Summary
O aumento de biomarcadores moleculares a serem testados para o manejo do cuidado do câncer de pulmão não pequenas células não escamosas (CPNPC-NS) tem impulsionado o desenvolvimento de métodos de detecção molecular rápidos e confiáveis. Descrevemos um fluxo de trabalho para avaliação de alterações genômicas para pacientes com CPNPC-NS usando uma abordagem de sequenciamento de próxima geração (NGS) ultrarrápida.
Abstract
O número de alterações moleculares a serem testadas para terapia-alvo de pacientes com câncer de pulmão não pequenas células não escamosas (CPNPC) tem aumentado significativamente nos últimos anos. A detecção de anormalidades moleculares é mandatória para o tratamento ideal de pacientes com CPNPC NS avançado ou metastático, permitindo que terapias-alvo sejam administradas com melhora na sobrevida global. No entanto, esses tumores desenvolvem mecanismos de resistência que são potencialmente direcionáveis usando novas terapias. Algumas alterações moleculares também podem modular a resposta ao tratamento. A caracterização molecular do CPCNP deve ser realizada em um curto tempo de resposta (TAT), em menos de 10 dias úteis, conforme recomendado pelas diretrizes internacionais. Além disso, a origem das biópsias teciduais para análise genômica é diversa, e seu tamanho está diminuindo continuamente com o desenvolvimento de métodos e protocolos menos invasivos. Consequentemente, os patologistas estão sendo desafiados a realizar técnicas moleculares eficazes, mantendo uma estratégia de diagnóstico eficiente e rápida. Aqui, descrevemos o fluxo de trabalho de sequenciamento de próxima geração (NGS) ultrarrápido baseado em amplicon usado na prática diária de rotina no diagnóstico de pacientes com CPNPC-NS. Mostramos que este sistema é capaz de identificar os atuais alvos moleculares utilizados em medicina de precisão em oncologia torácica em um TAT apropriado.
Introduction
Na última década, o desenvolvimento de terapias direcionadas e imunológicas aumentou significativamente a sobrevida global (SG) do câncer de pulmão não escamoso de células não pequenas (CPCNP)1,2. Nesse sentido, o número de genes obrigatórios e alvos moleculares a serem analisados no tratamento do CPNPC-NS tem aumentado nos últimos anos 3,4.
As diretrizes internacionais atuais recomendam testar EGFR, ALK, ROS1, BRAF, NTRK, RET, e MET no diagnóstico de NS-NS 5avançado. Além disso, como novas drogas têm recentemente dado resultados muito promissores em ensaios clínicos, alterações genômicas adicionais serão rastreadas em breve em vários genes adicionais, notadamente KRAS e HER2, juntamente com BRAC1/BRAC2, PI3KA, NRG1 e NUT 6,7,8,9. Além disso, o status de diferentes genes associados, como STK11, KEAP1 e TP53, pode ser de forte interesse para uma melhor predição da resposta ou resistência a algumas terapias-alvo e/ou inibidores de checkpoints imunes (ICIs)10,11,12.
É importante ressaltar que as alterações moleculares devem ser relatadas sem demora significativa para garantir a tomada de decisão clínica cuidadosa. A ausência de caracterização molecular de um tumor pode levar ao início de terapias não direcionadas, como quimioterapia com/sem imunoterapia, levando a uma estratégia de tratamento subótima, uma vez que a resposta à quimioterapia é limitada em pacientes com alterações acionáveis, como mutações no EGFR ou fusões gênicas13.
Além disso, o desenvolvimento atual de terapias-alvo/imunoterapias em ambientes neoadjuvantes e/ou adjuvantes poderia levar à busca sistemática, pelo menos, de alterações de EGFR e ALK no CPCNP em estágio inicial, uma vez que as ICIs devem ser administradas apenas em tumores selvagens para EGFR e ALK14. Agora, também é obrigatório testar a presença de mutações no EGFR no CPCNP (CPCNP com gene e SN em estágio inicial), uma vez que o osimertinibe (um inibidor da tirosina quinase do EGFR de terceira geração) pode ser usado como terapia adjuvante no CPCNP mutante para EGFR 15.
A estratégia para a avaliação dos diferentes biomarcadores na predição da resposta a diferentes terapias-alvo e/ou imunoterapias em pacientes com CPNPC-NS está avançando rapidamente, o que torna a identificação desses biomarcadores sequencialmente difícil 3,16. Nesse sentido, o Next-Generation Sequencing (NGS) é atualmente a abordagem ideal para a avaliação paralela de alto rendimento de alterações gênicas no NS-NS-CPNPC 5,17.
No entanto, o fluxo de trabalho da SNG pode ser difícil de dominar e pode conduzir a TAT mais longa18,19. Assim, muitos centros ainda realizam abordagens sequenciais (imunohistoquímica (IHQ), hibridização in situ fluorescente (FISH) e/ou sequenciamento direcionado). No entanto, essa estratégia é limitada em caso de pequeno tamanho de amostra e, sobretudo, devido ao maior número de mutações acionáveis que são necessárias para serem testadas no NS-NSCLC20. Assim, métodos de teste ultrarrápidos e diretos, permitindo a avaliação rápida de alterações gênicas, tornaram-se cada vez mais importantes para a tomada de decisões clínicas ideais. Além disso, sistemas aprovados e acreditados para testes moleculares estão se tornando obrigatórios para a prescrição de terapias-alvo específicas.
Aqui, descrevemos um ensaio DNA/RNA NGS ultrarrápido e automatizado baseado em amplicon para testes moleculares de NS-NSCLC que é usado no Laboratório de Patologia Clínica e Experimental (LPCE), Hospital Universitário de Nice, França e é acreditado de acordo com a norma ISO 15189 pelo Comitê Francês de Acreditação (COFRAC) (https://www.cofrac.fr/). O COFRAC certifica que o laboratório cumpre os requisitos da norma ISO 15189 e as regras de aplicação do COFRAC para as atividades de ensaio/calibração em análises moleculares em NGS automatizado em um sequenciador com o painel realizado pelo laboratório. A acreditação pela reconhecida norma internacional ISO 15189 demonstra a competência técnica do laboratório para um escopo definido e o bom funcionamento de um sistema de gestão adequado neste laboratório. Os benefícios e limitações desse fluxo de trabalho, desde a preparação das amostras de biópsia tecidual até a obtenção do laudo, são discutidos.
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Protocol
Todos os procedimentos foram aprovados pelo comitê de ética local (Comitê de Ética em Pesquisa com Seres Humanos, Centre Hospitalier Universitaire de Nice, Tumorothèque BB-0033-00025). Consentimento informado foi obtido de todos os pacientes para uso de amostras e dados gerados. Todas as amostras foram obtidas de pacientes diagnosticados com NS-CPNPC em LPCE (Nice, França) entre 20 de setembro e 31 de janeiro de 2022 como parte dos cuidados médicos.
1. Preparação de amostras de DNA e RNA FFPE usando instrumento de purificação automatizado (API) (Tempo de processamento: 5 h 15 min)
- Execute a planificação no instrumento.
- Ligue o instrumento e faça login com o nome de usuário e senha (Tabela de Materiais). Crie um plano de execução de purificação clicando em Executar, em Adicionar Plano e dando um nome ao plano de execução.
- Em seguida, selecione o kit de purificação apropriado e o protocolo para purificar sequencialmente o DNA e o RNA de amostras fixadas em formalina e emblocadas em parafina (FFPE). Permitir a quantificação após a purificação.
- Selecione o volume de eluição desejado (50 μL) na lista suspensa e clique em Avançar. Selecione o número de amostras que serão extraídas.
- Em seguida, selecione cada amostra, clique em Editar, insira ID de Exemplo e clique em Salvar.
- Preparar amostras de DNA e RNA FFPE usando GPI
- Preparar amostras de tecido FFPE (4 cortes de 10 μm com micrótomo) ou realizar macrodissecção diretamente em blocos FFPE. Colocar cada amostra de tecido FFPE em tubos de processamento de amostra FFPE separados e identificados (Tabela de Materiais).
- Centrifugar a 2000 x g por 1 min para coletar o tecido no fundo dos tubos.
- Adicionar a cada tubo de processamento de amostras FFPE uma mistura mestre de protease digest preparada a partir de um kit de purificação de ácido nucleico e incubar a 60 °C durante, pelo menos, 60 min (Tabela de Materiais). Incubar as amostras a 90 °C durante 60 min.
- Após a incubação, deixar as amostras arrefecerem durante 5 minutos à temperatura ambiente (TR).
- Para cada tubo de processamento de amostras FFPE, levante o tubo interno, bloqueie-o virando à esquerda e, em seguida, centrifugue as amostras a 2000 x g por 10 min.
- Destrave os tubos internos virando à direita, separe-os dos tubos externos e descarte-os. Mantenha as amostras nos tubos externos sobre gelo até o carregamento no API.
- Prepare uma mistura mestre de digestão DNase e carregue-a na placa de purificação de DNA e RNA FFPE pré-cheia 2. Em seguida, carregar as amostras preparadas em FFPE DNA e placa de purificação de RNA 1 (Tabela de Materiais).
- Inicie a execução de purificação na API.
- Na tela API, clique em Executar, selecione o Plano de Execução e clique em Avançar.
- Siga as indicações na tela para carregar a API com os consumíveis e reagentes necessários para a execução de purificação (Tabela de Materiais).
- Quando todos os reagentes estiverem carregados, clique em Avançar. Feche a porta da API e clique em Iniciar.
- No final da corrida, clique em "descarregar" na tela sensível ao toque e remova imediatamente a placa de arquivo de ácido nucleico de 48 poços contendo o DNA e o RNA da amostra purificada.
- Exporte os resultados da quantificação. Selar a placa e armazenar amostras purificadas a -80 °C. Transfira a placa de 96 poços para o sequenciador a ser analisado.
- Crie um exemplo e crie uma execução.
- Abra e inicie sessão no software, selecione na barra de menus Exemplos e clique em Criar Amostra.
- Insira o nome, o sexo e a porcentagem de células tumorais da amostra e preencha os campos obrigatórios e opcionais, se necessário.
- Salve os detalhes (o sexo e a porcentagem de células tumorais são importantes para analisar variantes de número de cópias [CNVs]).
- Escolha Execuções e Ácido Nucleico para Resultar na barra de menus.
- Insira o nome da execução na etapa de instalação . Clique em Avançar.
- Selecione ensaio na etapa Ensaios . Clique em Avançar.
- Selecione as amostras na etapa Amostras para executar com o ensaio.
- Em seguida, no painel Ensaios Selecionados , clique em Atribuir. Clique em Avançar.
- Revise as posições da amostra na placa de entrada da amostra. Clique em Avançar.
- Revise o resumo do plano de execução e Salvar & Imprimir ou Salvar.
2. NGS automatizado no sequenciador (Tempo de processamento: 30 min)
- Carregue a placa de amostra.
NOTA: A concentração ideal de ácido nucleico é de 0,5 ng/μL. A faixa de concentração de ácido nucleico validada é de 0,33-1 ng/μL. Para DNA e RNA, a concentração de 1 ng/μL foi validada em laboratório.- O sequenciador requer 20 μL de volume total. Verifique se há volume suficiente para o carregamento da amostra.
- Adicionar controles positivos (DNA e RNA) e NTC (DNA e RNA) ao 1º estágio do instrumento de purificação sem ser extraído. Use controles de DNA e RNA para cada execução para validar a execução e validar os lotes usados. Adicione controles de DNA e RNA à placa no final da execução da API.
- Carregue o sequenciador e inicie uma execução.
- Retire todos os reagentes de suas caixas na geladeira ou freezer e descongele em RT por um período mínimo de 30 min (Tabela de Materiais) e máximo de 12 h.
- No laboratório, mantenha o sequenciador sempre ligado seguindo as orientações dadas pelo fornecedor durante o treinamento presencial. Faça login no sistema.
- Carregue a placa do instrumento de purificação, que contém amostras, depois de selar a placa com uma folha de folha de placa de PCR adesiva (Tabela de Materiais).
- Instale todos os consumíveis no deck. O sequenciador fornece instruções passo a passo para carregar cada consumível necessário em uma posição destacada (Tabela de Materiais).
- Verifique se não há precipitações no tubo 3 da Tira 2-HD. Agite o tubo ou agite suavemente a tira para dissolver o precipitado, se necessário.
- A tira 1 e a tira 3 contêm esferas magnéticas. Essa etapa é muito crítica: garantir que as contas sejam ressuspensas. Não deve haver contas deixadas na parte superior do tubo.
- Vire a tira de cabeça para baixo e para trás 3-4 vezes para remover as contas. Segure a tira em uma extremidade com o selo da tira orientado para cima. Depois, gire rapidamente a tira para baixo usando um movimento rápido e centrífugo do braço e termine dando um movimento brusco do pulso.
- Centrifugar a 300 x g por 15 s. Repita se necessário. Centrifugar as tiras com adaptadores e suportes de tiras para minimizar falhas observadas aleatoriamente em relação a resíduos de esferas na parte superior das tiras.
- Feche o sistema e clique em Avançar. Instale as portas do compartimento de reagentes de sequenciamento (Tabela de Materiais). Feche a porta. O sequenciador inicia automaticamente a execução.
- Limpeza
- Para limpeza após a execução, quando a execução estiver concluída, clique em Avançar.
- A porta abre-se sucessivamente. Siga as instruções na tela para esvaziar os resíduos e remover todos os consumíveis. Clique em Avançar.
- Feche o deck quando terminar, clique em Avançar. Uma limpeza UV de 2 minutos é iniciada. O sequenciador está pronto para iniciar uma nova execução.
3. Análise dos resultados utilizando o software integrado (Tempo de análise por paciente [amostras ADN e ARN]: 15 min)
NOTA: A técnica é acreditada pelo Comitê Francês de Acreditação (COFRAC) ISO 15189 (https://www.cofrac.fr/)
- Dados e resultados
- Selecione um resultado de execução ou um resultado de amostra no menu Resultados . Na tela Resultados/Resultados da Execução , todas as execuções são listadas.
- Pesquise a lista de resultados filtrando em um cabeçalho de coluna.
- Clique em Resultados e clique em Resultados de Exemplo. Em seguida, clique no nome da amostra de interesse na coluna de nome da amostra para exibir os resultados de sequenciamento de uma amostra exclusiva.
- Clique em Colunas no canto superior esquerdo da tela ou desmarque as colunas da tabela.
- Veja os resultados do CQ e veja a cobertura do amplicon.
- Clique na guia QC na tela Resultados .
- Para o DNA, certifique-se de que as diferenças absolutas medianas entre pares (MAPDs) estejam entre 0 e 0,5 para validar a análise das variantes do número de cópias (CNV). As leituras mapeadas devem ser superiores a 1,5 milhão.
- Para o RNA, verifique se as leituras mapeadas estão entre 150.000 e 400.000. Abaixo disso, há o risco de falsos negativos e, além disso, há o risco de falsos positivos.
- Clique em um nome de exemplo para abrir a guia Principais descobertas .
- Role até os gráficos de cobertura do amplicon.
- Revise os gráficos de cobertura. Defina o limite mínimo para a cobertura amplicon, pois o fornecedor não o fornece. Para definir um intervalo e um limite, misture um controle e uma amostra de tipo selvagem (WT). Em seguida, observe o menor valor da cobertura do amplicon para uma ou mais mutações selecionadas.
- Exibir resultados de variantes.
- Para exportar os dados em formato tabular, clique em Exportar no canto superior direito da tela.
- Para exibir o resultado da variante de nucleotídeo único/variante de inserção-exclusão (SNV/INDEL), clique na guia Variantes e, em seguida, clique em SNVs/Indels. Clique em Editar filtros e selecione Sem filtro.
NOTA: O limiar de sensibilidade foi definido em 5% de acordo com as recomendações do grupo (https://www.e-cancer.fr/Professionnels-de-sante/Les-therapies-ciblees/Les-plateformes-de-genetique-moleculaire-des-cancers/Le-programme-d-assurance-qualite-des-plateformes) do INCA (Instituto Nacional de Câncer). - Exibir resultados do Fusion e exibir Variantes de Exon de RNA: Clique na guia Variantes e, em seguida, clique em Fusões.
- No canto superior direito, clique em Visualização e Variante de Exon de RNA e, em seguida, revise o gráfico de Variantes de Exon de RNA .
- Com este kit, o pulo de exon dos genes EGFR, MET, e AR pode ser detectado. Clique em Visualização; é mais fácil de analisar.
- Exibir desequilíbrio de fusão de blocos de exons de RNA: clique na guia Variantes e, em seguida, clique em Fusões.
- No canto superior direito, clique em Visualização e Desequilíbrio de Fusão de Blocos de Exon de RNA e, em seguida, revise os gráficos de Desequilíbrio de Fusão de Blocos de Exon de RNA . Uma fusão de desequilíbrio é uma fusão entre um parceiro conhecido e um parceiro que não é coberto pelo painel.
- Exibir resultados CNV: Clique em CNVs na guia Variantes para exibir os dados.
OBS: É necessário ficar atento aos resultados da CNV, informando durante o preparo das amostras o sexo e a porcentagem de células tumorais da amostra. O gene AR é transportado apenas pelo cromossomo X . Se o sexo não for especificado, o sexo masculino pode encontrar perdas, levando a resultados falso-positivos em pacientes do sexo masculino.
- Revise os resultados do plugin.
- Revise os resultados do plug-in Análise de cobertura : no canto superior direito, clique e selecione baixar arquivos.
- O plugin Análise de Cobertura gera um Relatório de Análise de Cobertura.
- Revise os resultados do plugin Análise de Cobertura molecular: No canto superior direito, clique e selecione baixar arquivos. Essa análise verifica se todos os amplicons estão cobertos e confirma os resultados das variantes de número de cópias (CNVs) fornecidos pelo software.
- Exibir métricas de ensaio e o relatório de execução
- Clique na guia Executar Relatório no Resumo da Execução.
- Para exibir o Relatório de Execução, selecione a opção Selecionar Amostra no menu suspenso.
- Métricas de ensaio e o relatório de execução: localize as métricas de sequenciamento na parte superior da tela, seguidas por métricas específicas de amostra na tabela Executar amostras .
Observação : informações no arquivo de suporte ao cliente (CSA) podem ajudar a solucionar problemas de resultados, mas eles não podem ser analisados diretamente. Os arquivos CSA resumem os dados de todos os dados de execução e destacam as causas de um problema em caso de falha na execução. - Baixar um relatório de execução: clique na guia Relatórios .
- Clique em Baixar relatório para baixar um resumo de relatório de execução em formato PDF.
- Gerar relatório de variantes.
- Habilite Gerar relatório na etapa Instalação para gerar automaticamente um relatório de variante para cada amostra durante a análise de dados de uma execução.
- Depois de gerar o relatório de variante para uma amostra, o sistema disponibiliza o relatório em dois locais: primeiro, um link é disponibilizado na tela Resultados/Resultados da amostra . Clique no link para baixar o PDF.
- Em segundo lugar, vá para o painel Relatório de Variante na guia Relatórios e clique no botão Baixar Relatório . Assine os relatórios de variantes eletronicamente ou manualmente.
Observação : relatórios assinados eletronicamente têm (aprovação) após o nome do exemplo na tela resultados de exemplo .
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Representative Results
Usando o procedimento aqui apresentado, descrito em detalhes em nossas publicações recentes21, desenvolvemos um fluxo de trabalho ideal para a avaliação de alterações moleculares como um teste reflexo na prática clínica rotineiramente realizada para o diagnóstico em pacientes com CPNPC NS usando uma abordagem de sequenciamento de última geração baseada em amplicon ultrarrápido. O fluxo de trabalho molecular do método é mostrado na Figura 1. A lista de genes incluídos no painel é mostrada na Figura Suplementar 1.
A análise molecular foi realizada em 259 pacientes com CPNPC-NS. Foram incluídas 153 biópsias brônquicas, 47 biópsias transtorácicas, 39 peças cirúrgicas e 25 bloqueios celulares de 13 derrames pleurais e 7 EBUS (Tabela 1). Os seguintes genes condutores mutantes foram observados em 242 análises de DNA/RNA NGS válidas ou disponíveis: KRAS (25,4%), EGFR (18,2%), BRAF (6,3%), ERBB2 (1,7%) e MET (1,7%). As seguintes fusões gênicas foram relatadas: ALK (4,3%), ROS1 (2,3%), RET (1,9%) e NTRK (0,8%). As alterações seguintes foram detectadas com incidência inferior a 1% (por exemplo, IDH1, CDKN2A, FGFR3, KIT, MTOR, FGFR4. NTRK3, NRAS, PIK3CA, IDH2, ERBB3, ERBB4, AR, CHECK2, SMO, PTEN). Para o DNA, 10 casos (4%) falharam, enquanto 5 casos (2%) falharam para o RNA. A falha deveu-se à má qualidade do DNA/RNA e/ou baixa quantidade de DNA/RNA. A falha na análise ocorreu apenas com amostras com menos de 10% de celularidade tumoral. Assim, definimos o ponto de corte da celularidade tumoral em 10%. Para os resultados de DNA NGS, 10 casos (4%) não passaram devido à baixa qualidade dos ácidos nucléicos (6 casos) ou quantidades insuficientes de ácidos nucleicos (4 casos com <13 ng de DNA). Da mesma forma, cinco casos (2%) falharam nos resultados do sequenciamento de RNA devido à qualidade inadequada do RNA e à baixa quantidade de RNA (<13 ng de RNA). A proporção média de células tumorais nos casos de insucesso foi limitada (15%, variando de 10% a 20%), em contraste com os casos de sucesso, onde os percentuais de células tumorais variaram de 30% a 90%. Dentre as 15 amostras malsucedidas, 11 originaram-se de biópsias de pequenos tecidos (com área média de 2 mm2), enquanto 4 eram espécimes citológicos (como ultrassom endobrônquico [EBUS]).
A sensibilidade do método para a detecção de SNVs e INDELs foi de 93,44%, para CNVs foi de 100% e para fusões foi de 91,67% com um conteúdo mínimo de células tumorais de 10% (Tabela 1).
O TAT médio da amostra endoscópica do laudo molecular foi de 72 h (variação: 48-96 h), com um TAT médio da extração ao relato de 24 h.
A validação analítica do fluxo de trabalho da NGS descrito acima foi realizada em 30 casos de CPNPC-NS. A validação demonstrou 100% de concordância com os métodos padrão-ouro previamente utilizados em nosso centro e listados em detalhes na publicação original21: RT-PCR EGFR Mutation Test; Teste de mutação RT-PCR KRAS ; ALK IHC, PEIXE ALK ; ROS1 IHC; ROS1 PEIXE; BRAFV600E; e métodos DNA/RNA NGS.
O procedimento em várias etapas desde a amostragem até o relato molecular de um adenocarcinoma pulmonar mutante EGFR/TP53 é retratado na Figura 2. A representação da mutação encontrada na amostra de biópsia utilizando o software visualizador genômico integrativo (IGV) é mostrada na Figura 2 Suplementar. Um exemplo de um relatório gerado a partir do software de relatório é mostrado na Figura Suplementar 3.
Figura 1: Diagrama do fluxo de trabalho do painel utilizado neste estudo. Esse valor foi modificado com permissão de Ilié et al.21. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Múltiplas etapas desde a amostragem até o relatório de biologia molecular. (A) Três amostras de biópsia brônquica recebidas no laboratório da sala de endoscopia. (B) Lâmina corada pela hematoxilina/Eosina/Safran do material de biópsia brônquica mostrando adenocarcinoma de pulmão com cerca de 40%-50% de células tumorais (aumento de 100x). (C) Relatório do software de relato mostrando uma mutação EGFR associada a uma mutação TP53 na amostra tumoral. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Número total de pacientes | 259 |
| Biópsias brônquicas | 153 |
| Biópsias transtorácicas | 47 |
| Peças cirúrgicas | 39 |
| Derrame pleural | 13 |
| EBUS | 7 |
| Genes mutantes do condutor | |
| KRAS | 25.40% |
| EGFR | 18.20% |
| BRAF | 6.30% |
| ERBB2 | 1.70% |
| CONHECI | 1.70% |
| Fusões gênicas | |
| ALK | 4.30% |
| ROS1 | 2.30% |
| RET | 1.95% |
| NTRK | 0.80% |
| Falha - casos de DNA | 10 casos (4%) |
| Falha - casos de RNA | 5 casos (2%) |
| Ponto de corte da celularidade tumoral | 10% |
| Intervalo percentual de células tumorais nos casos de falha | 10%–20% |
| Variação percentual de células tumorais em casos de sucesso | 30%–90% |
| Sensibilidade do método | |
| Detecção de SNVs e INDELs | 93.44% |
| Detecção de CNVs | 100% |
| Detecção de Fusões | 91.67% |
Tabela 1: Resultados da análise molecular. A análise molecular foi realizada em 259 pacientes com CPNPC-NS, incluindo 153 biópsias brônquicas, 47 biópsias transtorácicas, 39 peças cirúrgicas e 25 bloqueios celulares de 13 derrames pleurais e 7 EBUS.
Figura suplementar 1: Os genes incluídos no painel GX do ensaio de precisão oncomina NGS. Clique aqui para baixar este arquivo.
Figura Suplementar 2: Representação das leituras geradas e mutações encontradas na amostra de biópsia utilizando o software IGV. (A) gene EGFR e (B) gene TP53 . Clique aqui para baixar este arquivo.
Figura Suplementar 3: Relatório molecular gerado pelo software de notificação. Clique aqui para baixar este arquivo.
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Discussion
O desenvolvimento de uma abordagem NGS ultrarrápida baseada em amplicon como teste reflexo para avaliação de alterações moleculares no diagnóstico de qualquer estágio NS-NSLC é uma opção ideal para a detecção de todos os biomarcadores emergentes e recomendados pelas diretrizes em NS-NS 5,22,23. Enquanto os métodos sequenciais (IHC, PCR, FISH) se concentram apenas em genes específicos e podem resultar em exaustão do material tecidual, esse fluxo de trabalho NGS permite uma avaliação específica e sensível do status de 50 genes, incluindo mutações, fusões e amplificações, mesmo com uma baixa quantidade de ácido nucleico (mínimo de 13 ng para cada sequenciamento de DNA e RNA de acordo com este estudo).
Além disso, esse método fornece resultados rápidos e relevantes para o manejo de pacientes com CPNPC-NS. Em comparação com uma abordagem sob medida, a ausência de uma seleção inicial de casos a serem analisados, dependendo do estágio do tumor, e sem esperar a solicitação do médico permite economizar um tempo precioso. Nessa linha, tem sido demonstrado que o teste de SNG de CPNPC avançado afeta diretamente a sobrevida global do paciente24,25. Além disso, esses resultados moleculares são frequentemente obtidos simultaneamente a partir dos resultados de IHQ, especialmente para a avaliação da porcentagem de células tumorais PD-L1positivas26. O médico pode obter o "perfil molecular" do tumor com todos os biomarcadores necessários para a melhor escolha terapêutica do tratamento de primeira linha27. Em situações específicas, o médico pode inscrever os pacientes em um ensaio clínico de acordo com os resultados genômicos 28,29,30,31.
Tanto a análise de DNA quanto de RNA com o painel pode ser realizada em 2-14 pacientes por corrida, excluindo-se os controles (1 controle positivo e 1 negativo). É possível fazer três corridas por semana, o que significa que 42 pacientes podem se beneficiar de um perfil de NGS ultrarrápido de seu tumor. O sistema purificador, que realiza a extração e quantificação totalmente automatizada de DNA e RNA antes da preparação da biblioteca, permite uma rápida avaliação da viabilidade das análises de sequenciamento.
A capacidade de quantificar o DNA e o RNA extraídos antes da preparação da biblioteca e a opção de trabalhar com pequenas quantidades de ácido nucleico (a partir de um mínimo de 10 ng de DNA ou RNA, de acordo com as especificações) permite uma rápida avaliação da viabilidade da análise de sequenciamento.
Uma abordagem NGS pode ajudar a otimizar o gerenciamento do fluxo de trabalho da amostra em oncologia torácica, sendo mais abrangente na detecção de biomarcadores acionáveis. Tem sido demonstrado que o método baseado em PCR tem limitações intrínsecas na detecção de algumas mutações raras, especialmente mutações de inserção no éxon 20 do EGFR 32. Assim, a abordagem NGS permite que uma proporção maior de pacientes receba terapias focadas em biomarcadores. Nesse contexto, demonstrou-se que o teste do reflexo NGS para todos os CPNPCs avançados é custo-efetivo33. Além disso, a extração de ácido nucleico totalmente automatizada, a preparação da biblioteca e o sequenciamento integrados a este sistema NGS baseado em amplicon é uma economia de tempo significativa para a equipe do laboratório.
No entanto, a implementação de sequenciamento ultrarrápido de próxima geração (NGS) como um teste reflexo para o diagnóstico de NS-NS pode encontrar certas restrições na prática clínica diária. O escopo do painel genético (abrangendo 50 genes) é menor em comparação com os extensos painéis que compreendem várias centenas de genes34. O painel inclui todos os genes recomendados que estão associados a uma terapia-alvo em oncologia torácica. Além disso, alguns genes de interesse com potencial valor prognóstico não são incluídos. Por exemplo, KEAP1, STK11, SMARCA4 e RB1 não estão presentes no painel utilizado no presente trabalho. Esses genes podem ser importantes no futuro para a seleção de pacientes que se beneficiem dos inibidores KRASG12C sotorasib9, aprovados pela FDA. O uso de NGS ultrarrápida com tecnologia de sequenciamento de amplicon também pode introduzir o potencial para a falta de parceiros de genes de fusão raros35. Além disso, as análises de desequilíbrio revelaram alguns falsos positivos no rearranjo ALK inicialmente36. O limiar para detectar fusões de desequilíbrio ALK foi aumentado no novo ensaio modificado. No entanto, recomenda-se validar um resultado de desequilíbrio com uma técnica ortogonal (IHQ e/ou FISH).
Acima de tudo, esse fluxo de trabalho levanta questões relacionadas à sustentabilidade econômica e ao reembolso do teste NGS, que pode variar muito dependendo do sistema de saúde do país, especialmente na Europa37. Para a abordagem de custo-efetividade, é imperativo executar amostras suficientes ao mesmo tempo para economizar em consumíveis, o que às vezes não é possível, pois depende do recrutamento da amostra e do laboratório35. Além disso, a possibilidade de gerar uma carga adicional de trabalho desnecessária para a equipe do laboratório deve ser discutida e requer uma boa comunicação entre médicos, cirurgiões, patologistas e equipe técnica.
O uso simultâneo de DNA e RNA NGS é ideal, mas permanece discutível. Sabendo-se que a maioria das alterações genômicas para terapia-alvo são mutuamente exclusivas38, seria possível realizar primeiramente a análise de sequenciamento de DNA e depois de RNA. No entanto, essa estratégia levaria a um TAT mais longo para gerar um relatório.
A adequação tanto da quantidade quanto da qualidade dos ácidos nucléicos extraídos pode representar uma limitação para garantir a robustez das análises de NGS, especialmente nos casos envolvendo tecnologia de sequenciamento por captura híbrida e painéis extensivos que requerem maior quantidade de material com maior TAT6. A este respeito, este sistema NGS baseado em amplicon oferece a vantagem de exigir apenas 13 ng de DNA e RNA para o painel e tem uma taxa de falha geral muito baixa. Isso é de grande valia em oncologia torácica, uma vez que o tamanho das amostras é cada vez menor20,39,40.
As indicações do teste molecular estão em constante mudança na oncologia torácica e, para algumas alterações gênicas, são agora recomendadas em ambientesadjuvantes15. Em nossa opinião, é altamente provável que várias terapias-alvo adicionais surjam para o tratamento do CPCNP em estágio inicial na prática clínica de rotina, reforçando a necessidade de busca rápida de biomarcadores no momento do diagnóstico. Em conjunto, o progresso atual na medicina de precisão no câncer de pulmão inevitavelmente favorecerá uma abordagem NGS ultrarrápida que permite um perfil molecular mais abrangente, rápido e que economiza material de tumores.
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Disclosures
Christophe Bontoux participa de atividades de palestrante pago e recebe benefícios da Thermo Fisher Scientific. Paul Hofman participa de atividades de palestrante remunerado e recebe benefícios e financiamento da Thermo Fisher Scientific.
Acknowledgments
Agradecemos à Thermo Fisher Scientific por nos dar a possibilidade de usar seu dispositivo e materiais.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 well hard shell plate clear | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | 4483354 | |
| Adhesive PCR Plate Foil | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | AB0626 | |
| AutoLys M tube | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | A38738 | FFPE sample processing tubes |
| Genexus Barcodes 1-32 HD | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | A40261 | |
| Genexus GX5 Chip and Genexus Coupler | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | A40269 | |
| Genexus Pipette Tips | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | A40266 | |
| Genexus Purification Instrument | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | A48148 | Automated purification instrument (API) |
| Genexus Sequencing Kit | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | A40271 | |
| Genexus Templating Strips 3-GX5 and 4 | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | A40263 | |
| Genexus Integrated Sequencer | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | A45727 | |
| Ion Torrent Genexus FFPE DNA/RNA Purification Combo Kit | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | A45539 | |
| Oncomine Precision Assay GX (OPA) Panel (included Strips 1 and 2-HD) | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | A46291 |
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