Summary
Увеличение количества молекулярных биомаркеров, подлежащих тестированию для лечения неплоскоклеточного немелкоклеточного рака легкого (NS-NSCLC), привело к разработке быстрых и надежных методов молекулярного обнаружения. Мы описываем рабочий процесс для оценки геномных изменений у пациентов с НС-НМРЛ с использованием подхода сверхбыстрого секвенирования нового поколения (NGS).
Abstract
За последние несколько лет значительно возросло количество молекулярных изменений, которые необходимо исследовать для таргетной терапии пациентов с неплоскоклеточным немелкоклеточным раком легкого (НС-НМРЛ). Выявление молекулярных аномалий является обязательным для оптимального лечения пациентов с распространенным или метастатическим НМРЛ, что позволяет назначать таргетную терапию с улучшением общей выживаемости. Тем не менее, эти опухоли развивают механизмы резистентности, на которые потенциально можно воздействовать с помощью новых методов лечения. Некоторые молекулярные изменения также могут модулировать реакцию на лечение. Молекулярная характеристика NS-NSCLC должна быть выполнена в сжатые сроки (ТАТ), менее чем за 10 рабочих дней, как рекомендовано международными рекомендациями. Кроме того, происхождение биопсий тканей для геномного анализа разнообразно, и их размер постоянно уменьшается с развитием менее инвазивных методов и протоколов. Следовательно, перед патологоанатомами встает задача применения эффективных молекулярных методов, сохраняя при этом эффективную и быструю стратегию диагностики. В этой статье мы опишем сверхбыстрый рабочий процесс секвенирования нового поколения (NGS) на основе ампликонов, используемый в повседневной практике при диагностике пациентов с НС-НМРЛ. Мы показали, что эта система способна идентифицировать современные молекулярные мишени, используемые в прецизионной медицине в торакальной онкологии, в соответствующем ТАТ.
Introduction
За последнее десятилетие развитие таргетной и иммунотерапии значительно повысило общую выживаемость (ОВ) при неплоскоклеточном немелкоклеточном раке легкого (НС-НМРЛ)1,2. В связи с этим количество обязательных генов и молекулярных мишеней для анализа при лечении НС-НМРЛ увеличилось за последние несколько летна 3,4.
Современные международные рекомендации рекомендуют тестировать EGFR, ALK, ROS1, BRAF, NTRK, RET и MET при диагностике распространенного NS-NSCLC5. Более того, поскольку новые препараты в последнее время дали очень многообещающие результаты в клинических испытаниях, дополнительные геномные изменения в ближайшее время будут проверены в ряде дополнительных генов, в частности, KRAS и HER2, а также BRAC1/BRAC2, PI3KA, NRG1 и NUT 6,7,8,9. Кроме того, состояние различных ассоциированных генов, таких как STK11, KEAP1 и TP53, может представлять большой интерес для лучшего прогнозирования ответа или резистентности к некоторым таргетным методам лечения и/или ингибиторам контрольных точек иммунного ответа (ICI)10,11,12.
Важно отметить, что о молекулярных изменениях необходимо сообщать без существенной задержки, чтобы обеспечить тщательное принятие клинических решений. Отсутствие молекулярной характеристики опухоли может привести к началу нетаргетной терапии, такой как химиотерапия с иммунотерапией или без нее, что приводит к неоптимальной стратегии лечения, поскольку ответ на химиотерапию ограничен у пациентов с действенными изменениями, такими как мутации EGFR или слияние генов13.
Более того, нынешнее развитие таргетной терапии/иммунотерапии в неоадъювантных и/или адъювантных условиях может привести к систематическому поиску, по крайней мере, изменений EGFR и ALK на ранних стадиях NS-NSMРL, поскольку ИКТ следует назначать только при опухолях дикого типа для EGFR и ALK14. В настоящее время также является обязательным тестирование на наличие мутаций EGFR на ранних стадиях NS-NSCLC, поскольку осимертиниб (ингибитор тирозинкиназы EGFR третьего поколения) может быть использован в качестве адъювантной терапии при EGFR-мутантном NS-NSCLC15.
Стратегия оценки различных биомаркеров при прогнозировании ответа на различные таргетные терапии и/или иммунотерапию у пациентов с НС-НМРЛ развивается быстрыми темпами, что затрудняет последовательную идентификацию этих биомаркеров 3,16. В связи с этим секвенирование нового поколения (NGS) в настоящее время является оптимальным подходом для высокопроизводительной параллельной оценки изменений генов в NS-NSCLC 5,17.
Тем не менее, рабочий процесс NGS может быть сложным в освоении и может привести к более длительному ТАТ18,19. Таким образом, во многих центрах до сих пор применяются последовательные подходы (иммуногистохимия (ИГХ), флуоресцентная гибридизация in situ (FISH) и/или таргетное секвенирование). Тем не менее, эта стратегия ограничена в случае небольшого размера выборки и, прежде всего, из-за увеличения числа действенных мутаций, которые необходимо протестировать в NS-NSCLC20. Таким образом, сверхбыстрые и простые методы тестирования, позволяющие быстро оценить изменения генов, становятся все более важными для принятия оптимальных клинических решений. Кроме того, одобренные и аккредитованные системы молекулярного тестирования становятся обязательными для назначения специфической таргетной терапии.
В данной статье мы опишем сверхбыстрый и автоматизированный анализ ДНК/РНК NGS на основе ампликонов для молекулярного тестирования NS-NSCLC, который используется в Лаборатории клинической и экспериментальной патологии (LPCE) Университетской больницы Ниццы, Франция и аккредитован в соответствии с нормой ISO 15189 Французским комитетом по аккредитации (COFRAC) (https://www.cofrac.fr/). COFRAC удостоверяет, что лаборатория выполняет требования стандарта ISO 15189 и правил применения COFRAC для деятельности по испытаниям/калибровке при молекулярном анализе в автоматизированном NGS на секвенаторе с панелью, выполняемой лабораторией. Аккредитация в соответствии с признанным международным стандартом ISO 15189 демонстрирует техническую компетентность лаборатории в определенной области и надлежащее функционирование соответствующей системы менеджмента в этой лаборатории. Обсуждаются преимущества и ограничения этого рабочего процесса, начиная с подготовки образцов для биопсии тканей и заканчивая получением отчета.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры были одобрены местным комитетом по этике (Human Research Ethics Committee, Centre Hospitalier Universitaire de Nice, Tumorothèque BB-0033-00025). От всех пациентов было получено информированное согласие на использование образцов и сгенерированных данных. Все образцы были получены от пациентов с диагнозом NS-NSCLC в LPCE (Ницца, Франция) в период с 20 сентября по 31 января 2022 г. в рамках оказания медицинской помощи.
1. Подготовка образцов ДНК и РНК FFPE с помощью автоматизированного прибора очистки (API) (время обработки: 5 ч 15 мин)
- Запустите планировку на приборе.
- Включите прибор и войдите в систему, используя имя пользователя и пароль (Таблица материалов). Создайте план выполнения очистки, нажав кнопку Выполнить, затем Добавить план и присвоив ему имя.
- Затем выберите подходящий набор для очистки и протокол последовательной очистки ДНК и РНК из образцов, залитых формалином и парафином (FFPE). Включите количественное определение после очистки.
- Выберите нужный объем элюирования (50 мкл) из выпадающего списка, затем нажмите «Далее». Выберите количество образцов, которые будут извлечены.
- Затем выберите каждую выборку, нажмите кнопку Изменить, введите идентификатор образца и нажмите кнопку Сохранить.
- Подготовка образцов ДНК и РНК FFPE с помощью GPI
- Подготовьте образцы тканей FFPE (4 режущие срезы по 10 мкм с микротомом) или выполните макродиссекцию непосредственно на блоках FFPE. Поместите каждый образец ткани FFPE в отдельные и идентифицированные пробирки для обработки образцов FFPE (Таблица материалов).
- Центрифуга при 2000 x g в течение 1 мин, чтобы собрать ткань на дне пробирок.
- Добавьте в каждую пробирку для обработки образцов FFPE мастер-смесь для переваривания протеазы, приготовленную из набора для очистки нуклеиновых кислот, и инкубируйте при 60 °C не менее 60 мин (таблица материалов). Инкубируют образцы при температуре 90 °C в течение 60 мин.
- После инкубации дайте образцам остыть в течение 5 минут при комнатной температуре (RT).
- Для каждой пробирки для обработки образцов FFPE поднимите внутреннюю трубку, зафиксируйте ее, повернув влево, а затем центрифуйте образцы при 2000 x g в течение 10 минут.
- Разблокируйте внутренние камеры, повернув направо, отделите их от внешних труб и выбросьте. Храните образцы во внешних пробирках на льду до загрузки на API.
- Приготовьте мастер-смесь для разложения ДНКазы и загрузите ее в предварительно заполненную пластину для очистки ДНК и РНК FFPE 2. Затем загрузите подготовленные образцы в планшет для очистки ДНК и РНК FFPE 1 (таблица материалов).
- Запустите запуск очистки в API.
- На экране API нажмите кнопку «Выполнить», выберите план «Выполнить» и нажмите кнопку «Далее».
- Следуйте указаниям на экране, чтобы загрузить в API необходимые расходные материалы и реагенты, необходимые для очистки (таблица материалов).
- Когда все реагенты будут загружены, нажмите кнопку Далее. Закройте дверь API и нажмите кнопку Начать.
- По окончании прогона нажмите «выгрузить» на сенсорном экране и сразу же извлеките 48-луночный архив нуклеиновых кислот, содержащий очищенный образец ДНК и РНК.
- Экспортируйте результаты количественного анализа. Запечатайте планшет и храните очищенные образцы при -80 °C. Перенесите 96-луночный планшет в секвенсор для анализа.
- Создайте пример и создайте прогон.
- Откройте программное обеспечение и войдите в него, затем выберите в строке меню «Примеры » и нажмите «Создать образец».
- Введите название образца, пол и процент опухолевых клеток, а также заполните обязательные поля и необязательные поля, если это необходимо.
- Сохраните детали (пол и процентное соотношение опухолевых клеток важны для анализа вариантов числа копий [CNV]).
- Выберите «Запуски » и «Нуклеиновая кислота для результата » в строке меню.
- Введите имя запуска на шаге Настройка . Нажмите кнопку Далее.
- Выберите анализ на шаге Анализы . Нажмите кнопку Далее.
- Выберите образцы на шаге Образцы для выполнения анализа.
- Затем на панели Выбранные анализы щелкните Назначить. Нажмите кнопку Далее.
- Просмотрите положение образца на входной пластине образца. Нажмите кнопку Далее.
- Просмотрите сводку плана выполнения, а затем нажмите кнопку Сохранить и распечатать или Сохранить.
2. Автоматизированный NGS на секвенсоре (время обработки: 30 мин)
- Загрузите пластину для образцов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальная концентрация нуклеиновых кислот составляет 0,5 нг/мкл. Подтвержденный диапазон концентраций нуклеиновых кислот составляет 0,33-1 нг/мкл. Для ДНК и РНК концентрация 1 нг/мкл была подтверждена в лаборатории.- Для секвенсора требуется общий объем 20 мкл. Убедитесь, что имеется достаточный объем для загрузки образца.
- Добавьте положительный контроль (ДНК и РНК) и NTC (ДНК и РНК) к 1-й ступени очистительного прибора без экстракции. Используйте элементы управления ДНК и РНК для каждого запуска, чтобы проверить прогон и проверить используемые партии. Добавьте элементы управления ДНК и РНК на пластину в конце выполнения API.
- Загрузите секвенсор и запустите запуск.
- Выньте все реагенты из коробок в холодильнике или морозильной камере и разморозьте в RT в течение не менее 30 минут (таблица материалов) и не более 12 часов.
- В лаборатории всегда держите секвенсор включенным, следуя рекомендациям, данным поставщиком во время обучения на месте. Войдите в систему.
- Загрузите планшет из очистительного прибора, в котором находятся образцы, предварительно запечатав планшет листом клейкой фольги для ПЦР-планшета (Таблица материалов).
- Установите все расходники в колоду. Секвенсор предоставляет пошаговые инструкции по загрузке каждого необходимого расходного материала в выделенную позицию (Таблица материалов).
- Убедитесь, что на трубке 3 полосы Strip 2-HD нет осадков. При необходимости переверните трубку или осторожно вкрутите полоску, чтобы растворить осадок.
- Полоски 1 и 3 содержат магнитные шарики. Этот шаг очень важен: убедитесь, что бусины снова взвешены. В верхней части тюбика не должно остаться бисера.
- Переверните полоску вверх дном и обратно 3-4 раза, чтобы удалить бусины. Держите полоску за один конец так, чтобы лента была направлена вверх. После этого быстро поверните полоску вниз быстрым центробежным движением руки и закончите резким движением запястья.
- Центрифуга при 300 x g в течение 15 с. При необходимости повторите процедуру. Центрифугируйте полоски с помощью адаптеров и держателей полос, чтобы свести к минимуму случайные сбои, наблюдаемые в связи с остатками шариков в верхней части полосок.
- Закройте систему и нажмите кнопку Далее. Установите секвенцию реагентов на дверцы отсека (Таблица материалов). Закройте дверь. Секвенсор автоматически запустит прогон.
- Чистка
- Для очистки после выполнения, когда запуск будет завершен, нажмите кнопку Далее.
- Дверь открывается последовательно. Следуйте инструкциям на экране, чтобы опорожнить отходы и удалить все расходные материалы. Нажмите кнопку Далее.
- Когда закончите, закройте колоду, нажмите «Далее». Начнется 2-минутная УФ-очистка. Секвенсор готов начать новый запуск.
3. Анализ результатов с помощью интегрированного программного обеспечения (Время анализа по пациенту [образцы ADN и ARN]: 15 мин)
ПРИМЕЧАНИЕ: Методика аккредитована Французским комитетом по аккредитации (COFRAC) ISO 15189 (https://www.cofrac.fr/)
- Данные и результаты
- Выберите результат выполнения или пример результата в меню Результаты . На экране Результаты/Результаты выполнения перечислены все запуски.
- Поиск в списке результатов путем фильтрации в заголовке столбца.
- Щелкните Результаты и выберите Примеры результатов. Затем щелкните имя интересующего образца в столбце «Имя образца», чтобы просмотреть результаты виртуализации для уникального образца.
- Нажмите Столбцы в левом верхнем углу экрана или отмените выбор столбцов в таблице.
- Просмотрите результаты контроля качества и просмотрите покрытие ампликонов.
- Перейдите на вкладку «Контроль качества » на экране «Результаты ».
- Для ДНК убедитесь, что медиана абсолютных парных различий (MAPD) находится в диапазоне от 0 до 0,5, чтобы подтвердить анализ вариантов числа копий (CNV). Сопоставленные чтения должны быть больше 1,5 миллиона.
- Для РНК проверьте, находятся ли сопоставленные чтения в диапазоне от 150 000 до 400 000. Ниже этого уровня существует риск ложноотрицательных результатов, а сверх этого — риск ложноположительных результатов.
- Щелкните имя примера, чтобы открыть вкладку Основные выводы .
- Прокрутите страницу до графиков покрытия ампликонов.
- Просмотрите графики покрытия. Определите минимальный порог покрытия ампликоном, так как поставщик его не предоставляет. Чтобы определить диапазон и пороговое значение, смешайте контрольную и дикую выборку (WT). Затем наблюдайте за наименьшим значением покрытия ампликонов для одной или нескольких выбранных мутаций.
- Просмотр результатов поиска вариантов.
- Чтобы экспортировать данные в табличном формате, нажмите кнопку Экспорт в правом верхнем углу экрана.
- Чтобы просмотреть результат по однонуклеотидному варианту/варианту вставки-делеции (SNV/INDEL), перейдите на вкладку «Варианты », затем выберите «SNV/Indels». Нажмите «Редактировать фильтры» и выберите «Без фильтра».
ПРИМЕЧАНИЕ: Порог чувствительности определен на уровне 5% в соответствии с рекомендациями группы INCA (Французский национальный институт рака) (https://www.e-cancer.fr/Professionnels-de-sante/Les-therapies-ciblees/Les-plateformes-de-genetique-moleculaire-des-cancers/Le-programme-d-assurance-qualite-des-plateformes). - Просмотр результатов слияния и вариантов экзонов РНК: Перейдите на вкладку «Варианты», затем нажмите «Слияния».
- В правом верхнем углу нажмите Visualization and RNA Exon Variant, затем просмотрите график RNA Exon Variants .
- С помощью этого набора можно обнаружить пропуск экзонов генов EGFR, MET и AR . Щелкните Визуализация; Его легче анализировать.
- Просмотр дисбаланса слияния клеток РНК экзонов: перейдите на вкладку «Варианты», затем нажмите «Слияния».
- В правом верхнем углу нажмите Визуализация и дисбаланс слияния фрагментов РНК, затем просмотрите графики Дисбаланс слияния экзонных плиток РНК . Слияние дисбаланса — это слияние между известным партнером и партнером, которое не охвачено панелью.
- Просмотр результатов CNV: щелкните CNV на вкладке Варианты , чтобы отобразить данные.
ПРИМЕЧАНИЕ: Необходимо проявлять бдительность в отношении результатов CNV, сообщая во время подготовки образцов пол и процентное содержание опухолевых клеток в образце. Носителем гена AR является только Х-хромосома . Если пол не указан, мужской пол может столкнуться с потерями, что приведет к ложноположительным результатам у пациентов мужского пола.
- Просмотрите результаты плагина.
- Ознакомьтесь с результатами плагина Coverage Analysis : в правом верхнем углу нажмите и выберите загрузить файлы.
- Плагин Анализ покрытия генерирует отчет об анализе покрытия.
- Просмотрите результаты плагина молекулярного анализа покрытия : в правом верхнем углу нажмите и выберите загрузить файлы. Этот анализ проверяет, все ли ампликоны охвачены, и подтверждает результаты вариантов числа копий (CNV), предоставленные программным обеспечением.
- Просмотр метрик анализа и отчет о выполнении
- Перейдите на вкладку Run Report (Отчет о выполнении ) в разделе Run Summary (Сводка по выполнению).
- Чтобы просмотреть отчет о выполнении, выберите параметр Выбрать образец в раскрывающемся меню.
- Метрики анализа и отчет о выполнении: метрики последовательности находятся в верхней части экрана, а затем метрики, относящиеся к выборке, в таблице Примеры выполнения .
ПРИМЕЧАНИЕ: Информация в файле архива поддержки клиентов (CSA) может помочь в устранении неполадок с результатами, но их нельзя проанализировать напрямую. Файлы CSA суммируют данные всех данных запуска и выделяют причины проблемы в случае неудачного выполнения. - Чтобы скачать отчет о выполнении, перейдите на вкладку Отчеты .
- Нажмите кнопку Скачать отчет, чтобы загрузить сводку отчета о выполнении в формате PDF.
- Создание отчета о вариантах.
- Включите параметр Создать отчет на шаге Настройка , чтобы автоматически создавать отчет о вариантах для каждой выборки во время анализа данных выполнения.
- После создания отчета о вариантах для образца система делает отчет доступным в двух местах: во-первых, ссылка становится доступной на экране Результаты/Результаты выборки . Нажмите на ссылку, чтобы загрузить PDF-файл.
- Во-вторых, перейдите на панель «Отчет о вариантах » на вкладке «Отчеты » и нажмите кнопку «Скачать отчет ». Подписывайте отчеты о вариантах в электронном виде или вручную.
ПРИМЕЧАНИЕ: Отчеты, подписанные электронной подписью, имеют (Sign off) после имени образца на экране Sample Results .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Используя представленную здесь процедуру, подробно описанную в наших недавних публикациях21, мы разработали оптимальный рабочий процесс для оценки молекулярных изменений в качестве рефлекторного тестирования в рутинной клинической практике для диагностики у пациентов с НС-НМРЛ с использованием сверхбыстрого подхода к секвенированию нового поколения на основе ампликонов. Молекулярный рабочий процесс метода показан на рисунке 1. Список генов, включенных в панель, показан на дополнительном рисунке 1.
Молекулярный анализ проведен у 259 пациентов с НС-НМРЛ. Оно включало 153 биопсии бронхов, 47 трансторакальных биопсий, 39 хирургических препаратов и 25 клеточных блоков из 13 плевральных выпота и 7 ЭБУЗИ (табл. 1). В 242 валидных или доступных анализах ДНК/РНК NGS были обнаружены следующие драйверные мутантные гены: KRAS (25,4%), EGFR (18,2%), BRAF (6,3%), ERBB2 (1,7%) и MET (1,7%). Сообщалось о слияниях генов ALK (4,3%), ROS1 (2,3%), RET (1,9%) и NTRK (0,8%). Были выявлены следующие изменения с частотой менее 1% (например, IDH1, CDKN2A, FGFR3, KIT, MTOR, FGFR4. NTRK3, NRAS, PIK3CA, IDH2, ERBB3, ERBB4, AR, CHECK2, SMO, PTEN). Для ДНК 10 случаев (4%) не увенчались успехом, а для РНК – 5 случаев (2%). Неудача была вызвана низким качеством ДНК/РНК и/или низким количеством ДНК/РНК. Неудачный анализ происходил только с образцами, имеющими менее 10% опухолевой клеточности. Таким образом, мы определили порог клеточности опухоли на уровне 10%. Что касается результатов ДНК-NGS, то 10 случаев (4%) не прошли из-за низкого качества нуклеиновых кислот (6 случаев) или из-за недостаточного количества нуклеиновых кислот (4 случая с <13 нг ДНК). Аналогичным образом, в пяти случаях (2%) результаты секвенирования РНК не были получены как из-за неадекватного качества РНК, так и из-за низкого количества РНК (<13 нг РНК). Средняя доля опухолевых клеток в неудачных случаях была ограничена (15%, в диапазоне от 10% до 20%), в отличие от успешных случаев, где процентное содержание опухолевых клеток колебалось от 30% до 90%. Из 15 неудачных образцов 11 были получены из биопсии небольших тканей (со средней площадью 2 мм2), а 4 были цитологическими образцами (например, эндобронхиальное ультразвуковое исследование [EBUS]).
Чувствительность метода по выявлению СНВ и ИНДЕЛ составила 93,44%, для ХНВ – 100%, а для сращений – 91,67% при минимальном содержании опухолевых клеток 10% (табл. 1).
Среднее значение ТАТ при эндоскопическом отборе проб из молекулярного отчета составило 72 ч (диапазон: 48-96 ч), при этом среднее значение ТАТ от экстракции до отчета составило 24 ч.
Аналитическая валидация описанного выше рабочего процесса NGS была проведена на 30 случаях NS-NSCLC. Валидация продемонстрировала 100% соответствие методам золотого стандарта, ранее использовавшимся в нашем центре и подробно перечисленным в оригинальной публикации21: RT-PCR EGFR Mutation Test; Тест на мутацию KRAS ОТ-ПЦР; ALK IHC, ALK FISH; РОС1 МХК; РОС1 РЫБА; BRAFV600E; и методы ДНК/РНК NGS.
Многоступенчатая процедура от отбора проб до молекулярного отчета об аденокарциноме легкого с мутацией EGFR/TP53 показана на рисунке 2. Представление мутации, обнаруженной в образце биопсии, с помощью программного обеспечения интегративного просмотра генома (IGV) показано на дополнительном рисунке 2. Пример отчета, сгенерированного с помощью программного обеспечения для создания отчетов, показан на дополнительном рисунке 3.
Рисунок 1: Схема рабочего процесса панели, использованной в этом исследовании. Эта цифра изменена с разрешения Ilié et al.21. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Несколько этапов от отбора проб до отчета по молекулярной биологии. (А) Три образца биопсии бронхов, полученные в лаборатории из эндоскопического кабинета. (B) Окрашенное гематоксилином/эозином/сафраном предметное стекло образца биопсии бронхов, показывающее аденокарциному легкого с примерно 40%-50% опухолевых клеток (100-кратное увеличение). (C) Отчет из программного обеспечения для отчетности, показывающий мутацию EGFR , связанную с мутацией TP53 в образце опухоли. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
| Общее количество пациентов | 259 |
| Биопсия бронхов | 153 |
| Трансторакальная биопсия | 47 |
| Хирургические образцы | 39 |
| Плевральный выпот | 13 |
| EBUS | 7 |
| Гены-драйверы мутантов | |
| КРАС | 25.40% |
| EGFR | 18.20% |
| БРАФ | 6.30% |
| ЭРББ2 | 1.70% |
| ВСТРЕЧЕННЫЙ | 1.70% |
| Слияние генов | |
| АЛК | 4.30% |
| РОС1 | 2.30% |
| МОЧИТЬ | 1.95% |
| НТРК | 0.80% |
| Неудача - случаи ДНК | 10 случаев (4%) |
| Отказ - случаи РНК | 5 случаев (2%) |
| Отсечение клеточности опухоли | 10% |
| Процентный разброс опухолевых клеток в неудачных случаях | 10%–20% |
| Процентный диапазон опухолевых клеток в успешных случаях | 30%–90% |
| Чувствительность метода | |
| Обнаружение SNV и INDEL | 93.44% |
| Обнаружение CNV | 100% |
| Обнаружение слияний | 91.67% |
Таблица 1: Результаты молекулярного анализа. Молекулярный анализ выполнен у 259 пациентов с НС-НМРЛ, включая 153 биопсии бронхов, 47 трансторакальных биопсий, 39 хирургических препаратов и 25 клеточных блоков из 13 плевральных выпота и 7 ЭБУЗИ.
Дополнительный рисунок 1: Гены, включенные в панель GX прецизионного анализа онкомина NGS. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.
Дополнительный рисунок 2: Представление сгенерированных считываний и мутаций, обнаруженных в биопсийном образце, с помощью программного обеспечения IGV. (А) ген EGFR и (Б) ген TP53 . Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.
Дополнительный рисунок 3: Молекулярный отчет, сгенерированный программным обеспечением. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Разработка подхода NGS на основе сверхбыстрого ампликона в качестве рефлекторного тестирования для оценки молекулярных изменений при диагностике любой стадии NS-NSLC является оптимальным вариантом для выявления всех рекомендованных и новых биомаркеров в NS-NSCLC 5,22,23. В то время как последовательные методы (IHC, PCR, FISH) фокусируются только на определенных генах и могут привести к истощению тканевого материала, этот рабочий процесс NGS позволяет специфически и чувствительно оценить состояние 50 генов, включая мутации, слияния и амплификации, даже при низком количестве нуклеиновой кислоты (минимум 13 нг для каждого секвенирования ДНК и РНК согласно этому исследованию).
Кроме того, этот метод обеспечивает быстрые и актуальные результаты для ведения пациентов с НС-НМРЛ. По сравнению с индивидуальным подходом, отсутствие первоначального отбора случаев для анализа в зависимости от стадии опухоли и без ожидания запроса врача позволяет сэкономить драгоценное время. В этой линии было показано, что NGS-тестирование распространенного NS-NSMРL напрямую влияет на общую выживаемость пациентов24,25. Кроме того, эти молекулярные результаты часто получают одновременно с результатами ВПХ, особенно для оценки процента PD-L1-положительных опухолевых клеток26. Врач может получить «молекулярный профиль» опухоли со всеми биомаркерами, необходимыми для наилучшего терапевтического выбора терапии первой линии27. В определенных ситуациях врач может включить пациентов в клиническое исследование в соответствии с геномными результатами 28,29,30,31.
Анализ ДНК и РНК с помощью панели может быть выполнен у 2-14 пациентов за один проход, за исключением контрольной группы (1 положительный и 1 отрицательный контроль). Можно делать три пробежки в неделю, а это означает, что 42 пациента могут воспользоваться сверхбыстрым NGS-профилированием своей опухоли. Система очистителя, которая выполняет полностью автоматизированную экстракцию и количественное определение ДНК и РНК перед подготовкой библиотеки, позволяет быстро оценить осуществимость секвенирования.
Возможность количественного определения выделенных ДНК и РНК до подготовки библиотеки, а также возможность работы с небольшими количествами нуклеиновых кислот (начиная с минимум 10 нг ДНК или РНК, в соответствии со спецификациями) позволяет быстро оценить целесообразность анализа секвенирования.
Подход NGS может помочь оптимизировать управление рабочим процессом с образцами в торакальной онкологии за счет более комплексного обнаружения действенных биомаркеров. Показано, что метод, основанный на ПЦР, имеет существенные ограничения в выявлении некоторых редких мутаций, особенно инсерционных мутаций экзона 20 EGFR 32. Таким образом, подход NGS позволяет более высокой доле пациентов получать терапию, ориентированную на биомаркеры. В этом контексте было продемонстрировано, что рефлекторное тестирование NGS для всех распространенных НС-НМРЛ является экономически эффективным33. Кроме того, полностью автоматизированная экстракция нуклеиновых кислот, подготовка библиотек и секвенирование, интегрированные с этой системой NGS на основе ампликонов, значительно экономят время сотрудников лаборатории.
Тем не менее, внедрение сверхбыстрого секвенирования нового поколения (NGS) в качестве рефлекторного тестирования для диагностики NS-NSCLC может столкнуться с определенными ограничениями в повседневной клинической практике. Объем панели генов (охватывающий 50 генов) меньше по сравнению с обширными панелями, включающими несколько сотен генов34. Панель включает в себя все рекомендуемые гены, которые связаны с таргетной терапией при торакальной онкологии. Кроме того, некоторые гены, представляющие интерес с потенциальной прогностической ценностью, не включены. Например, KEAP1, STK11, SMARCA4 и RB1 отсутствуют на панели, используемой в настоящей работе. Эти гены могут быть важны в будущем для отбора пациентов, которые получат пользу от одобренных FDA ингибиторов KRASG12C соторасиба9. Использование сверхбыстрого NGS с технологией секвенирования ампликонов также может привести к отсутствию редких партнеров по слиянию генов35. Кроме того, анализ дисбаланса выявил несколько ложноположительных перегруппировок ALK первоначально36. В новом модифицированном анализе был увеличен порог обнаружения расплавления дисбаланса ALK. Тем не менее, рекомендуется валидировать результат дисбаланса с помощью ортогональной техники (ИГХ и/или FISH).
Прежде всего, этот рабочий процесс поднимает вопросы, связанные с экономической устойчивостью и возмещением расходов на тест NGS, которые могут сильно варьироваться в зависимости от системы здравоохранения страны, особенно в Европе37. Для подхода, основанного на экономической эффективности, крайне важно одновременно выполнять достаточное количество проб, чтобы сэкономить на расходных материалах, что иногда невозможно, так как это зависит от набора образцов и лаборатории35. Кроме того, следует обсудить возможность создания ненужной дополнительной нагрузки на персонал лаборатории, что требует хорошей коммуникации между врачами, хирургами, патологоанатомами и техническим персоналом.
Одновременное использование ДНК и РНК NGS является идеальным, но остается спорным. Зная, что большинство геномных изменений для таргетной терапии являютсявзаимоисключающими, можно было бы сначала провести анализ секвенирования ДНК, а затем РНК. Однако такая стратегия впоследствии приведет к более длительному ТАТ для создания отчета.
Адекватность как количества, так и качества экстрагированных нуклеиновых кислот может представлять собой ограничение в обеспечении надежности NGS-анализов, особенно в случаях, когда используется технология гибридного секвенирования захвата и обширные панели, требующие большего количества материала с более высоким ТАТ6. В этом отношении преимущество этой системы NGS на основе ампликонов заключается в том, что для панели требуется всего 13 нг ДНК и РНК, а также очень низкая общая частота неудач. Это очень ценно в торакальной онкологии, так как размер образцов становится все меньше и меньше 20,39,40.
Показания к молекулярному тестированию постоянно меняются в торакальной онкологии и в настоящее время для некоторых генных изменений рекомендуются в адъювантных условиях15. По нашему мнению, весьма вероятно, что в рутинной клинической практике появится несколько дополнительных таргетных терапий для лечения ранней стадии НМРЛ, что усилит необходимость оперативного поиска биомаркеров при постановке диагноза. В целом, текущий прогресс в прецизионной медицине рака легких неизбежно будет способствовать сверхбыстрому подходу NGS, который позволяет проводить более полное, быстрое и экономящее материал молекулярное профилирование опухолей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Кристоф Бонту участвует в оплачиваемых мероприятиях для докладчиков и получает пособия от компании Thermo Fisher Scientific. Пол Хофман (Paul Hofman) участвует в оплачиваемых выступлениях с лекциями и получает льготы и финансирование от компании Thermo Fisher Scientific.
Acknowledgments
Мы благодарим компанию Thermo Fisher Scientific за предоставленную нам возможность использовать их оборудование и материалы.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 well hard shell plate clear | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | 4483354 | |
| Adhesive PCR Plate Foil | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | AB0626 | |
| AutoLys M tube | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | A38738 | FFPE sample processing tubes |
| Genexus Barcodes 1-32 HD | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | A40261 | |
| Genexus GX5 Chip and Genexus Coupler | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | A40269 | |
| Genexus Pipette Tips | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | A40266 | |
| Genexus Purification Instrument | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | A48148 | Automated purification instrument (API) |
| Genexus Sequencing Kit | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | A40271 | |
| Genexus Templating Strips 3-GX5 and 4 | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | A40263 | |
| Genexus Integrated Sequencer | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | A45727 | |
| Ion Torrent Genexus FFPE DNA/RNA Purification Combo Kit | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | A45539 | |
| Oncomine Precision Assay GX (OPA) Panel (included Strips 1 and 2-HD) | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | A46291 |
References
- Howlader, N., et al. The effect of advances in lung-cancer treatment on population mortality. New England Journal of Medicine. 383 (7), 640-649 (2020).
- Melosky, B., et al. The rapidly evolving landscape of novel targeted therapies in advanced non-small cell lung cancer. Lung Cancer. 160, 136-151 (2021).
- Hanna, N. H., et al. Therapy for stage IV non-small-cell lung cancer with driver alterations: ASCO and OH (CCO) joint guideline update. Journal of Clinical Oncology. 39 (9), 1040-1091 (2021).
- Kerr, K. M., et al. The evolving landscape of biomarker testing for non-small cell lung cancer in Europe. Lung Cancer. 154, 161-175 (2021).
- Mosele, F., et al. Recommendations for the use of next-generation sequencing (NGS) for patients with metastatic cancers: a report from the ESMO precision medicine working group. Annals of Oncology. 31 (11), 1491-1505 (2020).
- Kazdal, D., Hofman, V., Christopoulos, P., Ilié, M., Stenzinger, A., Hofman, P. Fusion-positive non-small cell lung carcinoma: Biological principles, clinical practice, and diagnostic implications. Genes Chromosomes and Cancer. 61 (5), 244-260 (2022).
- Li, B. T., et al. Trastuzumab deruxtecan in HER2 -mutant non-small-cell lung cancer. New England Journal of Medicine. 386 (3), 241-251 (2022).
- Bontoux, C., Hofman, V., Brest, P., Ilié, M., Mograbi, B., Hofman, P. Daily practice assessment of KRAS status in NSCLC patients: A new challenge for the thoracic pathologist is right around the corner. Cancers. 14 (7), 1628 (2022).
- Skoulidis, F., et al. Sotorasib for lung cancers with KRAS p.G12C mutation. New England Journal of Medicine. 384 (25), 2371-2381 (2021).
- Hellyer, J. A., et al. Impact of tumor suppressor gene co-mutations on differential response to EGFR TKI therapy in EGFR L858R and Exon 19 deletion lung cancer. Clinical Lung Cancer. 23 (3), 264-272 (2022).
- Mograbi, B., Heeke, S., Hofman, P. The importance of stk11/lkb1 assessment in non-small cell lung carcinomas. Diagnostics. 11 (2), 196 (2021).
- Nadal, E., et al. Two patients with advanced-stage lung adenocarcinoma with radiologic complete response to nivolumab treatment harboring an STK11/LKB1 mutation. JCO Precision Oncology. 4, 1239-1245 (2022).
- Smeltzer, M. P., et al. The international association for the study of lung cancer global survey on molecular testing in lung cancer. Journal of Thoracic Oncology. 15 (9), 1434-1448 (2020).
- Ahern, E., Solomon, B. J., Hui, R., Pavlakis, N., O'Byrne, K., Hughes, B. G. M. Neoadjuvant immunotherapy for non-small cell lung cancer: Right drugs, right patient, right time. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 9 (6), e002248 (2021).
- Wu, Y. -L., et al. Osimertinib in resected EGFR-mutated non-small-cell lung cancer. New England Journal of Medicine. 383 (18), 1711-1723 (2020).
- Hanna, N. H., et al. Therapy for stage IV non-small-cell lung cancer without driver alterations: ASCO and OH (CCO) joint guideline update. J Clin Oncol. 38 (14), 1608-1632 (2020).
- de Maglio, G., et al. The storm of NGS in NSCLC diagnostic-therapeutic pathway: How to sun the real clinical practice. Critical Reviews in Oncology/Hematology. 169, 103561 (2022).
- DiStasio, M., Chen, Y., Rangachari, D., Costa, D. B., Heher, Y. K., VanderLaan, P. A. Molecular testing turnaround time for non-small cell lung cancer in routine clinical practice confirms feasibility of CAP/IASLC/AMP guideline recommendations: A single-center analysis. Clinical Lung Cancer. 18 (5), e349-e356 (2017).
- Heeke, S., et al. Use of the ion PGM and the genereader NGS systems in daily routine practice for advanced lung adenocarcinoma patients: A practical point of view reporting a comparative study and assessment of 90 patients. Cancers. 10 (4), 88 (2018).
- Hofman, P. The challenges of evaluating predictive biomarkers using small biopsy tissue samples and liquid biopsies from non-small cell lung cancer patients. Journal of Thoracic Disease. 11, S57-S64 (2019).
- Ilié, M., et al. Setting up an ultra-fast next-generation sequencing approach as reflex testing at diagnosis of non-squamous non-small cell lung cancer; experience of a single center (LPCE, Nice, France). Cancers. 14 (9), 2258 (2022).
- Zacharias, M., et al. Reflex testing in non-small cell lung carcinoma using DNA-and RNA-based next-generation sequencing-a single-center experience. Translational Lung Cancer Research. 10 (11), 4221-4234 (2021).
- Miller, T. E., et al. Clinical utility of reflex testing using focused nextgeneration sequencing for management of patients with advanced lung adenocarcinoma. Journal of Clinical Pathology. 71 (12), 1108-1115 (2018).
- Al-Ahmadi, A., et al. Next generation sequencing of advanced non-small cell lung cancer: utilization based on race and impact on survival. Clinical Lung Cancer. 22 (1), 16.e1-22.e1 (2021).
- Kim, J. H., Yoon, S., Lee, D. H., Jang, S. J., Chun, S. M., Kim, S. W. Real-world utility of next-generation sequencing for targeted gene analysis and its application to treatment in lung adenocarcinoma. Cancer Medicine. 10 (10), 3197-3204 (2021).
- Sheffield, B. S., et al. Point of care molecular testing: Community-based rapid next-generation sequencing to support cancer care. Current Oncology. 29 (3), 1326-1334 (2022).
- Camidge, D. R., Doebele, R. C., Kerr, K. M. Comparing and contrasting predictive biomarkers for immunotherapy and targeted therapy of NSCLC. Nature Reviews Clinical Oncology. 16 (6), 341-355 (2019).
- Rosas, D., Raez, L. E., Russo, A., Rolfo, C. Neuregulin 1 gene (Nrg1). A potentially new targetable alteration for the treatment of lung cancer. Cancers. 13 (20), 5038 (2021).
- Shapiro, G. I., et al. A Phase 1 study of RO6870810, a novel bromodomain and extra-terminal protein inhibitor, in patients with NUT carcinoma, other solid tumours, or diffuse large B-cell lymphoma. British Journal of Cancer. 124 (4), 744-753 (2021).
- Schoenfeld, A. J., et al. The genomic landscape of SMARCA4 alterations and associations with outcomes in patients with lung cancer. Clinical Cancer Research. 26 (21), 5701-5708 (2021).
- Zhang, K., et al. Identification of deleterious NOTCH mutation as novel predictor to efficacious immunotherapy in NSCLC. Clinical Cancer Research. 26 (14), 3649-3661 (2020).
- Shen, C. I., et al. Real-world evidence of the intrinsic limitations of PCR-based EGFR mutation assay in non-small cell lung cancer. Scientific Reports. 12 (1), 13566 (2022).
- Zou, D., et al. Diagnostic value and cost-effectiveness of next-generation sequencing-based testing for treatment of patients with advanced/metastatic non-squamous non-small-cell lung cancer in the United States. Journal of Molecular Diagnostics. 24 (8), 901-914 (2022).
- Zhong, Y., Xu, F., Wu, J., Schubert, J., Li, M. M. Application of next generation sequencing in laboratory medicine. Annals of Laboratory Medicine. 41 (1), 25-43 (2020).
- Bruno, R., Fontanini, G. Next generation sequencing for gene fusion analysis in lung cancer: A literature review. Diagnostics. 10 (8), 521 (2020).
- Hofman, V., et al. Ultra-fast gene fusion assessment for non-squamous non-small cell lung cancer. JTO Clinical and Research Reports. 4 (2), 100457 (2022).
- Horgan, D., et al. Personalized medicine perspective identifying the steps required to effectively implement next-generation sequencing in oncology at a national level in Europe. Journal of Personalized Medicine. 12 (1), 72 (2022).
- Cohen, D., et al. Optimizing mutation and fusion detection in NSCLC by sequential DNA and RNA sequencing. Journal of Thoracic Oncology. 15 (6), 1000-1014 (2020).
- Goswami, R. S., et al. Identification of factors affecting the success of next-generation sequencing testing in solid tumors. American Journal of Clinical Pathology. 145 (2), 222-237 (2016).
- Ilie, M., Hofman, P. Pitfalls in Lung Cancer Molecular Pathology: How to Limit them in Routine Practice. Current Medicinal Chemistry. 19 (16), 2638-2651 (2012).
