Summary
De toename van moleculaire biomarkers die moeten worden getest voor niet-plaveiselcelcarcinoom niet-kleincellige longkanker (NS-NSCLC) zorgmanagement heeft geleid tot de ontwikkeling van snelle en betrouwbare moleculaire detectiemethoden. We beschrijven een workflow voor de beoordeling van genomische veranderingen voor NS-NSCLC-patiënten met behulp van een ultrasnelle next generation sequencing (NGS)-benadering.
Abstract
Het aantal moleculaire veranderingen dat moet worden getest voor gerichte therapie van patiënten met niet-plaveiselcelkanker (NS-NSCLC) is de afgelopen jaren aanzienlijk toegenomen. De detectie van moleculaire afwijkingen is verplicht voor de optimale zorg voor gevorderde of gemetastaseerde NS-NSCLC-patiënten, waardoor gerichte therapieën kunnen worden toegediend met een verbetering van de algehele overleving. Desalniettemin ontwikkelen deze tumoren resistentiemechanismen die mogelijk kunnen worden aangepakt met behulp van nieuwe therapieën. Sommige moleculaire veranderingen kunnen ook de behandelingsrespons moduleren. De moleculaire karakterisering van NS-NSCLC moet worden uitgevoerd in een korte doorlooptijd (TAT), in minder dan 10 werkdagen, zoals aanbevolen door de internationale richtlijnen. Bovendien is de oorsprong van de weefselbiopten voor genomische analyse divers en neemt hun omvang voortdurend af met de ontwikkeling van minder invasieve methoden en protocollen. Bijgevolg worden pathologen uitgedaagd om effectieve moleculaire technieken uit te voeren met behoud van een efficiënte en snelle diagnosestrategie. Hier beschrijven we de ultrasnelle amplicon-gebaseerde next-generation sequencing (NGS)-workflow die wordt gebruikt in de dagelijkse routinepraktijk bij de diagnose voor NS-NSCLC-patiënten. We hebben aangetoond dat dit systeem in staat is om de huidige moleculaire doelen die worden gebruikt in precisiegeneeskunde in de thoracale oncologie te identificeren in een geschikte TAT.
Introduction
In het afgelopen decennium heeft de ontwikkeling van gerichte en immunotherapieën de totale overleving (OS) van niet-plaveiselcelkanker (NS-NSCLC) aanzienlijk verhoogd1,2. In dit opzicht is het aantal verplichte genen en moleculaire doelen om te analyseren bij de behandeling van NS-NSCLC de afgelopen jaren toegenomen 3,4.
De huidige internationale richtlijnen bevelen aan om EGFR, ALK, ROS1, BRAF, NTRK, RET, en MET te testen bij de diagnose van geavanceerde NS-NSCLC5. Bovendien, aangezien nieuwe geneesmiddelen onlangs veelbelovende resultaten hebben opgeleverd in klinische onderzoeken, zullen binnenkort aanvullende genomische veranderingen worden gescreend in een aantal extra genen, met name KRAS en HER2, samen met BRAC1/BRAC2, PI3KA, NRG1 en NUT 6,7,8,9. Bovendien kan de status van verschillende geassocieerde genen, zoals STK11, KEAP1 en TP53, van groot belang zijn voor een betere voorspelling van de respons of resistentie tegen sommige gerichte therapieën en/of immuuncheckpointremmers (ICI's)10,11,12.
Belangrijk is dat de moleculaire veranderingen zonder noemenswaardige vertraging moeten worden gerapporteerd om zorgvuldige klinische besluitvorming te garanderen. De afwezigheid van moleculaire karakterisering van een tumor kan leiden tot de start van niet-gerichte therapieën zoals chemotherapie met/zonder immunotherapie, wat leidt tot een suboptimale behandelingsstrategie, aangezien de respons op chemotherapie beperkt is bij patiënten met bruikbare veranderingen, zoals EGFR-mutaties of genfusies13.
Bovendien zou de huidige ontwikkeling van gerichte therapieën/immunotherapieën in neoadjuvante en/of adjuvante settings kunnen leiden tot het systematisch zoeken naar, ten minste, EGFR- en ALK-veranderingen in NS-NSCLC in een vroeg stadium, aangezien ICI's alleen mogen worden toegediend in tumoren die wildtype zijn voor EGFR en ALK14. Het is nu ook verplicht om te testen op de aanwezigheid van EGFR-mutaties in NS-NSCLC in een vroeg stadium, aangezien osimertinib (een EGFR-tyrosinekinaseremmer van de derde generatie) kan worden gebruikt als adjuvante therapie bij EGFR-mutant NS-NSCLC15.
De strategie voor de beoordeling van de verschillende biomarkers bij het voorspellen van de respons op verschillende gerichte therapieën en/of immunotherapieën bij NS-NSCLC-patiënten evolueert snel, wat de identificatie van deze biomarkers sequentieel moeilijk maakt 3,16. In dit opzicht is Next-Generation Sequencing (NGS) nu de optimale benadering voor parallelle beoordeling van genveranderingen met hoge doorvoer in NS-NSCLC 5,17.
De NGS-workflow kan echter moeilijk onder de knie te krijgen zijn en kan leiden tot langere TAT18,19. Zo voeren veel centra nog steeds sequentiële benaderingen uit (immunohistochemie (IHC), fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) en/of gerichte sequencing). Deze strategie is echter beperkt in het geval van een kleine steekproefomvang en vooral vanwege het toegenomen aantal bruikbare mutaties dat moet worden getest in NS-NSCLC20. Ultrasnelle en eenvoudige testmethoden die een snelle beoordeling van genveranderingen mogelijk maken, zijn dus steeds belangrijker geworden voor een optimale klinische besluitvorming. Bovendien worden goedgekeurde en geaccrediteerde systemen voor moleculair testen verplicht voor het voorschrijven van specifieke gerichte therapieën.
Hier beschrijven we een ultrasnelle en geautomatiseerde amplicon-gebaseerde DNA/RNA NGS-test voor moleculaire tests van NS-NSCLC die wordt gebruikt in het Laboratorium voor Klinische en Experimentele Pathologie (LPCE), Universitair Ziekenhuis van Nice, Frankrijk en is geaccrediteerd volgens de ISO 15189-norm door de Franse Accreditatiecommissie (COFRAC) (https://www.cofrac.fr/). Het COFRAC certificeert dat het laboratorium voldoet aan de eisen van de norm ISO 15189 en COFRAC toepassingsregels voor de activiteiten van testen/kalibratie in moleculaire analyse in geautomatiseerde NGS op een sequencer met het panel dat door het laboratorium wordt uitgevoerd. Accreditatie volgens de erkende internationale norm ISO 15189 toont de technische competentie van het laboratorium aan voor een gedefinieerde reikwijdte en de goede werking van een geschikt managementsysteem in dit laboratorium. De voordelen en beperkingen van deze workflow, van de voorbereiding van weefselbiopsiemonsters tot het verkrijgen van het rapport, worden besproken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedures zijn goedgekeurd door de lokale ethische commissie (Human Research Ethics Committee, Centre Hospitalier Universitaire de Nice, Tumorothèque BB-0033-00025). Van alle patiënten werd geïnformeerde toestemming verkregen om monsters en gegenereerde gegevens te gebruiken. Alle monsters zijn verkregen van patiënten met de diagnose NS-NSCLC in LPCE (Nice, Frankrijk) tussen 20 september en 31 januari 2022 als onderdeel van de medische zorg.
1. Voorbereiding van FFPE DNA- en RNA-monsters met behulp van een geautomatiseerd zuiveringsinstrument (API) (verwerkingstijd: 5 uur en 15 minuten)
- Voer planificatie uit op het instrument.
- Schakel het instrument in en meld u aan met de gebruikersnaam en het wachtwoord (Materiaaltabel). Maak een plan voor het uitvoeren van een zuiveringsactie door te klikken op Uitvoeren en vervolgens op Plan toevoegen en door een naam te geven aan het uitvoeringsplan.
- Selecteer vervolgens de juiste zuiveringskit en het juiste protocol voor het sequentieel zuiveren van DNA en RNA uit in formaline gefixeerde, in paraffine ingebedde (FFPE) monsters. Kwantificering na zuivering inschakelen.
- Selecteer het gewenste elutievolume (50 μL) in de vervolgkeuzelijst en klik vervolgens op Volgende. Selecteer het aantal monsters dat wordt geëxtraheerd.
- Selecteer vervolgens elk voorbeeld, klik op Bewerken, voer Voorbeeld-ID in en klik vervolgens op Opslaan.
- Bereid FFPE DNA- en RNA-monsters voor met behulp van GPI
- Bereid FFPE-weefselmonsters voor (4 snijsecties van 10 μm met een microtoom) of voer macrodissectie rechtstreeks uit op FFPE-blokken. Plaats elk FFPE-weefselmonster in gescheiden en geïdentificeerde FFPE-monsterverwerkingsbuizen (tabel met materialen).
- Centrifugeer op 2000 x g gedurende 1 minuut om het weefsel op de bodem van de buisjes te verzamelen.
- Voeg aan elke FFPE-monsterverwerkingsbuis een protease-digest-mastermix toe, bereid uit een nucleïnezuurzuiveringskit, en incubeer gedurende ten minste 60 minuten bij 60 °C (Materiaaltabel). Incubeer de monsters gedurende 60 minuten bij 90 °C.
- Laat de monsters na incubatie 5 minuten afkoelen bij kamertemperatuur (RT).
- Til voor elke FFPE-monsterverwerkingsbuis de binnenbuis op, vergrendel deze door naar links te draaien en centrifugeer de monsters vervolgens gedurende 10 minuten op 2000 x g .
- Ontgrendel de binnenbanden door naar rechts te draaien, scheid ze van de buitenste buizen en gooi ze weg. Bewaar de monsters in de buitenste buizen op ijs totdat ze op de API worden geladen.
- Bereid een DNase-vergistingsmastermix voor en laad deze in voorgevulde FFPE-DNA- en RNA-zuiveringsplaat 2. Laad vervolgens de voorbereide monsters in FFPE DNA- en RNA-zuiveringsplaat 1 (Tabel met materialen).
- Start de zuiveringsrun op API.
- Klik in het API-scherm op Uitvoeren, selecteer het Uitvoeringsplan en klik vervolgens op Volgende.
- Volg de aanwijzingen op het scherm om de API te laden met de vereiste verbruiksartikelen en reagentia die nodig zijn voor de zuiveringsrun (Tabel met materialen).
- Wanneer alle reagentia zijn geladen, klikt u op Volgende. Sluit de API-deur en klik op Start.
- Klik aan het einde van de run op « lossen » op het touchscreen en verwijder onmiddellijk de 48-well nucleïnezuurarchiefplaat met het gezuiverde monster-DNA en RNA.
- Exporteer de kwantificeringsresultaten. Sluit de plaat af en bewaar de gezuiverde monsters bij -80 °C. Breng de plaat met 96 putjes over naar de sequencer om te worden geanalyseerd.
- Maak een voorbeeld en maak een uitvoering.
- Open en meld u aan bij de software, kies vervolgens in de menubalk Voorbeelden en klik op Voorbeeld maken.
- Voer de naam, het geslacht en het percentage tumorcellen van het monster in en vul indien nodig de vereiste velden en optionele velden in.
- Bewaar de details (het geslacht en het percentage tumorcellen zijn belangrijk voor het analyseren van varianten van het aantal kopieën [CNV's]).
- Kies Runs en Nucleïnezuur om te resulteren in de menubalk.
- Voer de naam van de uitvoering in de installatiestap in . Klik op Volgende.
- Selecteer assay in de stap Assays . Klik op Volgende.
- Selecteer de monsters in de stap Voorbeelden die u met de test wilt uitvoeren.
- Klik vervolgens in het deelvenster Geselecteerde assays op Toewijzen. Klik op Volgende.
- Controleer de monsterposities op de monsterinvoerplaat. Klik op Volgende.
- Bekijk het overzicht van het uitvoeringsplan en klik vervolgens op Opslaan en afdrukken of Opslaan.
2. Geautomatiseerde NGS op de sequencer (verwerkingstijd: 30 min)
- Laad het monsterplaatje.
OPMERKING: De optimale nucleïnezuurconcentratie is 0.5 ng/μL. Het gevalideerde nucleïnezuurconcentratiebereik is 0,33-1 ng/μL. Voor DNA en RNA werd een concentratie van 1 ng/μL gevalideerd in het laboratorium.- De sequencer heeft een totaal volume van 20 μL nodig. Zorg ervoor dat er voldoende volume is voor het laden van monsters.
- Voeg positieve controles (DNA en RNA) en NTC (DNA en RNA) toe aan de 1e trap van het zuiveringsinstrument zonder te worden geëxtraheerd. Gebruik DNA- en RNA-controles voor elke run om de run te valideren en de gebruikte batches te valideren. Voeg DNA- en RNA-besturingselementen toe aan de plaat aan het einde van de API-run.
- Laad de sequencer en start een run.
- Haal alle reagentia uit hun dozen in de koelkast of vriezer en ontdooi bij RT gedurende een periode van minimaal 30 minuten (materiaaltabel) en maximaal 12 uur.
- Houd in het laboratorium de sequencer altijd ingeschakeld volgens het advies van de leverancier tijdens de training op locatie. Meld u aan bij het systeem.
- Laad de plaat van het zuiveringsinstrument, dat monsters bevat, na het verzegelen van de plaat met een vel zelfklevende PCR-plaatfolie (Tabel met materialen).
- Installeer alle verbruiksartikelen in het dek. De sequencer geeft stap-voor-stap instructies om elk vereist verbruiksartikel op een gemarkeerde positie te laden (Tabel met materialen).
- Controleer of er geen neerslag is op buis 3 van de Strip 2-HD. Draai de buis of draai de strip voorzichtig om het neerslag op te lossen, indien nodig.
- Strip 1 en Strip 3 bevatten magnetische kralen. Deze stap is zeer kritisch: zorg ervoor dat de kralen opnieuw worden gesuspendeerd. Er mogen geen parels meer in het bovenste deel van de buis zitten.
- Draai de strip 3-4 keer ondersteboven en terug om de kralen te verwijderen. Houd de strip aan het ene uiteinde vast met de stripafdichting naar boven gericht. Zwaai daarna de strip snel naar beneden met een snelle, middelpuntvliedende armbeweging en eindig met een scherpe polsbeweging.
- Centrifugeer op 300 x g gedurende 15 s. Herhaal indien nodig. Centrifugeer de strips met adapters en striphouders om storingen te minimaliseren die willekeurig worden waargenomen in verband met resten van kogels in het bovenste deel van de strips.
- Sluit het systeem en klik op Volgende. Installeer de sequentiereagentia in de ruimtedeuren (Tabel met materialen). Sluit de deur. De sequencer start automatisch de run.
- Reiniging
- Als u na de uitvoering wilt opschonen, klikt u op Volgende wanneer de uitvoering is voltooid.
- De deur gaat achtereenvolgens open. Volg de instructies op het scherm om het afval te legen en alle verbruiksartikelen te verwijderen. Klik op Volgende.
- Sluit het deck als u klaar bent, klik op Volgende. Er begint een UV-reiniging van 2 minuten. De sequencer is klaar om aan een nieuwe run te beginnen.
3. Analyse van de resultaten met behulp van de geïntegreerde software (Analysetijd per patiënt [monsters ADN en ARN]: 15 min)
OPMERKING: De techniek is geaccrediteerd door de Franse accreditatiecommissie (COFRAC) ISO 15189 (https://www.cofrac.fr/)
- Gegevens en resultaten
- Selecteer een uitvoeringsresultaat of een voorbeeldresultaat in het menu Resultaten . In het scherm Resultaten/Uitvoeringsresultaten worden alle uitvoeringen weergegeven.
- Doorzoek de lijst met resultaten door te filteren in een kolomkop.
- Klik op Resultaten en klik op Voorbeeldresultaten. Klik vervolgens op de naam van de steekproef in de kolom met de naam van de steekproef om de volgorderesultaten voor een unieke steekproef weer te geven.
- Klik op Kolommen in de linkerbovenhoek van het scherm of deselecteer de kolommen in de tabel.
- Bekijk de QC-resultaten en bekijk de amplicondekking.
- Klik op het tabblad QC in het scherm Resultaten .
- Zorg er voor DNA voor dat de mediane absolute paarsgewijze verschillen (MAPD's) tussen 0 en 0,5 liggen om de analyse van de kopienummervarianten (CNV) te valideren. De in kaart gebrachte lezingen moeten groter zijn dan 1,5 miljoen.
- Controleer voor RNA of de in kaart gebrachte lezingen tussen 150.000 en 400.000 liggen. Daaronder is er een risico op vals-negatieven en daarbuiten is er een risico op vals-positieven.
- Klik op de naam van een voorbeeld om het tabblad Belangrijkste bevindingen te openen.
- Scroll naar de amplicon Coverage Graphs.
- Bekijk de dekkingsgrafieken. Definieer de minimale drempel voor de amplicondekking, aangezien de leverancier deze niet biedt. Om een bereik en een drempelwaarde te definiëren, mengt u een controle- en een wildtypemonster (WT). Let vervolgens op de kleinste waarde van de amplicondekking voor een of meer geselecteerde mutaties.
- Bekijk de resultaten van de variant.
- Als u de gegevens in tabelvorm wilt exporteren, klikt u op Exporteren in de rechterbovenhoek van het scherm.
- Als u het resultaat van de single nucleotid variant/insertion-deletion variant (SNV/INDEL) wilt bekijken, klikt u op het tabblad Varianten en vervolgens op SNVs/Indels. Klik op Filters bewerken en selecteer Geen filter.
OPMERKING: De gevoeligheidsdrempel is vastgesteld op 5% volgens de aanbevelingen van de INCA-groep (Frans Nationaal Kankerinstituut) (https://www.e-cancer.fr/Professionnels-de-sante/Les-therapies-ciblees/Les-plateformes-de-genetique-moleculaire-des-cancers/Le-programme-d-assurance-qualite-des-plateformes). - Fusieresultaten bekijken en RNA-exonvarianten bekijken: Klik op het tabblad 'Varianten' en klik vervolgens op 'Fusies'.
- Klik rechtsboven op Visualisatie en RNA-exonvariant en bekijk vervolgens de plot RNA-exonvarianten .
- Met deze kit kan exon skipping van de EGFR-, MET- en AR-genen worden gedetecteerd. Klik op Visualisatie; Het is gemakkelijker te analyseren.
- Onbalans in RNA-exontielfusie bekijken: Klik op het tabblad 'Varianten ' en klik vervolgens op 'Fusies'.
- Klik rechtsboven op Visualisatie en RNA Exon Tile Fusion Onbalance en bekijk vervolgens de RNA Exon Tile Fusion Imbalance-plots . Een onbalansfusie is een fusie tussen een bekende partner en een partner die niet door het panel wordt gedekt.
- CNV-resultaten bekijken: Klik op CNV's op het tabblad 'Varianten ' om de gegevens weer te geven.
OPMERKING: Het is noodzakelijk om waakzaam te zijn met de resultaten van CNV door tijdens de voorbereiding van de monsters het geslacht en het percentage tumorcellen van het monster te informeren. Het AR-gen wordt alleen gedragen door het X-chromosoom . Als het geslacht niet wordt gespecificeerd, kan het mannelijk geslacht verliezen lijden, wat leidt tot vals-positieve resultaten bij mannelijke patiënten.
- Bekijk de resultaten van de plug-in.
- Bekijk de resultaten van de plug-in voor dekkingsanalyse : Klik rechtsboven op en selecteer bestanden downloaden.
- De plug-in Dekkingsanalyse genereert een dekkingsanalyserapport.
- Bekijk de resultaten van de plug-in voor moleculaire dekkingsanalyse : Klik rechtsboven op en selecteer bestanden downloaden. Deze analyse verifieert of alle amplicons zijn gedekt en bevestigt de resultaten van de kopieën van nummervarianten (CNV's) die door de software worden geleverd.
- Metrische analysegegevens en het uitvoeringsrapport weergeven
- Klik op het tabblad Rapport uitvoeren in het Uitvoeringsoverzicht.
- Als u het rapport Uitvoeren wilt bekijken, selecteert u de optie Voorbeeld selecteren in het vervolgkeuzemenu.
- Metrische gegevens van analyse en het uitvoeringsrapport: Zoek de metrische gegevens voor de volgorde boven aan het scherm, gevolgd door steekproefspecifieke metrische gegevens in de tabel Voorbeelden uitvoeren .
OPMERKING: Informatie in het CSA-bestand (Customer Support Archive) kan helpen bij het oplossen van problemen met resultaten, maar deze kunnen niet rechtstreeks worden geanalyseerd. De CSA-bestanden vatten de gegevens van de volledige uitvoeringsgegevens samen en markeren de oorzaken van een probleem in het geval van een mislukte uitvoering. - Een uitvoeringsrapport downloaden: Klik op het tabblad 'Rapporten '.
- Klik op Rapport downloaden om een samenvatting van het uitvoeringsrapport in PDF-indeling te downloaden.
- Variantenrapport genereren.
- Schakel Rapport genereren in de installatiestap in om automatisch een variantrapport te genereren voor elk voorbeeld tijdens de gegevensanalyse van een uitvoering.
- Na het genereren van het variantenrapport voor een voorbeeld, maakt het systeem het rapport op twee plaatsen beschikbaar: Eerst wordt een koppeling beschikbaar gesteld in het scherm Resultaten/Voorbeeldresultaten . Klik op de link om de PDF te downloaden.
- Ga vervolgens naar het deelvenster Variantrapport op het tabblad Rapporten en klik op de knop Rapport downloaden . Onderteken de variantrapporten elektronisch of handmatig.
OPMERKING: Elektronisch ondertekende rapporten hebben (Afmelden) achter de naam van het voorbeeld in het scherm Voorbeeldresultaten .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Met behulp van de hier gepresenteerde procedure, in detail beschreven in onze recente publicaties21, ontwikkelden we een optimale workflow voor de beoordeling van moleculaire verandering als een reflextest in routinematig uitgevoerde klinische praktijk voor diagnose bij patiënten met NS-NSCLC met behulp van een ultrasnelle amplicon-gebaseerde next-generation sequencing-benadering. De moleculaire workflow van de methode is weergegeven in figuur 1. De lijst van genen die in het panel zijn opgenomen, is weergegeven in aanvullende figuur 1.
Moleculaire analyse werd uitgevoerd bij 259 patiënten met NS-NSCLC. Het omvatte 153 bronchiale biopten, 47 transthoracale biopsieën, 39 chirurgische monsters en 25 celblokken van 13 pleurale effusie en 7 EBUS (tabel 1). De volgende driver-mutante genen werden waargenomen in 242 geldige of beschikbare NGS DNA/RNA-analyses: KRAS (25,4%), EGFR (18,2%), BRAF (6,3%), ERBB2 (1,7%) en MET (1,7%). De volgende genfusies werden gerapporteerd: ALK (4,3%), ROS1 (2,3%), RET (1,9%) en NTRK (0,8%). Volgende veranderingen werden gedetecteerd met een incidentie van minder dan 1% (bijv. IDH1, CDKN2A, FGFR3, KIT, MTOR, FGFR4. NTRK3, NRAS, PIK3CA, IDH2, ERBB3, ERBB4, AR, CHECK2, SMO, PTEN). Voor DNA faalden 10 gevallen (4%), terwijl 5 gevallen (2%) faalden voor RNA. Het falen was te wijten aan een slechte kwaliteit van DNA/RNA en/of een lage hoeveelheid DNA/RNA. Mislukte analyse vond alleen plaats bij monsters met minder dan 10% tumorcellulariteit. Daarom hebben we de cut-off van de tumorcellulariteit gedefinieerd op 10%. Voor DNA NGS-resultaten gingen 10 gevallen (4%) niet door vanwege de lage kwaliteit van nucleïnezuren (6 gevallen) of onvoldoende nucleïnezuurhoeveelheden (4 gevallen met <13 ng DNA). Evenzo faalden vijf gevallen (2%) voor RNA-sequencingresultaten vanwege zowel onvoldoende RNA-kwaliteit als een lage hoeveelheid RNA (<13 ng RNA). Het gemiddelde aandeel tumorcellen in de niet-succesvolle gevallen was beperkt (15%, variërend van 10% tot 20%), in tegenstelling tot de succesvolle gevallen waar tumorcelpercentages varieerden van 30% tot 90%. Van de 15 mislukte monsters waren er 11 afkomstig van kleine weefselbiopten (met een gemiddelde oppervlakte van 2 mm2), terwijl 4 cytologische monsters waren (zoals endobronchiale echografie [EBUS]).
De sensitiviteit van de methode voor de detectie van SNV's en INDEL's was 93,44%, voor CNV's 100% en voor fusies 91,67% met een minimaal tumorcelgehalte van 10% (tabel 1).
De gemiddelde TAT van endoscopiebemonstering uit het moleculaire rapport was 72 uur (bereik: 48-96 uur), met een gemiddelde TAT van extractie tot rapport van 24 uur.
De analytische validatie van de hierboven beschreven NGS-workflow werd uitgevoerd op 30 NS-NSCLC-cases. De validatie toonde 100% overeenstemming aan met de gouden standaardmethoden die eerder in ons centrum werden gebruikt en in detail werden vermeld in de oorspronkelijke publicatie21: RT-PCR EGFR Mutation Test; RT-PCR KRAS-mutatietest ; ALK IHC, ALK VIS; ROS1 IHC; ROS1 VIS; BRAFV600E; en DNA/RNA NGS-methoden.
De meerstapsprocedure van bemonstering tot het moleculair rapport van een EGFR/TP53-mutant longadenocarcinoom is afgebeeld in figuur 2. De weergave van de mutatie die in het biopsiemonster is gevonden met behulp van integratieve genomische viewer (IGV)-software wordt weergegeven in aanvullende figuur 2. Een voorbeeld van een gegenereerd rapport uit de rapportagesoftware is weergegeven in aanvullende figuur 3.
Figuur 1: Diagram van de panelworkflow die in dit onderzoek is gebruikt. Dit cijfer is aangepast met toestemming van Ilié et al.21. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Meerdere stappen van bemonstering tot moleculair biologisch rapport. (A) Drie bronchiale biopsiemonsters ontvangen in het laboratorium van de endoscopiekamer. (B) Hematoxyline/eosine/Safran-gekleurd objectglaasje van het bronchiale biopsiemonster dat een longadenocarcinoom toont met ongeveer 40%-50% tumorcellen (100x vergroting). (C) Rapport van de rapportagesoftware waaruit blijkt dat een EGFR-mutatie geassocieerd is met een TP53-mutatie in het tumormonster. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Totaal aantal patiënten | 259 |
| Bronchiale biopsieën | 153 |
| Transthoracale biopsieën | 47 |
| Chirurgische monsters | 39 |
| Pleurale effusie | 13 |
| EBUS | 7 |
| Bestuurder mutante genen | |
| KRAS | 25.40% |
| EGFR | 18.20% |
| BRAF | 6.30% |
| ERBB2 | 1.70% |
| ONTMOETTE | 1.70% |
| Genfusies | |
| ALK | 4.30% |
| ROS1 | 2.30% |
| ROTEN | 1.95% |
| NTRK | 0.80% |
| Falen - DNA-zaken | 10 gevallen (4%) |
| Falen - RNA-gevallen | 5 gevallen (2%) |
| Afsnijding van tumorcellulariteit | 10% |
| Percentagebereik van tumorcellen in de mislukte gevallen | 10%–20% |
| Percentagebereik van tumorcellen in succesvolle gevallen | 30%–90% |
| Gevoeligheid van de methode | |
| Detectie van SNV's en INDEL's | 93.44% |
| Detectie van CNV's | 100% |
| Detectie van fusies | 91.67% |
Tabel 1: Resultaten van moleculaire analyse. Moleculaire analyse werd uitgevoerd bij 259 patiënten met NS-NSCLC, waaronder 153 bronchiale biopten, 47 transthoracale biopsieën, 39 chirurgische monsters en 25 celblokken van 13 pleurale effusie en 7 EBUS.
Aanvullende figuur 1: De genen die zijn opgenomen in het NGS oncomine precision assay GX-panel. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur 2: Weergave van gegenereerde uitlezingen en mutaties gevonden in het biopsiemonster met behulp van IGV-software. (A) EGFR-gen en (B) TP53-gen . Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur 3: Moleculair rapport gegenereerd door de rapportagesoftware. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De ontwikkeling van een ultrasnelle op amplicon gebaseerde NGS-benadering als reflextesten voor de beoordeling van moleculaire veranderingen bij diagnose van elk stadium NS-NSLC is een optimale optie voor de detectie van alle door de richtlijn aanbevolen en opkomende biomarkers in NS-NSCLC 5,22,23. Terwijl sequentiële methoden (IHC, PCR, FISH) zich alleen richten op specifieke genen en kunnen leiden tot uitputting van weefselmateriaal, maakt deze NGS-workflow een specifieke en gevoelige evaluatie van de status van 50 genen mogelijk, inclusief mutaties, fusies en amplificaties, zelfs met een lage hoeveelheid nucleïnezuur (minimaal 13 ng voor elke DNA- en RNA-sequencing volgens deze studie).
Bovendien levert deze methode snelle en relevante resultaten op voor de behandeling van patiënten met NS-NSCLC. In vergelijking met een op maat gemaakte aanpak, stelt het ontbreken van een eerste selectie van te analyseren gevallen, afhankelijk van het tumorstadium, en zonder te wachten op het verzoek van de arts, hen in staat kostbare tijd te besparen. In deze lijn is aangetoond dat NGS-testen van geavanceerde NS-NSCLC een directe invloed hebben op de algehele overleving van de patiënt24,25. Bovendien worden deze moleculaire resultaten vaak gelijktijdig verkregen uit de IHC-resultaten, vooral voor de evaluatie van het percentage PD-L1-positieve tumorcellen26. De arts kan het "moleculaire profiel" van de tumor krijgen met alle biomarkers die nodig zijn voor de beste therapeutische keuze van eerstelijnsbehandeling27. In specifieke situaties kan de arts de patiënten inschrijven voor een klinische proef volgens de genomische resultaten 28,29,30,31.
Zowel DNA- als RNA-analyse met het panel kan worden uitgevoerd op 2-14 patiënten per run, exclusief controles (1 positieve en 1 negatieve controle). Het is mogelijk om drie runs per week te maken, wat betekent dat 42 patiënten baat kunnen hebben bij een ultrasnelle NGS-profilering van hun tumor. Het zuiveringssysteem, dat de volledig geautomatiseerde extractie en kwantificering van DNA en RNA uitvoert voordat de bibliotheek wordt voorbereid, maakt een snelle evaluatie van de haalbaarheid van de sequentieanalyses mogelijk.
De mogelijkheid om het geëxtraheerde DNA en RNA te kwantificeren voorafgaand aan de voorbereiding van de bibliotheek, en de mogelijkheid om met kleine hoeveelheden nucleïnezuur te werken (beginnend bij minimaal 10 ng DNA of RNA, volgens de specificaties) maakt een snelle beoordeling van de levensvatbaarheid van sequencinganalyse mogelijk.
Een NGS-benadering kan helpen het beheer van de monsterworkflow in de thoracale oncologie te optimaliseren door uitgebreider te zijn in de detectie van bruikbare biomarkers. Het is aangetoond dat de op PCR gebaseerde methode intrinsieke beperkingen heeft bij het detecteren van enkele zeldzame mutaties, met name EGFR exon 20-insertiemutaties32. De NGS-benadering stelt dus een groter deel van de patiënten in staat om biomarkergerichte therapieën te krijgen. In deze context is aangetoond dat NGS-reflextesten voor alle geavanceerde NS-NSCLC kosteneffectief zijn33. Bovendien is de volledig geautomatiseerde nucleïnezuurextractie, bibliotheekvoorbereiding en sequencing die zijn geïntegreerd met dit op amplicons gebaseerde NGS-systeem een aanzienlijke tijdsbesparing voor laboratoriumpersoneel.
Het implementeren van ultrasnelle next-generation sequencing (NGS) als reflextest voor het diagnosticeren van NS-NSCLC kan echter op bepaalde beperkingen stuiten in de dagelijkse klinische praktijk. De reikwijdte van het genenpanel (dat 50 genen omvat) is kleiner in vergelijking met de uitgebreide panels die enkele honderden genen omvatten34. Het panel bevat alle aanbevolen genen die geassocieerd zijn met een gerichte therapie in de thoracale oncologie. Bovendien zijn sommige genen van belang met een potentiële prognostische waarde niet opgenomen. KEAP1, STK11, SMARCA4 en RB1 zijn bijvoorbeeld niet aanwezig op het paneel dat in dit werk wordt gebruikt. Deze genen kunnen in de toekomst belangrijk zijn voor de selectie van patiënten die baat hebben bij de door de FDA goedgekeurde KRASG12C-remmers sotorasib9. Het gebruik van ultrasnelle NGS met amplicon-sequencingtechnologie kan ook de mogelijkheid introduceren voor het missen van zeldzame fusiegenpartners35. Bovendien brachten de onbalansanalyses aanvankelijk een vals-positieve ALK-herschikking aan het licht36. De drempel voor het detecteren van ALK-onbalansfusies werd verhoogd in de nieuwe gemodificeerde test. Het is echter aan te raden om een onbalansresultaat te valideren met een orthogonale techniek (IHC en/of FISH).
Bovenal roept deze workflow vragen op over de economische duurzaamheid en de vergoeding van de NGS-test, die sterk kunnen variëren afhankelijk van het gezondheidsstelsel van het land, met name in Europa37. Voor de kosteneffectiviteitsbenadering is het absoluut noodzakelijk om voldoende monsters tegelijkertijd te nemen om verbruiksartikelen te besparen, wat soms niet mogelijk is, omdat het afhangt van de monsterwerving en het laboratorium35. Bovendien moet de mogelijkheid om een onnodige extra werklast voor het laboratoriumpersoneel te genereren worden besproken en vereist dit een goede communicatie tussen artsen, chirurgen, pathologen en technisch personeel.
Het gelijktijdig gebruik van zowel DNA als RNA NGS is ideaal, maar blijft discutabel. Wetende dat de meeste genomische veranderingen voor gerichte therapie elkaar uitsluiten38, zou het mogelijk kunnen zijn om eerst DNA- en vervolgens RNA-sequencinganalyse uit te voeren. Deze strategie zou echter leiden tot een langere TAT om een rapport te genereren.
De toereikendheid van zowel de kwantiteit als de kwaliteit van geëxtraheerde nucleïnezuren zou een beperking kunnen vormen bij het waarborgen van de robuustheid van NGS-analyses, vooral in gevallen waarin sprake is van hybride vangstsequencingtechnologie en uitgebreide panels die een grotere hoeveelheid materiaal met een hogere TAT6 vereisen. In dit opzicht biedt dit op amplicons gebaseerde NGS-systeem het voordeel dat er slechts 13 ng DNA en RNA nodig is voor het panel en heeft het een zeer laag algemeen faalpercentage. Dit is zeer waardevol in de thoracale oncologie, aangezien de grootte van monsters steeds kleiner wordt 20,39,40.
De indicaties van moleculair testen veranderen voortdurend in de thoracale oncologie en worden nu aanbevolen in adjuvante settings voor sommige genveranderingen15. Naar onze mening is het zeer waarschijnlijk dat er verschillende aanvullende gerichte therapieën zullen ontstaan voor de behandeling van NS-NSCLC in een vroeg stadium in de routinematige klinische praktijk, wat de noodzaak versterkt om snel naar biomarkers te zoeken bij de diagnose. Alles bij elkaar genomen zal de huidige vooruitgang in precisiegeneeskunde bij longkanker onvermijdelijk de voorkeur geven aan een ultrasnelle NGS-benadering die een uitgebreidere, snellere en materiaalbesparende moleculaire profilering van tumoren mogelijk maakt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Christophe Bontoux neemt deel aan betaalde sprekersactiviteiten en ontvangt voordelen van Thermo Fisher Scientific. Paul Hofman neemt deel aan betaalde sprekersactiviteiten en ontvangt voordelen en financiering van Thermo Fisher Scientific.
Acknowledgments
We danken Thermo Fisher Scientific voor het feit dat ze ons de mogelijkheid hebben gegeven om hun apparaat en materialen te gebruiken.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 well hard shell plate clear | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | 4483354 | |
| Adhesive PCR Plate Foil | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | AB0626 | |
| AutoLys M tube | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | A38738 | FFPE sample processing tubes |
| Genexus Barcodes 1-32 HD | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | A40261 | |
| Genexus GX5 Chip and Genexus Coupler | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | A40269 | |
| Genexus Pipette Tips | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | A40266 | |
| Genexus Purification Instrument | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | A48148 | Automated purification instrument (API) |
| Genexus Sequencing Kit | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | A40271 | |
| Genexus Templating Strips 3-GX5 and 4 | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | A40263 | |
| Genexus Integrated Sequencer | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | A45727 | |
| Ion Torrent Genexus FFPE DNA/RNA Purification Combo Kit | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | A45539 | |
| Oncomine Precision Assay GX (OPA) Panel (included Strips 1 and 2-HD) | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | A46291 |
References
- Howlader, N., et al. The effect of advances in lung-cancer treatment on population mortality. New England Journal of Medicine. 383 (7), 640-649 (2020).
- Melosky, B., et al. The rapidly evolving landscape of novel targeted therapies in advanced non-small cell lung cancer. Lung Cancer. 160, 136-151 (2021).
- Hanna, N. H., et al. Therapy for stage IV non-small-cell lung cancer with driver alterations: ASCO and OH (CCO) joint guideline update. Journal of Clinical Oncology. 39 (9), 1040-1091 (2021).
- Kerr, K. M., et al. The evolving landscape of biomarker testing for non-small cell lung cancer in Europe. Lung Cancer. 154, 161-175 (2021).
- Mosele, F., et al. Recommendations for the use of next-generation sequencing (NGS) for patients with metastatic cancers: a report from the ESMO precision medicine working group. Annals of Oncology. 31 (11), 1491-1505 (2020).
- Kazdal, D., Hofman, V., Christopoulos, P., Ilié, M., Stenzinger, A., Hofman, P. Fusion-positive non-small cell lung carcinoma: Biological principles, clinical practice, and diagnostic implications. Genes Chromosomes and Cancer. 61 (5), 244-260 (2022).
- Li, B. T., et al. Trastuzumab deruxtecan in HER2 -mutant non-small-cell lung cancer. New England Journal of Medicine. 386 (3), 241-251 (2022).
- Bontoux, C., Hofman, V., Brest, P., Ilié, M., Mograbi, B., Hofman, P. Daily practice assessment of KRAS status in NSCLC patients: A new challenge for the thoracic pathologist is right around the corner. Cancers. 14 (7), 1628 (2022).
- Skoulidis, F., et al. Sotorasib for lung cancers with KRAS p.G12C mutation. New England Journal of Medicine. 384 (25), 2371-2381 (2021).
- Hellyer, J. A., et al. Impact of tumor suppressor gene co-mutations on differential response to EGFR TKI therapy in EGFR L858R and Exon 19 deletion lung cancer. Clinical Lung Cancer. 23 (3), 264-272 (2022).
- Mograbi, B., Heeke, S., Hofman, P. The importance of stk11/lkb1 assessment in non-small cell lung carcinomas. Diagnostics. 11 (2), 196 (2021).
- Nadal, E., et al. Two patients with advanced-stage lung adenocarcinoma with radiologic complete response to nivolumab treatment harboring an STK11/LKB1 mutation. JCO Precision Oncology. 4, 1239-1245 (2022).
- Smeltzer, M. P., et al. The international association for the study of lung cancer global survey on molecular testing in lung cancer. Journal of Thoracic Oncology. 15 (9), 1434-1448 (2020).
- Ahern, E., Solomon, B. J., Hui, R., Pavlakis, N., O'Byrne, K., Hughes, B. G. M. Neoadjuvant immunotherapy for non-small cell lung cancer: Right drugs, right patient, right time. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 9 (6), e002248 (2021).
- Wu, Y. -L., et al. Osimertinib in resected EGFR-mutated non-small-cell lung cancer. New England Journal of Medicine. 383 (18), 1711-1723 (2020).
- Hanna, N. H., et al. Therapy for stage IV non-small-cell lung cancer without driver alterations: ASCO and OH (CCO) joint guideline update. J Clin Oncol. 38 (14), 1608-1632 (2020).
- de Maglio, G., et al. The storm of NGS in NSCLC diagnostic-therapeutic pathway: How to sun the real clinical practice. Critical Reviews in Oncology/Hematology. 169, 103561 (2022).
- DiStasio, M., Chen, Y., Rangachari, D., Costa, D. B., Heher, Y. K., VanderLaan, P. A. Molecular testing turnaround time for non-small cell lung cancer in routine clinical practice confirms feasibility of CAP/IASLC/AMP guideline recommendations: A single-center analysis. Clinical Lung Cancer. 18 (5), e349-e356 (2017).
- Heeke, S., et al. Use of the ion PGM and the genereader NGS systems in daily routine practice for advanced lung adenocarcinoma patients: A practical point of view reporting a comparative study and assessment of 90 patients. Cancers. 10 (4), 88 (2018).
- Hofman, P. The challenges of evaluating predictive biomarkers using small biopsy tissue samples and liquid biopsies from non-small cell lung cancer patients. Journal of Thoracic Disease. 11, S57-S64 (2019).
- Ilié, M., et al. Setting up an ultra-fast next-generation sequencing approach as reflex testing at diagnosis of non-squamous non-small cell lung cancer; experience of a single center (LPCE, Nice, France). Cancers. 14 (9), 2258 (2022).
- Zacharias, M., et al. Reflex testing in non-small cell lung carcinoma using DNA-and RNA-based next-generation sequencing-a single-center experience. Translational Lung Cancer Research. 10 (11), 4221-4234 (2021).
- Miller, T. E., et al. Clinical utility of reflex testing using focused nextgeneration sequencing for management of patients with advanced lung adenocarcinoma. Journal of Clinical Pathology. 71 (12), 1108-1115 (2018).
- Al-Ahmadi, A., et al. Next generation sequencing of advanced non-small cell lung cancer: utilization based on race and impact on survival. Clinical Lung Cancer. 22 (1), 16.e1-22.e1 (2021).
- Kim, J. H., Yoon, S., Lee, D. H., Jang, S. J., Chun, S. M., Kim, S. W. Real-world utility of next-generation sequencing for targeted gene analysis and its application to treatment in lung adenocarcinoma. Cancer Medicine. 10 (10), 3197-3204 (2021).
- Sheffield, B. S., et al. Point of care molecular testing: Community-based rapid next-generation sequencing to support cancer care. Current Oncology. 29 (3), 1326-1334 (2022).
- Camidge, D. R., Doebele, R. C., Kerr, K. M. Comparing and contrasting predictive biomarkers for immunotherapy and targeted therapy of NSCLC. Nature Reviews Clinical Oncology. 16 (6), 341-355 (2019).
- Rosas, D., Raez, L. E., Russo, A., Rolfo, C. Neuregulin 1 gene (Nrg1). A potentially new targetable alteration for the treatment of lung cancer. Cancers. 13 (20), 5038 (2021).
- Shapiro, G. I., et al. A Phase 1 study of RO6870810, a novel bromodomain and extra-terminal protein inhibitor, in patients with NUT carcinoma, other solid tumours, or diffuse large B-cell lymphoma. British Journal of Cancer. 124 (4), 744-753 (2021).
- Schoenfeld, A. J., et al. The genomic landscape of SMARCA4 alterations and associations with outcomes in patients with lung cancer. Clinical Cancer Research. 26 (21), 5701-5708 (2021).
- Zhang, K., et al. Identification of deleterious NOTCH mutation as novel predictor to efficacious immunotherapy in NSCLC. Clinical Cancer Research. 26 (14), 3649-3661 (2020).
- Shen, C. I., et al. Real-world evidence of the intrinsic limitations of PCR-based EGFR mutation assay in non-small cell lung cancer. Scientific Reports. 12 (1), 13566 (2022).
- Zou, D., et al. Diagnostic value and cost-effectiveness of next-generation sequencing-based testing for treatment of patients with advanced/metastatic non-squamous non-small-cell lung cancer in the United States. Journal of Molecular Diagnostics. 24 (8), 901-914 (2022).
- Zhong, Y., Xu, F., Wu, J., Schubert, J., Li, M. M. Application of next generation sequencing in laboratory medicine. Annals of Laboratory Medicine. 41 (1), 25-43 (2020).
- Bruno, R., Fontanini, G. Next generation sequencing for gene fusion analysis in lung cancer: A literature review. Diagnostics. 10 (8), 521 (2020).
- Hofman, V., et al. Ultra-fast gene fusion assessment for non-squamous non-small cell lung cancer. JTO Clinical and Research Reports. 4 (2), 100457 (2022).
- Horgan, D., et al. Personalized medicine perspective identifying the steps required to effectively implement next-generation sequencing in oncology at a national level in Europe. Journal of Personalized Medicine. 12 (1), 72 (2022).
- Cohen, D., et al. Optimizing mutation and fusion detection in NSCLC by sequential DNA and RNA sequencing. Journal of Thoracic Oncology. 15 (6), 1000-1014 (2020).
- Goswami, R. S., et al. Identification of factors affecting the success of next-generation sequencing testing in solid tumors. American Journal of Clinical Pathology. 145 (2), 222-237 (2016).
- Ilie, M., Hofman, P. Pitfalls in Lung Cancer Molecular Pathology: How to Limit them in Routine Practice. Current Medicinal Chemistry. 19 (16), 2638-2651 (2012).
