Summary
Optogenetisk manipulation av signalvägar kan vara en kraftfull strategi för att undersöka hur signalering avkodas i utveckling, regenerering, homeostas och sjukdom. Detta protokoll ger praktiska riktlinjer för användning av ljus-syre-spänningsavkänningsdomänbaserade nodal- och benmorfogena proteiner (BMP) signalaktivatorer i det tidiga zebrafiskembryot.
Abstract
Signalvägar orkestrerar grundläggande biologiska processer, inklusive utveckling, regenerering, homeostas och sjukdom. Metoder för att experimentellt manipulera signalering krävs för att förstå hur signalering tolkas i dessa vittomfattande sammanhang. Molekylära optogenetiska verktyg kan ge reversibla, avstämbara manipulationer av signalvägsaktivitet med en hög grad av spatiotemporal kontroll och har tillämpats in vitro, ex vivo och in vivo. Dessa verktyg kopplar ihop ljuskänsliga proteindomäner, såsom den homodimeriserande LOV-domänen (Blue Light homodimerizing light-oxygen-voltage sensing), med signaleffektorer för att ge ljusberoende experimentell kontroll över signalering. Detta protokoll ger praktiska riktlinjer för användning av det LOV-baserade benmorfogenetiska proteinet (BMP) och nodalsignalaktivatorerna bOpto-BMP och bOpto-Nodal i det optiskt tillgängliga tidiga zebrafiskembryot. Den beskriver två kontrollexperiment: En snabb fenotypanalys för att bestämma lämpliga experimentella förhållanden och en immunofluorescensanalys för att direkt bedöma signalering. Tillsammans kan dessa kontrollexperiment bidra till att etablera en pipeline för användning av optogenetiska verktyg i tidiga zebrafiskembryon. Dessa strategier ger en kraftfull plattform för att undersöka signaleringens roll i utveckling, hälsa och fysiologi.
Introduction
Signalvägar gör det möjligt för celler att reagera på sin omgivning och samordna aktiviteter på vävnads- och organismomfattande skalor. Signaler som är avgörande för embryonal utveckling är bland annat TGF-beta-superfamiljens medlemmar av benmorfogenetiskt protein (BMP) och nodal 1,2,3. Under embryogenesen formar de vägar som regleras av dessa och andra signaler kroppsplanen genom att kontrollera genuttryck och ytterligare processer för att säkerställa att olika vävnader och organ utvecklas och samverkar korrekt. Patologier, inklusive fosterskador och cancer, kan uppstå när signalering eller svar på signalering störs 4,5,6,7. Trots rigorösa undersökningar av signalering återstår mycket mer att upptäcka om hur nivåer och dynamik avkodas i en mängd olika sammanhang 8,9,10,11, särskilt under utveckling 12,13,14,15,16,17,18,19.
För att förstå hur signalering avkodas skulle ett idealiskt experiment vara att manipulera signaleringsnivåer, timing och/eller dynamik – med en hög grad av rumslig och tidsmässig kontroll – och bedöma resultat. Till exempel föreslås exakta rumsliga signalgradienter för att mönstra utvecklande vävnader20,21. Att ändra rumsliga fördelningar för signalgradient skulle hjälpa till att testa denna hypotes22. Dessutom blir betydelsen av signaldynamik för att generera olika cellulära svar tydligare: Samma signalväg kan instruera celler att differentiera eller föröka sig beroende på signaleringsfrekvens, till exempel 9,23. Experimentella paradigm där signaleringsdynamik lätt kan manipuleras kommer att vara värdefulla för att utforska förhållandet mellan dynamik och cellödesbeslut 8,12,13,14,15.
Historiskt sett har flera metoder använts för att manipulera signalering i utvecklingssammanhang, vilket har lett till grundläggande upptäckter 1,2,3. Signalering kan blockeras med hjälp av mutanter som förlorar sin funktion, uttryck av ektopiska hämmare eller antagonistläkemedel. Metoder för att aktivera signalering inkluderar agonistläkemedel, rekombinanta ligander, ektopiskt uttryck av ligander eller konstitutivt aktiva receptorer och mutanter som hämmar förlust av funktion. Dessa metoder sträcker sig längs ett kontinuum av experimentell kontroll. Till exempel kan mutanter och ektopiska uttryck hamna på släggsidan av kontinuum: Med dessa tillvägagångssätt kan dramatiska, systemiska förändringar i signalvägsaktivitet orsaka tidig död och förhindra undersökningar i senare skeden, eller med tiden kan det resultera i pleiotropa effekter som är svåra att särskilja. Dessutom är det ofta utmanande att självständigt manipulera en signalfunktion i taget, till exempel nivå eller varaktighet. Mot den andra änden av kontinuum erbjuder vissa metoder mer exakt experimentell kontroll, såsom mikrofluidiska enheter som exponerar prover för läkemedel eller rekombinanta proteiner med tidsmässig och ibland rumslig kontroll 18,24,25, eller genetiska metoder, inklusive värmechockinducerbara och vävnadsspecifika promotorer som kan erbjuda liknande fördelar16,26,27. Dessa metoder kan dock vara svåra att utföra, kanske inte är reversibla, kan ha relativt långsam kinetik eller dålig upplösning och kan vara otillgängliga i vissa modellsystem.
Molekylära optogenetiska metoder är ett kraftfullt tillägg till denna verktygslåda. Dessa metoder använder proteiner som reagerar på olika ljusvåglängder för att manipulera biologiska processer, inklusive signalering 8,12,13,14,15, och har utvecklats under årtionden för användning i en mängd olika system från cellodling till hela djur 12,13,28. Jämfört med historiska metoder kan molekylär optogenetik ofta erbjuda en högre grad av spatiotemporal kontroll över biologiska processer: Styrenheten i optogenetiska system är ljus, och kontroll av ljusvåglängd, intensitet, varaktighet och exponeringsfrekvens är relativt enkel. Med sofistikerade system som konfokalmikroskop och tvåfotonmikroskop är rumslig kontroll i det subcellulära området möjlig 29,30,31. Verktyg för att optogenetiskt manipulera signalering har utvecklats och tillämpats i flera system, inklusive de som beskrivs i Johnson et al.22, Čapek et al.32, Krishnamurthy et al.33 och Huang et al.34. Till exempel, genom att utnyttja den rumsliga kontroll som optogenetiken ger, användes denna strategi nyligen för att modifiera en signalgradient i Drosophila-embryon, vilket visar att flugembryogenesen är förvånansvärt robust mot förändringar i denna gradient22. Reversibiliteten och den snabba on/off-kinetiken hos optogenetiska signalaktivatorer har också gjort dem till attraktiva verktyg för att undersöka avkodningen av signaleringsdynamik 8,12,13,14,15,34,35,36.
Det tidiga zebrafiskembryot är ett in vivo-system som är väl lämpat för optogenetiska studier eftersom det är externt befruktat, transparent, mikroskopvänligt och genetiskt hanterbart. Ljusexponering är lättare att leverera till embryon som utvecklas utanför modern, ljus kan tränga igenom och komma åt deras icke-ogenomskinliga vävnader, levande zebrafiskembryon tolererar avbildning väl (förutom att de är transparenta), och befintliga genetiska metoder ger enkla möjligheter till knockdown- och överuttrycksexperiment, förutom utvecklingen av användbara transgena37.
Nyligen utvecklades optogenetiska verktyg för att aktivera BMP38- och Nodal39-signalering i zebrafiskembryon med exponering för blått ljus (Figur 1). Vi hänvisar till dessa verktyg som bOpto-BMP och bOpto-Nodal (b för blåljusaktiverad och Opto för optogenetisk). bOpto-BMP/Nodal är baserade på liknande mekanismer för aktivering av vägar. Bindningen av BMP- eller nodalligander till deras respektive receptorserin-treoninkinaser driver receptorkinasdomäninteraktioner som leder till fosforylering av signaleffektorer (Smad1/5/9 för BMP och Smad2/3 för Nodal). Fosforylerade signaleffektorer translokerar sedan till kärnan och reglerar målgenuttryck3 (Figur 1A,D). Dessa receptorkinasinteraktioner kan göras ljusresponsiva genom att koppla receptorkinaser till ljuskänsliga dimeriserande proteiner: Med ljusexponering bör dessa chimära proteiner dimeriseras, vilket får receptorkinasdomänerna att interagera och aktivera signalering (Figur 1B,C,E,F). Det är viktigt att notera att bOpto-BMP/Nodal, i motsats till endogena receptorer, inte innehåller extracellulära ligandbindande domäner, vilket säkerställer ligandoberoende aktivitet (Figur 1C,F). Denna optogenetiska aktiveringsstrategi uppnåddes först med receptortyrosinkinaser40,41,42 och tillämpades sedan på receptorserin-treoninkinaser.
bOpto-BMP/Nodal använder den blåljuskänsliga (~450 nm) homodimeriserande ljus-syre-spänningsavkänningsdomänen (LOV) från algen Vaucheria fridiga AUREO1-proteinet (VfLOV)43,44. Dessa konstruktioner består av ett membran-riktat myristoylering-motiv följt av antingen BMP- eller nodalreceptorkinasdomäner, sammansmälta till en LOV-domän (Figur 1B,E). Exponering för blått ljus bör orsaka LOV-homodimerisering, vilket resulterar i interaktioner mellan receptorkinasdomäner som leder till respektive Smad-fosforylering och aktivering av signalvägar (figur 1C,F). För bOpto-BMP visade sig en kombination av konstrukt med typ I-receptorkinasdomänerna från Acvr1l (även känd som Alk8) och BMPR1aa (även känd som Alk3) och typ II-receptorkinasdomänen från BMPR2a optimalt aktivera signalering38 (Addgene #207614, #207615 och #207616). För bOpto-Nodal används en kombination av konstrukt med typ I-receptorkinasdomänen från Acvr1ba och typ II-receptorkinasdomänen från Acvr2ba39.
bOpto-BMP/Nodal har introducerats i tidiga zebrafiskembryon genom att injicera mRNA i encellsstadiet, och använts för att undersöka betydelsen av signaleringslängd i nodaltolkning39, för att avgöra varför zebrafiskar förlorar förmågan att svara på nodal45, och för att undersöka hur BMP-målgener svarar på olika BMP-signaleringsnivåer38. Det är troligt att dessa verktyg kommer att fortsätta att vara användbara i en rad olika framtida utredningar. Men styrkan hos optogenetiska signalaktivatorer är också deras svaghet: ljuskänsliga prover måste behandlas med försiktighet för att undvika oavsiktlig ektopisk signalaktivitet. Exponering för rumsljus eller solljus kan aktivera bOpto-BMP/Nodal.
Detta protokoll ger praktiska förslag för användning av mRNA-kodade LOV-baserade BMP- och Nodal-aktivatorer i tidiga zebrafiskembryon. Den börjar med att beskriva en strategi för att bygga en ljuslåda för att kontrollera enhetlig ljusexponering och temperatur (Figur 2, Tilläggsfil 1, Tilläggsfil 2, Tilläggsfil 3, Tilläggsfil 4, Tilläggsfil 5, Tilläggsfil 6, Tilläggsfil 7, Tilläggsfil 8). Den beskriver sedan två viktiga kontrollexperiment som avgör om en optogenetisk signalaktivator beter sig som förväntat - dvs. aktiverar signalvägsaktivitet endast när den utsätts för ljus (figur 3). Den första kontrollanalysen innebär att fenotyper undersöks en dag efter befruktning i ljusexponerade och oexponerade embryon (Figur 3A). mRNA-injicerade ljusexponerade embryon, men inte oexponerade embryon, bör fenokopiera BMP eller nodalt överuttryck (Figur 4A,B; I synnerhet BMP-fenotyper är tydligt urskiljbara vid denna tidpunkt46). Denna analys ger en snabb aktivitetsavläsning. I den andra kontrollanalysen, för att avgöra om fenotyper orsakas specifikt av överskott av BMP eller Nodal-signalering och för att direkt observera förändringen i signaleringsnivåer, används immunofluorescensfärgning för att detektera fosforylerade signaleffektorer (pSmad1/5/9 respektive pSmad2/3) efter en 20 minuters ljusexponering runt sent blastula/tidigt gastrulationsstadium, när signalaktiviteten har beskrivits väl12, 16,17,47,48,49,50 (figur 3B och figur 4C). (Observera att även om rumsligt lokaliserad aktivering har demonstrerats för både bOpto-BMP38 och bOpto-Nodal39, beskriver detta protokoll endast enhetlig ljusexponering och aktiveringsstrategier för signalering.) Det är tillrådligt att utföra dessa kontrollexperiment innan bOpto-BMP/Nodal appliceras på specifika forskningsfrågor för att bestämma idealiska lokala experimentella förhållanden.
Protocol
Forskningsprotokoll för zebrafiskar granskades och godkändes av NICHD Animal Care and Use Committee vid National Institutes of Health (ASP 21-008). Alla zebrafiskstudier har utförts i enlighet med Vägledning för skötsel och användning av försöksdjur.
1. Bygga en ljuslåda
- För att kontrollera ljusexponering och temperatur, konstruera en ljuslåda som använder en ljusemitterande diod (LED) mikroplattbelysning som ljuskälla (Figur 2A, Materialförteckning, Tilläggsfil 1, Tilläggsfil 2). Denna anpassningsbara belysning ger dynamisk, programmerbar kontroll över flera våglängder.
OBS: Det finns många möjliga strategier för att bygga en ljuslåda, och ett alternativt tillvägagångssätt kan vara lämpligare (se t.ex. Gerhardt et al.51, Bugaj et al.52, Kumar och Khammash53, och mer på https://www.optobase.org/materials/). - Inkludera följande funktioner i ljuslådan: Temperaturkontroll (28 °C är idealiskt för zebrafiskembryon), uteslutning av oönskat ljus (t.ex. rumsljus och solljus), enhetlig leverans av blått ljus som täcker målområdet (t.ex. 6-hålsplatta) och kontroll över ljusintensitet och exponeringsdynamik.
OBS: bOpto-BMP/Nodal aktiveras av blått ljus, men vissa optogenetiska verktyg svarar på andra våglängder. Använd lämplig våglängd för det optogenetiska verktyget. - Borra ett hål genom toppen av en inkubator (Figur 2B) som är något bredare än LED-utgångslinsen.
- Se till att det inte finns några elektriska komponenter i toppen av inkubatorn som kommer att förstöras genom borrning (materialtabell). Detta kan konstateras genom att kontakta inkubatortillverkaren och fråga direkt.
- Om det finns ett befintligt hål på inkubatorns övre panel, använd en stegborr för att öka hålstorleken till 1.25 tum. Använd annars en 1.25 tums hålsåg med spindel.
- Om det finns interna paneler som blockerar ljuskällan, borra lämplig hålstorlek för att säkerställa att ljuskäglan inte blockeras (Figur 2A). Paneler är vanligtvis gjorda av tunn plåt, så använd låga hastigheter och metallborr för att förhindra skador (koboltborr rekommenderas).
- Konstruera en LED-hållare för att fästa LED-mikroplattbelysningen på toppen av inkubatorn (Figur 2C, Kompletterande Fil 3, Kompletterande Fil 4, Kompletterande Fil 5, Kompletterande Fil 6, Kompletterande Fil 7, Kompletterande Fil 8).
- Montera fyra M3-kubavstånd på den vertikala fästdelen med M3-skruvar.
- Fäst de två sidofästena till vänster och höger om det vertikala fästets kubavstånd. Montera ett annat kubavstånd i det överblivna hålet på sidofästena.
- Montera den vertikala fästdelen på LED-mikroplattans belysningsenhet (materialförteckning) med M6-skruvar. Placera LED-linspackningen över LED-systemlinsen.
- Montera de monterade delarna på inkubatorpanelens fäste och sedan på M3-avstånden på de vertikala och sidofästena. Placera inkubatorpackningen över det borrade hålet ovanpå inkubatorn.
- Placera inkubatorpanelens fäste ovanpå inkubatorpackningen och se till att packningen och panelöppningarna är koncentriska med inkubatorns hål. Montera panelen på inkubatorns topp med skruvar nr 8. Se till att denna tätning är ljustät.
- Placera en 6-hålsplatta på den översta hyllan i inkubatorn. Bestäm om ljusstrålen täcker plattan jämnt (Figur 2A). Använd ett pappersark för att visualisera ljustäckningen.
- Om hela plattan inte täcks av strålen, öka avståndet mellan lysdioden och plattan genom att flytta hyllan nedåt. För systemet som beskrivs här räcker det med ~14 tum mellan lysdioden och hyllan.
- Använd en ljusmätare för att bestämma instrålningsnivån och rumslig enhetlighet (Materialförteckning).
- För att undvika oavsiktligt solljus och exponering för rumsljus, använd väderstrippning för att säkerställa att inkubatordörren är ljustät (Figur 2A).
- Zebrafiskembryon utvecklas kraftigt vid 28 °C54. Använd en minneskortstermometer för att säkerställa att ljuslådan håller 28 °C.
2. Generering av mRNA för injektion
OBS: pCS2+ är vektorryggraden för bOpto-BMP-konstruktionerna38 och bOpto-Nodal-konstruktionerna39. Denna vektor är ampicillinresistent. bOpto-BMP består av tre konstruktioner (Figur 1B): BMPR1aa-LOV (Addgene # 207614): Förmodad kinasdomän av typ I BMPR1aa-receptorn (även känd som Alk3) sammansmält med LOV; Acvr1l-LOV (Addgene # 207615): Förmodad kinasdomän av typ I Acvr1l-receptorn (även känd som Alk8) smält till LOV; och BMPR2a-LOV (Addgene # 207616): Förmodad kinasdomän av typ II BMPR2a-receptorn och följande C-terminala domän sammansmält med LOV. bOpto-Nodal består av två konstruktioner (Figur 1E): Acvr1ba-LOV: Förmodad kinasdomän av typ I Acvr1ba-receptorn (även känd som Acvr1b) sammansmält med LOV; Acvr2ba-LOV: Förmodad kinasdomän av typ II Acvr2ba-receptorn (även kallad Acvr2b) sammansmält med LOV.
- För att linjärisera plasmider, söndersmält mellan 2-5 μg plasmid-DNA med hjälp av NotI-restriktionsenzym vid 37 °C i 1-3 timmar (Materialförteckning).
OBS: Det är också möjligt att generera linjäriserat DNA med hjälp av plasmiden som PCR-mall. - Rena DNA med hjälp av en standard kolonnbaserad reningssats (Table of Materials).
- Använd ett in vitro SP6-transkriptionskit, t.ex. ett mMessage mMachine-kit, för att transkribera RNA från den linjäriserade mallen (Table of Materials). Ställ in två reaktioner enligt tillverkarens rekommendationer för att säkerställa högre avkastning.
- Rena RNA med hjälp av ett standardkolonnbaserat RNA-saneringskit (Table of Materials). Det är också möjligt att rena via nederbörd.
3. Injicera mRNA
- Minst 1 dag före injektioner, gör injektionsskålar och agarosbelagda 6-brunnsplattor.
- Förbered 200 ml 1 % agaros i zebrafiskembryot och mikrovågsugn tills agarosen har lösts upp helt. Alla standardembryosubstrat för zebrafiskar bör vara godtagbara. Uteslut dock metylenblått från embryomediet eftersom det kan påverka nedströmsavbildning i andra tillämpningar.
- Häll försiktigt smält agaros i petriskålar av plast med måtten 100 mm x 15 mm. Fyll disken till hälften.
- Skölj en injektionsskålform med embryomedium och placera försiktigt på smält agaros, se till att inga bubblor fastnar mellan formen och agaros. Använd tejp för att göra en flik på baksidan av formen för enkel placering och hämtning.
- Möglet ska flyta i den smälta agarosen. Om formen sjunker, ta försiktigt bort den smälta agarosen och upprepa steg 3.1.3.
- Efter att agaros har stelnat, använd fliken för att försiktigt ta bort formen. Detta kan påskyndas genom att placera skålen vid 4 °C.
- Gör agarosbelagda 6-brunnsplattor om du arbetar med dekorionerade embryon för immunofluorescensexperiment.
- Använd en engångspipett på 10 ml plast för att överföra tillräckligt med smält agaros för att täcka botten av varje brunn på en 6-hålsplatta.
- Förvara injektionsskålar och 6-brunnsplattor vid 4 °C. De kan användas omedelbart eller lagras tills agarosen är uttorkad eller förorenad (vanligtvis 2-3 veckor).
- Förbered pipettspetsar av flammat glas om du arbetar med dekorionerade embryon för immunofluorescensexperiment.
- Sätt in änden av en glaspipett i en bunsenbrännare och rotera kontinuerligt tills kanterna är släta. Dehorionerade embryon måste bekvämt passa genom pipettens ände. Låt inte öppningen krympa under embryots diameter.
- Antingen köpa eller dra mikroinjektionsnålar (Materialförteckning). Det är tillrådligt att ha extra nålar tillgängliga på injektionsdagen om en ersättning är nödvändig.
- Dagen före injektionerna sätter du upp zebrafiskuppfödare enligt institutets standardrutiner (SOP). Håll hanar och honor åtskilda.
- Slå på ljuslådans temperaturregulator för att hålla 28 °C. För att säkerställa att ljuslådans temperatur håller sig på 28 °C, övervaka temperaturen med en minneskortstermometer (Materialförteckning).
- Bered mRNA-injektionsblandning(ar). Injicera ekvimolära mängder av varje konstruktion. Det är nödvändigt att empiriskt bestämma vilken mängd som ska injiceras.
- bOpto-BMP-avskriftsstorlekarna är följande:
Acvr1l-LOV = 2007 nukleotider (nt)
BMPR1aa-LOV = 1983 nt
BMPR2a-LOV = 3409 nt - För att injicera ekvimolära mängder, injicera 1,01 gånger mer av Acvr1l-konstruktionen än BMPR1aa; injicera 1,72 gånger mer av BMPR2a-konstruktionen än BMPR1aa.
- bOpto-Nodal-avskriftsstorlekarna är följande:
Acvr1ba-LOV och Acvr2ba-LOV är båda 1962 nt. - Om du vill injicera ekvimolära mängder injicerar du samma mängd av varje konstruktion.
- Bered ekvimolära injektionsblandningar och kombinera alla mRNA som riktar sig mot en väg till en injektionsblandning. Inkludera fenolrött injektionsspårämne om så önskas. För de data som visas i figur 4 användes 15 pg av varje bOpto-Nodal-konstruktion (Acvr1ba-LOV och Acvr2ba-LOV), och för bOpto-BMP användes 7,8 pg Acvr1l-LOV och BMPR1aa-LOV, och 13,4 pg BMPR2a-LOV.
- Förvara injektionsblandningarna vid -20 °C. När den optimala koncentrationen av injektionsblandningen har bestämts, gör 5–10 μl alikvoter och förvara vid -20 °C eller -80 °C.
- Injektion dag
- Om du utför en fenotypbestämningsanalys (figur 3A), injicera genom korionen direkt i mitten av cellen i encellsstadiet enligt ditt laboratoriums SOP. Korionen skyddar embryon från miljöstressorer och håller de instängda embryona. Detta är till hjälp vid poängsättning för korrekt kvantifiering av lyserade embryon (Figur 4A,B).
- Om en immunofluorescensanalys utförs (Figur 3B) kommer embryon så småningom att behöva dekorioneras för avbildning (Figur 4C). Injicera därför direkt i mitten av cellen hos dekorionerade embryon i encellsstadiet (se Rogers et al.55 för dekorioneringsprotokoll). Alternativt kan embryon dekorioneras manuellt efter fixering, men detta är mer besvärligt än dekorionering med pronas.
- Använd flammande glaspipetter för att hantera dekorionerade embryon (steg 3.1.10). Var noga med att inte utsätta dekorionerade embryon för luft eller plast, vilket kommer att få embryon att lysera. Hantera dekorionerade embryon varsamt.
- Förbered en extra skål med icke-injicerade embryon som ett mått för att utvärdera progressionsstadiet (se steg 4.3.5). Se till att proxyembryon kommer från samma uppsättning experimentella embryon, så att alla embryon befruktades samtidigt från samma föräldrar. Detta är användbart för immunofluorescensanalysen där stadiet är relevant men är onödigt för fenotypningsanalysen.
- Använd följande betingelser för både fenotypnings- och immunofluorescensanalyserna: 1) icke-injicerad, oexponerad, 2) icke-injicerad, exponerad för ljus, 3) injicerad, oexponerad, 4) injicerad, exponerad för ljus. Välj minst 30 embryon per tillstånd. För optimal embryohälsa, inkubera inte mer än 30 embryon per brunn i en 6-hålsplatta.
- Efter injektionen överförs embryona till märkta petriskålar eller agarosöverdragna 6-hålsplattor (för dekorionerade embryon) och inkuberas vid 28 °C. Embryon är ännu inte ljuskänsliga. Behandla injicerade embryon som om de vore ljuskänsliga efter 1,5 timme efter befruktning (hpf).
4. Experiment med ljusexponering
OBS: Exponering för ~450 nm ljus med en bestrålning på 45 W/m2 aktiverar kraftigt bOpto-BMP/Nodal utan uppenbar fototoxicitet (för information om ljusmätare, se materialförteckning). Nivån på optogenetiskt aktiverad signalering kan ställas in genom att ändra instrålningsvärdena38. Fototoxicitet kommer dock att behöva bedömas vid högre bestrålning.
- Tidskänsligt steg. Vid 4- till 16-cellsstadiet, cirka 1,5 hpf, tar man bort obefruktade och sjuka embryon. Omfördela vid behov för att säkerställa samma antal embryon i varje brunn (högst 30).
OBS: Det är viktigt att utföra detta steg runt 4- till 16-cellsstadiet eftersom embryon kommer att bli ljuskänsliga när det injicerade mRNA:t översätts till protein. Vi har inte observerat bevis för att embryon är signifikant ljuskänsliga före 1,5 hpf. För att minimera oavsiktlig fotoaktivering vid bedömning av embryon efter 1.5 hpf, använd rött ljus eller täck ljuskällor - inklusive mikroskop stages - med rött gelfilterpapper som blockerar LOV-dimeriserande blå våglängder (Materialförteckning).- Utvärdera embryon konsekvent för att säkerställa opartisk fördelning mellan förhållanden och experiment.
- För fenotypningsanalysen, använd följande 1-dagars ljusexponeringsprotokoll med början vid 1.5 hpf (figur 3A).
- Linda in den oexponerade kontrollplattan i aluminiumfolie. Denna platta bör innehålla både icke-injicerade och injicerade embryon. Se till att plattan är helt täckt och var noga med att inte föra in revor i folien. Placera denna platta på den nedre hyllan i 28 °C-ljuslådan (Figur 2A).
- Placera den exponerade plattan på den översta hyllan i 28 °C-ljuslådan (Figur 2A). Se till att locket sitter på skålen för att undvika avdunstning av embryot. Slå på det blå ljuset (en bestrålning på 45 W/m2 aktiverar signaleringen kraftigt).
- Stäng ljuslådedörren för att undvika oavsiktlig exponering för rumsljus. Om så önskas, inkludera en minneskortstermometer inuti ljuslådan innan du stänger luckan. Öppna inte dörren förrän fenotypbestämning 1 dag efter befruktning (dpf; se steg 5.1).
- För immunofluorescensanalysen, exponera embryon för blått ljus i 20 minuter med början runt 40 % epiboly56 (~6 hpf) och fixera omedelbart efter ljusexponering, tillsammans med de oexponerade kontrollerna (Figur 3B). En 20 minuters exponering för blått ljus vid 40 % epiboly aktiverar reproducerbart signalering.
- Cirka 1,5 hpf, linda in både exponerade och oexponerade rätter separat i aluminiumfolie. Se till att disken är helt täckt och var noga med att inte föra in revor i folien. Lämna proxyskålen uppackad. Placera de inslagna formarna och den oförpackade proxyskålen i ljuslådan för 28 °C (Figur 2A). Slå inte på lysdioden ännu.
- Om du testar mer än en mRNA-mängd, för det oexponerade tillståndet, sortera embryon som injicerats med olika mängder i individuella agarosbelagda 6-brunnsplattor, vilket hjälper till att minimera oavsiktlig ljusexponering under efterföljande fixering.
- Stäng ljuslådedörren för att undvika oavsiktlig exponering för rumsljus.
- Späd formaldehydbuljongen till 4 % i 1x fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) och alikvot 1 ml i förmärkta 2 ml rundbottnade mikrocentrifugrör, ett rör per tillstånd. Förvaras vid 4 °C.
- Cirka 5 hpf, ta bort proxyskålen som innehåller icke-injicerade embryon och bedöm utvecklingsstadiet med hjälp av ett dissekeringsskop. Stadiet för proxyembryona bör återspegla stadiet för de ljuskänsliga embryona i de förpackade skålarna.
- Ta också bort de inslagna rätterna så att alla rätter får samma temperatur. Upprepa tills proxyembryon har nått 40 % epiboly (~6 hpf). Embryogenesprogression är temperaturkänslig54; Ju längre skålarna är utanför inkubatorn, desto längre tid tar det för embryona att nå 40 % epiboly.
- När proxyembryona har nått 40 % epiboly, packa upp den exponerade skålen och placera den på den översta hyllan i ljuslådan (Figur 2A). Låt den oexponerade skålen/skålarna vara inslagna och placera den på den nedre hyllan. Tänd omedelbart det blå ljuset, stäng dörren och ställ in en timer på 20 minuter (en bestrålning på 45 W/m2 aktiverar signaleringen kraftigt).
- För att förbereda dig för fixering, ta bort så mycket rumsljus som möjligt (stäng persienner, släck takbelysningen, stäng av skärmar etc.). Se till att de formaldehydhaltiga rören är korrekt märkta. Omedelbart före fixering, ta bort formaldehydhaltiga rör från 4 °C och placera bredvid ljuslådan.
- Tids- och ljuskänsligt steg. Var beredd på att röra dig snabbt i slutet av 20 minuters ljusexponering. Efter 20 minuter öppnar du ljuslådans lucka och tar bort den oexponerade skålen.
- Använd en flammad glaspipettspets för att snabbt men försiktigt överföra ljuskänsliga embryon till det förberedda motsvarande röret med 4 % formaldehyd.
- Minimera överföringstiden (<45 s) för ljuskänsliga embryon för att undvika oavsiktlig ljusexponering. Se till att det inte finns några luftbubblor i pipetten. Luftexponering kommer att förstöra dekorionerade embryon.
- För att mata ut embryon i formaldehyd, sänk ner glaspipettspetsen i formaldehyden och låt embryona sjunka ner i vätskan. Minimera mängden embryomedium som överförs till formaldehyden genom att hålla embryona i slutet av spetsen.
- Efter att embryona har överförts, sätt tillbaka pipetten i samma brunn och pipettera upp och ner för att få bort eventuella embryon som fastnat. Detta förhindrar att embryon från flera sjukdomar av misstag hamnar i ett rör.
- Upprepa omedelbart steg 4.3.11-4.3.13 för de oexponerade, icke-injicerade embryona, följt av de exponerade embryona (injicerade och icke-injicerade).
- Förvara fixerade embryon vid 4 °C över natten.
5. Utvärdering av experiment
- Fenotypbedömning och avbildning
- Vid 1 dpf, helst mellan 24-32 hpf, ta bort embryon från ljuslådan för att bedöma fenotyper med hjälp av ett dissekeringsskop och skapa en poängsättningsmatris. Detta är det experimentella effektmåttet. Oavsiktlig fotoaktivering är inte längre ett problem.
- Poängsätt embryon medan du fortfarande är i korionen för enkelhetens skull. Använd en pipett eller sond för att flytta embryon för att se från flera vinklar.
- Embryon som upplever överskott av BMP-signalering kommer att ventraliseras med varierande svårighetsgrad som beskrivs i detalj i Kishimoto et al. 199746 (figur 4A, vänster panel). Embryon som upplever överskott av nodal signalering kommer att ha en rad utvecklingsdefekter relaterade till överskott av mesendoderm (Figur 4A, höger panel)1,3,47,57,58,59,60. De har ofta lyserats med 1 dpf.
- Poängsätt varje embryo under alla förhållanden (figur 4B). Skaffa dig en översiktsbild av alla embryon i varje brunn. Om så önskas, dekorionera och avbilda enskilda representativa embryon i metylcellulosa (Figur 4A).
- Immunofluorescensfärgning och avbildning
- Efter inkubation av embryon i 4 % formaldehyd vid 4 °C över natten, avlägsna formaldehyd och tvätta 3-5 gånger med 1x fosfatbuffrad koksaltlösning med Tween20 (PBST). Ta bort PBST och tillsätt 100 % metanol.
- Stäng rören och vänd dem försiktigt för att blanda kvarvarande PBST och metanol. Tvätta 2 gånger med metanol och förvara vid -20 °C i minst 2 timmar upp till flera år.
- För pSmad1/5/9 (BMP) immunofluorescensprotokoll, se Rogers et al.38. För pSmad2/3 (Nodal) immunofluorescensprotokoll, se van Boxtel et al.17 och Rogers et al.47.
- Avbilda immunfärgade embryon med hjälp av ett mikroskop som kan snittas optiskt (t.ex. ett konfokalmikroskop eller ett ljusarksmikroskop). Undvik mättnad och bibehåll identiska avbildningsförhållanden mellan alla prover som färgats med samma antikropp.
- Bild inom 5 dagar efter avslutad immunofluorescensfärgning eftersom fluorescens kan blekna med tiden.
Representative Results
Målet med de två kontrollexperimenten som beskrivs här är att avgöra om bOpto-BMP/Nodal aktiverar sina respektive vägar som svar på exponering för blått ljus utan att påverka signaleringen i frånvaro av ljus, som förväntat. Använd dessa kontroller för att upprätta lämpligt experimentellt arbetsflöde i ditt labb innan du tillämpar bOpto-BMP/Nodal på dina forskningsfrågor av intresse.
Fenotypningsanalysen kan slutföras på endast 2 dagar och ger en användbar indikation på signalaktivitet och fototoxicitet (figur 3A). Injicerade, blåljusexponerade embryon bör fenokopiera överskott av BMP-signalering (ventralisering46; Figur 4A, vänster panel) eller nodsignalering (utvecklingsdefekter relaterade till extra mesendoderm 1,3,47,57,58,59,60 (Figur 4A, höger panel)). Om injicerade, ljusexponerade embryon är afenotypiska, testa kvaliteten på mRNA och överväg att injicera mer, och dubbelkolla ljusexponeringsstrategin för att säkerställa konstant exponering för starkt ljus (~450 nm ljus med en instrålning på 45 W/m2 bör aktivera signalering starkt). Däremot bör injicerade, oexponerade embryon se identiska ut med icke-injicerade syskon. Om oexponerade embryon som injiceras uppvisar fenotyper, ska mängden mRNA som injiceras minskas och försöksuppställningen omprövas för att säkerställa att oexponerade embryon skyddas från ljusexponering. De data som visas i figur 4B visar resultaten från typiska fenotypningsexperiment med lämpliga mRNA-mängder och exponeringsförhållanden: stark signalaktivitet är uppenbar i injicerade, ljusexponerade embryon, med endast en liten del av injicerade, oexponerade embryon som uppvisar fenotyper.
Fenotypningsanalysen ger också en möjlighet att bedöma fototoxicitet. Om fototoxiciteten är försumbar bör icke-injicerade, ljusexponerade embryon vara vildtypade, liknande icke-injicerade, oexponerade embryon. Om icke-injicerade, ljusexponerade embryon har defekter, men inte icke-injicerade, oexponerade embryon, överväg att minska ljusinstrålningen. En bestrålning på 45 W/m2 aktiverar signaleringen på ett kraftfullt sätt utan uppenbar fototoxicitet. De data som visas i figur 4B visar inga oroande skillnader mellan icke-injicerade, ljusexponerade och icke-injicerade, oexponerade embryon, vilket tyder på försumbar fototoxicitet.
Även om immunofluorescensanalyserna kräver mer tid och ansträngning (~1 vecka) jämfört med fenotypningsanalysen (2 dagar), ger immunofluorescensfärgning en direkt avläsning av signalvägsaktivitet och kan avslöja subtila signalförändringar som kanske inte återspeglas av grov morfologi. Immunofluorescens är särskilt viktigt för att bedöma svar på bOpto-Nodal, eftersom överskott av Nodal-signalering ofta resulterar i att embryon lyserar med 1 dpf - vilket kan ha många orsaker - i motsats till de specifika ventraliseringsfenotyper som är karakteristiska för överskott av BMP-signalering46 (Figur 4A). Injicerade, blåljusexponerade embryon bör uppvisa en jämn ökning av Smad1/5/9- eller Smad2/3-fosforylering jämfört med icke-injicerade, ljusexponerade embryon. Om nivåerna inte ökar, eller bara ökar svagt, testa kvaliteten på mRNA och överväg att injicera mer, och dubbelkolla ljusexponeringsstrategin. En 20 minuters exponering för blått ljus med en instrålning på 45 W/m2 cirka 40 % epiboly bör aktivera signalering starkt. Om pSmad-färgningen inte är enhetlig, försök att injicera mRNA i mitten av cellen (snarare än äggulan), vilket kan resultera i en mer enhetlig mRNA-fördelning.
Injicerade, oexponerade embryon bör ha pSmad-nivåer som är jämförbara med icke-injicerade embryon. Anekdotiskt har vi observerat läckande Smad-fosforylering med bOpto-Nodal än med bOpto-BMP. Om pSmad-nivåerna ökar i injicerade, oexponerade embryon, minska mängden mRNA som injiceras. Omvärdera dessutom försöksuppställningen för att säkerställa att 1) oexponerade embryon inte oavsiktligt utsätts för ljus, och 2) ljusexponeringen under fixeringen är minimal. Under fixeringssteget är det viktigt att inte låta mer än 45 s förflyta mellan avlägsnande från ljuslådan och nedsänkning i formaldehyd. Dessutom, under detta steg, minimera exponeringen för rumsljus och solljus genom att stänga persienner, stänga av vita ljuskällor, använda röda lampor eller täcka vita ljuskällor med blått ljusblockerande gelfilterpapper (Materialförteckning).
Data i figur 4C visar resultaten från typiska immunfluorescensfärgningsexperiment med lämpliga mRNA-mängder och ljusexponeringsförhållanden: pSmad-nivåerna är likartade i icke-injicerade och oexponerade embryon, medan injicerade, ljusexponerade embryon uppvisar högre nivåer av Smad-fosforylering.
Figur 1: Aktiveringsstrategi för bOpto-BMP och -Nodal-signalering . (A) Den endogena BMP-signalvägen aktiveras av BMP-ligandbindning, vilket leder till bildning av ett typ I/II-receptorkomplex, fosforylering av Smad1/5/9 och uttryck av BMP-målgener. Typ I-receptorerna BMPR1aa och Acvr1l är också kända som Alk3 respektive Alk8. BMPR2a är en typ II-receptor. (B) bOpto-BMP-konstruktioner38. Förmodade kinasdomäner från BMPR1aa och Acvr1l smälts samman med LOV; BMPR2a-LOV-fusionen innehåller den förmodade kinasdomänen och receptor C-terminaldomänen (CTD). Alla fusioner är membranriktade med ett myristoyleringmotiv (Myr). Domänerna separeras av glycin-serin (GS) länkare. Konstruktioner taggas vid CTD:n med en HA-epitoptagg. Denna kombination av tre konstruktioner visade sig optimalt aktivera BMP-signalering. (C) bOpto-BMP-medierad aktivering av BMP-signalering. När de utsätts för blått ljus dimeriseras LOV-domäner, vilket tros utlösa komplex bildning och signalaktivering. (D) Den endogena nodsignalvägen aktiveras av nodligandbindning, vilket leder till bildning av ett typ I/II-receptorkomplex, fosforylering av Smad2/3 och uttryck av nodala målgener. Typ I-receptorn Acvr1ba och typ II-receptorn Acvr2ba är också kända som Acvr1b respektive Acvr2b. (E) bOpto-Nodal-konstruktioner39. Förmodade kinasdomäner från Acvr1ba och Acvr2ba smälts samman med LOV. Alla fusioner är membranriktade med ett myristoyleringmotiv (Myr). Domäner separeras av GS-länkare. Konstruktioner taggas vid CTD:n med en HA-epitoptagg. (F) bOpto-Nodal-medierad nodsignaleringaktivering. När de utsätts för blått ljus dimeriseras LOV-domäner, vilket tros utlösa komplex bildning och signalaktivering. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Temperaturkontrollerad ljuslåda för optogenetiska experiment . (A) En LED-mikroplattbelysning monteras på toppen av en inkubator med hjälp av en specialbyggd LED-hållare. Zebrafiskembryon i en 6-hålsplatta på den första hyllan utsätts för ljus genom ett hål som borrats i toppen av inkubatorn. Den nedre hyllan rymmer en andra uppsättning oexponerade kontrollembryon i en aluminiumfolieförpackad 6-hålsplatta. Inkubatordörren är fodrad med tätningslister för att förhindra oavsiktlig exponering för rumsljus eller solljus. (B) Detalj av proceduren för att skapa ett hål i inkubatorn med hjälp av en stegborr. Inkubatormodellen som används här har en invändig panel som krävde borrning av ett andra, större hål (Materialförteckning). (C) Detalj av den anpassade LED-hållaren designad för ett belysningssystem med tre våglängder. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Bild 3: Arbetsflöde för bOpto-BMP/Nodal-experiment. Fenotypanalys och pSmad immunofluorescensfärgning för att testa aktiviteten hos bOpto-BMP/Nodal. Embryon injiceras med mRNA i encellsstadiet och överförs till en ljuslåda senast 1,5 timme efter befruktningen (hpf). A) Bestämning av fenotyp. Injicerade embryon och icke-injicerade syskon föds upp i mörker eller utsätts för enhetligt blått ljus från 1,5 hpf till 1 dag efter befruktning (dpf). Optogenetisk signalaktivitet kan utvärderas genom att poängsätta embryon för fenotyper som överensstämmer med överdriven signalvägsaktivitet. (B) pSmad immunofluorescensfärgning. Injicerade embryon och icke-injicerade syskon föds upp i mörker till 40 % epiboly (~6 hpf). Hälften av de injicerade och hälften av de icke-injicerade embryona utsätts sedan för enhetligt blått ljus i 20 minuter. Efter exponering fixeras alla embryon och utsätts för immunofluorescensfärgning för pSmad. Förhöjda nivåer av pSmad1/5/9 eller pSmad2/3 återspeglar optogenetisk aktivering av BMP- respektive nodalsignalering. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Bedömning av ljusaktiverade signalsvar i zebrafiskembryon. Zebrafiskembryon injicerades i encellsstadiet med mRNA som kodar för bOpto-BMP/Nodal. (A) Embryon föddes antingen upp i mörker eller exponerades för enhetligt blått ljus med början 1,5 timme efter befruktning (hpf). Fenotyperna poängsattes 1 dag efter befruktning (dpf). Representativa fenotyper visas. Överskott av BMP-signalering leder till ventralisering (vänster panel), medan överskott av Nodal-signalering orsakar utvecklingsdefekter associerade med extra mesendoderm (höger panel). Skalstapel = 500 μm. (B) Kvantifiering av fenotyp. Injicerade embryon och icke-injicerade syskon föddes upp i mörker med en startvikt på 1,5 hpf (svart glödlampa). Hälften av de injicerade och hälften av de icke-injicerade embryona exponerades för enhetligt blått ljus (blå glödlampa). (C) Injicerade embryon och icke-injicerade syskon föddes upp i mörker med början vid 1,5 hpf (svart glödlampa). Vid 40 % epiboly (~6 hpf) exponerades hälften av de injicerade och hälften av de icke-injicerade embryona för enhetligt blått ljus (blå glödlampa). Efter 20 minuter fixerades alla embryon och utsattes för immunofluorescensfärgning för antingen fosforylerad Smad1/5/9 eller Smad2/3. Högre pSmad-intensiteter indikerar ökad BMP/Nodal-signalering. Skalstapel = 200 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Kompletterande File 1: Ljuslåda full montering. 3D PDF-fil som visar en 3D-vy av hela ljuslådemonteringen. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Tilläggsfil 2: Ljuslåda sprängskiss. 3D PDF-fil som visar en 3D-vy av den sprängda ljuslådan. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Tilläggsfil 3: Stor lätt packning. CAD-ritningsfil (. DWG-format) för att tillverka den stora ljuspackningen för LED-hållaren med hjälp av en laserskärare. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Tilläggsfil 4: Liten lätt packning. CAD-ritningsfil (. DWG-format) för att tillverka den lilla ljuspackningen för LED-hållaren med hjälp av en laserskärare. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Tilläggsfil 5: Akrylplattformsbas. CAD-ritningsfil (. DWG-format) för att tillverka LED-hållarens akrylplattformsbas med hjälp av en laserskärare. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Tilläggsfil 6: Akrylplattform vertikal. CAD-ritningsfil (. DWG-format) för att tillverka LED-hållarens akrylplattform vertikalt med hjälp av en laserskärare. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Tilläggsfil 7: Akrylstöd vänster. CAD-ritningsfil (. DWG-format) för att tillverka LED-hållarens akryl vänster stöd med hjälp av en laserskärare. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Tilläggsfil 8: Akrylstöd höger. CAD-ritningsfil (. DWG-format) för att tillverka LED-hållarens akryl med hjälp av en laserskärare. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Discussion
Injektion av mRNA är den nuvarande strategin för att leverera bOpto-BMP/Nodal till zebrafiskembryon. Denna metod har flera nackdelar. För det första varierar den lämpliga mängden mRNA mellan olika laboratorier. Den mängd som används bör vara tillräcklig för att aktivera signalering på ett robust sätt med ljusexponering, men utan oavsiktlig mörkeraktivering. Det är en bra idé att testa flera mängder för att hitta optimala mRNA-nivåer, och när de väl är etablerade, skapa alikvoter av en mastermix för att reproducerbart introducera samma mängd mRNA. För det andra kan ojämn fördelning av injicerat mRNA leda till ojämn signalaktivering. Injicering i mitten av cellen (inte äggulan) tros främja jämn mRNA-distribution. Slutligen, eftersom injicerat mRNA bryts ned med tiden, kanske detta tillvägagångssätt inte är lämpligt för experiment på äldre embryon. I framtiden skulle dessa problem kunna åtgärdas genom transgena zebrafisklinjer som allmänt uttrycker bOpto-BMP/Nodal med en maternell eller läkemedelsinducerbar promotor. Även om det kan vara en utmaning att arbeta med potentiellt ljuskänsliga vuxna zebrafiskar i detta sammanhang, har zebrafiskar 61,62 och Drosophila 22,34,35,63 transgena med optogenetiska verktyg framgångsrikt utvecklats.
Att undvika oavsiktlig fotoaktivering är en allmän utmaning med optogenetiska verktyg. För enkelhetens skull, behandla injicerade embryon äldre än 1,5 hpf som ljuskänsliga. Oavsiktlig ljusexponering kan ofta undvikas genom att helt enkelt slå in tallrikar eller fat med aluminiumfolie. För experiment som kräver visuell observation av levande embryon äldre än 1,5 hpf är det dock möjligt att använda röda ljuskällor eller att täcka vita ljuskällor med billigt gelfilterpapper som blockerar LOV-dimeriserande våglängder (Materialförteckning).
Ljuslådan som beskrivs här är utformad för specifika applikationer som kräver exakt kontroll över ljusinstrålningsnivåer, dynamik och våglängder (figur 2). Andra fördelar med denna ljuslåda inkluderar enhetlig ljusexponering, försumbar oavsiktlig provuppvärmning, gott om utrymme för flera 6-brunnsplattor och långlivade, spektralt välkarakteriserade ljuskällor. Olika ljusexponeringsstrategier kan dock vara att föredra beroende på forskningsansökan. Många laboratorier har utvecklat enklare och mer kostnadseffektiva enhetliga ljusexponeringssystem med mindre fotavtryck, inklusive att fodra inkubatorer med LED-remsor, hänga upp LED-paneler över prover eller införliva lysdioder i odlingsskållock 32,38,39,40,64,65,66 . Det är viktigt att notera att ljuslådan som används i detta protokoll inte tillåter användare att självständigt reglera enskilda brunnar (i motsats till Bugaj et al.52) eller ge rumslig kontroll över ljusexponeringen. Spatialt lokaliserad optogenetisk aktivering har demonstrerats med bOpto-BMP38 och bOpto-Nodal39 med hjälp av lasrar i SPIM respektive konfokala system, och har också realiserats med många andra optogenetiska strategier i en mängd olika modellsystem (diskuteras i Rogers och Müller12). Vissa tillvägagångssätt har till och med uppnått subcellulär rumslig upplösning 29,30,31. Även om implementeringen av rumsligt lokaliserade ljusexponeringssystem ligger utanför ramen för detta protokoll, är rumsliga aktiveringsexperiment med bOpto-BMP/Nodal teoretiskt möjliga med specialutrustning som digitala mikrospegelenheter eller maskeringsmetoder. Läsarna uppmuntras att utforska den omfattande litteraturen om gör-det-själv-ljuslådor för optogenetiska experiment innan de bestämmer sig för en ljusexponeringsstrategi (se t.ex. Gerhardt et al.51, Bugaj et al.52, Kumar och Khammash 53 och mer på https://www.optobase.org/materials/).
Molekylära optogenetiska strategier erbjuder ofta en högre grad av spatiotemporal kontroll över biologiska processer jämfört med historiska metoder som mutanter, ektopiskt genuttryck, rekombinanta proteiner och läkemedel. Läsare som är intresserade av fördelarna med optogenetiska metoder kan utforska andra publicerade verktyg som finns tillgängliga i zebrafiskar och andra organismer. Dessa inkluderar verktyg för att manipulera ytterligare signalvägar 32,65,67,68, reglera genuttryck 61,64,66,69,70,71, ändra proteinlokalisering 31,72 och aktivera apoptos 62. Dessa verktyg och många andra är bekvämt katalogiserade på OptoBase, en kurerad webbresurs för molekylära optogenetikmetoder28. För dem som inspireras att skapa nya optogenetiska verktyg innehåller resursen också användbara beskrivningar av ljuskänsliga proteiner som har använts i ett brett spektrum av strategier, inklusive ljuskänsliga proteiner som svarar på gröna, röda och nära infraröda våglängder. Vi är glada över att det vetenskapliga samfundet kommer att inse den fulla potentialen hos molekylära optogenetiska metoder.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Finansieringen av detta protokoll tillhandahölls av NICHD Intramural Program till KWR (ZIA HD009002-01). Vi tackar Jeff Farrell och hans labb för deras upplysande feedback, Will Anderson för utmärkt teknisk support, Leanne Iannucci för stresstestning av protokollet och mätning av instrålning, och NIH Shared Zebrafish-anläggningen för deras hårda arbete med att hålla zebrafisken frisk.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Building a light box & Light exposure protocol | |||
| #8 x 1" Hex Self-drilling Screw | McMaster-Carr | 99663A222 | 1.4.5 |
| Digital Optical Power and Energy Meter | ThorLabs | PM100D | 1.7 4 |
| Incubator (142 liters) | Boekel Scientific | 139400 | 1.3.1 |
| Incubator Panel Mount (1/4" thick cast black acrylic) | Custom part / Piedmont Plastics | Incubator_panel | 1.4.4 |
| Large HSS Spiral Groove Step Drill Bit | CO-Z | SDB0001TA | 1.3.2 |
| LED lens gasket, Incubator gasket; 1/32" thick black silicone | McMaster-Carr | 5812T12 | 1.4.3 1.4.4 |
| LED microplate illuminator | Prizmatix | NA | 1.1 1.4.3 |
| M3 10mm Cube Standoff | Newark Eletronics | 005.60.533 | 1.4.1 |
| M3 x 10mm 316SS Flat Head Screw | McMaster-Carr | 91801A156 | 1.4.1 |
| M6 x 10mm 316SS Flat Head Screw | McMaster-Carr | 91801A305 | 1.4.3 |
| Memory card thermometer | Fisherbrand | 15-081-111 | 1.9 3.2.1 |
| Microscope Slide Power Meter Sensor Head (150 mW) | ThorLabs | S170C | 1.7 4 |
| Red gel filter paper #E106 | Rosco / B&H Foto & Electronics | 110084014805-E106 | 4.2.1 |
| Side Brackets (1/4" thick cast black acrylic) | Custom part / Piedmont Plastics | Side_bracket | 1.4.2 |
| Vertical Bracket (1/4" thick cast black acrylic) | Custom part / Piedmont Plastics | Vertical_bracket | 1.4.1 |
| Weather stripping: Light duty EPDM foam, 1/2" wd 1/4" tk | McMaster-Carr | 8694K12 | 1.8 |
| Generating mRNA | |||
| EZNA MicroElute Cycle Pure Kit | Omega | D6293-02 | 2.4 |
| GeneJET Miniprep Kit (250 rxns) | Thermo Scientific | K0503 | 2.2 |
| Microsample incubator (Hybex) | SciGene | 1057-30-0 | 2 |
| Microsample incubator 1.5 ml tube block (Hybex) | SciGene | 1057-34-0 | 2 |
| Nanodrop One Spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-ONE-W | 2.4 |
| NotI-HF restriction enzyme | New England Biolabs (NEB) | R3189L | 2.1 |
| pCS2-Opto-Alk3 | Addgene | 207614 | 2 |
| pCS2-Opto-Alk8 | Addgene | 207615 | 2 |
| pCS2-Opto-BMPR2a | Addgene | 207616 | 2 |
| RNeasy Mini Kit (250 rxns) | Qiagen | 74106 | 2.3 |
| Injecting mRNA | |||
| Agarose (UltraPure) | Invitrogen / Thermo Fisher | 16500500 | 3.1.1 |
| 250 ml glass beakers | Fisherbrand | FB100250 | 3.3.2 |
| 6-well dishes (case of 50) | Falcon | 08 772 1B | 3.1.6 |
| B-8A ball joint | Narishige | B-8A | 3.3 |
| Back pressure unit (microinjection rig component) | Applied Scientific Instrumentation (ASI) | BPU | 3.3 |
| Foot switch (microinjection rig component) | Applied Scientific Instrumentation (ASI) | FWS | 3.3 |
| GJ-1 magnetic stand | Narishige | GJ-1 | 3.3 |
| Glass capillaries (4 in, OD 1 mm, filament) | World Precision Instruments | 1B100F-4 | 3.1.11 |
| Glass petri dish bottoms (for dechorionating) | Pyrex | 08-748A | 3.3.2 |
| Glass pipettes (5 3/4" with wide tip) | Kimble-Chase | 63A53WT | 3.1.9 |
| Injection dish molds | Adaptive Science Tools | tu1 | 3.1.3 |
| IP iron plate | Narishige | IP | 3.3 |
| M-152 micromanipulator | Narishige | M-152 | 3.3 |
| Micro pipette holder kit (microinjection rig component) | Applied Scientific Instrumentation (ASI) | MIMPH-MPIP-Kit | 3.3 |
| Micrometers | Meiji Techno America | MA285 | 3.3 |
| MPPI-2 pressure injector (microinjection rig component) | Applied Scientific Instrumentation (ASI) | MPPI-3 | 3.3 |
| Needle puller | World Precision Instruments | PUL-1000 | 3.1.11 |
| Petri dishes (100 mm x 15 mm, case of 500) | Falcon | 08-757-100D | 3.1.2 |
| Pipettor (10 ml, green) | Bel-Art | F37898-0000 | 3.3 |
| Pronase | Roche | 11459643001 | 3.3.2 |
| Squeeze bottles (500 ml) | Nalgene / Thermo Scientific | 2402-0500 | 3.3 |
References
- Jones, W. D., Mullins, M. C. Cell signaling pathways controlling an axis organizing center in the zebrafish. Current Topics in Developmental Biology. 150, 149-209 (2022).
- Hill, C. S. Establishment and interpretation of NODAL and BMP signaling gradients in early vertebrate development. Current Topics in Developmental Biology. 149, 311-340 (2022).
- Zinski, J., Tajer, B., Mullins, M. C. TGF-β Family Signaling in Early Vertebrate Development. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 10 (6), a033274 (2018).
- Shore, E. M., Kaplan, F. S. Inherited human diseases of heterotopic bone formation. Nature Reviews. Rheumatology. 6 (9), 518-527 (2010).
- Hebron, K. E., Hernandez, E. R., Yohe, M. E. The RASopathies: from pathogenetics to therapeutics. Disease Models & Mechanisms. 15 (2), dmm049107 (2022).
- Grant, M. G., Patterson, V. L., Grimes, D. T., Burdine, R. D. Modeling Syndromic Congenital Heart Defects in Zebrafish. Current Topics in Developmental Biology. 124, 1-40 (2017).
- Nusse, R., Clevers, H. Wnt/beta-Catenin Signaling, Disease, and Emerging Therapeutic Modalities. Cell. 169 (6), 985-999 (2017).
- Farahani, P. E., Reed, E. H., Underhill, E. J., Aoki, K., Toettcher, J. E. Signaling, Deconstructed: Using Optogenetics to Dissect and Direct Information Flow in Biological Systems. Annual Review of Biomedical Engineering. 23, 61-87 (2021).
- Purvis, J. E., Lahav, G. Encoding and decoding cellular information through signaling dynamics. Cell. 152 (5), 945-956 (2013).
- Wibisana, J. N., Okada, M. Encoding and decoding NF-kappaB nuclear dynamics. Current Opinion in Cell Biology. 77, 102103 (2022).
- Friedel, L., Loewer, A. The guardian's choice: how p53 enables context-specific decision-making in individual cells. TheFEBS Journal. 289 (1), 40-52 (2022).
- Rogers, K. W., Müller, P. Optogenetic approaches to investigate spatiotemporal signaling during development. Current Topics in Developmental Biology. 137, 37-77 (2020).
- Johnson, H. E., Toettcher, J. E. Illuminating developmental biology with cellular optogenetics. Current Opinion in Biotechnology. 52, 42-48 (2018).
- Bosman, S. L., Sonnen, K. F.
- Li, P., Elowitz, M. B. Communication codes in developmental signaling pathways. Development. 146 (12), dev170977 (2019).
- Tucker, J. A., Mintzer, K. A., Mullins, M. C. The BMP signaling gradient patterns dorsoventral tissues in a temporally progressive manner along the anteroposterior axis. Developmental Cell. 14 (1), 108-119 (2008).
- van Boxtel, A. L., et al. A temporal window for signal activation dictates the dimensions of a Nodal signaling domain. Developmental Cell. 35 (2), 175-185 (2015).
- Sorre, B., Warmflash, A., Brivanlou, A. H., Siggia, E. D. Encoding of temporal signals by the TGF-β pathway and implications for embryonic patterning. Developmental Cell. 30 (3), 334-342 (2014).
- Economou, A. D., Hill, C. S. Temporal dynamics in the formation and interpretation of Nodal and BMP morphogen gradients. Current Topics in Developmental Biology. 137, 363-389 (2020).
- Rogers, K. W., Schier, A. F. Morphogen gradients: from generation to interpretation. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 27, 377-407 (2011).
- Barkai, N., Shilo, B. Z. Robust generation and decoding of morphogen gradients. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 1 (5), a001990 (2009).
- Johnson, H. E., Djabrayan, N. J. V., Shvartsman, S. Y., Toettcher, J. E. Optogenetic Rescue of a Patterning Mutant. Current Biology. 30 (17), 3414-3424 (2020).
- Imayoshi, I., et al. Oscillatory control of factors determining multipotency and fate in mouse neural progenitors. Science. 342 (6163), 1203-1208 (2013).
- Lin, B., et al. Synthetic spatially graded Rac activation drives cell polarization and movement. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (52), E3668-E3677 (2012).
- Cui, K. W., et al. Spatially controlled stem cell differentiation via morphogen gradients: A comparison of static and dynamic microfluidic platforms. Journal of Vacuum Science & Technology. A, Vaccum, Surfaces, and Films. 38 (3), 033205 (2020).
- Faden, F., Mielke, S., Lange, D., Dissmeyer, N. Generic tools for conditionally altering protein abundance and phenotypes on demand. Biological Chemistry. 395 (7-8), 737-762 (2014).
- Shoji, W., Sato-Maeda, M. Application of heat shock promoter in transgenic zebrafish. Development, Growth & Differentiation. 50 (6), 401-406 (2008).
- Kolar, K., Knobloch, C., Stork, H., Znidaric, M., Weber, W. OptoBase: A web platform for molecular optogenetics. ACS Synthetic Biology. 7 (7), 1825-1828 (2018).
- Benedetti, L., et al. Light-activated protein interaction with high spatial subcellular confinement. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (10), E2238-E2245 (2018).
- Krueger, D., De Renzis, S. Optogenetic Methods to Control Tissue Mechanics in Drosophila. Methods in Molecular Biology. 2540, 269-283 (2022).
- Buckley, C. E. Optogenetic Control of Subcellular Protein Location and Signaling in Vertebrate Embryos. Methods in Molecular Biology. 1920, 143-162 (2019).
- Čapek, D., et al. Light-activated Frizzled7 reveals a permissive role of non-canonical wnt signaling in mesendoderm cell migration. Elife. 8, e42093 (2019).
- Krishnamurthy, V. V., et al. Reversible optogenetic control of kinase activity during differentiation and embryonic development. Development. 143 (21), 4085-4094 (2016).
- Huang, A., Amourda, C., Zhang, S., Tolwinski, N. S., Saunders, T. E. Decoding temporal interpretation of the morphogen Bicoid in the early Drosophila embryo. Elife. 6, e26258 (2017).
- Johnson, H. E., Toettcher, J. E. Signaling dynamics control cell fate in the early Drosophila embryo. Developmental Cell. 48 (3), 361.e3-370.e3 (2019).
- Aoki, K., et al. Stochastic ERK activation induced by noise and cell-to-cell propagation regulates cell density-dependent proliferation. Molecular Cell. 52 (4), 529-540 (2013).
- Chow, R. W., Vermot, J. The rise of photoresponsive protein technologies applications in vivo: a spotlight on zebrafish developmental and cell biology. F1000Research. , (2017).
- Rogers, K. W., ElGamacy, M., Jordan, B. M., Müller, P. Optogenetic investigation of BMP target gene expression diversity. Elife. 9, e58641 (2020).
- Sako, K., et al. Optogenetic control of Nodal signaling reveals a temporal pattern of Nodal signaling regulating cell fate specification during gastrulation. Cell Reports. 16 (3), 866-877 (2016).
- Grusch, M., et al. Spatio-temporally precise activation of engineered receptor tyrosine kinases by light. The EMBO Journal. 33 (15), 1713-1726 (2014).
- Crossman, S. H., Janovjak, H. Light-activated receptor tyrosine kinases: Designs and applications. Current Opinion in Pharmacology. 63, 102197 (2022).
- Kainrath, S., Janovjak, H. Design and Application of Light-Regulated Receptor Tyrosine Kinases. Methods in Molecular Biology. 2173, 233-246 (2020).
- Takahashi, F., et al. AUREOCHROME, a photoreceptor required for photomorphogenesis in stramenopiles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (49), 19625-19630 (2007).
- Toyooka, T., Hisatomi, O., Takahashi, F., Kataoka, H., Terazima, M.
- Vopalensky, P., Pralow, S., Vastenhouw, N. L. Reduced expression of the Nodal co-receptor Oep causes loss of mesendodermal competence in zebrafish. Development. 145 (5), dev.158832 (2018).
- Kishimoto, Y., Lee, K. H., Zon, L., Hammerschmidt, M., Schulte-Merker, S. The molecular nature of zebrafish swirl: BMP2 function is essential during early dorsoventral patterning. Development. 124 (22), 4457-4466 (1997).
- Rogers, K. W., et al. Nodal patterning without Lefty inhibitory feedback is functional but fragile. Elife. 6, e28785 (2017).
- Dubrulle, J., et al. Response to Nodal morphogen gradient is determined by the kinetics of target gene induction. Elife. 4, e05042 (2015).
- Harvey, S. A., Smith, J. C. Visualisation and quantification of morphogen gradient formation in the zebrafish. PLoS Biology. 7 (5), e1000101 (2009).
- Zinski, J., Tuazon, F., Huang, Y., Mullins, M., Umulis, D. Imaging and Quantification of P-Smad1/5 in Zebrafish Blastula and Gastrula Embryos. Methods in Molecular Biology. 1891, 135-154 (2019).
- Gerhardt, K. P., Castillo-Hair, S. M., Tabor, J. J. DIY optogenetics: Building, programming, and using the Light Plate Apparatus. Methods in Enzymology. 624, 197-226 (2019).
- Bugaj, L. J., Lim, W. A. High-throughput multicolor optogenetics in microwell plates. Nature Protocols. 14 (7), 2205-2228 (2019).
- Kumar, S., Khammash, M. Platforms for Optogenetic Stimulation and Feedback Control. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 10, 918917 (2022).
- Urushibata, H., et al. Control of Developmental Speed in Zebrafish Embryos Using Different Incubation Temperatures. Zebrafish. 18 (5), 316-325 (2021).
- Rogers, K. W., Bläßle, A., Schier, A. F., Müller, P. Measuring protein stability in living zebrafish embryos using fluorescence decay after photoconversion (FDAP). Journal of Visualized Experiments. (95), e52266 (2015).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F.
- Feldman, B., et al. Zebrafish organizer development and germ-layer formation require nodal-related signals. Nature. 395 (6698), 181-185 (1998).
- Shimizu, T., et al. Cooperative roles of Bozozok/Dharma and Nodal-related proteins in the formation of the dorsal organizer in zebrafish. Mechanisms of Development. 91 (1-2), 293-303 (2000).
- Rebagliati, M. R., Toyama, R., Fricke, C., Haffter, P., Dawid, I. B. Zebrafish nodal-related genes are implicated in axial patterning and establishing left-right asymmetry. Developmental Biology. 199 (2), 261-272 (1998).
- Gritsman, K., Talbot, W. S., Schier, A. F.
- LaBelle, J., et al. TAEL 2.0: An Improved Optogenetic Expression System for Zebrafish. Zebrafish. 18 (1), 20-28 (2021).
- Mruk, K., Ciepla, P., Piza, P. A., Alnaqib, M. A., Chen, J. K. Targeted cell ablation in zebrafish using optogenetic transcriptional control. Development. 147 (12), dev183640 (2020).
- Johnson, H. E., et al. The spatiotemporal limits of developmental Erk signaling. Developmental Cell. 40 (2), 185-192 (2017).
- Motta-Mena, L. B., et al. An optogenetic gene expression system with rapid activation and deactivation kinetics. Nature Chemical Biology. 10 (3), 196-202 (2014).
- Patel, A. L., et al.
- LaBelle, J., Woo, S. Light-Induced GFP Expression in Zebrafish Embryos using the Optogenetic TAEL/C120 System. Journal of Visualized Experiments. (174), e62818 (2021).
- Kainrath, S., Stadler, M., Reichhart, E., Distel, M., Janovjak, H. Green-light-induced inactivation of receptor signaling using cobalamin-binding domains. Angewandte Chemie. 56 (16), 4608-4611 (2017).
- Benman, W., et al. Temperature-responsive optogenetic probes of cell signaling. Nat Chem Biol. 18 (2), 152-160 (2022).
- Reade, A., et al. TAEL: a zebrafish-optimized optogenetic gene expression system with fine spatial and temporal control. Development. 144 (2), 345-355 (2017).
- Putri, R. R., Chen, L. Spatiotemporal control of zebrafish (Danio rerio) gene expression using a light-activated CRISPR activation system. Gene. 677, 273-279 (2018).
- Liu, H., Gomez, G., Lin, S., Lin, S., Lin, C.
- Buckley, C. E., et al. Reversible optogenetic control of subcellular protein localization in a live vertebrate embryo. Developmental Cell. 36 (1), 117-126 (2016).
