Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Optogenetisk signalaktivering i sebrafiskembryoer

Published: October 27, 2023 doi: 10.3791/65733
Automatic Translation
*1, *1, 2, 2, 1
1Division of Developmental Biology, Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development, NIH, 2Instrumentation Development and Engineering Application Solutions, National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering, NIH
* These authors contributed equally

Summary

Optogenetisk manipulering av signalveier kan være en kraftig strategi for å undersøke hvordan signalering dekodes i utvikling, regenerering, homeostase og sykdom. Denne protokollen gir praktiske retningslinjer for bruk av lys-oksygen-spenning sensing domenebasert Nodal og bein morfogent protein (BMP) signalaktivatorer i tidlig sebrafisk embryo.

Abstract

Signalveier orkestrerer grunnleggende biologiske prosesser, inkludert utvikling, regenerering, homeostase og sykdom. Metoder for eksperimentell manipulering av signalering er nødvendig for å forstå hvordan signalering tolkes i disse omfattende sammenhenger. Molekylære optogenetiske verktøy kan gi reversible, justerbare manipulasjoner av signalveiaktivitet med høy grad av spatiotemporal kontroll og har blitt brukt in vitro, ex vivo og in vivo. Disse verktøyene kobler lysresponsive proteindomener, for eksempel det blå lyset homodimerizing light-oxygen-voltage sensing (LOV) -domenet, med signaleffektorer for å gi lysavhengig eksperimentell kontroll over signalering. Denne protokollen gir praktiske retningslinjer for bruk av det LOV-baserte benmorfogenetiske proteinet (BMP) og Nodal-signalaktivatorene bOpto-BMP og bOpto-Nodal i det optisk tilgjengelige tidlige sebrafiskembryoet. Den beskriver to kontrolleksperimenter: En rask fenotypeanalyse for å bestemme passende eksperimentelle forhold, og en immunfluorescensanalyse for å direkte vurdere signalering. Sammen kan disse kontrolleksperimentene bidra til å etablere en rørledning for bruk av optogenetiske verktøy i tidlige sebrafiskembryoer. Disse strategiene gir en kraftig plattform for å undersøke rollene til signalering i utvikling, helse og fysiologi.

Introduction

Signalveier tillater celler å reagere på sitt miljø og koordinere aktiviteter på vevs- og organismeskala. Signaler som er avgjørende for embryonal utvikling inkluderer TGF-beta superfamiliemedlemmene bein morfogenetisk protein (BMP) og Nodal 1,2,3. Under embryogenese mønstrer veiene som reguleres av disse signalene og andre kroppsplanen ved å kontrollere genuttrykk og tilleggsprosesser for å sikre at forskjellige vev og organer utvikler seg og grensesnitt riktig. Patologier, inkludert fødselsskader og kreft, kan oppstå når signalering eller respons på signalering forstyrres 4,5,6,7. Til tross for grundige undersøkelser av signalering, gjenstår det mye mer å oppdage om hvordan nivåer og dynamikk dekodes i en rekke sammenhenger 8,9,10,11, spesielt under utvikling 12,13,14,15,16,17,18,19.

For å forstå hvordan signalering dekodes, ville et ideelt eksperiment være å manipulere signalnivåer, timing og / eller dynamikk - med høy grad av romlig og tidsmessig kontroll - og vurdere utfall. For eksempel foreslås presise romlige signalgradienter for å mønstre utviklende vev20,21. Endring av signalgradient romlige fordelinger vil bidra til å teste denne hypotesen22. I tillegg blir viktigheten av signaldynamikk for å generere forskjellige cellulære responser tydeligere: Den samme signalveien kan instruere celler til å differensiere eller spre seg avhengig av signalfrekvens, for eksempel 9,23. Eksperimentelle paradigmer der signaldynamikk lett kan manipuleres, vil være verdifulle for å utforske forholdet mellom dynamikk og celleskjebnebeslutninger 8,12,13,14,15.

Historisk har flere metoder blitt brukt til å manipulere signalering i utviklingssammenhenger, noe som har ført til grunnleggende funn 1,2,3. Signalering kan blokkeres ved hjelp av mutanter med tap av funksjon, ektopisk inhibitoruttrykk eller antagonistmedikamenter. Metoder for å aktivere signalering inkluderer agonistmedikamenter, rekombinante ligander, ektopisk ekspresjon av ligander eller konstitutivt aktive reseptorer, og pathway inhibitor loss-of-function mutanter. Disse metodene spenner langs et kontinuum av eksperimentell kontroll. For eksempel kan mutanter og ektopisk uttrykk falle på sleggesiden av kontinuumet: Med disse tilnærmingene kan dramatiske, systemiske endringer i baneaktivitet forårsake tidlig død og utelukke undersøkelser på senere stadier, eller over tid kan det resultere i pleiotropiske effekter som er vanskelige å skille ut. I tillegg er det ofte utfordrende å uavhengig manipulere en signalfunksjon om gangen, for eksempel nivå eller varighet. Mot den andre enden av kontinuumet tilbyr noen metoder mer presis eksperimentell kontroll, for eksempel mikrofluidiske enheter som utsetter prøver for legemidler eller rekombinante proteiner med tidsmessig og noen ganger romlig kontroll 18,24,25, eller genetiske metoder, inkludert varmesjokkinduserbare og vevsspesifikke promotorer som kan tilby lignende fordeler16,26,27. Disse metodene kan imidlertid være vanskelige å utføre, kanskje ikke reversible, kan ha relativt langsom kinetikk eller dårlig oppløsning, og kan være utilgjengelige i enkelte modellsystemer.

Molekylære optogenetiske tilnærminger er et kraftig tillegg til denne verktøykassen. Disse tilnærmingene bruker proteiner som reagerer på forskjellige lysbølgelengder for å manipulere biologiske prosesser, inkludert signalering 8,12,13,14,15, og har blitt utviklet over flere tiår for bruk i en rekke systemer fra cellekultur til hele dyr 12,13,28. Sammenlignet med historiske tilnærminger kan molekylær optogenetikk ofte tilby en høyere grad av spatiotemporal kontroll over biologiske prosesser: Kontrolleren i optogenetiske systemer er lett, og kontroll av lysbølgelengde, intensitet, varighet og eksponeringsfrekvens er relativt enkel. Med sofistikerte systemer som konfokale og to-foton mikroskoper, er romlig kontroll i det subcellulære området mulig 29,30,31. Verktøy for å optogenetisk manipulere signalering har blitt utviklet og anvendt i flere systemer, inkludert de som er beskrevet i Johnson et al.22, Čapek et al.32, Krishnamurthy et al.33 og Huang et al.34. For eksempel, ved å utnytte den romlige kontrollen som optogenetikk gir, ble denne strategien nylig brukt til å modifisere en signalgradient i Drosophila-embryoer, noe som viser at flueembryogenese er overraskende robust mot endringer i denne gradienten22. Reversibiliteten og den raske av/på-kinetikken til optogenetiske signalaktivatorer har også gjort dem til attraktive verktøy for å undersøke dekoding av signaldynamikk 8,12,13,14,15,34,35,36.

Det tidlige sebrafiskembryoet er et in vivo-system som er godt egnet for optogenetiske studier fordi det er eksternt befruktet, gjennomsiktig, mikroskopivennlig og genetisk håndterbart. Lyseksponering er lettere å levere til embryoer som utvikler seg utenfor moren, lys kan trenge inn og få tilgang til deres ikke-ugjennomsiktige vev, levende sebrafiskembryoer tåler avbildning godt (i tillegg til å være gjennomsiktige), og eksisterende genetiske metoder gir enkle muligheter for knockdown og overuttrykkseksperimenter, i tillegg til utvikling av nyttig transgenikk 37.

Nylig ble det utviklet optogenetiske verktøy for å aktivere BMP38- og Nodal39-signalering i sebrafiskembryoer med eksponering for blått lys (figur 1). Vi omtaler disse verktøyene som bOpto-BMP og bOpto-Nodal (b for blått lys aktivert og Opto for optogenetisk). bOpto-BMP/Nodal er basert på lignende aktiveringsmekanismer. Bindingen av BMP eller Nodal-ligander til deres respektive reseptor-serin-treoninkinaser driver reseptorkinasedomeneinteraksjoner som fører til fosforylering av signaleffektorer (Smad1/5/9 for BMP og Smad2/3 for Nodal). Fosforylerte signaleffektorer translokerer deretter til kjernen og regulerer målgenuttrykk3 (figur 1A, D). Disse reseptorkinaseinteraksjonene kan gjøres lysresponsive ved å koble reseptorkinaser til lysresponsive dimeriserende proteiner: Ved lyseksponering bør disse kimære proteinene dimerisere, noe som får reseptorkinasedomenene til å interagere og aktivere signalering (figur 1B, C, E, F). Det er viktig å merke seg at i motsetning til endogene reseptorer inneholder bOpto-BMP/Nodal ikke ekstracellulære ligandbindende domener, noe som sikrer liganduavhengig aktivitet (figur 1C,F). Denne optogenetiske aktiveringsstrategien ble først oppnådd med reseptortyrosinkinaser40,41,42 og deretter anvendt på reseptorserin-treoninkinaser.

bOpto-BMP/Nodal bruker det blå lysresponsive (~450 nm) homodimeriserende lys-oksygen-spenningssensor-domenet (LOV) fra algen Vaucheria fridiga AUREO1 protein (VfLOV)43,44. Disse konstruksjonene består av et membranrettet myristoyleringsmotiv etterfulgt av enten BMP- eller nodalreseptorkinasedomener, smeltet sammen med et LOV-domene (figur 1B,E). Eksponering for blått lys bør forårsake LOV-homodimerisering, noe som resulterer i reseptorkinasedomeneinteraksjoner som fører til respektive Smad-fosforylering og baneaktivering (figur 1C,F). For bOpto-BMP ble en kombinasjon av konstruksjoner med type I-reseptorkinasedomenene fra Acvr1l (også kjent som Alk8) og BMPR1aa (også kjent som Alk3) og type II-reseptorkinasedomenet fra BMPR2a funnet å aktivere signalering38 optimalt (Addgene #207614, #207615 og #207616). For bOpto-Nodal brukes en kombinasjon av konstruksjoner med type I-reseptorkinasedomenet fra Acvr1ba og type II-reseptorkinasedomenet fra Acvr2ba39.

bOpto-BMP/Nodal har blitt introdusert i tidlige sebrafiskembryoer ved å injisere mRNA på encellestadiet, og brukes til å undersøke rollen til signalvarighet i Nodal tolkning39, for å avgjøre hvorfor sebrafisk mister evnen til å reagere på Nodal45, og for å undersøke hvordan BMP-målgener reagerer på forskjellige BMP-signalnivåer38. Det er sannsynlig at disse verktøyene vil fortsette å være nyttige i et mangfoldig utvalg av fremtidige undersøkelser. Styrken til optogenetiske signalaktivatorer er imidlertid også deres svakhet: lysfølsomme prøver må behandles med forsiktighet for å unngå utilsiktet ektopisk signalaktivitet. Eksponering for romlys eller sollys kan aktivere bOpto-BMP/Nodal.

Denne protokollen gir praktiske forslag til bruk av mRNA-kodede LOV-baserte BMP- og Nodal-aktivatorer i tidlige sebrafiskembryoer. Den begynner med å detaljere en strategi for å bygge en lysboks for å kontrollere jevn lyseksponering og temperatur (figur 2, tilleggsfil 1, tilleggsfil 2, tilleggsfil 3, tilleggsfil 4, tilleggsfil 5, tilleggsfil 6, tilleggsfil 7, tilleggsfil 8). Den beskriver deretter to viktige kontrolleksperimenter som bestemmer om en optogenetisk signalaktivator oppfører seg som forventet, dvs. aktiverer baneaktivitet bare når den utsettes for lys (figur 3). Den første kontrollanalysen innebærer å undersøke fenotyper en dag etter befruktning i lyseksponerte og ueksponerte embryoer (figur 3A). mRNA-injiserte lyseksponerte embryoer, men ikke ueksponerte embryoer, bør fenokopi BMP eller nodal overekspresjon (figur 4A,B; Spesielt BMP-fenotyper kan tydelig skilles på dette tidspunktetpunkt 46). Denne analysen gir en rask aktivitetsavlesning. I den andre kontrollanalysen, for å avgjøre om fenotyper er forårsaket spesifikt av overflødig BMP- eller Nodal-signalering og for direkte å observere endringen i signalnivåer, brukes immunfluorescensfarging til å oppdage fosforylerte signaleffektorer (henholdsvis pSmad1/5/9 eller pSmad2/3) etter en 20 min lyseksponering rundt sen blastula / tidlig gastrulasjonsstadium, når signalaktiviteten er godt beskrevet12, 16,17,47,48,49,50 (figur 3B og figur 4C). (Merk at selv om romlig lokalisert aktivering er demonstrert for både bOpto-BMP38 og bOpto-Nodal39, beskriver denne protokollen bare ensartet lyseksponering og signalaktiveringsstrategier.) Det anbefales å utføre disse kontrolleksperimentene før bOpto-BMP/Nodal brukes på spesifikke forskningsspørsmål for å bestemme ideelle lokale eksperimentelle forhold.

Protocol

Sebrafiskforskningsprotokoller ble gjennomgått og godkjent av NICHD Animal Care and Use Committee ved National Institutes of Health (ASP 21-008). Alle sebrafiskstudier ble utført i samsvar med veilederen for stell og bruk av forsøksdyr.

1. Bygge en lysboks

  1. For å kontrollere lyseksponering og temperatur, konstruer en lysboks som bruker en lysdiode (LED) mikroplatebelysning som lyskilde (figur 2A, materialfortegnelse, tilleggsfil 1, tilleggsfil 2). Denne tilpassbare belysningen gir dynamisk, programmerbar kontroll over flere bølgelengder.
    MERK: Det er mange mulige strategier for å bygge en lysboks, og en alternativ tilnærming kan være mer hensiktsmessig (se f.eks. Gerhardt et al.51, Bugaj et al.52, Kumar og Khammash 53, og mer på https://www.optobase.org/materials/).
  2. Inkluder følgende funksjoner i lysboksen: Temperaturkontroll (28 °C er ideelt for sebrafiskembryoer), utelukkelse av uønsket lys (f.eks. romlys og sollys), jevn levering av blått lys som dekker målområdet (f.eks. 6-brønnsplate) og kontroll over lysintensitet og eksponeringsdynamikk.
    MERK: bOpto-BMP/Nodal aktiveres av blått lys, men noen optogenetiske verktøy reagerer på andre bølgelengder. Bruk riktig bølgelengde for det optogenetiske verktøyet.
  3. Bor et hull gjennom toppen av en inkubator (figur 2B) som er litt bredere enn LED-utgangslinsen.
    1. Forsikre deg om at det ikke er noen elektriske komponenter i toppen av inkubatoren som vil bli ødelagt ved boring (materialfortegnelse). Dette kan fastslås ved å kontakte inkubatorprodusenten og spørre direkte.
    2. Hvis det er et eksisterende hull på inkubatorens topppanel, bruk en trinnbor for å øke hullstørrelsen til 1,25 tommer. Bruk ellers en 1,25 tommers hullsag med arbor.
    3. Hvis det er innvendige paneler som blokkerer lyskilden, bor du riktig hullstørrelse for å sikre at lyskjeglen ikke er blokkert (figur 2A). Paneler er vanligvis laget av tynne metallplater, så bruk lave hastigheter og metallbor for å forhindre skade (koboltborkrone anbefales).
  4. Konstruer en LED-holder for å feste LED-mikroplatebelysningen til toppen av inkubatoren (figur 2C, tilleggsfil 3, tilleggsfil 4, tilleggsfil 5, tilleggsfil 6, tilleggsfil 7, tilleggsfil 8).
    1. Monter fire M3 kube standoffs til det vertikale brakettstykket ved hjelp av M3 skruer.
    2. Fest de to sidebrakettene til venstre og høyre for kubestandene til den vertikale braketten. Monter en annen kube standoff til venstre hull på sidebrakettene.
    3. Monter det vertikale brakettstykket på LED-mikroplatebelysningsenhet (materialfortegnelse) ved hjelp av M6-skruer. Plasser LED-linsepakningen over LED-systemlinsen.
    4. Monter de monterte delene på inkubatorpanelmonteringen, deretter til M3-standoffene på vertikale og sidebraketter. Plasser inkubatorpakningen over det borede hullet på toppen av inkubatoren.
    5. Plasser inkubatorpanelfestet på toppen av inkubatorpakningen, slik at pakningen og panelåpningene er konsentriske med inkubatorens hull. Monter panel til inkubator topp ved hjelp av nr. 8 skruer. Forsikre deg om at denne forseglingen er lett.
  5. Plasser en 6-brønns plate på øverste hylle av inkubatoren. Bestem om lysstrålen dekker platen jevnt (figur 2A). Bruk et ark for å visualisere lysdekning.
  6. Hvis hele platen ikke er dekket av strålen, øker du avstanden mellom LED-lampen og platen ved å flytte hyllen ned. For systemet som er beskrevet her, er ~ 14 tommer mellom LED og hylle tilstrekkelig.
  7. Bruk en lysmåler for å bestemme strålingsnivået og romlig ensartethet (materialfortegnelse).
  8. For å unngå utilsiktet sollys og romlyseksponering, bruk værstripping for å sikre at inkubatordøren er lystett (figur 2A).
  9. Sebrafiskembryoer utvikler seg robust ved 28 °C54. Bruk et minnekorttermometer for å sikre at lysboksen holder 28 °C.

2. Generere mRNA til injeksjon

MERK: pCS2+ er vektorryggraden for bOpto-BMP-konstruksjoner38 og bOpto-Nodal-konstruksjoner39. Denne vektoren er ampicillinresistent. bOpto-BMP består av tre konstruksjoner (figur 1B): BMPR1aa-LOV (Addgene # 207614): Antatt kinasedomene av type I BMPR1aa-reseptor (også kjent som Alk3) smeltet sammen med LOV; Acvr1l-LOV (Addgene # 207615): Antatt kinasedomene av type I Acvr1l-reseptor (også kjent som Alk8) smeltet sammen med LOV; og BMPR2a-LOV (Addgene # 207616): Antatt kinasedomene av type II BMPR2a-reseptor og følgende C-terminal domene smeltet sammen med LOV. bOpto-Nodal består av to konstruksjoner (figur 1E): Acvr1ba-LOV: Antatt kinasedomene av type I Acvr1ba-reseptor (også kjent som Acvr1b) smeltet sammen med LOV; Acvr2ba-LOV: Antatt kinasedomene av type II Acvr2ba-reseptor (også kjent som Acvr2b) smeltet sammen med LOV.

  1. For å linearisere plasmider, fordøye mellom 2-5 μg plasmid-DNA ved bruk av NotI-restriksjonsenzym ved 37 °C i 1-3 timer (materialfortegnelse).
    MERK: Det er også mulig å generere linearisert DNA ved hjelp av plasmidet som PCR-mal.
  2. Rens DNA ved hjelp av et standard kolonnebasert rensesett (materialfortegnelse).
  3. Bruk et in vitro SP6-transkripsjonssett, for eksempel et mMessage mMachine-sett, for å transkribere RNA fra den lineariserte malen (materialfortegnelse). Sett opp to reaksjoner i henhold til produsentens anbefalinger for å sikre høyere utbytte.
  4. Rens RNA ved hjelp av et standard kolonnebasert RNA-oppryddingssett (materialfortegnelse). Det er også mulig å rense via nedbør.

3. Injisere mRNA

  1. Minst 1 dag før injeksjoner, lage injeksjonsfat og agarosebelagte 6-brønnsplater.
    1. Tilbered 200 ml 1% agarose i sebrafiskembryomedium og mikrobølgeovn til agarosen er fullstendig oppløst. Ethvert standard sebrafiskembryomedium bør være akseptabelt; Ekskluder imidlertid metylenblått fra embryomediet, da det kan påvirke nedstrøms avbildning i andre applikasjoner.
    2. Hell forsiktig smeltet agarose i 100 mm x 15 mm plastpetriskåler. Fyll oppvasken halvveis.
    3. Skyll en injeksjonsfatform med embryomedium og legg forsiktig på smeltet agarose, slik at ingen bobler fanges mellom formen og agarose. Bruk tape til å lage en fane på baksiden av formen for enkel plassering og gjenfinning.
    4. Formen skal flyte i smeltet agarose. Hvis formen synker, fjern forsiktig fra den smeltede agarose og gjenta trinn 3.1.3.
    5. Etter at agarose har størknet, bruk tappen til å fjerne formen forsiktig. Dette kan fremskyndes ved å sette fatet på 4 °C.
    6. Lag agarosebelagte 6-brønnsplater hvis du arbeider med dekorionerte embryoer for immunfluorescenseksperimenter.
    7. Bruk en engangs 10 ml plastpipette for å overføre nok smeltet agarose til å dekke bunnen av hver brønn på en 6-brønnsplate.
    8. Oppbevar injeksjonsfat og 6-brønns tallerkener ved 4 °C. De kan brukes umiddelbart eller lagres til agarose er tørket ut eller forurenset (vanligvis 2-3 uker).
    9. Forbered flammede glasspipettespisser hvis du arbeider med dekorionerte embryoer for immunfluorescenseksperimenter.
    10. Sett enden av en glasspipette inn i en Bunsen-brennerflamme og roter kontinuerlig til kantene er glatte. Dekorionerte embryoer må passe komfortabelt gjennom pipettens ende. Ikke la åpningen krympe under diameteren til et embryo.
    11. Enten kjøpe eller trekke mikroinjeksjon nåler (Table of Materials). Det anbefales å ha ekstra kanyler tilgjengelig på injeksjonsdagen i tilfelle en erstatning er nødvendig.
  2. Dagen før injeksjoner, sett opp sebrafiskoppdrettere i henhold til instituttets standard operasjonsprosedyrer (SOP). Hold menn og kvinner atskilt.
    1. Slå på lysboksens temperaturregulator for å opprettholde 28 °C. For å sikre at lysbokstemperaturen holder seg på 28 °C, må du overvåke temperaturen ved hjelp av et minnekorttermometer (materialfortegnelse).
    2. Forbered mRNA-injeksjonsblanding(er). Injiser ekvimolære mengder av hver konstruksjon. Det er nødvendig å empirisk bestemme hvilken mengde som skal injiseres.
    3. bOpto-BMP transkripsjonsstørrelser er som følger:
      Acvr1l-LOV = 2007 nukleotider (nt)
      BMPR1aa-LOV = 1983 nt
      BMPR2a-LOV = 3409 nt
    4. For å injisere ekvimolare mengder, injiser 1,01x mer av Acvr1l-konstruksjonen enn BMPR1aa; injiser 1,72 ganger mer av BMPR2a-konstruksjonen enn BMPR1aa.
    5. bOpto-Nodal transkriptstørrelser er som følger:
      Acvr1ba-LOV og Acvr2ba-LOV er begge 1962 nt.
    6. For å injisere ekvimolære mengder, injiser samme mengde av hver konstruksjon.
    7. Forbered ekvimolære injeksjonsblandinger, kombiner alle mRNA rettet mot en vei i en injeksjonsblanding. Inkluder fenolrød injeksjonssporer hvis ønskelig. For dataene vist i figur 4 ble det brukt 15 pg av hver bOpto-Nodal-konstruksjon (Acvr1ba-LOV og Acvr2ba-LOV), og for bOpto-BMP ble det brukt 7,8 pg Acvr1l-LOV og BMPR1aa-LOV, og 13,4 pg BMPR2a-LOV.
    8. Oppbevar injeksjonsblandinger ved -20 °C. Når den optimale konsentrasjonen av injeksjonsblandingen er bestemt, lages 5-10 μl alikoter og oppbevares ved -20 °C eller -80 °C.
  3. Injeksjon dag
    1. Hvis du utfører en fenotypingsanalyse (figur 3A), injiser gjennom korionen direkte inn i midten av cellen på encellestadiet i henhold til laboratoriets SOP. Korionen beskytter embryoer mot miljømessige stressfaktorer og holder lyserte embryoer inneholdt. Dette er nyttig under skåring for nøyaktig kvantifisering av lyserte embryoer (figur 4A,B).
    2. Hvis du utfører en immunfluorescensanalyse (figur 3B), må embryoer til slutt dekoreres for avbildning (figur 4C). Injiser derfor direkte inn i midten av cellen av dekorionerte embryoer på encellestadiet (se Rogers et al.55 for dehorionerende protokoll). Alternativt kan embryoer dehorioneres manuelt etter fiksering, men dette er mer tungvint enn dekorionering med pronase.
    3. Bruk flammede glasspipetter til å håndtere dekorionerte embryoer (trinn 3.1.10). Pass på at du ikke utsetter dekorerte embryoer for luft eller plast, noe som vil føre til at embryoer lyses. Håndter dehorionerte embryoer forsiktig.
    4. Forbered en ekstra tallerken med ikke-injiserte embryoer som en proxy for å evaluere stadieprogresjon (se trinn 4.3.5). Sørg for at proxy-embryoer er fra samme sett med eksperimentelle embryoer, slik at alle embryoer ble befruktet samtidig fra de samme foreldrene. Dette er nyttig for immunfluorescensanalysen der stadium er relevant, men er unødvendig for fenotypingsanalysen.
    5. Bruk følgende betingelser for både fenotyping og immunfluorescensanalyse: 1) ikke-injisert, ueksponert, 2) ikke-injisert, utsatt for lys, 3) injisert, ueksponert, 4) injisert, utsatt for lys. Velg minst 30 embryoer per tilstand. For optimal embryohelse, ikke inkuber mer enn 30 embryoer per brønn i en 6-brønnsplate.
    6. Etter injeksjon, overfør embryoer til merkede petriskåler eller agarosebelagte 6-brønnsplater (for dekorionerte embryoer) og inkuber ved 28 °C. Embryoer er ennå ikke lysfølsomme. Behandle injiserte embryoer som om de er lysfølsomme etter 1,5 timer etter befruktning (hpf).

4. Eksperiment med lyseksponering

MERK: Eksponering for ~450 nm lys med en utstråling på 45 W/m2 aktiverer bOpto-BMP/Nodal robust uten åpenbar fototoksisitet (for lysmålerinformasjon, se Materialfortegnelse). Nivået av optogenetisk aktivert signalering kan justeres ved å endre strålingsverdier38. Fototoksisitet må imidlertid vurderes ved høyere bestrålinger.

  1. Tidsfølsomt trinn. På 4- til 16-cellestadiet, rundt 1,5 hpf, fjern ubefruktede og usunne embryoer. Omfordel, om nødvendig, for å sikre samme antall embryoer i hver brønn (ikke mer enn 30).
    MERK: Det er viktig å utføre dette trinnet rundt 4- til 16-cellestadiet fordi embryoer blir lysfølsomme når det injiserte mRNA blir oversatt til protein. Vi har ikke observert bevis for at embryoer er signifikant lysfølsomme før 1,5 hpf. For å minimere utilsiktet fotoaktivering hvis du vurderer embryoer etter 1,5 hpf, bruk røde lys, eller dekk lyskilder - inkludert mikroskoptrinn - med rødt gelfilterpapir som blokkerer LOV-dimeriserende blå bølgelengder (materialfortegnelse).
    1. Evaluer embryoer konsekvent for å sikre objektiv fordeling mellom forhold og eksperimenter.
  2. For fenotypingsanalysen, bruk følgende 1-dagers lyseksponeringsprotokoll som starter på 1,5 hpf (figur 3A).
    1. Pakk den ueksponerte kontrollplaten inn i aluminiumsfolie. Denne platen skal inneholde både ikke-injiserte og injiserte embryoer. Pass på at tallerkenen er helt dekket og pass på at du ikke introduserer tårer i folien. Plasser denne platen på den nederste hyllen i lysboksen på 28 °C (figur 2A).
    2. Plasser den synlige platen på øverste hylle i lysboksen på 28 °C (figur 2A). Forsikre deg om at dekselet er på fatet for å unngå fordampning av embryomedium. Slå på det blå lyset (en utstråling på 45 W/m2 aktiverer signalering robust).
    3. Lukk lysboksdøren for å unngå utilsiktet lyseksponering i rommet. Hvis ønskelig, ta med et minnekorttermometer inne i lysboksen før du lukker døren. Ikke åpne døren før fenotypeskåring ved 1 dag etter fertilisering (dpf; se trinn 5.1).
  3. For immunfluorescensanalysen, utsett embryoer for blått lys i 20 minutter med start rundt 40 % epiboly56 (~6 hpf) og fikser umiddelbart etter lyseksponering, sammen med de ueksponerte kontrollene (figur 3B). En eksponering på 20 minutter blått lys ved 40 % reproduserbar reproduserbar aktivering av signalering.
    1. Rundt 1,5 hpf, pakk separat både eksponerte og ueksponerte retter i aluminiumsfolie. Pass på at oppvasken er helt dekket og pass på at du ikke introduserer tårer i folien. La proxy-parabolen være pakket ut. Legg de innpakkede tallerkenene og den uinnpakkede tallerkenen i den 28 °C lette boksen (figur 2A). Ikke slå på LED-lampen ennå.
    2. Hvis du tester mer enn en mRNA-mengde, for den ueksponerte tilstanden, sorter embryoer injisert med forskjellige mengder i individuelle agarosebelagte 6-brønnsplater, noe som vil bidra til å minimere utilsiktet lyseksponering under påfølgende fiksering.
    3. Lukk lysboksdøren for å unngå utilsiktet lyseksponering i rommet.
    4. Fortynn formaldehydlager til 4 % i 1x fosfatbufret saltvann (PBS) og alikot 1 ml i forhåndsmerkede 2 ml mikrosentrifugerør med rund bunn, ett rør per tilstand. Oppbevares ved 4 °C.
    5. Rundt 5 hpf, fjern proxy-parabolen som inneholder ikke-injiserte embryoer og vurder utviklingsstadiet ved hjelp av et dissekeringsomfang. Stadiet av proxy-embryoene skal gjenspeile scenen til de lysfølsomme embryoene i de innpakkede tallerkenene.
    6. Fjern de innpakkede tallerkenene også, slik at alle rettene opplever samme temperatur. Gjenta til proxy-embryoer har nådd 40% epiboly (~6 hpf). Embryogeneseprogresjon er temperaturfølsom54; Derfor, jo lenger oppvasken er utenfor inkubatoren, desto lengre tid vil det ta for embryoene å nå 40% epiboly.
    7. Når proxy-embryoene har nådd 40% epiboly, pakk ut den eksponerte tallerkenen og legg den på den øverste hyllen i lysboksen (figur 2A). La de ueksponerte tallerkenene være pakket inn og sett på den nedre hyllen. Slå umiddelbart på det blå lyset, lukk døren og still inn en tidtaker i 20 minutter (en utstråling på 45 W/m2 aktiverer signalering robust).
    8. For å forberede seg på fiksering, fjern så mye romlys som mulig (lukk persienner, slå av overlysene, slå av skjermer, etc.). Forsikre deg om at de formaldehydholdige rørene er riktig merket. Umiddelbart før fiksering, fjern formaldehydholdige rør fra 4 °C og plasser ved siden av lysboksen.
    9. Tids- og lysfølsomt trinn. Vær forberedt på å bevege deg raskt på slutten av 20 min lyseksponering. Etter 20 minutter åpner du lysboksdøren og fjerner den ueksponerte tallerkenen.
    10. Bruk en pipettespiss av flammet glass til å overføre lysfølsomme embryoer raskt, men skånsomt inn i det tilberedte tilsvarende røret med 4 % formaldehyd.
    11. Minimer overføringstiden (<45 s) til lysfølsomme embryoer for å unngå utilsiktet lyseksponering. Forsikre deg om at det ikke er luftbobler i pipetten. Lufteksponering vil ødelegge dehorionerte embryoer.
    12. For å kaste ut embryoer i formaldehyd, senk glasspipettespissen i formaldehydet og la embryoene synke ned i væsken. Minimer mengden embryomedium som overføres til formaldehydet ved å holde embryoene på slutten av spissen.
    13. Etter at embryoer er overført, returner pipetten til samme brønn og pipett opp og ned for å løsne eventuelle fastlåste embryoer. Dette forhindrer at embryoer fra flere forhold ved et uhell ender opp i ett rør.
    14. Gjenta umiddelbart trinn 4.3.11-4.3.13 for de ueksponerte, ikke-injiserte embryoene, etterfulgt av de eksponerte embryoene (injisert og ikke-injisert).
    15. Oppbevar faste embryoer ved 4 °C over natten.

5. Evaluering av eksperiment

  1. Fenotypeskåring og avbildning
    1. Ved 1 dpf, ideelt mellom 24-32 hpf, fjern embryoer fra lysboksen for å vurdere fenotyper ved hjelp av et dissekeringsomfang og lag en scoringsrubrikke. Dette er det eksperimentelle endepunktet; Utilsiktet fotoaktivering er ikke lenger et problem.
    2. Score embryoer mens du fortsatt er i korionen for enkelhets skyld. Bruk en pipette eller sonde for å flytte embryoer for å se fra flere vinkler.
      1. Embryoer som opplever overflødig BMP-signalering vil bli ventralisert med varierende grad av alvorlighetsgrad som beskrevet i detalj i Kishimoto et al. 199746 (figur 4A, venstre panel). Embryoer som opplever overflødig nodal signalering vil ha en rekke utviklingsdefekter relatert til overflødig mesendoderm (figur 4A, høyre panel) 1,3,47,57,58,59,60. De vil ofte ha lysert med 1 dpf.
    3. Skår hvert embryo under alle forhold (figur 4B). Få et oversiktsbilde over alle embryoer i hver brønn. Om ønskelig, dekorionat og bilde individuelle representative embryoer i metylcellulose (figur 4A).
  2. Immunfluorescensfarging og avbildning
    1. Etter å ha inkubert embryoer i 4% formaldehyd ved 4 °C over natten, fjern formaldehyd og vask 3-5x med 1x fosfatbufret saltvann med Tween20 (PBST). Fjern PBST og tilsett 100% metanol.
    2. Lukk rørene og snu dem forsiktig for å blande gjenværende PBST og metanol. Vask 2x med metanol og oppbevar ved -20 °C i minst 2 timer opp til år.
    3. For pSmad1/5/9 (BMP) immunfluorescensprotokoll, se Rogers et al.38. For pSmad2/3 (Nodal) immunfluorescensprotokoll, se van Boxtel et al.17 og Rogers et al.47.
    4. Bilde immunostained embryoer, ved hjelp av et mikroskop i stand til optisk seksjonering (f.eks en konfokal eller lys ark mikroskop). Unngå metning og oppretthold identiske bildeforhold mellom alle prøver farget med samme antistoff.
    5. Bilde innen 5 dager etter fullført immunfluorescensfarging fordi fluorescens kan falme over tid.

Representative Results

Målet med de to kontrolleksperimentene som er beskrevet her, er å avgjøre om bOpto-BMP/Nodal aktiverer sine respektive veier som respons på eksponering for blått lys uten å påvirke signaleringen i fravær av lys, som forventet. Bruk disse kontrollene til å etablere riktig eksperimentell arbeidsflyt i laboratoriet ditt før du bruker bOpto-BMP/Nodal på dine forskningsspørsmål av interesse.

Fenotypingsanalysen kan fullføres på bare 2 dager og gir en nyttig indikasjon på signalaktivitet og fototoksisitet (figur 3A). Injiserte, blålyseksponerte embryoer bør fenokopi av overflødig BMP-signalering (ventralisering46; Figur 4A, venstre panel) eller Nodal signalering (utviklingsdefekter relatert til ekstra mesendoderm 1,3,47,57,58,59,60 (figur 4A, høyre panel)). Hvis de injiseres, er lyseksponerte embryoer fenotiopiske, test kvaliteten på mRNA og vurder å injisere mer, og dobbeltsjekk lyseksponeringsstrategien for å sikre konstant eksponering for sterkt lys (~ 450 nm lys med en bestråling på 45 W / m2 bør sterkt aktivere signalering). I motsetning til dette bør injiserte, ueksponerte embryoer se identiske ut som ikke-injiserte søsken. Hvis injiserte, ueksponerte embryoer viser fenotyper, reduser mengden mRNA injisert og revurder det eksperimentelle oppsettet for å sikre at ueksponerte embryoer er beskyttet mot lyseksponering. Dataene vist i figur 4B viser resultatene fra typiske fenotypingseksperimenter med passende mRNA-mengder og eksponeringsforhold: sterk signaleringsaktivitet er tydelig i injiserte, lyseksponerte embryoer, med bare en liten brøkdel av injiserte, ueksponerte embryoer som viser fenotyper.

Fenotypingsanalysen gir også mulighet til å vurdere fototoksisitet. Hvis fototoksisiteten er ubetydelig, bør ikke-injiserte, lyseksponerte embryoer vises villtype, lik ikke-injiserte, ueksponerte embryoer. Hvis ikke-injiserte, lyseksponerte embryoer har defekter, men ikke ikke-injiserte, ueksponerte embryoer, bør du vurdere å redusere lysinnstrålingen. En stråling på 45 W/m2 aktiverer signalering robust uten åpenbar fototoksisitet. Dataene vist i figur 4B viser ingen bekymringsfulle forskjeller mellom ikke-injiserte, lyseksponerte og ikke-injiserte, ueksponerte embryoer, noe som indikerer ubetydelig fototoksisitet.

Selv om immunfluorescensanalysene krever mer tid og krefter (~1 uke) sammenlignet med fenotypingsanalysen (2 dager), gir immunfluorescensfarging en direkte avlesning av signalveisaktivitet og kan avsløre subtile signalendringer som kanskje ikke reflekteres av brutto morfologi. Immunfluorescens er spesielt viktig for å vurdere respons på bOpto-Nodal, fordi overflødig nodal signalering ofte resulterer i at embryoer lyser med 1 dpf - som kan ha mange årsaker - i motsetning til de spesifikke ventraliseringsfenotypene som er karakteristiske for overflødig BMP-signalering46 (figur 4A). Injiserte, blålyseksponerte embryoer bør vise en jevn økning i Smad1/5/9 eller Smad2/3 fosforylering sammenlignet med ikke-injiserte, lyseksponerte embryoer. Hvis nivåene ikke økes, eller bare økes svakt, test kvaliteten på mRNA og vurder å injisere mer, og dobbeltsjekk lyseksponeringsstrategien. En eksponering på 20 minutter for blått lys med en strålingsstråling på 45 W/m2 rundt 40 % bør aktivere signaleringen sterkt. Hvis pSmad-farging er ujevn, kan du prøve å injisere mRNA i midten av cellen (i stedet for eggeplommen), noe som kan resultere i mer jevn mRNA-fordeling.

Injiserte, ueksponerte embryoer bør ha pSmad-nivåer som kan sammenlignes med ikke-injiserte embryoer. Anekdotisk har vi observert lekkerere Smad-fosforylering med bOpto-Nodal enn bOpto-BMP. Hvis pSmad-nivåene økes i injiserte, ueksponerte embryoer, reduser mengden mRNA injisert. I tillegg må du revurdere det eksperimentelle oppsettet for å sikre at 1) ueksponerte embryoer ikke utilsiktet blir utsatt for lys, og 2) lyseksponering under fiksering er minimal. Under fikseringstrinnet er det viktig å la det ikke gå mer enn 45 s mellom fjerning fra lysboksen og nedsenking i formaldehyd. I tillegg minimerer du eksponeringen for romlys og sollys i løpet av dette trinnet ved å lukke persienner, slå av hvite lyskilder, bruke røde lys eller dekke hvite lyskilder med blått lysblokkerende gelfilterpapir (materialfortegnelse).

Dataene i figur 4C viser resultatene fra typiske immunfluorescensfargeeksperimenter med passende mRNA-mengder og lyseksponeringsforhold: pSmad-nivåer er like i ikke-injiserte og ueksponerte embryoer, mens injiserte, lyseksponerte embryoer utviser høyere nivåer av Smad-fosforylering.

Figure 1
Figur 1: bOpto-BMP og -Nodal signaleringsaktiveringsstrategi . (A) Den endogene BMP-signalveien aktiveres ved BMP-ligandbinding, noe som fører til dannelse av et type I / II-reseptorkompleks, fosforylering av Smad1/5/9 og ekspresjon av BMP-målgener. Type I-reseptorene BMPR1aa og Acvr1l er også kjent som henholdsvis Alk3 og Alk8. BMPR2a er en type II-reseptor. (B) bOpto-BMP konstruerer38. Antatte kinasedomener fra BMPR1aa og Acvr1l er smeltet sammen med LOV; BMPR2a-LOV-fusjonen inneholder det antatte kinasedomenet og reseptor C-terminale domenet (CTD). Alle fusjoner er membranmålrettet med et myristoyleringsmotiv (Myr). Domener er atskilt med glycin-serin (GS) linkere. Konstruksjoner er merket på CTD med en HA-epitopkode. Denne kombinasjonen av tre konstruksjoner ble funnet å aktivere BMP-signalering optimalt. (C) bOpto-BMP-mediert BMP-signalaktivering. Når de utsettes for blått lys, dimeriserer LOV-domener, noe som antas å utløse kompleks dannelse og signalaktivering. (D) Den endogene nodale signalveien aktiveres ved nodal ligandbinding, noe som fører til dannelse av et type I / II-reseptorkompleks, fosforylering av Smad2/3 og ekspresjon av nodale målgener. Type I-reseptoren Acvr1ba og type II-reseptoren Acvr2ba er også kjent som henholdsvis Acvr1b og Acvr2b. (E) bOpto-Nodal konstruksjoner39. Antatte kinasedomener fra Acvr1ba og Acvr2ba smeltes sammen med LOV. Alle fusjoner er membranmålrettet med et myristoyleringsmotiv (Myr). Domener er atskilt med GS-linkere. Konstruksjoner er merket på CTD med en HA-epitopkode. (F) bOpto-Nodal-mediert Nodal signaleringsaktivering. Når de utsettes for blått lys, dimeriserer LOV-domener, noe som antas å utløse kompleks dannelse og signalaktivering. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Temperaturkontrollert lysboks for optogenetiske eksperimenter . (A) En LED-mikroplatebelysning er montert på toppen av en inkubator ved hjelp av en spesialbygd LED-holder. Sebrafiskembryoer i en 6-brønnsplate på første hylle blir utsatt for lys gjennom et hull boret inn i toppen av inkubatoren. Den nedre hyllen inneholder et andre sett med ueksponerte kontrollembryoer i en aluminiumsfolieinnpakket 6-brønnsplate. Inkubatordøren er foret med værstripping for å forhindre utilsiktet eksponering for romlys eller sollys. (B) Detalj av prosedyren for å lage et hull i inkubatoren ved hjelp av en trinnbor. Inkubatormodellen som brukes her har et internt panel som krevde boring av et annet, større hull (materialfortegnelse). (C) Detalj av den tilpassede LED-holderen designet for et belysningssystem med tre bølgelengder. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: bOpto-BMP/Nodal eksperimentarbeidsflyt. Fenotypeanalyse og pSmad immunfluorescensfarging for å teste aktivitet av bOpto-BMP/Nodal. Embryoer injiseres med mRNA på encellestadiet og overføres til en lysboks senest 1,5 time etter befruktning (hpf). (A) Fenotypeanalyse. Injiserte embryoer og ikke-injiserte søsken blir oppdrettet i mørket eller utsatt for ensartet blått lys som starter ved 1,5 hpf til 1 dag etter befruktning (dpf). Optogenetisk signaleringsaktivitet kan evalueres ved å skåre embryoer for fenotyper i samsvar med overflødig baneaktivitet. (B) pSmad immunfluorescensfarging. Injiserte embryoer og ikke-injiserte søsken blir oppdrettet i mørket til 40% epiboly (~ 6 hpf). Halvparten av de injiserte og halvparten av de ikke-injiserte embryoene blir deretter utsatt for jevnt blått lys i 20 minutter. Etter eksponering blir alle embryoer fiksert og utsatt for immunfluorescensfarging for pSmad. Forhøyede nivåer av pSmad1/5/9 eller pSmad2/3 reflekterer optogenetisk aktivering av henholdsvis BMP eller Nodal signalering. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Vurdering av lysaktiverte signalresponser i sebrafiskembryoer. Sebrafiskembryoer ble injisert på encellestadiet med mRNA-koding bOpto-BMP/Nodal. (A) Embryoer ble enten oppdrettet i mørket eller utsatt for ensartet blått lys fra 1,5 timer etter befruktning (hpf). Fenotyper ble skåret på 1 dag etter befruktning (dpf). Representative fenotyper vises. Overflødig BMP-signalering fører til ventralisering (venstre panel), mens overflødig nodal signalering forårsaker utviklingsdefekter forbundet med ekstra mesendoderm (høyre panel). Skala bar = 500 μm. (B) Fenotype kvantifisering. Injiserte embryoer og ikke-injiserte søsken ble oppdrettet i mørket fra 1,5 hpf (svart pære). Halvparten av de injiserte og halvparten av de ikke-injiserte embryoene ble utsatt for ensartet blått lys (blå pære). (C) Injiserte embryoer og ikke-injiserte søsken ble oppdrettet i mørket fra 1,5 hpf (svart pære). Ved 40% epiboly (~ 6 hpf) ble halvparten av de injiserte og halvparten av de ikke-injiserte embryoene utsatt for ensartet blått lys (blå pære). Etter 20 minutter ble alle embryoer fiksert og utsatt for immunfluorescensfarging for enten fosforylert Smad1/5/9 eller Smad2/3. Høyere pSmad-intensiteter indikerer økt BMP/Nodal signalering, henholdsvis. Skala bar = 200 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tilleggsfil 1: Lysboks full montering. 3D PDF-fil som viser en 3D-visning av samlingen av hele lysboksen. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfil 2: Visning av lysboks i oppløste deler. 3D PDF-fil som viser en 3D-visning av samlingen av bokser i oppløste deler. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfil 3: Stor lyspakning. CAD-tegningsfil (. DWG-format) for å fremstille den store lyspakningen til LED-holderen ved hjelp av en laserkutter. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfil 4: Liten lyspakning. CAD-tegningsfil (. DWG-format) for å fremstille den lille lyspakningen til LED-holderen ved hjelp av en laserkutter. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfil 5: Akryl plattformbase. CAD-tegningsfil (. DWG-format) for å fremstille LED-holderens akrylplattformbase ved hjelp av en laserkutter. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfil 6: Akrylplattformvertikal. CAD-tegningsfil (. DWG-format) for å fremstille LED-holderens akrylplattform vertikalt ved hjelp av en laserkutter. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfil 7: Akrylstøtte igjen. CAD-tegningsfil (. DWG-format) for å fremstille LED-holderen akryl venstre støtte ved hjelp av en laserkutter. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfil 8: Akrylstøtterett. CAD-tegningsfil (. DWG-format) for å fremstille LED-holderens akrylhøyre støtte ved hjelp av en laserkutter. Klikk her for å laste ned denne filen.

Discussion

Injeksjon av mRNA er den nåværende strategien for å levere bOpto-BMP/Nodal til sebrafiskembryoer. Denne metoden har flere ulemper. For det første varierer riktig mengde mRNA mellom laboratorier. Mengden som brukes skal være tilstrekkelig til å aktivere signalering robust med lyseksponering, men uten utilsiktet mørk aktivering. Det er en god ide å teste flere mengder for å finne optimale mRNA-nivåer, og når de er etablert, lage alikoter av en masterblanding for reproduserbart å introdusere samme mengde mRNA. For det andre kan ujevn fordeling av injisert mRNA føre til ujevn signalaktivering. Injisering i midten av cellen (ikke eggeplommen) antas å fremme jevn mRNA-distribusjon. Til slutt, fordi injisert mRNA nedbrytes over tid, kan denne tilnærmingen ikke være egnet for eksperimenter i eldre embryoer. I fremtiden kan disse problemene løses ved at transgene sebrafisklinjer allestedsnærværende uttrykker bOpto-BMP/Nodal med en maternell eller medikamentinduserbar promotor. Selv om arbeid med potensielt lysfølsomme voksne sebrafisk kan være en utfordring i denne sammenhengen, har sebrafisk 61,62 og Drosophila 22,34,35,63 transgene som inneholder optogenetiske verktøy blitt utviklet.

Å unngå utilsiktet fotoaktivering er en generell utfordring med optogenetiske verktøy. For enkelhets skyld, behandle injiserte embryoer eldre enn 1,5 hpf som lysfølsomme. Utilsiktet lyseksponering kan ofte unngås ved ganske enkelt å pakke inn tallerkener eller tallerkener med aluminiumsfolie. For eksperimenter som krever visuell observasjon av levende embryoer eldre enn 1,5 hpf, er det imidlertid mulig å bruke røde lyskilder eller å dekke hvite lyskilder med billig gelfilterpapir som blokkerer LOV-dimeriserende bølgelengder (Table of Materials).

Lysboksen som beskrives her, er designet for spesifikke bruksområder som krever presis kontroll over lysstrålingsnivåer, dynamikk og bølgelengder (figur 2). Andre fordeler med denne lysboksen inkluderer jevn lyseksponering, ubetydelig utilsiktet prøveoppvarming, god plass til flere 6-brønnsplater og langlivede, spektralt godt karakteriserte lyskilder. Imidlertid kan forskjellige lyseksponeringsstrategier være å foretrekke, avhengig av forskningsapplikasjonen. Mange laboratorier har utviklet enklere og mer kostnadseffektive ensartede lyseksponeringssystemer med mindre fotavtrykk, inkludert fôrinkubatorer med LED-striper, suspendering av LED-paneler over prøver, eller inkorporering av lysdioder i oppvasklokk 32,38,39,40,64,65,66 . Det er viktig at lysboksen som brukes i denne protokollen ikke tillater brukere å selvstendig regulere individuelle brønner (i motsetning til Bugaj et al.52) eller gi romlig kontroll over lyseksponering. Romlig lokalisert optogenetisk aktivering har blitt demonstrert med bOpto-BMP38 og bOpto-Nodal39 ved bruk av lasere i henholdsvis SPIM- eller konfokale systemer, og har også blitt realisert med mange andre optogenetiske strategier i en rekke modellsystemer (diskutert i Rogers og Müller12). Noen tilnærminger har til og med oppnådd subcellulær romlig oppløsning 29,30,31. Selv om implementeringen av romlig lokaliserte lyseksponeringssystemer er utenfor omfanget av denne protokollen, er romlige aktiveringseksperimenter med bOpto-BMP / Nodal teoretisk mulig med spesialutstyr som digitale mikromirror-enheter eller maskeringsmetoder. Leserne oppfordres til å utforske den omfattende litteraturen om DIY-lysbokser for optogenetiske eksperimenter før de forplikter seg til en lyseksponeringsstrategi (se f.eks. Gerhardt et al.51, Bugaj et al.52, Kumar og Khammash 53 og mer på https://www.optobase.org/materials/).

Molekylære optogenetiske strategier tilbyr ofte en høyere grad av spatiotemporal kontroll over biologiske prosesser sammenlignet med historiske tilnærminger som mutanter, ektopisk genuttrykk, rekombinante proteiner og legemidler. Lesere som er interessert i fordelene med optogenetiske tilnærminger, kan utforske andre publiserte verktøy som er tilgjengelige i sebrafisk og andre organismer. Disse inkluderer verktøy for å manipulere ytterligere signalveier 32,65,67,68, regulere genuttrykk 61,64,66,69,70,71, endre proteinlokalisering 31,72 og aktivere apoptose 62. Disse verktøyene og mange andre er beleilig katalogisert på OptoBase, en kuratert nettressurs for molekylære optogenetikktilnærminger28. For de som er inspirert til å lage nye optogenetiske verktøy, inneholder ressursen også nyttige beskrivelser av lysresponsive proteiner som har blitt brukt i et bredt spekter av strategier, inkludert lysresponsive proteiner som reagerer på grønne, røde og nær-infrarøde bølgelengder. Vi er glade for at det vitenskapelige samfunnet skal realisere det fulle potensialet for molekylære optogenetiske tilnærminger.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Finansiering for denne protokollen ble gitt av NICHD Intramural Program til KWR (ZIA HD009002-01). Vi takker Jeff Farrell og hans laboratorium for deres opplysende tilbakemeldinger, Will Anderson for utmerket teknisk støtte, Leanne Iannucci for stresstesting av protokollen og måling av bestråling, og NIH Shared Zebrafish-anlegget for deres harde arbeid med å holde sebrafisken sunn.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Building a light box & Light exposure protocol
#8 x 1" Hex Self-drilling Screw McMaster-Carr 99663A222 1.4.5
Digital Optical Power and Energy Meter ThorLabs PM100D 1.7
4
Incubator (142 liters) Boekel Scientific 139400 1.3.1
Incubator Panel Mount (1/4" thick cast black acrylic) Custom part / Piedmont Plastics Incubator_panel 1.4.4
Large HSS Spiral Groove Step Drill Bit CO-Z SDB0001TA 1.3.2
LED lens gasket, Incubator gasket; 1/32" thick black silicone McMaster-Carr 5812T12 1.4.3
1.4.4
LED microplate illuminator Prizmatix NA 1.1
1.4.3
M3 10mm Cube Standoff Newark Eletronics 005.60.533 1.4.1
M3 x 10mm 316SS Flat Head Screw McMaster-Carr 91801A156 1.4.1
M6 x 10mm 316SS Flat Head Screw McMaster-Carr 91801A305 1.4.3
Memory card thermometer Fisherbrand 15-081-111 1.9
3.2.1
Microscope Slide Power Meter Sensor Head (150 mW) ThorLabs S170C 1.7
4
Red gel filter paper #E106 Rosco / B&H Foto & Electronics 110084014805-E106 4.2.1
Side Brackets (1/4" thick cast black acrylic) Custom part / Piedmont Plastics Side_bracket 1.4.2
Vertical Bracket (1/4" thick cast black acrylic) Custom part / Piedmont Plastics Vertical_bracket 1.4.1
Weather stripping: Light duty EPDM foam, 1/2" wd 1/4" tk McMaster-Carr 8694K12 1.8
Generating mRNA
EZNA MicroElute Cycle Pure Kit Omega D6293-02 2.4
GeneJET Miniprep Kit (250 rxns) Thermo Scientific K0503 2.2
Microsample incubator (Hybex) SciGene 1057-30-0 2
Microsample incubator 1.5 ml tube block (Hybex) SciGene 1057-34-0 2
Nanodrop One Spectrophotometer Thermo Scientific ND-ONE-W 2.4
NotI-HF restriction enzyme New England Biolabs (NEB) R3189L 2.1
pCS2-Opto-Alk3 Addgene 207614 2
pCS2-Opto-Alk8 Addgene 207615 2
pCS2-Opto-BMPR2a Addgene 207616 2
RNeasy Mini Kit (250 rxns) Qiagen 74106 2.3
Injecting mRNA
Agarose (UltraPure) Invitrogen / Thermo Fisher 16500500 3.1.1
250 ml glass beakers Fisherbrand FB100250 3.3.2
6-well dishes (case of 50) Falcon 08 772 1B 3.1.6
B-8A ball joint Narishige B-8A 3.3
Back pressure unit (microinjection rig component) Applied Scientific Instrumentation (ASI) BPU 3.3
Foot switch (microinjection rig component) Applied Scientific Instrumentation (ASI) FWS 3.3
GJ-1 magnetic stand Narishige GJ-1 3.3
Glass capillaries (4 in, OD 1 mm, filament) World Precision Instruments 1B100F-4 3.1.11
Glass petri dish bottoms (for dechorionating) Pyrex 08-748A 3.3.2
Glass pipettes (5 3/4" with wide tip) Kimble-Chase 63A53WT 3.1.9
Injection dish molds Adaptive Science Tools tu1 3.1.3
IP iron plate Narishige IP 3.3
M-152 micromanipulator Narishige M-152 3.3
Micro pipette holder kit (microinjection rig component) Applied Scientific Instrumentation (ASI) MIMPH-MPIP-Kit 3.3
Micrometers Meiji Techno America MA285 3.3
MPPI-2 pressure injector (microinjection rig component) Applied Scientific Instrumentation (ASI) MPPI-3 3.3
Needle puller World Precision Instruments PUL-1000 3.1.11
Petri dishes (100 mm x 15 mm, case of 500) Falcon 08-757-100D 3.1.2
Pipettor (10 ml, green) Bel-Art F37898-0000 3.3
Pronase Roche 11459643001 3.3.2
Squeeze bottles (500 ml) Nalgene / Thermo Scientific 2402-0500 3.3

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jones, W. D., Mullins, M. C. Cell signaling pathways controlling an axis organizing center in the zebrafish. Current Topics in Developmental Biology. 150, 149-209 (2022).
  2. Hill, C. S. Establishment and interpretation of NODAL and BMP signaling gradients in early vertebrate development. Current Topics in Developmental Biology. 149, 311-340 (2022).
  3. Zinski, J., Tajer, B., Mullins, M. C. TGF-β Family Signaling in Early Vertebrate Development. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 10 (6), a033274 (2018).
  4. Shore, E. M., Kaplan, F. S. Inherited human diseases of heterotopic bone formation. Nature Reviews. Rheumatology. 6 (9), 518-527 (2010).
  5. Hebron, K. E., Hernandez, E. R., Yohe, M. E. The RASopathies: from pathogenetics to therapeutics. Disease Models & Mechanisms. 15 (2), dmm049107 (2022).
  6. Grant, M. G., Patterson, V. L., Grimes, D. T., Burdine, R. D. Modeling Syndromic Congenital Heart Defects in Zebrafish. Current Topics in Developmental Biology. 124, 1-40 (2017).
  7. Nusse, R., Clevers, H. Wnt/beta-Catenin Signaling, Disease, and Emerging Therapeutic Modalities. Cell. 169 (6), 985-999 (2017).
  8. Farahani, P. E., Reed, E. H., Underhill, E. J., Aoki, K., Toettcher, J. E. Signaling, Deconstructed: Using Optogenetics to Dissect and Direct Information Flow in Biological Systems. Annual Review of Biomedical Engineering. 23, 61-87 (2021).
  9. Purvis, J. E., Lahav, G. Encoding and decoding cellular information through signaling dynamics. Cell. 152 (5), 945-956 (2013).
  10. Wibisana, J. N., Okada, M. Encoding and decoding NF-kappaB nuclear dynamics. Current Opinion in Cell Biology. 77, 102103 (2022).
  11. Friedel, L., Loewer, A. The guardian's choice: how p53 enables context-specific decision-making in individual cells. TheFEBS Journal. 289 (1), 40-52 (2022).
  12. Rogers, K. W., Müller, P. Optogenetic approaches to investigate spatiotemporal signaling during development. Current Topics in Developmental Biology. 137, 37-77 (2020).
  13. Johnson, H. E., Toettcher, J. E. Illuminating developmental biology with cellular optogenetics. Current Opinion in Biotechnology. 52, 42-48 (2018).
  14. Bosman, S. L., Sonnen, K. F. Signaling oscillations in embryonic development. Current Topics in Developmental Biology. 149, 341-372 (2022).
  15. Li, P., Elowitz, M. B. Communication codes in developmental signaling pathways. Development. 146 (12), dev170977 (2019).
  16. Tucker, J. A., Mintzer, K. A., Mullins, M. C. The BMP signaling gradient patterns dorsoventral tissues in a temporally progressive manner along the anteroposterior axis. Developmental Cell. 14 (1), 108-119 (2008).
  17. van Boxtel, A. L., et al. A temporal window for signal activation dictates the dimensions of a Nodal signaling domain. Developmental Cell. 35 (2), 175-185 (2015).
  18. Sorre, B., Warmflash, A., Brivanlou, A. H., Siggia, E. D. Encoding of temporal signals by the TGF-β pathway and implications for embryonic patterning. Developmental Cell. 30 (3), 334-342 (2014).
  19. Economou, A. D., Hill, C. S. Temporal dynamics in the formation and interpretation of Nodal and BMP morphogen gradients. Current Topics in Developmental Biology. 137, 363-389 (2020).
  20. Rogers, K. W., Schier, A. F. Morphogen gradients: from generation to interpretation. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 27, 377-407 (2011).
  21. Barkai, N., Shilo, B. Z. Robust generation and decoding of morphogen gradients. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 1 (5), a001990 (2009).
  22. Johnson, H. E., Djabrayan, N. J. V., Shvartsman, S. Y., Toettcher, J. E. Optogenetic Rescue of a Patterning Mutant. Current Biology. 30 (17), 3414-3424 (2020).
  23. Imayoshi, I., et al. Oscillatory control of factors determining multipotency and fate in mouse neural progenitors. Science. 342 (6163), 1203-1208 (2013).
  24. Lin, B., et al. Synthetic spatially graded Rac activation drives cell polarization and movement. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (52), E3668-E3677 (2012).
  25. Cui, K. W., et al. Spatially controlled stem cell differentiation via morphogen gradients: A comparison of static and dynamic microfluidic platforms. Journal of Vacuum Science & Technology. A, Vaccum, Surfaces, and Films. 38 (3), 033205 (2020).
  26. Faden, F., Mielke, S., Lange, D., Dissmeyer, N. Generic tools for conditionally altering protein abundance and phenotypes on demand. Biological Chemistry. 395 (7-8), 737-762 (2014).
  27. Shoji, W., Sato-Maeda, M. Application of heat shock promoter in transgenic zebrafish. Development, Growth & Differentiation. 50 (6), 401-406 (2008).
  28. Kolar, K., Knobloch, C., Stork, H., Znidaric, M., Weber, W. OptoBase: A web platform for molecular optogenetics. ACS Synthetic Biology. 7 (7), 1825-1828 (2018).
  29. Benedetti, L., et al. Light-activated protein interaction with high spatial subcellular confinement. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (10), E2238-E2245 (2018).
  30. Krueger, D., De Renzis, S. Optogenetic Methods to Control Tissue Mechanics in Drosophila. Methods in Molecular Biology. 2540, 269-283 (2022).
  31. Buckley, C. E. Optogenetic Control of Subcellular Protein Location and Signaling in Vertebrate Embryos. Methods in Molecular Biology. 1920, 143-162 (2019).
  32. Čapek, D., et al. Light-activated Frizzled7 reveals a permissive role of non-canonical wnt signaling in mesendoderm cell migration. Elife. 8, e42093 (2019).
  33. Krishnamurthy, V. V., et al. Reversible optogenetic control of kinase activity during differentiation and embryonic development. Development. 143 (21), 4085-4094 (2016).
  34. Huang, A., Amourda, C., Zhang, S., Tolwinski, N. S., Saunders, T. E. Decoding temporal interpretation of the morphogen Bicoid in the early Drosophila embryo. Elife. 6, e26258 (2017).
  35. Johnson, H. E., Toettcher, J. E. Signaling dynamics control cell fate in the early Drosophila embryo. Developmental Cell. 48 (3), 361.e3-370.e3 (2019).
  36. Aoki, K., et al. Stochastic ERK activation induced by noise and cell-to-cell propagation regulates cell density-dependent proliferation. Molecular Cell. 52 (4), 529-540 (2013).
  37. Chow, R. W., Vermot, J. The rise of photoresponsive protein technologies applications in vivo: a spotlight on zebrafish developmental and cell biology. F1000Research. , (2017).
  38. Rogers, K. W., ElGamacy, M., Jordan, B. M., Müller, P. Optogenetic investigation of BMP target gene expression diversity. Elife. 9, e58641 (2020).
  39. Sako, K., et al. Optogenetic control of Nodal signaling reveals a temporal pattern of Nodal signaling regulating cell fate specification during gastrulation. Cell Reports. 16 (3), 866-877 (2016).
  40. Grusch, M., et al. Spatio-temporally precise activation of engineered receptor tyrosine kinases by light. The EMBO Journal. 33 (15), 1713-1726 (2014).
  41. Crossman, S. H., Janovjak, H. Light-activated receptor tyrosine kinases: Designs and applications. Current Opinion in Pharmacology. 63, 102197 (2022).
  42. Kainrath, S., Janovjak, H. Design and Application of Light-Regulated Receptor Tyrosine Kinases. Methods in Molecular Biology. 2173, 233-246 (2020).
  43. Takahashi, F., et al. AUREOCHROME, a photoreceptor required for photomorphogenesis in stramenopiles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (49), 19625-19630 (2007).
  44. Toyooka, T., Hisatomi, O., Takahashi, F., Kataoka, H., Terazima, M. Photoreactions of aureochrome-1. Biophysical Journal. 100 (11), 2801-2809 (2011).
  45. Vopalensky, P., Pralow, S., Vastenhouw, N. L. Reduced expression of the Nodal co-receptor Oep causes loss of mesendodermal competence in zebrafish. Development. 145 (5), dev.158832 (2018).
  46. Kishimoto, Y., Lee, K. H., Zon, L., Hammerschmidt, M., Schulte-Merker, S. The molecular nature of zebrafish swirl: BMP2 function is essential during early dorsoventral patterning. Development. 124 (22), 4457-4466 (1997).
  47. Rogers, K. W., et al. Nodal patterning without Lefty inhibitory feedback is functional but fragile. Elife. 6, e28785 (2017).
  48. Dubrulle, J., et al. Response to Nodal morphogen gradient is determined by the kinetics of target gene induction. Elife. 4, e05042 (2015).
  49. Harvey, S. A., Smith, J. C. Visualisation and quantification of morphogen gradient formation in the zebrafish. PLoS Biology. 7 (5), e1000101 (2009).
  50. Zinski, J., Tuazon, F., Huang, Y., Mullins, M., Umulis, D. Imaging and Quantification of P-Smad1/5 in Zebrafish Blastula and Gastrula Embryos. Methods in Molecular Biology. 1891, 135-154 (2019).
  51. Gerhardt, K. P., Castillo-Hair, S. M., Tabor, J. J. DIY optogenetics: Building, programming, and using the Light Plate Apparatus. Methods in Enzymology. 624, 197-226 (2019).
  52. Bugaj, L. J., Lim, W. A. High-throughput multicolor optogenetics in microwell plates. Nature Protocols. 14 (7), 2205-2228 (2019).
  53. Kumar, S., Khammash, M. Platforms for Optogenetic Stimulation and Feedback Control. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 10, 918917 (2022).
  54. Urushibata, H., et al. Control of Developmental Speed in Zebrafish Embryos Using Different Incubation Temperatures. Zebrafish. 18 (5), 316-325 (2021).
  55. Rogers, K. W., Bläßle, A., Schier, A. F., Müller, P. Measuring protein stability in living zebrafish embryos using fluorescence decay after photoconversion (FDAP). Journal of Visualized Experiments. (95), e52266 (2015).
  56. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).
  57. Feldman, B., et al. Zebrafish organizer development and germ-layer formation require nodal-related signals. Nature. 395 (6698), 181-185 (1998).
  58. Shimizu, T., et al. Cooperative roles of Bozozok/Dharma and Nodal-related proteins in the formation of the dorsal organizer in zebrafish. Mechanisms of Development. 91 (1-2), 293-303 (2000).
  59. Rebagliati, M. R., Toyama, R., Fricke, C., Haffter, P., Dawid, I. B. Zebrafish nodal-related genes are implicated in axial patterning and establishing left-right asymmetry. Developmental Biology. 199 (2), 261-272 (1998).
  60. Gritsman, K., Talbot, W. S., Schier, A. F. Nodal signaling patterns the organizer. Development. 127 (5), 921-932 (2000).
  61. LaBelle, J., et al. TAEL 2.0: An Improved Optogenetic Expression System for Zebrafish. Zebrafish. 18 (1), 20-28 (2021).
  62. Mruk, K., Ciepla, P., Piza, P. A., Alnaqib, M. A., Chen, J. K. Targeted cell ablation in zebrafish using optogenetic transcriptional control. Development. 147 (12), dev183640 (2020).
  63. Johnson, H. E., et al. The spatiotemporal limits of developmental Erk signaling. Developmental Cell. 40 (2), 185-192 (2017).
  64. Motta-Mena, L. B., et al. An optogenetic gene expression system with rapid activation and deactivation kinetics. Nature Chemical Biology. 10 (3), 196-202 (2014).
  65. Patel, A. L., et al. Optimizing photoswitchable MEK. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (51), 25756-25763 (2019).
  66. LaBelle, J., Woo, S. Light-Induced GFP Expression in Zebrafish Embryos using the Optogenetic TAEL/C120 System. Journal of Visualized Experiments. (174), e62818 (2021).
  67. Kainrath, S., Stadler, M., Reichhart, E., Distel, M., Janovjak, H. Green-light-induced inactivation of receptor signaling using cobalamin-binding domains. Angewandte Chemie. 56 (16), 4608-4611 (2017).
  68. Benman, W., et al. Temperature-responsive optogenetic probes of cell signaling. Nat Chem Biol. 18 (2), 152-160 (2022).
  69. Reade, A., et al. TAEL: a zebrafish-optimized optogenetic gene expression system with fine spatial and temporal control. Development. 144 (2), 345-355 (2017).
  70. Putri, R. R., Chen, L. Spatiotemporal control of zebrafish (Danio rerio) gene expression using a light-activated CRISPR activation system. Gene. 677, 273-279 (2018).
  71. Liu, H., Gomez, G., Lin, S., Lin, S., Lin, C. Optogenetic control of transcription in zebrafish. PLoS One. 7 (11), e50738 (2012).
  72. Buckley, C. E., et al. Reversible optogenetic control of subcellular protein localization in a live vertebrate embryo. Developmental Cell. 36 (1), 117-126 (2016).

Tags

Optogenetisk signalaktivering sebrafiskembryoer signalveier molekylære optogenetiske verktøy spatiotemporal kontroll lysresponsive proteindomener LOV-domene BMP-signalering nodal signalering BOpto-BMP BOpto-nodal eksperimentell kontroll fenotypeanalyse immunfluorescensanalyse rørledning for optogenetiske verktøy
Optogenetisk signalaktivering i sebrafiskembryoer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Saul, A. J., Rogers, C. E.,… More

Saul, A. J., Rogers, C. E., Garmendia-Cedillos, M., Pohida, T., Rogers, K. W. Optogenetic Signaling Activation in Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (200), e65733, doi:10.3791/65733 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter