utfelling på tube 3 på Strip 2-HD. Knips røret eller virv forsiktig strimmelen for å løse opp bunnfallet om nødvendig.
- Strip 1 og Strip 3 inneholder magnetiske perler. Dette trinnet er veldig kritisk: sørg for at perlene er suspendert. Det skal ikke være perler igjen i den øvre delen av røret.
- Snu stripen opp ned og tilbake 3-4 ganger for å fjerne perlene. Hold stripen i den ene enden med stripetetningen orientert oppover. Etterpå svinger du stripen raskt nedover ved hjelp av en rask, sentrifugal armbevegelse, og avslutter med å gi et skarpt knips på håndleddet.
- Sentrifuge ved 300 x g i 15 s. Gjenta om nødvendig. Sentrifuger strimlene med adaptere og stripholdere for å minimere feil observert tilfeldig i forbindelse med rester av baller i øvre del av strimlene.
- Lukk systemet og klikk på Neste. Monter sekvenseringsreagenskarnappdørene (materialfortegnelse). Lukk døren. Sequenceren starter automatisk kjøringen.
- Renhold
- For rengjøring etter løpet, når kjøringen er fullført, klikker du Neste.
- Døren åpnes suksessivt. Følg instruksjonene på skjermen for å tømme avfallet og fjerne alle forbruksvarer. Klikk på Neste.
- Lukk visningen når du er ferdig, klikk Neste. En 2 min UV-rengjøring starter. Sequenceren er klar til å starte et nytt løp.
3. Analyse av resultatene ved hjelp av den integrerte programvaren (Analysetid av pasient [prøver ADN og ARN]: 15 min)
MERK: Teknikken er akkreditert av den franske akkrediteringskomiteen (COFRAC) ISO 15189 (https://www.cofrac.fr/)
- Data og resultater
- Velg et kjøreresultat eller et eksempelresultat på Resultater-menyen . I skjermbildet Resultater / Kjør er alle løpene oppført.
- Søk i resultatlisten ved å filtrere i en kolonneoverskrift.
- Klikk Resultater , og klikk Eksempelresultater. Klikk deretter navnet på utvalget av interesse i eksempelnavnkolonnen for å vise sekvensresultater for et unikt eksempel.
- Klikk på Kolonner øverst til venstre på skjermen, eller fjern merkingen av kolonnene fra tabellen.
- Se QC-resultatene og se amplicondekningen.
- Klikk kategorien QC i skjermbildet Resultater .
- For DNA, sørg for at median absolutte parvise forskjeller (MAPD) er mellom 0 og 0,5 for å validere kopinummervarianter (CNV) analyse. De kartlagte avlesningene må være større enn 1,5 millioner.
- For RNA, sjekk om de kartlagte lesningene er mellom 150 000 og 400 000. Under dette er det en risiko for falske negativer, og utover det er det fare for falske positiver.
- Klikk et eksempelnavn for å åpne kategorien Nøkkelfunn .
- Bla til amplion dekningsgrafer.
- Se gjennom dekningsdiagrammene. Definer minimumsterskelen for amplicondekningen, da leverandøren ikke gir den. Hvis du vil definere et område og en terskelverdi, blander du en kontroll og en villtypeprøve (WT). Deretter observerer du den minste verdien av amplikondekningen for en eller flere utvalgte mutasjoner.
- Vis variantresultater.
- Hvis du vil eksportere dataene i tabellformat, klikker du Eksporter øverst til høyre på skjermen.
- For å se resultatet av en enkelt nukleotidvariant/innsetting-delesjonsvariant (SNV/INDEL), klikk på kategorien Varianter , og klikk deretter SNVs/Indels. Klikk på Rediger filtre, og velg Ingen filter.
MERK: Sensitivitetsgrensen er definert til 5% i henhold til anbefalingene fra INCA (French National Cancer Institute) gruppe (https://www.e-cancer.fr/Professionnels-de-sante/Les-therapies-ciblees/Les-plateformes-de-genetique-moleculaire-des-cancers/Le-programme-d-assurance-qualite-des-plateformes). - Se Fusion-resultater og se RNA Exon Variants: Klikk på Varianter-fanen, og klikk deretter på Fusions.
- Klikk på Visualisering og RNA Exon Variant øverst til høyre, og se deretter gjennom RNA Exon Variants-plottet .
- Med dette settet kan eksonhopping av EGFR-, MET- og AR-genene oppdages. Klikk på Visualisering; Det er lettere å analysere.
- Se ubalanse i fusjon av RNA-eksonfliser: Klikk på Varianter-fanen , og klikk deretter på Fusjoner.
- Klikk på Visualisering og RNA Exon Tile Fusion Imbalance øverst til høyre, og se deretter gjennom RNA Exon Tile Fusion Imbalance-plottene . En ubalansefusjon er en fusjon mellom en kjent partner og en partner som ikke dekkes av panelet.
- Se CNV-resultater: Klikk på CNV-er i kategorien Varianter for å vise dataene.
MERK: Det er nødvendig å være årvåken med resultatene av CNV ved å informere under utarbeidelsen av prøvene av kjønn og prosentandelen av tumorceller i prøven. AR-genet bæres bare av X-kromosomet . Hvis kjønn ikke er spesifisert, kan det mannlige kjønn oppleve tap, noe som fører til falske positive resultater hos mannlige pasienter.
- Se gjennom plugin-resultater.
- Se gjennom resultatene av plugin-modulen for dekningsanalyse : Klikk og velg last ned filer øverst til høyre.
- Dekningsanalyse-plugin genererer en dekningsanalyserapport.
- Gjennomgå molekylære dekningsanalyse-pluginresultater : Klikk og velg last ned filer øverst til høyre. Denne analysen verifiserer om alle forsterkerne er dekket og bekrefter resultatene av kopinummervarianter (CNV) levert av programvaren.
- Vise analysemåledata og kjørerapporten
- Klikk kategorien Kjør rapport i Kjøresammendrag.
- Hvis du vil vise Kjør-rapporten, velger du alternativet Velg eksempel på rullegardinmenyen.
- Analyseberegninger og kjørerapporten: Finn sekvensberegningene øverst på skjermen, etterfulgt av eksempelspesifikke beregninger i Kjør eksempler-tabellen .
Informasjon i CSA-filen (Customer Support Archive) kan bidra til å feilsøke resultater, men de kan ikke analyseres direkte. CSA-filene oppsummerer dataene for hele kjøredataene og fremhever årsakene til et problem i tilfelle en mislykket kjøring. - Last ned en kjørerapport: Klikk på Rapporter-fanen.
- Klikk på Last ned rapport for å laste ned et sammendrag av kjørerapporten i PDF-format.
- Generer variantrapport.
- Aktiver Generer rapport i oppsetttrinnet for automatisk å generere en variantrapport for hvert eksempel under dataanalyse av en kjøring.
- Når variantrapporten er generert for et utvalg, gjør systemet rapporten tilgjengelig på to steder: Først gjøres en kobling tilgjengelig i skjermbildet Resultater/eksempelresultater . Klikk på koblingen for å laste ned PDF-filen.
- For det andre, gå til Variantrapport-ruten i kategorien Rapporter og klikk på Last ned rapport-knappen . Signer variantrapportene elektronisk eller manuelt.
MERK: Elektronisk signerte rapporter har (Logg av) etter eksempelnavnet i skjermbildet Eksempelresultater .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved hjelp av prosedyren som presenteres her, beskrevet i detalj i våre siste publikasjoner21, utviklet vi en optimal arbeidsflyt for vurdering av molekylær endring som reflekstesting i rutinemessig utført klinisk praksis for diagnose hos pasienter med NS-NSCLC ved hjelp av en ultra-rask forsterkerbasert neste generasjons sekvenseringstilnærming. Den molekylære arbeidsflyten til metoden er vist i figur 1. Listen over gener som inngår i panelet er vist i tilleggsfigur 1.
Molekylær analyse ble utført hos 259 pasienter med NS-NSCLC. Den inkluderte 153 bronkialbiopsier, 47 transtorakale biopsier, 39 kirurgiprøver og 25 celleblokker fra 13 pleuravæske og 7 EBUS (tab 1). Følgende drivermuterte gener ble observert i 242 gyldige eller tilgjengelige NGS DNA/RNA-analyser: KRAS (25,4 %), EGFR (18,2 %), BRAF (6,3 %), ERBB2 (1,7 %) og MTT (1,7 %). Følgende genfusjoner ble rapportert: ALK (4,3 %), ROS1 (2,3 %), RET (1,9 %) og NTRK (0,8 %). Etter endringer ble det påvist en forekomst under 1 % (f.eks. IDH1, CDKN2A, FGFR3, KIT, MTOR, FGFR4. NTRK3, NRAS, PIK3CA, IDH2, ERBB3, ERBB4, AR, CHECK2, SMO, PTEN). For DNA mislyktes 10 tilfeller (4%), mens 5 tilfeller (2%) mislyktes for RNA. Svikten skyldtes dårlig kvalitet på DNA/RNA og/eller lav mengde DNA/RNA. Mislykket analyse skjedde bare med prøver med mindre enn 10% tumorcellularitet. Dermed definerte vi tumorcellularitetsgrensen ved 10%. For DNA NGS-resultater passerte 10 tilfeller (4%) ikke på grunn av enten den lave kvaliteten på nukleinsyrer (6 tilfeller) eller utilstrekkelige nukleinsyremengder (4 tilfeller med <13 ng DNA). Tilsvarende mislyktes fem tilfeller (2%) for RNA-sekvenseringsresultater på grunn av både utilstrekkelig RNA-kvalitet og en lav mengde RNA (<13 ng RNA). Den gjennomsnittlige andelen tumorceller i de mislykkede tilfellene var begrenset (15%, varierende fra 10% til 20%), i motsetning til de vellykkede tilfellene hvor tumorcelleprosentene varierte fra 30% til 90%. Blant de 15 mislykkede prøvene stammet 11 fra små vevsbiopsier (med et gjennomsnittlig areal på 2 mm2), mens 4 var cytologiske prøver (som endobronkial ultralyd [EBUS]).
Sensitiviteten til metoden for påvisning av SNV og INDEL var 93,44%, for CNV var 100%, og for fusjoner var 91,67% med et minimum tumorcelleinnhold på 10% (tabell 1).
Gjennomsnittlig TAT fra endoskopi prøvetaking fra molekylrapporten var 72 timer (område: 48-96 timer), med en gjennomsnittlig TAT fra ekstraksjon til rapport på 24 timer.
Den analytiske valideringen av den ovenfor beskrevne NGS-arbeidsflyten ble utført på 30 NS-NSCLC-tilfeller. Valideringen viste 100% samsvar med gullstandardmetodene som tidligere ble brukt ved vårt senter og oppført i detalj i den opprinnelige publikasjonen21: RT-PCR EGFR Mutation Test; RT-PCR KRAS mutasjonstest; ALK IHC, ALK FISK; ROS1 IHC; ROS1 FISK; BRAFV600E; og DNA/RNA NGS-metoder.
Multitrinnsprosedyren fra prøvetaking til molekylær rapport om et EGFR/TP53-mutert lungeadenokarsinom er avbildet i figur 2. Representasjonen av mutasjonen funnet i biopsiprøven ved hjelp av IGV-programvare (integrative genomic viewer) er vist i tilleggsfigur 2. Et eksempel på en generert rapport fra rapporteringsprogramvaren er vist i tilleggsfigur 3.
Figur 1: Diagram over panelarbeidsflyten som ble brukt i denne studien. Denne figuren er modifisert med tillatelse fra Ilié et al.21. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Flere trinn fra prøvetaking til molekylærbiologisk rapport. (A) Tre bronkialbiopsiprøver mottatt i laboratoriet fra endoskopirommet. (B) Hematoksylin / Eosin / Safran-farget lysbilde av bronkial biopsi prøve som viser en lunge adenokarsinom med ca 40% -50% av tumorceller (100x forstørrelse). (C) Rapport fra rapporteringsprogramvaren som viser en EGFR-mutasjon assosiert med en TP53-mutasjon i tumorprøven. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Totalt antall pasienter | 259 |
| Bronkial biopsier | 153 |
| Transtorakale biopsier | 47 |
| Kirurgiske prøver | 39 |
| Pleural effusjon | 13 |
| EBUS | 7 |
| Driver muterte gener | |
| KRAS | 25.40% |
| EGFR | 18.20% |
| BRAF | 6.30% |
| ERBB2 | 1.70% |
| MØTTE | 1.70% |
| Genfusjoner | |
| ALK | 4.30% |
| ROS1 | 2.30% |
| RET | 1.95% |
| NTRK | 0.80% |
| Svikt - DNA-saker | 10 tilfeller (4 %) |
| Feil - RNA-tilfeller | 5 tilfeller (2 %) |
| Tumor cellularitet cut-off | 10% |
| Prosentvis utvalg av tumorceller i de mislykkede tilfellene | 10%–20% |
| Prosentvis utvalg av tumorceller i vellykkede tilfeller | 30%–90% |
| Sensitivitet av metoden | |
| Påvisning av SNV og INDELs | 93.44% |
| Påvisning av CNVer | 100% |
| Påvisning av fusjoner | 91.67% |
Tabell 1: Utfall av molekylær analyse. Molekylær analyse ble utført hos 259 pasienter med NS-NSCLC, inkludert 153 bronkialbiopsier, 47 transtorakale biopsier, 39 kirurgiske prøver og 25 celleblokker fra 13 pleuravæske og 7 EBUS.
Tilleggsfigur 1: Genene som inngår i NGS oncomine precision assay GX-panelet. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfigur 2: Representasjon av genererte avlesninger og mutasjoner funnet i biopsiprøven ved hjelp av IGV-programvare. (A) EGFR-genet og (B) TP53-genet . Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfigur 3: Molekylær rapport generert av rapporteringsprogramvaren. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Utviklingen av en ultrarask forsterkerbasert NGS-tilnærming som reflekstesting for molekylær endringsvurdering ved diagnose av ethvert stadium NS-NSLC er et optimalt alternativ for påvisning av alle retningslinjeanbefalte og nye biomarkører i NS-NSCLC 5,22,23. Mens sekvensielle metoder (IHC, PCR, FISH) bare fokuserer på spesifikke gener og kan resultere i utmattelse av vevsmateriale, tillater denne NGS-arbeidsflyten en spesifikk og sensitiv evaluering av statusen til 50 gener, inkludert mutasjoner, fusjoner og amplifikasjoner, selv med en lav mengde nukleinsyre (minimum 13 ng for hver DNA- og RNA-sekvensering i henhold til denne studien).
I tillegg gir denne metoden raske og relevante resultater for behandling av pasienter med NS-NSCLC. Sammenlignet med en skreddersydd tilnærming, kan fraværet av et innledende utvalg av tilfeller som skal analyseres, avhengig av tumorstadiet, og uten å vente på legenes forespørsel, gjøre det mulig for dem å spare dyrebar tid. I denne linjen er det vist at NGS-testing av avansert NS-NSCLC direkte påvirker pasientens totale overlevelse24,25. I tillegg oppnås disse molekylære resultatene ofte samtidig fra IHC-resultatene, spesielt for evaluering av prosentandelen PD-L1 positive tumorceller26. Legen kan få den "molekylære profilen" av svulsten med alle biomarkørene som kreves for det beste terapeutiske valget av førstelinjebehandling27. I spesifikke situasjoner kan legen registrere pasientene i en klinisk studie i henhold til genomiske resultater 28,29,30,31.
Både DNA- og RNA-analyse med panelet kan utføres på 2-14 pasienter per kjøring, unntatt kontroller (1 positiv og 1 negativ kontroll). Det er mulig å gjøre tre løp per uke, noe som betyr at 42 pasienter kan dra nytte av en ultrarask NGS-profilering av svulsten. Rensesystemet, som utfører helautomatisk ekstraksjon og kvantifisering av DNA og RNA før bibliotekforberedelse, muliggjør rask evaluering av gjennomførbarheten av sekvenseringsanalysene.
Evnen til å kvantifisere ekstrahert DNA og RNA før bibliotekforberedelse, og muligheten til å arbeide med små mengder nukleinsyre (fra minimum 10 ng DNA eller RNA, i henhold til spesifikasjonene) tillater en rask vurdering av levedyktighet for sekvenseringsanalyse.
En NGS-tilnærming kan bidra til å optimalisere styringen av prøvearbeidsflyten i thorax onkologi ved å være mer omfattende i påvisning av handlingsbare biomarkører. Det er vist at den PCR-baserte metoden har iboende begrensninger i påvisning av noen sjeldne mutasjoner, spesielt EGFR ekson 20 innsettingsmutasjoner32. Dermed gjør NGS-tilnærmingen det mulig for en høyere andel pasienter å motta biomarkørfokuserte terapier. I denne sammenheng er det vist at NGS-reflekstesting for all avansert NS-NSCLC er kostnadseffektiv33. Videre er den helautomatiske nukleinsyreekstraksjonen, bibliotekforberedelsen og sekvenseringen integrert med dette amplikonbaserte NGS-systemet en betydelig tidsbesparelse for laboratoriepersonalet.
Imidlertid kan implementering av ultrarask neste generasjons sekvensering (NGS) som reflekstesting for diagnostisering av NS-NSCLC støte på visse begrensninger i daglig klinisk praksis. Genpanelets omfang (som omfatter 50 gener) er færre sammenlignet med de omfattende panelene som består av flere hundre gener34. Panelet inneholder alle anbefalte gener som er assosiert med en målrettet terapi i thorax onkologi. Videre er noen gener av interesse med potensiell prognostisk verdi ikke inkludert. For eksempel er KEAP1, STK11, SMARCA4 og RB1 ikke til stede på panelet som brukes i det foreliggende arbeidet. Disse genene kan være viktige i fremtiden for utvelgelse av pasienter til å dra nytte av FDA-godkjente KRASG12C-hemmere sotorasib9. Bruk av ultrarask NGS med amplikonsekvenseringsteknologi kan også introdusere potensialet for manglende sjeldne fusjonsgenpartnere35. I tillegg avdekket ubalanseanalysene noen falskt positive ALK-omlegginger innledningsvis36. Terskelen for å oppdage ALK-ubalansefusjoner ble økt i den nye modifiserte analysen. Det anbefales imidlertid å validere et ubalanseresultat med en ortogonal teknikk (IHC og/eller FISH).
Fremfor alt reiser denne arbeidsflyten spørsmål knyttet til økonomisk bærekraft og refusjon av NGS-testen, som kan variere sterkt avhengig av landets helsesystem, spesielt i Europa37. For kostnadseffektivitetstilnærmingen er det viktig å kjøre nok prøver samtidig for å spare på forbruksvarer, noe som noen ganger ikke er mulig, da det avhenger av prøverekrutteringen og laboratoriet35. Videre bør muligheten for å generere en unødvendig ekstra arbeidsbelastning for laboratoriepersonalet diskuteres og krever god kommunikasjon mellom leger, kirurger, patologer og teknisk personale.
Samtidig bruk av både DNA og RNA NGS er ideell, men kan fortsatt diskuteres. Å vite at de fleste genomiske endringene for målrettet terapi er gjensidig utelukkende38, kan det være mulig å først utføre DNA og deretter RNA-sekvenseringsanalyse. Imidlertid vil denne strategien følgelig føre til en lengre TAT for å generere en rapport.
Tilstrekkeligheten av både mengden og kvaliteten på ekstraherte nukleinsyrer kan representere en begrensning for å sikre robustheten til NGS-analyser, spesielt i tilfeller som involverer hybrid fangstsekvenseringsteknologi og omfattende paneler som krever en høyere mengde materiale med høyere TAT6. I denne forbindelse tilbyr dette forsterkerbaserte NGS-systemet fordelen av å kreve bare 13 ng DNA og RNA for panelet og har en svært lav total feilrate. Dette er svært verdifullt i thorax onkologi siden størrelsen på prøvene blir mindre og mindre 20,39,40.
Indikasjonene på molekylær testing er i kontinuerlig endring i thorax onkologi, og for noen genforandringer anbefales nå i adjuvante omgivelser15. Etter vår vurdering er det overveiende sannsynlig at det vil dukke opp flere flere målrettede terapier for behandling av tidlig stadium NS-NSCLC i rutinemessig klinisk praksis, noe som forsterker behovet for raskt å søke etter biomarkører ved diagnose. Samlet sett vil den nåværende fremgangen i presisjonsmedisin i lungekreft uunngåelig favorisere en ultra-rask NGS-tilnærming som muliggjør en mer omfattende, rask og materialbesparende molekylær profilering av svulster.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Christophe Bontoux deltar i betalte foredragsholderaktiviteter og mottar fordeler fra Thermo Fisher Scientific. Paul Hofman deltar i betalte foredragsholderaktiviteter og mottar fordeler og finansiering fra Thermo Fisher Scientific.
Acknowledgments
Vi takker Thermo Fisher Scientific for å gi oss muligheten til å bruke deres enhet og materialer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 well hard shell plate clear | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | 4483354 | |
| Adhesive PCR Plate Foil | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | AB0626 | |
| AutoLys M tube | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | A38738 | FFPE sample processing tubes |
| Genexus Barcodes 1-32 HD | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | A40261 | |
| Genexus GX5 Chip and Genexus Coupler | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | A40269 | |
| Genexus Pipette Tips | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | A40266 | |
| Genexus Purification Instrument | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | A48148 | Automated purification instrument (API) |
| Genexus Sequencing Kit | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | A40271 | |
| Genexus Templating Strips 3-GX5 and 4 | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | A40263 | |
| Genexus Integrated Sequencer | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | A45727 | |
| Ion Torrent Genexus FFPE DNA/RNA Purification Combo Kit | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | A45539 | |
| Oncomine Precision Assay GX (OPA) Panel (included Strips 1 and 2-HD) | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | A46291 |
References
- Howlader, N., et al. The effect of advances in lung-cancer treatment on population mortality. New England Journal of Medicine. 383 (7), 640-649 (2020).
- Melosky, B., et al. The rapidly evolving landscape of novel targeted therapies in advanced non-small cell lung cancer. Lung Cancer. 160, 136-151 (2021).
- Hanna, N. H., et al. Therapy for stage IV non-small-cell lung cancer with driver alterations: ASCO and OH (CCO) joint guideline update. Journal of Clinical Oncology. 39 (9), 1040-1091 (2021).
- Kerr, K. M., et al. The evolving landscape of biomarker testing for non-small cell lung cancer in Europe. Lung Cancer. 154, 161-175 (2021).
- Mosele, F., et al. Recommendations for the use of next-generation sequencing (NGS) for patients with metastatic cancers: a report from the ESMO precision medicine working group. Annals of Oncology. 31 (11), 1491-1505 (2020).
- Kazdal, D., Hofman, V., Christopoulos, P., Ilié, M., Stenzinger, A., Hofman, P. Fusion-positive non-small cell lung carcinoma: Biological principles, clinical practice, and diagnostic implications. Genes Chromosomes and Cancer. 61 (5), 244-260 (2022).
- Li, B. T., et al. Trastuzumab deruxtecan in HER2 -mutant non-small-cell lung cancer. New England Journal of Medicine. 386 (3), 241-251 (2022).
- Bontoux, C., Hofman, V., Brest, P., Ilié, M., Mograbi, B., Hofman, P. Daily practice assessment of KRAS status in NSCLC patients: A new challenge for the thoracic pathologist is right around the corner. Cancers. 14 (7), 1628 (2022).
- Skoulidis, F., et al. Sotorasib for lung cancers with KRAS p.G12C mutation. New England Journal of Medicine. 384 (25), 2371-2381 (2021).
- Hellyer, J. A., et al. Impact of tumor suppressor gene co-mutations on differential response to EGFR TKI therapy in EGFR L858R and Exon 19 deletion lung cancer. Clinical Lung Cancer. 23 (3), 264-272 (2022).
- Mograbi, B., Heeke, S., Hofman, P. The importance of stk11/lkb1 assessment in non-small cell lung carcinomas. Diagnostics. 11 (2), 196 (2021).
- Nadal, E., et al. Two patients with advanced-stage lung adenocarcinoma with radiologic complete response to nivolumab treatment harboring an STK11/LKB1 mutation. JCO Precision Oncology. 4, 1239-1245 (2022).
- Smeltzer, M. P., et al. The international association for the study of lung cancer global survey on molecular testing in lung cancer. Journal of Thoracic Oncology. 15 (9), 1434-1448 (2020).
- Ahern, E., Solomon, B. J., Hui, R., Pavlakis, N., O'Byrne, K., Hughes, B. G. M. Neoadjuvant immunotherapy for non-small cell lung cancer: Right drugs, right patient, right time. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 9 (6), e002248 (2021).
- Wu, Y. -L., et al. Osimertinib in resected EGFR-mutated non-small-cell lung cancer. New England Journal of Medicine. 383 (18), 1711-1723 (2020).
- Hanna, N. H., et al. Therapy for stage IV non-small-cell lung cancer without driver alterations: ASCO and OH (CCO) joint guideline update. J Clin Oncol. 38 (14), 1608-1632 (2020).
- de Maglio, G., et al. The storm of NGS in NSCLC diagnostic-therapeutic pathway: How to sun the real clinical practice. Critical Reviews in Oncology/Hematology. 169, 103561 (2022).
- DiStasio, M., Chen, Y., Rangachari, D., Costa, D. B., Heher, Y. K., VanderLaan, P. A. Molecular testing turnaround time for non-small cell lung cancer in routine clinical practice confirms feasibility of CAP/IASLC/AMP guideline recommendations: A single-center analysis. Clinical Lung Cancer. 18 (5), e349-e356 (2017).
- Heeke, S., et al. Use of the ion PGM and the genereader NGS systems in daily routine practice for advanced lung adenocarcinoma patients: A practical point of view reporting a comparative study and assessment of 90 patients. Cancers. 10 (4), 88 (2018).
- Hofman, P. The challenges of evaluating predictive biomarkers using small biopsy tissue samples and liquid biopsies from non-small cell lung cancer patients. Journal of Thoracic Disease. 11, S57-S64 (2019).
- Ilié, M., et al. Setting up an ultra-fast next-generation sequencing approach as reflex testing at diagnosis of non-squamous non-small cell lung cancer; experience of a single center (LPCE, Nice, France). Cancers. 14 (9), 2258 (2022).
- Zacharias, M., et al. Reflex testing in non-small cell lung carcinoma using DNA-and RNA-based next-generation sequencing-a single-center experience. Translational Lung Cancer Research. 10 (11), 4221-4234 (2021).
- Miller, T. E., et al. Clinical utility of reflex testing using focused nextgeneration sequencing for management of patients with advanced lung adenocarcinoma. Journal of Clinical Pathology. 71 (12), 1108-1115 (2018).
- Al-Ahmadi, A., et al. Next generation sequencing of advanced non-small cell lung cancer: utilization based on race and impact on survival. Clinical Lung Cancer. 22 (1), 16.e1-22.e1 (2021).
- Kim, J. H., Yoon, S., Lee, D. H., Jang, S. J., Chun, S. M., Kim, S. W. Real-world utility of next-generation sequencing for targeted gene analysis and its application to treatment in lung adenocarcinoma. Cancer Medicine. 10 (10), 3197-3204 (2021).
- Sheffield, B. S., et al. Point of care molecular testing: Community-based rapid next-generation sequencing to support cancer care. Current Oncology. 29 (3), 1326-1334 (2022).
- Camidge, D. R., Doebele, R. C., Kerr, K. M. Comparing and contrasting predictive biomarkers for immunotherapy and targeted therapy of NSCLC. Nature Reviews Clinical Oncology. 16 (6), 341-355 (2019).
- Rosas, D., Raez, L. E., Russo, A., Rolfo, C. Neuregulin 1 gene (Nrg1). A potentially new targetable alteration for the treatment of lung cancer. Cancers. 13 (20), 5038 (2021).
- Shapiro, G. I., et al. A Phase 1 study of RO6870810, a novel bromodomain and extra-terminal protein inhibitor, in patients with NUT carcinoma, other solid tumours, or diffuse large B-cell lymphoma. British Journal of Cancer. 124 (4), 744-753 (2021).
- Schoenfeld, A. J., et al. The genomic landscape of SMARCA4 alterations and associations with outcomes in patients with lung cancer. Clinical Cancer Research. 26 (21), 5701-5708 (2021).
- Zhang, K., et al. Identification of deleterious NOTCH mutation as novel predictor to efficacious immunotherapy in NSCLC. Clinical Cancer Research. 26 (14), 3649-3661 (2020).
- Shen, C. I., et al. Real-world evidence of the intrinsic limitations of PCR-based EGFR mutation assay in non-small cell lung cancer. Scientific Reports. 12 (1), 13566 (2022).
- Zou, D., et al. Diagnostic value and cost-effectiveness of next-generation sequencing-based testing for treatment of patients with advanced/metastatic non-squamous non-small-cell lung cancer in the United States. Journal of Molecular Diagnostics. 24 (8), 901-914 (2022).
- Zhong, Y., Xu, F., Wu, J., Schubert, J., Li, M. M. Application of next generation sequencing in laboratory medicine. Annals of Laboratory Medicine. 41 (1), 25-43 (2020).
- Bruno, R., Fontanini, G. Next generation sequencing for gene fusion analysis in lung cancer: A literature review. Diagnostics. 10 (8), 521 (2020).
- Hofman, V., et al. Ultra-fast gene fusion assessment for non-squamous non-small cell lung cancer. JTO Clinical and Research Reports. 4 (2), 100457 (2022).
- Horgan, D., et al. Personalized medicine perspective identifying the steps required to effectively implement next-generation sequencing in oncology at a national level in Europe. Journal of Personalized Medicine. 12 (1), 72 (2022).
- Cohen, D., et al. Optimizing mutation and fusion detection in NSCLC by sequential DNA and RNA sequencing. Journal of Thoracic Oncology. 15 (6), 1000-1014 (2020).
- Goswami, R. S., et al. Identification of factors affecting the success of next-generation sequencing testing in solid tumors. American Journal of Clinical Pathology. 145 (2), 222-237 (2016).
- Ilie, M., Hofman, P. Pitfalls in Lung Cancer Molecular Pathology: How to Limit them in Routine Practice. Current Medicinal Chemistry. 19 (16), 2638-2651 (2012).
