Summary
Ökningen av molekylära biomarkörer som ska testas för icke-skivepitel, icke-småcellig lungcancer (NS-NSCLC) har föranlett utvecklingen av snabba och tillförlitliga molekylära detektionsmetoder. Vi beskriver ett arbetsflöde för bedömning av genomisk förändring för NS-NSCLC-patienter med hjälp av en ultrasnabb nästa generations sekvenseringsmetod (NGS).
Abstract
Antalet molekylära förändringar som ska testas för riktad behandling av patienter med icke-skivepitel, icke-småcellig lungcancer (NS-NSCLC) har ökat avsevärt de senaste åren. Detektion av molekylära abnormiteter är obligatorisk för optimal vård av avancerade eller metastaserande NS-NSCLC-patienter, vilket gör det möjligt att administrera riktade terapier med en förbättring av den totala överlevnaden. Ändå utvecklar dessa tumörer resistensmekanismer som är potentiellt målinriktade med hjälp av nya terapier. Vissa molekylära förändringar kan också modulera behandlingssvaret. Den molekylära karakteriseringen av NS-NSCLC måste utföras på kort handläggningstid (TAT), på mindre än 10 arbetsdagar, enligt rekommendationerna i de internationella riktlinjerna. Dessutom är ursprunget till vävnadsbiopsierna för genomisk analys varierande, och deras storlek minskar kontinuerligt med utvecklingen av mindre invasiva metoder och protokoll. Följaktligen utmanas patologer att utföra effektiv molekylär teknik samtidigt som de upprätthåller en effektiv och snabb diagnosstrategi. Här beskriver vi det ultrasnabba amplicon-baserade arbetsflödet för nästa generations sekvensering (NGS) som används i den dagliga rutinrutinen vid diagnos för NS-NSCLC-patienter. Vi visade att detta system kan identifiera de nuvarande molekylära målen som används inom precisionsmedicin inom thoraxonkologi i en lämplig TAT.
Introduction
Under det senaste decenniet har utvecklingen av riktade terapier och immunterapier avsevärt ökat den totala överlevnaden (OS) för icke-skivepitel, icke-småcellig lungcancer (NS-NSCLC)1,2. I detta avseende har antalet obligatoriska gener och molekylära mål att analysera vid behandling av NS-NSCLC ökat under de senaste åren 3,4.
Nuvarande internationella riktlinjer rekommenderar testning av EGFR, ALK, ROS1, BRAF, NTRK, RET och MET vid diagnos av avancerad NS-NSCLC5. Dessutom, eftersom nya läkemedel nyligen har gett mycket lovande resultat i kliniska prövningar, kommer ytterligare genomiska förändringar inom kort att screenas i ett antal ytterligare gener, särskilt KRAS och HER2, tillsammans med BRAC1/BRAC2, PI3KA, NRG1 och NUT 6,7,8,9. Dessutom kan statusen för olika associerade gener, såsom STK11, KEAP1 och TP53 vara av stort intresse för en bättre förutsägelse av svaret eller resistensen mot vissa riktade terapier och/eller immuncheckpointhämmare (ICI)10,11,12.
Det är viktigt att de molekylära förändringarna rapporteras utan betydande dröjsmål för att säkerställa noggrant kliniskt beslutsfattande. Frånvaron av molekylär karakterisering av en tumör kan leda till initiering av icke-riktade terapier såsom kemoterapi med/utan immunterapi, vilket leder till en suboptimal behandlingsstrategi, eftersom kemoterapisvaret är begränsat hos patienter med behandlingsbara förändringar, såsom EGFR-mutationer eller genfusioner13.
Dessutom kan den nuvarande utvecklingen av riktade terapier/immunterapier i neoadjuvanta och/eller adjuvanta miljöer leda till att man systematiskt letar efter, åtminstone, EGFR- och ALK-förändringar i tidiga stadier av NS-NSCLC, eftersom ICI endast bör administreras i tumörer som är vildtyper för EGFR och ALK14. Det är nu också obligatoriskt att testa för förekomst av EGFR-mutationer i NS-NSCLC i tidigt stadium, eftersom osimertinib (en tredje generationens EGFR-tyrosinkinashämmare) kan användas som adjuvant behandling vid EGFR-mutant NS-NSCLC15.
Strategin för bedömning av de olika biomarkörerna för att förutsäga svaret på olika riktade terapier och/eller immunterapier hos NS-NSCLC-patienter utvecklas snabbt, vilket gör identifieringen av dessa biomarkörer sekventiellt svår 3,16. I detta avseende är Next-Generation Sequencing (NGS) nu den optimala metoden för parallell bedömning av genförändringar i NS-NSCLC 5,17 med hög genomströmning.
NGS-arbetsflödet kan dock vara svårt att bemästra och kan leda till längre TAT18,19. Således utför många centra fortfarande sekventiella metoder (immunhistokemi (IHC), fluorescens in situ-hybridisering (FISH) och/eller riktad sekvensering). Denna strategi är dock begränsad vid liten provstorlek och framför allt på grund av det ökade antalet handlingsbara mutationer som måste testas i NS-NSCLC20. Ultrasnabba och enkla testmetoder som möjliggör snabb bedömning av genförändringar har därför blivit allt viktigare för optimalt kliniskt beslutsfattande. Dessutom blir godkända och ackrediterade system för molekylär testning obligatoriska för förskrivning av specifika riktade terapier.
Här beskriver vi en ultrasnabb och automatiserad amplicon-baserad DNA/RNA NGS-analys för molekylär testning av NS-NSCLC som används i laboratoriet för klinisk och experimentell patologi (LPCE), Nice University Hospital, Frankrike och är ackrediterad enligt ISO 15189-normen av den franska ackrediteringskommittén (COFRAC) (https://www.cofrac.fr/). COFRAC intygar att laboratoriet uppfyller kraven i standarden ISO 15189 och COFRAC:s tillämpningsregler för testning/kalibrering i molekylär analys i automatiserad NGS på en sequencer med panelen utförd av laboratoriet. Ackreditering enligt den erkända internationella standarden ISO 15189 visar laboratoriets tekniska kompetens för en definierad omfattning och att ett lämpligt ledningssystem fungerar korrekt i detta laboratorium. Fördelarna och begränsningarna med detta arbetsflöde, från beredning av vävnadsbiopsiprover till erhållande av rapporten, diskuteras.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla procedurer har godkänts av den lokala etiska kommittén (Human Research Ethics Committee, Centre Hospitalier Universitaire de Nice, Tumorothèque BB-0033-00025). Informerat samtycke inhämtades från alla patienter för att använda prover och genererade data. Alla prover togs från patienter som diagnostiserats med NS-NSCLC i LPCE (Nice, Frankrike) mellan 20 september och 31 januari 2022 som en del av den medicinska vården.
1. Beredning av FFPE DNA- och RNA-prover med hjälp av automatiserat reningsinstrument (API) (Behandlingstid: 5 h 15 min)
- Kör planifiering på instrumentet.
- Slå på instrumentet och logga in med användarnamn och lösenord (Materialförteckning). Skapa en reningskörningsplan genom att klicka på Kör, sedan på Lägg till plan och genom att ge körplanen ett namn.
- Välj sedan lämplig reningssats och protokoll för sekventiell rening av DNA och RNA från formalinfixerade paraffininbäddade (FFPE) prover. Aktivera kvantifiering efter rening.
- Välj önskad elueringsvolym (50 μL) i listrutan och klicka sedan på Nästa. Välj antalet exempel som ska extraheras.
- Markera sedan varje exempel, klicka på Redigera, ange Exempel-ID och klicka sedan på Spara.
- Förbered FFPE DNA- och RNA-prover med GPI
- Bered FFPE-vävnadsprover (4 skärsektioner på 10 μm med en mikrotom) eller utför makrodissektion direkt på FFPE-block. Placera varje FFPE-vävnadsprov i separerade och identifierade FFPE-provbearbetningsrör (materialförteckning).
- Centrifugera vid 2000 x g i 1 minut för att samla upp vävnaden i botten av rören.
- Tillsätt en masterblandning av proteasuppslutning från en nukleinsyrareningssats till varje FFPE-provrör och inkubera vid 60 °C i minst 60 minuter (materialförteckning). Inkubera proverna vid 90 °C i 60 minuter.
- Efter inkubationen, låt proverna svalna i 5 minuter i rumstemperatur (RT).
- För varje FFPE-provbearbetningsrör, lyft det inre röret, lås det genom att vrida det åt vänster och centrifugera sedan proverna vid 2000 x g i 10 minuter.
- Lås upp de inre rören genom att vrida dig åt höger, separera dem från de yttre rören och kassera dem. Förvara proverna i de yttre rören på is tills de laddas på API:et.
- Förbered en DNase-nedbrytningsmasterblandning och ladda den i förfylld FFPE DNA- och RNA-reningsplatta 2. Ladda sedan de förberedda proverna i FFPE DNA- och RNA-reningsplatta 1 (materialtabell).
- Starta reningskörningen på API.
- På API-skärmen klickar du på Kör, väljer Kör plan och klickar sedan på Nästa.
- Följ indikationerna på skärmen för att ladda API:et med de nödvändiga förbrukningsvaror och reagenser som behövs för reningskörningen (materialförteckning).
- När alla reagenser har laddats klickar du på Nästa. Stäng API-luckan och klicka på Starta.
- I slutet av körningen klickar du på « lossa » på pekskärmen och tar omedelbart bort 48-brunnars nukleinsyraarkivplattan som innehåller det renade provet DNA och RNA.
- Exportera kvantifieringsresultaten. Försegla plattan och förvara renade prover vid -80 °C. Överför 96-brunnsplattan till sequencern som ska analyseras.
- Skapa ett exempel och skapa en körning.
- Öppna och logga in på programvaran, välj sedan i menyraden Exempel och klicka på Skapa prov.
- Ange provets namn, kön och procentandel tumörceller och fyll i de obligatoriska fälten och valfria fälten om det behövs.
- Spara detaljerna (könet och andelen tumörceller är viktiga för att analysera kopienummervarianter [CNVs]).
- Välj Körningar och Nukleinsyra för att resultera i menyraden.
- Ange körningsnamnet i installationssteget . Klicka på Nästa.
- Välj analys i steget Analyser . Klicka på Nästa.
- Välj exemplen i steget Exempel som ska köras med analysen.
- Klicka sedan på Tilldela i rutan Valda analyser. Klicka på Nästa.
- Granska sample positioner på sample inmatningsplatta. Klicka på Nästa.
- Granska sammanfattningen av körplanen och sedan Spara och skriv ut eller Spara.
2. Automatiserad NGS på sequencern (Bearbetningstid: 30 min)
- Ladda sample plattan.
OBS: Den optimala nukleinsyrakoncentrationen är 0.5 ng/μL. Det validerade nukleinsyrakoncentrationsintervallet är 0,33-1 ng/μL. För DNA och RNA validerades 1 ng/μL-koncentration i laboratoriet.- Sequencern kräver 20 μL total volym. Se till att det finns tillräckligt med volym för sample laddning.
- Tillsätt positiva kontroller (DNA och RNA) och NTC (DNA och RNA) till det 1:a steget av reningsinstrumentet utan att extraheras. Använd DNA- och RNA-kontroller för varje körning för att verifiera körningen och verifiera de batchar som används. Lägg till DNA- och RNA-kontroller på plattan i slutet av API-körningen.
- Ladda sequencern och starta en körning.
- Ta ut alla reagenser ur lådorna i kylen eller frysen och tina vid RT i minst 30 minuter (materialförteckning) och högst 12 timmar.
- I laboratoriet, håll sequencern alltid påslagen enligt de råd som ges av leverantören under utbildningen på plats. Logga in på systemet.
- Ladda plattan från reningsinstrumentet, som innehåller samples, efter att ha förseglat plattan med ett ark självhäftande PCR-plåtfolie (materialförteckning).
- Installera alla förbrukningsvaror i däcket. Sequencern ger steg-för-steg-instruktioner för att ladda varje nödvändig förbrukningsvara i en markerad position (Materialförteckning).
- Kontrollera att det inte finns några utfällningar på rör 3 på Strip 2-HD. Snärta till röret eller virvla försiktigt remsan för att lösa upp fällningen om det behövs.
- Remsa 1 och remsa 3 innehåller magnetiska pärlor. Detta steg är mycket kritiskt: se till att pärlorna är återuppsatta. Det ska inte finnas några pärlor kvar i den övre delen av röret.
- Vänd remsan upp och ner och tillbaka 3-4 gånger för att ta bort pärlorna. Håll remsan i ena änden med remstätningen riktad uppåt. Sväng sedan snabbt remsan nedåt med en snabb, centrifugal armrörelse och avsluta med att ge en skarp snärt med handleden.
- Centrifugera vid 300 x g i 15 s. Upprepa vid behov. Centrifugera remsorna med adaptrar och remshållare för att minimera fel som observeras slumpmässigt i samband med rester av kulor i den övre delen av remsorna.
- Stäng systemet och klicka på Nästa. Installera dörrarna till sekvenseringsreagensfacket (materialförteckning). Stäng dörren. Sequencern startar automatiskt körningen.
- Rengöring
- Om du vill rensa efter körningen klickar du på Nästa när körningen är klar.
- Dörren öppnas successivt. Följ instruktionerna på skärmen för att tömma avfallet och ta bort alla förbrukningsvaror. Klicka på Nästa.
- Stäng kortleken när du är klar och klicka på Nästa. En 2 min UV-rengöring startar. Sequencern är redo att starta en ny körning.
3. Analys av resultaten med hjälp av den integrerade programvaran (analystid per patient [prover ADN och ARN]: 15 min)
OBS: Tekniken är ackrediterad av den franska ackrediteringskommittén (COFRAC) ISO 15189 (https://www.cofrac.fr/)
- Data och resultat
- Välj ett körningsresultat eller ett exempelresultat på menyn Resultat . På skärmen Resultat/Körningsresultat visas alla körningar.
- Sök i resultatlistan genom att filtrera i en kolumnrubrik.
- Klicka på Resultat och sedan på Exempelresultat. Klicka sedan på namnet på det exempel som är av intresse i kolumnen för exempelnamn för att visa sekvenseringsresultat för ett unikt exempel.
- Klicka på Kolumner längst upp till vänster på skärmen eller avmarkera kolumnerna i tabellen.
- View QC-resultaten och view amplicon-täckningen.
- Klicka på fliken QC på skärmen Resultat .
- För DNA, se till att medianen för absoluta parvisa skillnader (MAPD) är mellan 0 och 0,5 för att validera CNV-analysen (copy number variants). De mappade läsningarna måste vara större än 1,5 miljoner.
- För RNA kontrollerar du om de mappade avläsningarna är mellan 150 000 och 400 000. Under detta finns det risk för falskt negativa resultat, och utöver det finns det risk för falskt positiva resultat.
- Klicka på ett exempelnamn för att öppna fliken Viktiga resultat .
- Bläddra till amplicon Täckningsgrafer.
- Granska täckningsdiagrammen. Definiera det lägsta tröskelvärdet för amplikontäckningen, eftersom leverantören inte tillhandahåller den. Om du vill definiera ett intervall och ett tröskelvärde blandar du en kontroll och ett vildtypsexempel (WT). Observera sedan det minsta värdet på amplikontäckningen för en eller flera utvalda mutationer.
- Visa variantresultat.
- Om du vill exportera data i tabellformat klickar du på Exportera i det övre högra hörnet av skärmen.
- Om du vill visa resultatet av SNV/INDEL-varianten (Single Nucleotid Variant/INDEL) klickar du på fliken Varianter och sedan på SNV/Indels. Klicka på Redigera filter och välj Inget filter.
OBS: Känslighetströskeln har definierats till 5 % enligt rekommendationerna från INCA (French National Cancer Institute) group (https://www.e-cancer.fr/Professionnels-de-sante/Les-therapies-ciblees/Les-plateformes-de-genetique-moleculaire-des-cancers/Le-programme-d-assurance-qualite-des-plateformes). - Visa fusionsresultat och visa RNA Exon-varianter: Klicka på fliken Varianter och sedan på Fusioner.
- Klicka på Visualisering och RNA Exon-variant längst upp till höger och granska sedan diagrammet RNA Exon-varianter .
- Med detta kit kan exonhoppning av EGFR-, MET- och AR-generna upptäckas. Klicka på Visualisering; Det är lättare att analysera.
- Visa obalans i RNA-exonfusion: Klicka på fliken Varianter och sedan på Fusioner.
- Klicka på Visualisering och RNA Exon Tile Fusion Imbalance längst upp till höger och granska sedan diagrammen RNA Exon Tile Fusion Imbalance . En obalansfusion är en fusion mellan en känd partner och en partner som inte omfattas av panelen.
- Visa CNV-resultat: Klicka på CNV:er på fliken Varianter för att visa data.
OBS: Det är nödvändigt att vara vaksam på resultaten av CNV genom att informera under beredningen av proverna om könet och andelen tumörceller i provet. AR-genen bärs endast av X-kromosomen . Om könet inte specificeras kan det manliga könet drabbas av förluster, vilket leder till falskt positiva resultat hos manliga patienter.
- Granska plugin-resultaten.
- Granska resultaten av plugin-programmet Coverage Analysis : Klicka på och välj ladda ned filer längst upp till höger.
- Plugin-programmet Täckningsanalys genererar en täckningsanalysrapport.
- Granska resultaten av plugin-programmet för molekylär täckningsanalys : Klicka på och välj ladda ner filer längst upp till höger. Denna analys verifierar om alla amplikoner är täckta och bekräftar resultaten av kopieringsnummervarianter (CNV) som tillhandahålls av programvaran.
- Visa analysmått och körningsrapporten
- Klicka på fliken Kör rapport i Körningssammanfattning.
- Om du vill visa rapporten Kör väljer du alternativet Välj exempel i listrutan.
- Analysmått och körningsrapporten: Hitta sekvenseringsmåtten överst på skärmen, följt av exempelspecifika mått i tabellen Kör exempel .
Information i CSA-filen (Customer Support Archive) kan hjälpa dig att felsöka resultat, men de kan inte analyseras direkt. CSA-filerna sammanfattar data för hela körningsdata och markerar orsakerna till ett problem i händelse av en misslyckad körning. - Ladda ned en körningsrapport: Klicka på fliken Rapporter .
- Klicka på Ladda ned rapport för att ladda ned en sammanfattning av körningsrapporten i PDF-format.
- Generera variantrapport.
- Aktivera Generera rapport i installationssteget för att automatiskt generera en variantrapport för varje prov under dataanalys av en körning.
- När du har genererat variantrapporten för ett urval gör systemet rapporten tillgänglig på två ställen: Först görs en länk tillgänglig på skärmen Resultat/provresultat . Klicka på länken för att ladda ner PDF-filen.
- För det andra, gå till rutan Variantrapport på fliken Rapporter och klicka på knappen Ladda ner rapport . Signera variantrapporterna elektroniskt eller manuellt.
Elektroniskt signerade rapporter har (Signera) efter exempelnamnet på skärmen Sample Results .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Med hjälp av den procedur som presenteras här, som beskrivs i detalj i våra senaste publikationer21, utvecklade vi ett optimalt arbetsflöde för bedömning av molekylär förändring som en reflextestning i rutinmässigt utförd klinisk praxis för diagnos hos patienter med NS-NSCLC med hjälp av en ultrasnabb amplicon-baserad nästa generations sekvenseringsmetod. Metodens molekylära arbetsflöde visas i figur 1. Listan över gener som ingår i panelen visas i tilläggsfigur 1.
Molekylär analys utfördes på 259 patienter med NS-NSCLC. Den inkluderade 153 bronkialbiopsier, 47 transthoraxbiopsier, 39 kirurgiska prover och 25 cellblock från 13 pleurautgjutningar och 7 EBUS (tabell 1). Följande drivande mutantgener observerades i 242 giltiga eller tillgängliga NGS DNA/RNA-analyser: KRAS (25,4 %), EGFR (18,2 %), BRAF (6,3 %), ERBB2 (1,7 %) och MET (1,7 %). Följande genfusioner rapporterades: ALK (4,3 %), ROS1 (2,3 %), RET (1,9 %) och NTRK (0,8 %). Följande förändringar upptäcktes med en incidens under 1 % (t.ex. IDH1, CDKN2A, FGFR3, KIT, MTOR, FGFR4. NTRK3, NRAS, PIK3CA, IDH2, ERBB3, ERBB4, AR, CHECK2, SMO, PTEN). För DNA misslyckades 10 fall (4 %) medan 5 fall (2 %) misslyckades för RNA. Misslyckandet berodde på dålig kvalitet på DNA/RNA och/eller låg mängd DNA/RNA. Misslyckad analys inträffade endast med prover med mindre än 10 % tumörcellularitet. Således definierade vi tumörcellularitetsgränsen till 10 %. För DNA NGS-resultat godkändes 10 fall (4 %) inte på grund av antingen den låga kvaliteten på nukleinsyror (6 fall) eller otillräckliga nukleinsyramängder (4 fall med <13 ng DNA). På samma sätt misslyckades fem fall (2 %) för RNA-sekvenseringsresultat på grund av både otillräcklig RNA-kvalitet och en låg mängd RNA (<13 ng RNA). Den genomsnittliga andelen tumörceller i de misslyckade fallen var begränsad (15 %, från 10 % till 20 %), i motsats till de framgångsrika fallen där tumörcellprocenten varierade från 30 % till 90 %. Av de 15 underkända proverna härrörde 11 från små vävnadsbiopsier (med en genomsnittlig area på 2 mm2), medan 4 var cytologiska prover (t.ex. endobronkiskt ultraljud [EBUS]).
Sensitiviteten för metoden för detektion av SNV och INDEL var 93,44 %, för CNV 100 % och för fusioner 91,67 % med ett lägsta tumörcellsinnehåll på 10 % (tabell 1).
Medelvärdet för TAT från endoskopiprovtagning från den molekylära rapporten var 72 timmar (intervall: 48-96 timmar), med ett medelvärde för TAT från extraktion till rapport på 24 timmar.
Den analytiska valideringen av det ovan beskrivna NGS-arbetsflödet utfördes på 30 NS-NSCLC-fall. Valideringen visade 100 % överensstämmelse med de guldstandardmetoder som tidigare använts vid vårt center och som listas i detalj i den ursprungliga publikationen21: RT-PCR EGFR Mutation Test; RT-PCR KRAS-mutationstest ; ALK IHC, ALK FISK; ROS1 IHC; ROS1 FISK; BRAFV600E; och DNA/RNA NGS-metoder.
Flerstegsproceduren från provtagning till molekylär rapport för ett EGFR/TP53-mutant lungadenokarcinom visas i figur 2. Representationen av mutationen som hittades i biopsiprovet med hjälp av IGV-programvara (Integrative Genomic Viewer) visas i kompletterande figur 2. Ett exempel på en genererad rapport från rapporteringsprogrammet visas i kompletterande figur 3.
Figur 1: Diagram över panelarbetsflödet som används i denna studie. Denna siffra har modifierats med tillstånd från Ilié et al.21. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Flera steg från provtagning till molekylärbiologisk rapport. A) Tre bronkialbiopsiprover som tagits emot i laboratoriet från endoskopirummet. (B) Hematoxylin/Eosin/Safran-färgat objektglas av bronkialbiopsiprovet som visar ett lungadenokarcinom med cirka 40-50 % tumörceller (100x förstoring). (C) Rapport från rapporteringsprogramvaran som visar en EGFR-mutation associerad med en TP53-mutation i tumörprovet. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Totalt antal patienter | 259 |
| Bronkialbiopsier | 153 |
| Transthorax biopsier | 47 |
| Kirurgiska prover | 39 |
| Pleuravätska | 13 |
| EBUS (EBUS) | 7 |
| Drivande mutantgener | |
| KRAS | 25.40% |
| EGFR | 18.20% |
| BRAF | 6.30% |
| ERBB2 | 1.70% |
| TRÄFFADE | 1.70% |
| Fusioner av gener | |
| ALK | 4.30% |
| ROS1 | 2.30% |
| RET | 1.95% |
| NTRK (NTRK) | 0.80% |
| Misslyckande - DNA-fall | 10 fall (4%) |
| Misslyckande - RNA-fall | 5 fall (2%) |
| Cut-off för tumörcellularitet | 10% |
| Procentuellt intervall av tumörceller i de misslyckade fallen | 10%–20% |
| Procentuellt intervall av tumörceller i framgångsrika fall | 30%–90% |
| Metodens känslighet | |
| Detektering av SNV och INDEL | 93.44% |
| Detektering av CNV | 100% |
| Detektion av fusioner | 91.67% |
Tabell 1: Resultat av molekylär analys. Molekylär analys utfördes på 259 patienter med NS-NSCLC, inklusive 153 bronkialbiopsier, 47 transthoraxbiopsier, 39 kirurgiska prover och 25 cellblock från 13 pleurautgjutningar och 7 EBUS.
Tilläggsfigur 1: De gener som ingår i NGS oncomine precision assay GX-panelen. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Tilläggsfigur 2: Representation av genererade avläsningar och mutationer som hittats i biopsiprovet med hjälp av IGV-programvara. (A) EGFR-genen och (B) TP53-genen . Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur 3: Molekylär rapport genererad av rapporteringsprogramvaran. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Utvecklingen av en ultrasnabb amplicon-baserad NGS-metod som reflextestning för molekylär förändringsbedömning vid diagnos av NS-NSLC i alla stadier är ett optimalt alternativ för detektion av alla riktlinjerekommenderade och framväxande biomarkörer i NS-NSCLC 5,22,23. Medan sekventiella metoder (IHC, PCR, FISH) endast fokuserar på specifika gener och kan resultera i utmattning av vävnadsmaterial, möjliggör detta NGS-arbetsflöde en specifik och känslig utvärdering av statusen för 50 gener, inklusive mutationer, fusioner och amplifieringar, även med en låg mängd nukleinsyra (minst 13 ng för varje DNA- och RNA-sekvensering enligt denna studie).
Dessutom ger denna metod snabba och relevanta resultat för behandling av patienter med NS-NSCLC. Jämfört med ett skräddarsytt tillvägagångssätt gör frånvaron av ett första urval av fall som ska analyseras, beroende på tumörstadiet, och utan att vänta på läkarens begäran att de kan spara dyrbar tid. I denna linje har det visats att NGS-testning av avancerad NS-NSCLC direkt påverkar patientens totala överlevnad24,25. Dessutom erhålls dessa molekylära resultat ofta samtidigt från IHC-resultaten, särskilt för utvärdering av andelen PD-L1-positiva tumörceller26. Läkaren kan få den "molekylära profilen" av tumören med alla biomarkörer som krävs för det bästa terapeutiska valet av första linjensbehandling. I specifika situationer kan läkaren registrera patienterna i en klinisk prövning enligt genomresultaten 28,29,30,31.
Både DNA- och RNA-analys med panelen kan utföras på 2-14 patienter per körning, exklusive kontroller (1 positiv och 1 negativ kontroll). Det är möjligt att göra tre körningar per vecka, vilket innebär att 42 patienter kan dra nytta av en ultrasnabb NGS-profilering av sin tumör. Reningssystemet, som utför helautomatisk extraktion och kvantifiering av DNA och RNA före biblioteksberedning, möjliggör snabb utvärdering av genomförbarheten av sekvenseringsanalyserna.
Möjligheten att kvantifiera det extraherade DNA:t och RNA:t före biblioteksberedning och möjligheten att arbeta med små mängder nukleinsyra (från minst 10 ng DNA eller RNA, enligt specifikationerna) möjliggör en snabb bedömning av sekvenseringsanalysens genomförbarhet.
En NGS-metod kan hjälpa till att optimera hanteringen av provarbetsflödet inom thoraxonkologi genom att vara mer omfattande när det gäller att upptäcka användbara biomarkörer. Det har visat sig att den PCR-baserade metoden har inneboende begränsningar när det gäller att upptäcka vissa sällsynta mutationer, särskilt EGFR exon 20-insättningsmutationer32. NGS-metoden gör det möjligt för en högre andel patienter att få biomarkörfokuserade terapier. I detta sammanhang har det visats att NGS-reflextestning för alla avancerade NS-NSCLC är kostnadseffektivt33. Dessutom är den helautomatiska nukleinsyraextraktionen, biblioteksberedningen och sekvenseringen integrerad med detta amplicon-baserade NGS-system en betydande tidsbesparing för laboratoriepersonalen.
Att implementera ultrasnabb next-generation sequencing (NGS) som ett reflextest för att diagnostisera NS-NSCLC kan dock stöta på vissa begränsningar i den dagliga kliniska praktiken. Genpanelens omfattning (som omfattar 50 gener) är mindre jämfört med de omfattande panelerna som omfattar flera hundra gener34. Panelen inkluderar alla rekommenderade gener som är associerade med en riktad terapi inom thoraxonkologi. Dessutom ingår inte vissa gener av intresse med ett potentiellt prognostiskt värde. Till exempel finns inte KEAP1, STK11, SMARCA4 och RB1 på panelen som används i detta arbete. Dessa gener kan vara viktiga i framtiden för urvalet av patienter som ska dra nytta av de FDA-godkända KRASG12C-hämmarna sotorasib9. Användningen av ultrasnabb NGS med amplikonsekvenseringsteknik kan också leda till att sällsynta fusionsgenpartners går miste om35. Dessutom visade obalansanalyserna på en del falskt positiva ALK-förändringar initialt36. Tröskelvärdet för att detektera ALK-obalansfusioner höjdes i den nya modifierade analysen. Det rekommenderas dock att validera ett obalansresultat med en ortogonal teknik (IHC och/eller FISH).
Framför allt väcker detta arbetsflöde frågor som rör den ekonomiska hållbarheten och ersättningen för NGS-testet, som kan variera mycket beroende på landets hälso- och sjukvårdssystem, särskilt i Europa37. För kostnadseffektivitetsmetoden är det absolut nödvändigt att köra tillräckligt många prover samtidigt för att spara på förbrukningsvaror, vilket ibland inte är möjligt, eftersom det beror på provrekryteringen och laboratoriet35. Dessutom bör möjligheten att skapa en onödig extra arbetsbelastning för laboratoriepersonalen diskuteras och kräver god kommunikation mellan läkare, kirurger, patologer och teknisk personal.
Samtidig användning av både DNA och RNA NGS är idealisk men är fortfarande diskutabel. Med tanke på att de flesta av de genomiska förändringarna för riktad terapi är ömsesidigt uteslutande38, kan det vara möjligt att först utföra DNA- och sedan RNA-sekvenseringsanalys. Denna strategi skulle dock leda till en längre TAT för att generera en rapport.
Lämpligheten av både kvantitet och kvalitet på extraherade nukleinsyror kan utgöra en begränsning när det gäller att säkerställa NGS-analysernas robusthet, särskilt i fall som involverar hybridavskiljningssekvenseringsteknik och omfattande paneler som kräver en större mängd material med högre TAT6. I detta avseende erbjuder detta amplicon-baserade NGS-system fördelen att det endast kräver 13 ng DNA och RNA för panelen och har en mycket låg total felfrekvens. Detta är mycket värdefullt inom thoraxonkologi eftersom storleken på proverna blir mindre och mindre 20,39,40.
Indikationerna för molekylär testning förändras kontinuerligt inom thoraxonkologin och rekommenderas nu för vissa genförändringar i adjuvansmiljöer15. Enligt vår uppfattning är det mycket troligt att flera ytterligare riktade terapier kommer att dyka upp för behandling av NS-NSCLC i tidig klinisk praxis, vilket förstärker behovet av att snabbt söka efter biomarkörer vid diagnos. Sammantaget kommer de nuvarande framstegen inom precisionsmedicin inom lungcancer oundvikligen att gynna en ultrasnabb NGS-metod som möjliggör en mer omfattande, snabb och materialbesparande molekylär profilering av tumörer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Christophe Bontoux deltar i betalda talaraktiviteter och får förmåner från Thermo Fisher Scientific. Paul Hofman deltar i betalda talaraktiviteter och får förmåner och finansiering från Thermo Fisher Scientific.
Acknowledgments
Vi tackar Thermo Fisher Scientific för att de gav oss möjligheten att använda deras enhet och material.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 well hard shell plate clear | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | 4483354 | |
| Adhesive PCR Plate Foil | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | AB0626 | |
| AutoLys M tube | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | A38738 | FFPE sample processing tubes |
| Genexus Barcodes 1-32 HD | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | A40261 | |
| Genexus GX5 Chip and Genexus Coupler | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | A40269 | |
| Genexus Pipette Tips | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | A40266 | |
| Genexus Purification Instrument | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | A48148 | Automated purification instrument (API) |
| Genexus Sequencing Kit | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | A40271 | |
| Genexus Templating Strips 3-GX5 and 4 | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | A40263 | |
| Genexus Integrated Sequencer | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | A45727 | |
| Ion Torrent Genexus FFPE DNA/RNA Purification Combo Kit | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | A45539 | |
| Oncomine Precision Assay GX (OPA) Panel (included Strips 1 and 2-HD) | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | A46291 |
References
- Howlader, N., et al. The effect of advances in lung-cancer treatment on population mortality. New England Journal of Medicine. 383 (7), 640-649 (2020).
- Melosky, B., et al. The rapidly evolving landscape of novel targeted therapies in advanced non-small cell lung cancer. Lung Cancer. 160, 136-151 (2021).
- Hanna, N. H., et al. Therapy for stage IV non-small-cell lung cancer with driver alterations: ASCO and OH (CCO) joint guideline update. Journal of Clinical Oncology. 39 (9), 1040-1091 (2021).
- Kerr, K. M., et al. The evolving landscape of biomarker testing for non-small cell lung cancer in Europe. Lung Cancer. 154, 161-175 (2021).
- Mosele, F., et al. Recommendations for the use of next-generation sequencing (NGS) for patients with metastatic cancers: a report from the ESMO precision medicine working group. Annals of Oncology. 31 (11), 1491-1505 (2020).
- Kazdal, D., Hofman, V., Christopoulos, P., Ilié, M., Stenzinger, A., Hofman, P. Fusion-positive non-small cell lung carcinoma: Biological principles, clinical practice, and diagnostic implications. Genes Chromosomes and Cancer. 61 (5), 244-260 (2022).
- Li, B. T., et al. Trastuzumab deruxtecan in HER2 -mutant non-small-cell lung cancer. New England Journal of Medicine. 386 (3), 241-251 (2022).
- Bontoux, C., Hofman, V., Brest, P., Ilié, M., Mograbi, B., Hofman, P. Daily practice assessment of KRAS status in NSCLC patients: A new challenge for the thoracic pathologist is right around the corner. Cancers. 14 (7), 1628 (2022).
- Skoulidis, F., et al. Sotorasib for lung cancers with KRAS p.G12C mutation. New England Journal of Medicine. 384 (25), 2371-2381 (2021).
- Hellyer, J. A., et al. Impact of tumor suppressor gene co-mutations on differential response to EGFR TKI therapy in EGFR L858R and Exon 19 deletion lung cancer. Clinical Lung Cancer. 23 (3), 264-272 (2022).
- Mograbi, B., Heeke, S., Hofman, P. The importance of stk11/lkb1 assessment in non-small cell lung carcinomas. Diagnostics. 11 (2), 196 (2021).
- Nadal, E., et al. Two patients with advanced-stage lung adenocarcinoma with radiologic complete response to nivolumab treatment harboring an STK11/LKB1 mutation. JCO Precision Oncology. 4, 1239-1245 (2022).
- Smeltzer, M. P., et al. The international association for the study of lung cancer global survey on molecular testing in lung cancer. Journal of Thoracic Oncology. 15 (9), 1434-1448 (2020).
- Ahern, E., Solomon, B. J., Hui, R., Pavlakis, N., O'Byrne, K., Hughes, B. G. M. Neoadjuvant immunotherapy for non-small cell lung cancer: Right drugs, right patient, right time. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 9 (6), e002248 (2021).
- Wu, Y. -L., et al. Osimertinib in resected EGFR-mutated non-small-cell lung cancer. New England Journal of Medicine. 383 (18), 1711-1723 (2020).
- Hanna, N. H., et al. Therapy for stage IV non-small-cell lung cancer without driver alterations: ASCO and OH (CCO) joint guideline update. J Clin Oncol. 38 (14), 1608-1632 (2020).
- de Maglio, G., et al. The storm of NGS in NSCLC diagnostic-therapeutic pathway: How to sun the real clinical practice. Critical Reviews in Oncology/Hematology. 169, 103561 (2022).
- DiStasio, M., Chen, Y., Rangachari, D., Costa, D. B., Heher, Y. K., VanderLaan, P. A. Molecular testing turnaround time for non-small cell lung cancer in routine clinical practice confirms feasibility of CAP/IASLC/AMP guideline recommendations: A single-center analysis. Clinical Lung Cancer. 18 (5), e349-e356 (2017).
- Heeke, S., et al. Use of the ion PGM and the genereader NGS systems in daily routine practice for advanced lung adenocarcinoma patients: A practical point of view reporting a comparative study and assessment of 90 patients. Cancers. 10 (4), 88 (2018).
- Hofman, P. The challenges of evaluating predictive biomarkers using small biopsy tissue samples and liquid biopsies from non-small cell lung cancer patients. Journal of Thoracic Disease. 11, S57-S64 (2019).
- Ilié, M., et al. Setting up an ultra-fast next-generation sequencing approach as reflex testing at diagnosis of non-squamous non-small cell lung cancer; experience of a single center (LPCE, Nice, France). Cancers. 14 (9), 2258 (2022).
- Zacharias, M., et al. Reflex testing in non-small cell lung carcinoma using DNA-and RNA-based next-generation sequencing-a single-center experience. Translational Lung Cancer Research. 10 (11), 4221-4234 (2021).
- Miller, T. E., et al. Clinical utility of reflex testing using focused nextgeneration sequencing for management of patients with advanced lung adenocarcinoma. Journal of Clinical Pathology. 71 (12), 1108-1115 (2018).
- Al-Ahmadi, A., et al. Next generation sequencing of advanced non-small cell lung cancer: utilization based on race and impact on survival. Clinical Lung Cancer. 22 (1), 16.e1-22.e1 (2021).
- Kim, J. H., Yoon, S., Lee, D. H., Jang, S. J., Chun, S. M., Kim, S. W. Real-world utility of next-generation sequencing for targeted gene analysis and its application to treatment in lung adenocarcinoma. Cancer Medicine. 10 (10), 3197-3204 (2021).
- Sheffield, B. S., et al. Point of care molecular testing: Community-based rapid next-generation sequencing to support cancer care. Current Oncology. 29 (3), 1326-1334 (2022).
- Camidge, D. R., Doebele, R. C., Kerr, K. M. Comparing and contrasting predictive biomarkers for immunotherapy and targeted therapy of NSCLC. Nature Reviews Clinical Oncology. 16 (6), 341-355 (2019).
- Rosas, D., Raez, L. E., Russo, A., Rolfo, C. Neuregulin 1 gene (Nrg1). A potentially new targetable alteration for the treatment of lung cancer. Cancers. 13 (20), 5038 (2021).
- Shapiro, G. I., et al. A Phase 1 study of RO6870810, a novel bromodomain and extra-terminal protein inhibitor, in patients with NUT carcinoma, other solid tumours, or diffuse large B-cell lymphoma. British Journal of Cancer. 124 (4), 744-753 (2021).
- Schoenfeld, A. J., et al. The genomic landscape of SMARCA4 alterations and associations with outcomes in patients with lung cancer. Clinical Cancer Research. 26 (21), 5701-5708 (2021).
- Zhang, K., et al. Identification of deleterious NOTCH mutation as novel predictor to efficacious immunotherapy in NSCLC. Clinical Cancer Research. 26 (14), 3649-3661 (2020).
- Shen, C. I., et al. Real-world evidence of the intrinsic limitations of PCR-based EGFR mutation assay in non-small cell lung cancer. Scientific Reports. 12 (1), 13566 (2022).
- Zou, D., et al. Diagnostic value and cost-effectiveness of next-generation sequencing-based testing for treatment of patients with advanced/metastatic non-squamous non-small-cell lung cancer in the United States. Journal of Molecular Diagnostics. 24 (8), 901-914 (2022).
- Zhong, Y., Xu, F., Wu, J., Schubert, J., Li, M. M. Application of next generation sequencing in laboratory medicine. Annals of Laboratory Medicine. 41 (1), 25-43 (2020).
- Bruno, R., Fontanini, G. Next generation sequencing for gene fusion analysis in lung cancer: A literature review. Diagnostics. 10 (8), 521 (2020).
- Hofman, V., et al. Ultra-fast gene fusion assessment for non-squamous non-small cell lung cancer. JTO Clinical and Research Reports. 4 (2), 100457 (2022).
- Horgan, D., et al. Personalized medicine perspective identifying the steps required to effectively implement next-generation sequencing in oncology at a national level in Europe. Journal of Personalized Medicine. 12 (1), 72 (2022).
- Cohen, D., et al. Optimizing mutation and fusion detection in NSCLC by sequential DNA and RNA sequencing. Journal of Thoracic Oncology. 15 (6), 1000-1014 (2020).
- Goswami, R. S., et al. Identification of factors affecting the success of next-generation sequencing testing in solid tumors. American Journal of Clinical Pathology. 145 (2), 222-237 (2016).
- Ilie, M., Hofman, P. Pitfalls in Lung Cancer Molecular Pathology: How to Limit them in Routine Practice. Current Medicinal Chemistry. 19 (16), 2638-2651 (2012).
