Summary
Optogenetisk manipulation af signalveje kan være en stærk strategi til at undersøge, hvordan signalering afkodes i udvikling, regenerering, homeostase og sygdom. Denne protokol giver praktiske retningslinjer for brug af lys-ilt-spændingsdetekterende domænebaserede Nodal og knoglemorfogenprotein (BMP) signalaktivatorer i det tidlige zebrafiskembryo.
Abstract
Signalveje orkestrerer grundlæggende biologiske processer, herunder udvikling, regenerering, homeostase og sygdom. Metoder til eksperimentelt at manipulere signalering er nødvendige for at forstå, hvordan signalering fortolkes i disse vidtrækkende sammenhænge. Molekylære optogenetiske værktøjer kan tilvejebringe reversible, justerbare manipulationer af signalvejsaktivitet med en høj grad af spatiotemporal kontrol og er blevet anvendt in vitro, ex vivo og in vivo. Disse værktøjer parrer lysresponsive proteindomæner, såsom det blå lys homodimeriserende lys-ilt-spændingssensing (LOV) domæne, med signaleffektorer for at give lysafhængig eksperimentel kontrol over signalering. Denne protokol giver praktiske retningslinjer for anvendelse af det LOV-baserede knoglemorfogenetiske protein (BMP) og Nodal-signalaktivatorerne bOpto-BMP og bOpto-Nodal i det optisk tilgængelige tidlige zebrafiskembryo. Den beskriver to kontroleksperimenter: Et hurtigt fænotypeassay til bestemmelse af passende eksperimentelle betingelser og et immunofluorescensassay til direkte vurdering af signalering. Tilsammen kan disse kontrolforsøg hjælpe med at etablere en pipeline til brug af optogenetiske værktøjer i tidlige zebrafiskembryoner. Disse strategier giver en stærk platform til at undersøge signalernes roller i udvikling, sundhed og fysiologi.
Introduction
Signalveje gør det muligt for celler at reagere på deres miljø og koordinere aktiviteter på vævs- og organismeskalaer. Signaler, der er afgørende for embryonal udvikling, inkluderer TGF-beta-superfamiliemedlemmerne knoglemorfogenetisk protein (BMP) og Nodal 1,2,3. Under embryogenese mønstrer de veje, der reguleres af disse signaler og andre, kroppens plan ved at kontrollere genekspression og yderligere processer for at sikre, at forskellige væv og organer udvikler sig og interagerer korrekt. Patologier, herunder fosterskader og kræft, kan opstå, når signalering eller reaktioner på signalering forstyrres 4,5,6,7. På trods af grundig undersøgelse af signalering er der stadig meget mere at opdage om, hvordan niveauer og dynamik afkodes i forskellige sammenhænge 8,9,10,11, især under udvikling 12,13,14,15,16,17,18,19.
For at forstå, hvordan signalering afkodes, ville et ideelt eksperiment være at manipulere signalniveauer, timing og / eller dynamik - med en høj grad af rumlig og tidsmæssig kontrol - og vurdere resultater. For eksempel foreslås præcise rumlige signalgradienter til mønsterudvikling af væv20,21. Ændring af rumlige fordelinger af signalgradienter ville hjælpe med at teste denne hypotese22. Derudover bliver vigtigheden af signaldynamik i generering af forskellige cellulære reaktioner tydeligere: Den samme signalvej kan instruere celler til at differentiere eller sprede sig afhængigt af signalfrekvens, for eksempel 9,23. Eksperimentelle paradigmer, hvor signaldynamik let kan manipuleres, vil være værdifulde for at udforske forholdet mellem dynamik og celleskæbnebeslutninger 8,12,13,14,15.
Historisk set er flere metoder blevet brugt til at manipulere signalering i udviklingsmæssige sammenhænge, hvilket fører til grundlæggende opdagelser 1,2,3. Signalering kan blokeres ved hjælp af pathway tab-af-funktion mutanter, ektopisk inhibitor ekspression, eller antagonist narkotika. Metoder til aktivering af signalering omfatter agonistlægemidler, rekombinante ligander, ektopisk ekspression af ligander eller konstitutivt aktive receptorer og pathway-hæmmer tab-af-funktion mutanter. Disse metoder spænder langs et kontinuum af eksperimentel kontrol. For eksempel kan mutanter og ektopisk ekspression falde på forhammersiden af kontinuummet: Med disse tilgange kan dramatiske, systemiske ændringer i vejaktivitet forårsage tidlig død og udelukke undersøgelser på senere stadier eller over tid kan resultere i pleiotropiske virkninger, der er vanskelige at adskille. Derudover er det ofte udfordrende uafhængigt at manipulere en signalfunktion ad gangen, såsom niveau eller varighed. Mod den anden ende af kontinuummet tilbyder nogle metoder mere præcis eksperimentel kontrol, såsom mikrofluidiske enheder, der udsætter prøver for lægemidler eller rekombinante proteiner med tidsmæssig og undertiden rumlig kontrol 18,24,25 eller genetiske metoder, herunder varmechokinducerbare og vævsspecifikke promotorer, der kan tilbyde lignende fordele16,26,27. Disse metoder kan dog være vanskelige at udføre, er muligvis ikke reversible, kan have relativt langsom kinetik eller dårlig opløsning og kan være utilgængelige i nogle modelsystemer.
Molekylære optogenetiske tilgange er en stærk tilføjelse til dette værktøjssæt. Disse tilgange bruger proteiner, der reagerer på forskellige lysbølgelængder til at manipulere biologiske processer, herunder signalering 8,12,13,14,15, og er udviklet over årtier til brug i en række systemer fra cellekultur til hele dyr12,13,28. Sammenlignet med historiske tilgange kan molekylær optogenetik ofte tilbyde en højere grad af rumlig tidsmæssig kontrol over biologiske processer: Regulatoren i optogenetiske systemer er lys, og kontrol af lysbølgelængde, intensitet, varighed og eksponeringsfrekvens er relativt ligetil. Med sofistikerede systemer såsom konfokale og to-fotonmikroskoper er rumlig kontrol i det subcellulære område muligt 29,30,31. Værktøjer til optogenetisk manipulation af signalering er blevet udviklet og anvendt i flere systemer, herunder dem, der er beskrevet i Johnson et al.22, Čapek et al.32, Krishnamurthy et al.33 og Huang et al.34. For eksempel blev denne strategi for nylig brugt til at ændre en signalgradient i Drosophila-embryoner, hvilket viser, at flueembryogenese er overraskende robust over for ændringer i denne gradient22. Reversibiliteten og den hurtige tænd/sluk-kinetik af optogenetiske signalaktivatorer har også gjort dem til attraktive værktøjer til at undersøge afkodningen af signaldynamik 8,12,13,14,15,34,35,36.
Det tidlige zebrafiskembryo er et in vivo-system , der er velegnet til optogenetiske undersøgelser, fordi det er eksternt befrugtet, gennemsigtigt, mikroskopivenligt og genetisk medgørligt. Lyseksponering er lettere at levere til embryoner, der udvikler sig uden for moderen, lys kan trænge ind og få adgang til deres ikke-uigennemsigtige væv, levende zebrafiskembryoner tåler billeddannelse godt (ud over at være gennemsigtige), og eksisterende genetiske metoder giver enkle muligheder for knockdown- og overekspressionseksperimenter ud over udviklingen af nyttige transgene stoffer37.
For nylig blev der udviklet optogenetiske værktøjer til at aktivere BMP38 og Nodal39 signalering i zebrafiskembryoner med eksponering for blåt lys (figur 1). Vi henviser til disse værktøjer som bOpto-BMP og bOpto-Nodal (b for blåt lysaktiveret og Opto for optogenetisk). bOpto-BMP/Nodal er baseret på lignende vejaktiveringsmekanismer. Bindingen af BMP eller Nodal ligander til deres respektive receptorserin-threoninkinaser driver receptorkinasedomæneinteraktioner, der fører til phosphorylering af signaleffektorer (Smad1/5/9 for BMP og Smad2/3 for Nodal). Fosforylerede signaleffektorer translokerer derefter til kernen og regulerer målgenekspression3 (figur 1A, D). Disse receptorkinaseinteraktioner kan gøres lysresponsive ved at koble receptorkinaser til lysresponsive dimeriserende proteiner: Ved lyseksponering skal disse kimære proteiner dimerisere, hvilket får receptorkinasedomænerne til at interagere og aktivere signalering (figur 1B, C, E, F). Det er vigtigt, at bOpto-BMP / Nodal i modsætning til endogene receptorer ikke indeholder ekstracellulære ligandbindende domæner, hvilket sikrer liganduafhængig aktivitet (figur 1C, F). Denne optogenetiske aktiveringsstrategi blev først opnået med receptortyrosinkinaser40,41,42 og derefter anvendt på receptorserin-threoninkinaser.
bOpto-BMP/Nodal bruger det blå lysresponsive (~450 nm) homodimeriserende lys-ilt-spændingssensor (LOV) domæne fra algen Vaucheria fridiga AUREO1 protein (VfLOV)43,44. Disse konstruktioner består af et membranmålrettet myristoyleringsmotiv efterfulgt af enten BMP- eller Nodalreceptorkinasedomæner, smeltet sammen med et LOV-domæne (figur 1B, E). Eksponering for blåt lys bør forårsage LOV-homodimerisering, hvilket resulterer i receptorkinasedomæneinteraktioner, der fører til respektive Smad-phosphorylering og vejaktivering (figur 1C, F). For bOpto-BMP viste det sig, at en kombination af konstruktioner med type I-receptorkinasedomænerne fra Acvr1l (også kendt som Alk8) og BMPR1aa (også kendt som Alk3) og type II-receptorkinasedomænet fra BMPR2a optimalt aktiverede signalering38 (Addgene #207614, #207615 og #207616). Til bOpto-Nodal anvendes en kombination af konstruktioner med type I-receptorkinasedomænet fra Acvr1ba og type II-receptorkinasedomænet fra Acvr2ba39.
bOpto-BMP/Nodal er blevet introduceret i tidlige zebrafiskembryoner ved at injicere mRNA på encellestadiet og brugt til at undersøge signalvarighedens rolle i Nodalfortolkning39, til at bestemme, hvorfor zebrafisk mister evnen til at reagere på Nodal45, og til at undersøge, hvordan BMP-målgener reagerer på forskellige BMP-signalniveauer38. Det er sandsynligt, at disse værktøjer fortsat vil være nyttige i en lang række fremtidige undersøgelser. Imidlertid er styrken af optogenetiske signalaktivatorer også deres svaghed: lysfølsomme prøver skal behandles med omhu for at undgå utilsigtet ektopisk signalaktivitet. Udsættelse for rumlys eller sollys kan aktivere bOpto-BMP/Nodal.
Denne protokol giver praktiske forslag til brug af mRNA-kodede LOV-baserede BMP- og Nodal-aktivatorer i tidlige zebrafiskembryoner. Den begynder med en detaljeret beskrivelse af en strategi til opbygning af en lysboks til styring af ensartet lyseksponering og temperatur (figur 2, supplerende fil 1, supplerende fil 2, supplerende fil 3, supplerende fil 4, supplerende fil 5, supplerende fil 6, supplerende fil 7, supplerende fil 8). Derefter beskrives to centrale kontroleksperimenter, der bestemmer, om en optogenetisk signalaktivator opfører sig som forventet - dvs. kun aktiverer vejaktivitet, når den udsættes for lys (figur 3). Det første kontrolassay indebærer undersøgelse af fænotyper en dag efter befrugtning i lyseksponerede og ikke-eksponerede embryoner (figur 3A). mRNA-injicerede lyseksponerede embryoner, men ikke ueksponerede embryoner, bør fænokopi BMP eller Nodal overekspression (figur 4A, B; Især BMP-fænotyper er klart forskellige på dette tidspunkt, punkt46). Dette assay giver en hurtig aktivitetsaflæsning. I det andet kontrolassay, for at bestemme, om fænotyper er forårsaget specifikt af overskydende BMP- eller Nodal-signalering og for direkte at observere ændringen i signalniveauer, anvendes immunofluorescensfarvning til at detektere fosforylerede signaleffektorer (henholdsvis pSmad1/5/9 eller pSmad2/3) efter en 20 minutters lyseksponering omkring sen blastula / tidlig gastrulationsfase, når signalaktiviteten er velbeskrevet12, 16,17,47,48,49,50 (figur 3B og figur 4C). (Bemærk, at selvom rumligt lokaliseret aktivering er blevet demonstreret for både bOpto-BMP38 og bOpto-Nodal39, beskriver denne protokol kun ensartet lyseksponering og signalaktiveringsstrategier.) Det tilrådes at udføre disse kontroleksperimenter, inden bOpto-BMP / Nodal anvendes på specifikke forskningsspørgsmål for at bestemme ideelle lokale eksperimentelle forhold.
Protocol
Zebrafiskforskningsprotokoller blev gennemgået og godkendt af NICHD Animal Care and Use Committee ved National Institutes of Health (ASP 21-008). Alle zebrafiskundersøgelser blev udført i overensstemmelse med vejledningen for pasning og brug af forsøgsdyr.
1. Opbygning af en lysboks
- For at kontrollere lyseksponering og temperatur skal du konstruere en lysboks, der bruger en lysemitterende diode (LED) mikropladebelysning som lyskilde (figur 2A, materialetabel, supplerende fil 1, supplerende fil 2). Denne belysning, der kan tilpasses, giver dynamisk, programmerbar kontrol over flere bølgelængder.
BEMÆRK: Der er mange mulige strategier til at bygge en lysboks, og en alternativ tilgang kan være mere passende (se f.eks. Gerhardt et al.51, Bugaj et al.52, Kumar og Khammash 53 og mere på https://www.optobase.org/materials/). - Inkluder følgende funktioner i lysboksen: Temperaturkontrol (28 °C er ideel til zebrafiskembryoner), udelukkelse af uønsket lys (f.eks. rumlys og sollys), ensartet levering af blåt lys, der dækker målområdet (f.eks. 6-brøndplade) og kontrol over lysintensitet og eksponeringsdynamik.
BEMÆRK: bOpto-BMP / Nodal aktiveres af blåt lys, men nogle optogenetiske værktøjer reagerer på andre bølgelængder. Brug den passende bølgelængde til det optogenetiske værktøj. - Bor et hul gennem toppen af en inkubator (figur 2B), der er lidt bredere end LED-udgangslinsen.
- Sørg for, at der ikke er elektriske komponenter i toppen af inkubatoren, der vil blive ødelagt ved boring (materialetabel). Dette kan konstateres ved at kontakte inkubatorproducenten og spørge direkte.
- Hvis der er et eksisterende hul på inkubatorens toppanel, skal du bruge en trinboremaskine til at øge hulstørrelsen til 1,25 tommer. Ellers brug en 1,25 tommer hulsav med arbor.
- Hvis der er indvendige paneler, der blokerer lyskilden, skal du bore den passende hulstørrelse for at sikre, at lyskeglen ikke er blokeret (figur 2A). Paneler er typisk lavet af tynde metalplader, så brug langsomme hastigheder og metalbor for at forhindre skader (koboltbor anbefales).
- Konstruer en LED-holder til at fastgøre LED-mikropladebelysningen til toppen af inkubatoren (figur 2C, supplerende fil 3, supplerende fil 4, supplerende fil 5, supplerende fil 6, supplerende fil 7, supplerende fil 8).
- Monter fire M3-terningholdere på det lodrette beslagsstykke ved hjælp af M3-skruer.
- Fastgør de to sidebeslag til venstre og højre for den lodrette beslags terningstandoffs. Monter endnu en terningstandoff på det resterende hul på sidebeslagene.
- Monter det lodrette beslag på LED-mikropladebelysningsenhed (materialetabel) ved hjælp af M6-skruer. Placer LED-objektivpakningen over LED-systemlinsen.
- Monter de samlede stykker på inkubatorpanelmonteringen og derefter på M3-standoffs på lodrette og sidebeslag. Placer inkubatorpakningen over det borede hul oven på inkubatoren.
- Placer inkubatorpanelbeslaget oven på inkubatorpakningen, og sørg for, at pakningen og panelåbningerne er koncentriske med inkubatorens hul. Monter panel på inkubatortoppen ved hjælp af nr. 8 skruer. Sørg for, at denne tætning er lystæt.
- Placer en 6-brøndplade på inkubatorens øverste hylde. Bestem, om lysstrålen dækker pladen ensartet (figur 2A). Brug et ark papir til at visualisere lysdækningen.
- Hvis hele pladen ikke er dækket af strålen, skal du øge afstanden mellem LED'en og pladen ved at flytte hylden ned. For det system, der er beskrevet her, ~ 14 tommer mellem LED og hylde er tilstrækkelig.
- Brug en lysmåler til at bestemme bestrålingsniveauet og den rumlige ensartethed (materialetabel).
- For at undgå utilsigtet sollys og eksponering for rumlys skal du bruge vejrstripning for at sikre, at inkubatordøren er lystæt (figur 2A).
- Zebrafiskembryoner udvikler sig robust ved 28 °C54. Brug et hukommelseskorttermometer til at sikre, at lysboksen rummer 28 °C.
2. Generering af mRNA til injektion
BEMÆRK: pCS2+ er vektorrygraden for bOpto-BMP konstruktioner38 og bOpto-Nodal konstruktioner39. Denne vektor er ampicillinresistent. bOpto-BMP består af tre konstruktioner (figur 1B): BMPR1aa-LOV (Addgene # 207614): Formodet kinasedomæne af type I BMPR1aa-receptor (også kendt som Alk3) smeltet sammen med LOV; Acvr1l-LOV (Addgene # 207615): Formodet kinasedomæne af typen I Acvr1l-receptor (også kendt som Alk8) smeltet sammen med LOV; og BMPR2a-LOV (Addgene # 207616): Formodet kinasedomæne af type II BMPR2a-receptoren og følgende C-terminaldomæne fusioneret til LOV. bOpto-Nodal består af to konstruktioner (figur 1E): Acvr1ba-LOV: Formodet kinasedomæne af typen I Acvr1ba-receptor (også kendt som Acvr1b) smeltet sammen med LOV; Acvr2ba-LOV: Formodet kinasedomæne af type II Acvr2ba-receptoren (også kendt som Acvr2b) smeltet sammen med LOV.
- For at linearisere plasmider fordøjes mellem 2-5 μg plasmid-DNA ved anvendelse af NotI-restriktionsenzym ved 37 °C i 1-3 timer (materialetabel).
BEMÆRK: Det er også muligt at generere lineært DNA ved hjælp af plasmidet som PCR-skabelon. - Rens DNA ved hjælp af et standard kolonnebaseret rensningssæt (materialetabel).
- Brug et in vitro SP6-transkriptionssæt, såsom et mMessage mMachine-sæt, til at transskribere RNA fra den lineariserede skabelon (materialetabel). Opsæt to reaktioner i henhold til producentens anbefalinger for at sikre højere udbytte.
- Rens RNA ved hjælp af et standard kolonnebaseret RNA-oprydningssæt (materialetabel). Det er også muligt at rense via nedbør.
3. Injektion af mRNA
- Mindst 1 dag før injektionerne skal der laves injektionsskåle og agarosebelagte plader med 6 brønde.
- Forbered 200 ml 1% agarose i zebrafiskembryomedium og mikrobølgeovn, indtil agaroseen er opløst fuldstændigt. Ethvert standardembryonmedium for zebrafisk bør være acceptabelt. Udeluk dog methylenblåt fra embryomediet, da det kan påvirke downstream-billeddannelse i andre applikationer.
- Hæld forsigtigt smeltet agarose i 100 mm x 15 mm plast petriskåle. Fyld opvasken halvvejs.
- Skyl en sprøjteform med embryomedium og læg forsigtigt på smeltet agarose, og sørg for, at der ikke fanges bobler mellem formen og agarose. Brug tape til at lave en fane på bagsiden af formen for nem placering og hentning.
- Formen skal flyde i den smeltede agarose. Hvis formen synker, fjernes den forsigtigt fra den smeltede agarose og gentages trin 3.1.3.
- Når agarose er størknet, skal du bruge tappen til forsigtigt at fjerne formen. Dette kan fremskyndes ved at placere skålen ved 4 °C.
- Lav agarosebelagte 6-brøndsplader, hvis du arbejder med dechorionerede embryoner til immunofluorescensforsøg.
- Brug en engangspipette på 10 ml plast til at overføre nok smeltet agarose til at dække bunden af hvert hul i en plade med 6 huller.
- Opbevar injektionsskåle og tallerkener med 6 huller ved 4 °C. De kan bruges straks eller opbevares, indtil agaroseen er tørret ud eller forurenet (normalt 2-3 uger).
- Forbered flammede glaspipettespidser, hvis du arbejder med dechorionerede embryoner til immunofluorescensforsøg.
- Indsæt enden af en glaspipette i en bunsenbrænderflamme, og drej kontinuerligt, indtil kanterne er glatte. Dechorionerede embryoner skal passe komfortabelt gennem pipettens ende. Lad ikke åbningen krympe under diameteren af et embryo.
- Køb eller træk mikroinjektionsnåle (materialefortegnelse). Det anbefales at have ekstra nåle til rådighed på injektionsdagen, hvis en udskiftning er nødvendig.
- Dagen før injektioner oprettes zebrafiskopdrættere i henhold til instituttets standardprocedurer (SOP'er). Hold mænd og kvinder adskilt.
- Tænd for lysboksens temperaturregulator for at opretholde 28 °C. For at sikre, at temperaturen i lysboksen forbliver på 28 °C, skal du overvåge temperaturen ved hjælp af et hukommelseskorttermometer (materialetabel).
- Forbered mRNA-injektionsblanding (er). Injicer ækvimolære mængder af hver konstruktion. Det er nødvendigt empirisk at bestemme, hvilket beløb der skal injiceres.
- bOpto-BMP transkriptionsstørrelser er som følger:
Acvr1l-LOV = 2007 nukleotider (nt)
BMPR1aa-LOV = 1983 nt
BMPR2a-LOV = 3409 nt - For at injicere ækvimolære mængder skal du injicere 1,01x mere af Acvr1l-konstruktionen end BMPR1aa; injicere 1.72x mere af BMPR2a-konstruktionen end BMPR1aa.
- bOpto-Nodal transkriptionsstørrelser er som følger:
Acvr1ba-LOV og Acvr2ba-LOV er begge 1962 nt. - For at injicere ækvimolære mængder skal du injicere samme mængde af hver konstruktion.
- Forbered ækvimolære injektionsblandinger, der kombinerer alle mRNA'er, der er målrettet mod en vej til en injektionsblanding. Inkluder phenolrødt injektionssporstof, hvis det ønskes. For dataene vist i figur 4 blev 15 pg af hver bOpto-Nodal-konstruktion (Acvr1ba-LOV og Acvr2ba-LOV) anvendt, og for bOpto-BMP blev 7,8 pg Acvr1l-LOV og BMPR1aa-LOV og 13,4 pg BMPR2a-LOV anvendt.
- Opbevar injektionsblandinger ved -20 °C. Når den optimale koncentration af injektionsblandingen er bestemt, fremstilles 5-10 μL alikvoter og opbevares ved -20 °C eller -80 °C.
- Injektion dag
- Hvis du udfører et fænotypeassay (figur 3A), injiceres gennem korionen direkte ind i midten af cellen på encellestadiet i henhold til dit laboratoriums SOP. Korionen beskytter embryoner mod miljømæssige stressfaktorer og holder lyserede embryoner indeholdt. Dette er nyttigt under scoring for nøjagtig kvantificering af lyserede embryoner (figur 4A, B).
- Hvis der udføres et immunofluorescensassay (figur 3B), skal embryoner i sidste ende dechorioneres til billeddannelse (figur 4C). Injicer derfor direkte i midten af cellen af dechorionerede embryoner på encellestadiet (se Rogers et al.55 for dechorionerende protokol). Alternativt kan embryoner manuelt dechorioneres efter fiksering, men dette er mere besværligt end dechorionering med pronase.
- Der anvendes flammede glaspipetter til håndtering af dechorionerede embryoner (trin 3.1.10). Pas på ikke at udsætte dechorionerede embryoner for luft eller plast, hvilket vil få embryoner til at lyse. Afchorionerede embryoner håndteres forsigtigt.
- Forbered en ekstra skål med ikke-injicerede embryoner som proxy for at evaluere progression af stadiet (se trin 4.3.5). Sørg for, at proxyembryoner er fra det samme sæt forsøgsembryoner, således at alle embryoner blev befrugtet på samme tid fra de samme forældre. Dette er nyttigt til immunofluorescensanalysen, hvor stadiet er relevant, men er unødvendigt for fænotypeanalysen.
- Brug følgende betingelser for både fænotype- og immunofluorescensassays: 1) ikke-injiceret, ikke-eksponeret, 2) ikke-injiceret, udsat for lys, 3) injiceret, ikke-eksponeret, 4) injiceret, udsat for lys. Vælg mindst 30 embryoner pr. Tilstand. For optimal embryosundhed må du ikke inkubere mere end 30 embryoner pr. Brønd i en 6-brøndplade.
- Efter injektionen overføres embryoner til mærkede petriskåle eller agarosebelagte 6-brøndsplader (til dechorionerede embryoner) og inkuberes ved 28 °C. Embryoner er endnu ikke lysfølsomme. Behandl injicerede embryoner, som om de er lysfølsomme efter 1,5 time efter befrugtning (hpf).
4. Forsøg med lyseksponering
BEMÆRK: Eksponering for ~450 nm lys med en bestråling på 45 W/m2 aktiverer kraftigt bOpto-BMP/Nodal uden åbenlys fototoksicitet (for oplysninger om lysmålere, se materialetabel). Niveauet af optogenetisk aktiveret signalering kan indstilles ved at ændre bestrålingsværdier38. Fototoksicitet skal dog vurderes ved højere bestråling.
- Tidsfølsomt trin. På 4- til 16-cellestadiet, omkring 1,5 hpf, fjernes ubefrugtede og usunde embryoner. Omfordel om nødvendigt for at sikre det samme antal embryoner i hver brønd (højst 30).
BEMÆRK: Det er vigtigt at udføre dette trin omkring 4- til 16-cellestadiet, fordi embryoner bliver lysfølsomme, når det injicerede mRNA oversættes til protein. Vi har ikke observeret tegn på, at embryoner er signifikant lysfølsomme før 1,5 hpf. For at minimere utilsigtet fotoaktivering, hvis man vurderer embryoner efter 1,5 hpf, skal du bruge røde lys eller dække lyskilder - inklusive mikroskoptrin - med rødt gelfilterpapir, der blokerer LOV-dimeriserende blå bølgelængder (materialetabel).- Evaluer embryoner konsekvent for at sikre upartiske fordelinger mellem betingelser og eksperimenter.
- Til fænotypeanalysen skal du bruge følgende 1-dages lyseksponeringsprotokol, der starter ved 1,5 hpf (figur 3A).
- Pak den ueksponerede kontrolplade ind i aluminiumsfolie. Denne plade skal indeholde både ikke-injicerede og injicerede embryoner. Sørg for, at pladen er helt dækket, og pas på ikke at indføre tårer i folien. Denne plade anbringes på den nederste hylde i 28 °C-lyskassen (figur 2A).
- Den eksponerede plade anbringes på den øverste hylde i 28 °C-lysboksen (figur 2A). Sørg for, at dækslet er på skålen for at undgå fordampning af embryomedium. Tænd for det blå lys (en bestråling på 45 W/m2 aktiverer signaleringen robust).
- Luk døren til lysboksen for at undgå utilsigtet eksponering for rumlys. Hvis det ønskes, skal du inkludere et hukommelseskorttermometer inde i lysboksen, inden du lukker døren. Åbn ikke lågen, før fænotypescoren er foretaget 1 dag efter befrugtning (dpf; se trin 5.1).
- Til immunofluorescensanalysen udsættes embryoner for blåt lys i 20 minutter startende omkring 40% epiboly56 (~ 6 hpf) og fastgøres umiddelbart efter lyseksponering sammen med de ikke-eksponerede kontroller (figur 3B). En 20 minutters eksponering for blåt lys ved 40% epiboly reproducerbart aktiverer signalering.
- Omkring 1,5 hkf pakkes både de udsatte og ueksponerede skåle separat ind i aluminiumsfolie. Sørg for, at opvasken er helt dækket, og pas på ikke at indføre tårer i folien. Lad proxyskålen være pakket ud. Anbring de indpakkede fade og den uindpakkede patronskål i 28 °C-lyskassen (figur 2A). Tænd ikke LED'en endnu.
- Hvis du tester mere end en mRNA-mængde, skal du for den ikke-eksponerede tilstand sortere embryoner injiceret med forskellige mængder i individuelle agarosebelagte 6-brøndplader, hvilket vil hjælpe med at minimere utilsigtet lyseksponering under efterfølgende fiksering.
- Luk døren til lysboksen for at undgå utilsigtet eksponering for rumlys.
- Fortynd formaldehydstammen til 4% i 1x fosfatbufret saltvand (PBS) og alikvote 1 ml i præmærkede 2 ml rundbundede mikrocentrifugeglas, et rør pr. Tilstand. Opbevares ved 4 °C.
- Omkring 5 hpf fjernes proxyskålen, der indeholder ikke-injicerede embryoner, og udviklingsstadiet vurderes ved hjælp af et dissekeringsomfang. Proxyembryonernes stadium skal afspejle stadiet af de lysfølsomme embryoner i de indpakkede retter.
- Fjern også de indpakkede retter, så alle retter oplever den samme temperatur. Gentag indtil proxyembryoner har nået 40% epiboly (~ 6 hpf). Embryogeneseprogression er temperaturfølsom54; Derfor, jo længere retterne er uden for inkubatoren, jo længere tid vil det tage for embryonerne at nå 40% epiboly.
- Når proxyembryonerne har nået 40% epiboly, pakkes den blottede skål ud og placeres på den øverste hylde i lyskassen (figur 2A). Lad de(n) ueksponerede tallerken(er) være pakket ind og læg dem på den nederste hylde. Tænd straks det blå lys, luk døren, og indstil en timer til 20 minutter (en bestråling på 45 W/m2 aktiverer signaleringen robust).
- For at forberede fiksering skal du fjerne så meget rumlys som muligt (luk persienner, sluk for ovenlysene, sluk skærme osv.). Sørg for, at de formaldehydholdige rør er korrekt mærket. Umiddelbart før fiksering fjernes formaldehydholdige rør fra 4 °C og anbringes ved siden af lyskassen.
- Tids- og lysfølsomme trin. Vær forberedt på at bevæge dig hurtigt i slutningen af 20 minutters lyseksponering. Efter 20 minutter skal du åbne døren til lysboksen og fjerne den ueksponerede skål.
- Brug en flammet glaspipettespids til hurtigt men forsigtigt at overføre lysfølsomme embryoner til det fremstillede tilsvarende rør med 4% formaldehyd.
- Minimer overførselstiden (<45 s) for lysfølsomme embryoner for at undgå utilsigtet lyseksponering. Sørg for, at der ikke er luftbobler i pipetten. Lufteksponering vil ødelægge dechorionerede embryoner.
- For at skubbe embryoner ud i formaldehyd nedsænkes glaspipettespidsen i formaldehydet og lader embryonerne synke ned i væsken. Minimer mængden af embryomedium, der overføres til formaldehydet, ved at holde embryonerne i slutningen af spidsen.
- Når embryonerne er opført, sættes pipetten tilbage i den samme brønd og pipetteres op og ned for at løsne eventuelle fastlåste embryoner. Dette forhindrer, at embryoner fra flere tilstande ved et uheld ender i et rør.
- Straks trin 4.3.11-4.3.13 gentages for ikke-eksponerede, ikke-injicerede embryoner efterfulgt af de eksponerede embryoner (injicerede og ikke-injicerede).
- Opbevar faste embryoner ved 4 °C natten over.
5. Evaluering af eksperiment
- Fænotype scoring og billeddannelse
- Ved 1 dpf, ideelt mellem 24-32 hpf, skal du fjerne embryoner fra lysboksen for at vurdere fænotyper ved hjælp af et dissekeringsomfang og oprette en scoringsrubrik. Dette er det eksperimentelle endepunkt; Utilsigtet fotoaktivering er ikke længere et problem.
- Scor embryoner, mens du stadig er i korionen for lethed. Brug en pipette eller sonde til at flytte embryoner for at se fra flere vinkler.
- Embryoner, der oplever overskydende BMP-signalering, vil blive ventraliseret med varierende sværhedsgrad som beskrevet detaljeret i Kishimoto et al. 199746 (figur 4A, venstre panel). Embryoner, der oplever overskydende nodalsignalering, vil have en række udviklingsdefekter relateret til overskydende mesendoderm (figur 4A, højre panel)1,3,47,57,58,59,60. De vil ofte have lyseret med 1 dpf.
- Bedøm hvert embryo under alle forhold (figur 4B). Få et oversigtsbillede over alle embryoner i hver brønd. Hvis det ønskes, dechorionere og afbilde individuelle repræsentative embryoner i methylcellulose (figur 4A).
- Immunofluorescensfarvning og billeddannelse
- Efter inkubation af embryoner i 4% formaldehyd ved 4 °C natten over, fjernes formaldehyd og vaskes 3-5x med 1x fosfatbufret saltvand med Tween20 (PBST). Fjern PBST og tilsæt 100% methanol.
- Luk rørene og vend dem forsigtigt om for at blande resterende PBST og methanol. Vask 2x med methanol og opbevar ved -20 °C i mindst 2 timer op til år.
- For pSmad1/5/9 (BMP) immunofluorescensprotokol, se Rogers et al.38. For pSmad2/3 (Nodal) immunofluorescensprotokol, se van Boxtel et al.17 og Rogers et al.47.
- Billede immunfarvede embryoner ved hjælp af et mikroskop, der er i stand til optisk sektionering (f.eks. Et konfokal eller lysarkmikroskop). Undgå mætning og oprethold identiske billeddannelsesbetingelser mellem alle prøver farvet med det samme antistof.
- Billede inden for 5 dage efter afslutning af immunofluorescensfarvningen, fordi fluorescens kan falme over tid.
Representative Results
Målet med de to kontroleksperimenter, der er beskrevet her, er at bestemme, om bOpto-BMP / Nodal aktiverer deres respektive veje som reaktion på eksponering for blåt lys uden at påvirke signalering i fravær af lys, som forventet. Brug disse kontroller til at etablere den passende eksperimentelle arbejdsgang i dit laboratorium, før du anvender bOpto-BMP / Nodal på dine forskningsspørgsmål af interesse.
Fænotypeanalysen kan afsluttes på kun 2 dage og giver en nyttig indikation af signalaktivitet og fototoksicitet (figur 3A). Injicerede, blå lyseksponerede embryoner bør fænokopi overskydende BMP-signalering (ventralisering46; Figur 4A, venstre panel) eller Nodal signalering (udviklingsfejl relateret til ekstra mesendoderm 1,3,47,57,58,59,60 (figur 4A, højre panel)). Hvis de injiceres, er lyseksponerede embryoner aphenotypiske, test kvaliteten af mRNA'et og overvej at injicere mere, og dobbelttjek lyseksponeringsstrategien for at sikre konstant eksponering for stærkt lys (~ 450 nm lys med en bestråling på 45 W / m2 bør kraftigt aktivere signalering). I modsætning hertil skal injicerede, ikke-eksponerede embryoner se identiske ud som ikke-injicerede søskende. Hvis de injiceres, udviser ikke-eksponerede embryoner fænotyper, reducerer mængden af mRNA, der injiceres, og revurderer forsøgsopstillingen for at sikre, at ikke-eksponerede embryoner beskyttes mod lyseksponering. Dataene vist i figur 4B viser resultaterne fra typiske fænotypeforsøg med passende mRNA-mængder og eksponeringsbetingelser: stærk signalaktivitet er tydelig i injicerede, lyseksponerede embryoner, hvor kun en lille brøkdel af injicerede, ueksponerede embryoner udviser fænotyper.
Fænotypeanalysen giver også mulighed for at vurdere fototoksicitet. Hvis fototoksiciteten er ubetydelig, bør ikke-injicerede, lyseksponerede embryoner forekomme vildtype, svarende til ikke-injicerede, ikke-eksponerede embryoner. Hvis ikke-injicerede, lyseksponerede embryoner har defekter, men ikke ikke-injicerede, ikke-eksponerede embryoner, skal det overvejes at reducere lysindstrålingen. En bestråling på 45 W/m2 aktiverer signalering robust uden tydelig fototoksicitet. De data, der er vist i figur 4B , viser ingen bekymrende forskelle mellem ikke-injicerede, lyseksponerede og ikke-injicerede, ikke-eksponerede embryoner, hvilket tyder på ubetydelig fototoksicitet.
Selvom immunofluorescensanalyserne kræver mere tid og kræfter (~ 1 uge) sammenlignet med fænotypeanalysen (2 dage), giver immunofluorescensfarvning en direkte aflæsning af signalvejsaktivitet og kan afsløre subtile signalændringer, der muligvis ikke afspejles af bruttomorfologi. Immunofluorescens er især vigtig for at vurdere reaktioner på bOpto-Nodal, fordi overskydende Nodal-signalering ofte resulterer i, at embryoner lyseres med 1 dpf - hvilket kan have mange årsager - i modsætning til de specifikke ventraliseringsfænotyper, der er karakteristiske for overskydende BMP-signalering46 (figur 4A). Injicerede, blå lyseksponerede embryoner bør udvise en ensartet stigning i Smad1/5/9 eller Smad2/3 phosphorylering sammenlignet med ikke-injicerede, lyseksponerede embryoner. Hvis niveauerne ikke øges eller kun øges svagt, skal du teste kvaliteten af mRNA'et og overveje at injicere mere og dobbelttjekke lyseksponeringsstrategien. En 20 minutters eksponering for blåt lys med en bestråling på 45 W/m2 omkring 40% epiboly bør kraftigt aktivere signalering. Hvis pSmad-farvning ikke er ensartet, kan du prøve at injicere mRNA i midten af cellen (snarere end æggeblommen), hvilket kan resultere i mere ensartet mRNA-fordeling.
Injicerede, ikke-eksponerede embryoner bør have pSmad-niveauer, der kan sammenlignes med ikke-injicerede embryoner. Anekdotisk har vi observeret utæt Smad-phosphorylering med bOpto-Nodal end bOpto-BMP. Hvis pSmad-niveauerne øges i injicerede, ikke-eksponerede embryoner, skal du reducere mængden af injiceret mRNA. Derudover skal forsøgsopstillingen revurderes for at sikre, at 1) ueksponerede embryoner ikke utilsigtet udsættes for lys, og 2) lyseksponeringen under fiksering er minimal. Under fikseringstrinnet er det afgørende at lade ikke gå mere end 45 s mellem fjernelse fra lysboksen og nedsænkning i formaldehyd. Derudover skal du i løbet af dette trin minimere eksponeringen for rumlys og sollys ved at lukke persienner, slukke for hvide lyskilder, bruge rødt lys eller dække hvide lyskilder med blåt lysblokerende gelfilterpapir (materialetabel).
Dataene i figur 4C viser resultaterne fra typiske immunfluorescensfarvningseksperimenter med passende mRNA-mængder og lyseksponeringsbetingelser: pSmad-niveauer er ens i ikke-injicerede og ikke-eksponerede embryoner, mens injicerede, lyseksponerede embryoner udviser højere niveauer af Smad-phosphorylering.
Figur 1: bOpto-BMP og -Nodal signalaktiveringsstrategi . (A) Den endogene BMP-signalvej aktiveres af BMP-ligandbinding, hvilket fører til dannelse af et type I / II-receptorkompleks, phosphorylering af Smad1/5/9 og ekspression af BMP-målgener. Type I-receptorerne BMPR1aa og Acvr1l er også kendt som henholdsvis Alk3 og Alk8. BMPR2a er en type II-receptor. (B) bOpto-BMP konstruerer38. Formodede kinasedomæner fra BMPR1aa og Acvr1l smeltes sammen med LOV; BMPR2a-LOV-fusionen indeholder det formodede kinasedomæne og receptor C-terminaldomæne (CTD). Alle fusioner er membranmålrettede med et myristoyleringsmotiv (Myr). Domæner adskilles af glycin-serin (GS) linkere. Konstruktioner mærkes ved CTD med et HA-epitopmærke. Denne kombination af tre konstruktioner viste sig at aktivere BMP-signalering optimalt. C) aktivering af bOpto-BMP-medieret BMP-signalering. Når de udsættes for blåt lys, dæmpes LOV-domæner, hvilket menes at udløse kompleks dannelse og signalaktivering. (D) Den endogene Nodal-signalvej aktiveres af Nodalligandbinding, hvilket fører til dannelse af et type I / II-receptorkompleks, phosphorylering af Smad2/3 og ekspression af Nodal-målgener. Type I-receptoren Acvr1ba og type II-receptoren Acvr2ba er også kendt som henholdsvis Acvr1b og Acvr2b. (E) bOpto-Nodal konstruktioner39. Formodede kinasedomæner fra Acvr1ba og Acvr2ba smeltes sammen med LOV. Alle fusioner er membranmålrettede med et myristoyleringsmotiv (Myr). Domæner adskilles af GS-linkere. Konstruktioner mærkes ved CTD med et HA-epitopmærke. (F) bOpto-Nodal-medieret Nodal signalering aktivering. Når de udsættes for blåt lys, dæmpes LOV-domæner, hvilket menes at udløse kompleks dannelse og signalaktivering. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Temperaturstyret lysboks til optogenetiske forsøg . (A) En LED-mikropladebelysning er monteret på toppen af en inkubator ved hjælp af en specialbygget LED-holder. Zebrafiskembryoner i en 6-brøndplade på den første hylde udsættes for lys gennem et hul boret ind i toppen af inkubatoren. Den nederste hylde indeholder et andet sæt ueksponerede kontrolembryoner i en aluminiumsfolieindpakket 6-brøndsplade. Inkubatordøren er foret med vejrstripping for at forhindre utilsigtet udsættelse for rumlys eller sollys. (B) Detaljeret beskrivelse af proceduren for at skabe et hul i inkubatoren ved hjælp af en trinboremaskine. Inkubatormodellen, der anvendes her, har et internt panel, der krævede boring af et andet, større hul (materialetabel). (C) Detalje af den brugerdefinerede LED-holder designet til et belysningssystem med tre bølgelængder. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: bOpto-BMP/Nodal eksperiment arbejdsgang. Fænotypeanalyse og pSmad-immunfluorescensfarvning til testaktivitet af bOpto-BMP / Nodal. Embryoner injiceres med mRNA på encellestadiet og overføres til en lysboks senest 1,5 timer efter befrugtning (hpf). A) fænotypeanalyse. Injicerede embryoner og ikke-injicerede søskende opdrættes i mørke eller udsættes for ensartet blåt lys fra 1,5 hpf indtil 1 dag efter befrugtning (dpf). Optogenetisk signalaktivitet kan evalueres ved at score embryoner for fænotyper i overensstemmelse med overskydende vejaktivitet. (B) pSmad immunfluorescens farvning. Injicerede embryoner og ikke-injicerede søskende opdrættes i mørke indtil 40% epiboly (~ 6 hpf). Halvdelen af de injicerede og halvdelen af de ikke-injicerede embryoner udsættes derefter for ensartet blåt lys i 20 minutter. Efter eksponering fikseres alle embryoner og udsættes for immunofluorescensfarvning for pSmad. Forhøjede niveauer af pSmad1/5/9 eller pSmad2/3 afspejler henholdsvis optogenetisk aktivering af BMP eller Nodal signalering. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Vurdering af lysaktiverede signalresponser i zebrafiskembryoner. Zebrafiskembryoner blev injiceret på encellestadiet med mRNA, der koder for bOpto-BMP/Nodal. (A) Embryoner blev enten opdrættet i mørke eller udsat for ensartet blåt lys fra 1,5 time efter befrugtning (hpf). Fænotyper blev scoret 1 dag efter befrugtning (dpf). Repræsentative fænotyper vises. Overskydende BMP-signalering fører til ventralisering (venstre panel), mens overskydende nodalsignalering forårsager udviklingsfejl forbundet med ekstra mesendoderm (højre panel). Skalabjælke = 500 μm. (B) Fænotypekvantificering. Injicerede embryoner og ikke-injicerede søskende blev opdrættet i mørke startende ved 1,5 hpf (sort pære). Halvdelen af de injicerede og halvdelen af de ikke-injicerede embryoner blev udsat for ensartet blåt lys (blå pære). (C) Injicerede embryoner og ikke-injicerede søskende blev opdrættet i mørke fra 1,5 hpf (sort pære). Ved 40% epiboly (~ 6 hpf) blev halvdelen af de injicerede og halvdelen af de ikke-injicerede embryoner udsat for ensartet blåt lys (blå pære). Efter 20 minutter blev alle embryoner fikseret og udsat for immunfluorescensfarvning for enten phosphoryleret Smad1/5/9 eller Smad2/3. Højere pSmad-intensiteter indikerer henholdsvis øget BMP/Nodal-signalering. Skalabjælke = 200 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende fil 1: Lysboks fuld samling. 3D PDF-fil, der viser en 3D-visning af den fulde lysboksenhed. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende fil 2: Lysboks eksploderet visning. 3D PDF-fil, der viser en 3D-visning af den eksploderede lysboksenhed. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende fil 3: Stor let pakning. CAD-tegningsfil (. DWG-format) til fremstilling af den store lyspakning til LED-holderen ved hjælp af en laserskærer. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende fil 4: Lille let pakning. CAD-tegningsfil (. DWG-format) til fremstilling af den lille lyspakning til LED-holderen ved hjælp af en laserskærer. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende fil 5: Akryl platform base. CAD-tegningsfil (. DWG-format) til fremstilling af LED-holderens akrylplatformbase ved hjælp af en laserskærer. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende fil 6: Akrylplatform lodret. CAD-tegningsfil (. DWG-format) til fremstilling af LED-holderens akrylplatform lodret ved hjælp af en laserskærer. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende fil 7: Akrylstøtte tilbage. CAD-tegningsfil (. DWG-format) til fremstilling af LED-holderen akryl venstre støtte ved hjælp af en laserskærer. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende fil 8: Akrylstøtte ret. CAD-tegningsfil (. DWG-format) til fremstilling af LED-holderen akryl højre støtte ved hjælp af en laserskærer. Klik her for at downloade denne fil.
Discussion
Injektion af mRNA er den nuværende strategi for at levere bOpto-BMP/Nodal til zebrafiskembryoner. Denne metode har flere ulemper. For det første varierer den passende mængde mRNA mellem laboratorier. Den anvendte mængde skal være tilstrækkelig til at aktivere signalering robust med lyseksponering, men uden utilsigtet mørk aktivering. Det er en god ide at teste flere mængder for at finde optimale mRNA-niveauer, og når de er etableret, skal du oprette alikvoter af en masterblanding for reproducerbart at introducere den samme mængde mRNA. For det andet kan ujævn fordeling af injiceret mRNA føre til ujævn signalaktivering. Injektion i midten af cellen (ikke æggeblommen) menes at fremme selv mRNA-distribution. Endelig, fordi injiceret mRNA nedbrydes over tid, er denne tilgang muligvis ikke egnet til forsøg i ældre embryoner. I fremtiden kan disse problemer løses ved, at transgene zebrafiskelinjer allestedsnærværende udtrykker bOpto-BMP/Nodal med en moderlig eller lægemiddelinducerbar promotor. Selvom arbejdet med potentielt lysfølsomme voksne zebrafisk kan være en udfordring i denne sammenhæng, er zebrafisk 61,62 og Drosophila 22,34,35,63 transgene med optogenetiske værktøjer blevet udviklet med succes.
At undgå utilsigtet fotoaktivering er en generel udfordring med optogenetiske værktøjer. For nemheds skyld skal injicerede embryoner, der er ældre end 1,5 hpf, behandles som lysfølsomme. Utilsigtet lyseksponering kan ofte undgås ved blot at pakke tallerkener eller tallerkener med aluminiumsfolie. For forsøg, der kræver visuel observation af levende embryoner ældre end 1,5 hpf, er det imidlertid muligt at anvende røde lyskilder eller at dække hvide lyskilder med billigt gelfilterpapir, der blokerer LOV-dimeriserende bølgelængder (materialetabel).
Den her beskrevne lysboks er designet til specifikke applikationer, der kræver præcis kontrol over lysindstrålingsniveauer, dynamik og bølgelængder (figur 2). Andre fordele ved denne lysboks inkluderer ensartet lyseksponering, ubetydelig utilsigtet prøveopvarmning, rigelig plads til flere 6-brøndsplader og langlivede, spektralt velkarakteriserede lyskilder. Imidlertid kan forskellige lyseksponeringsstrategier være at foretrække afhængigt af forskningsapplikationen. Mange laboratorier har udviklet enklere og mere omkostningseffektive ensartede lyseksponeringssystemer med mindre fodaftryk, herunder foring af inkubatorer med LED-strimler, ophængning af LED-paneler over prøver eller inkorporering af lysdioder i kulturopvaskelåg 32,38,39,40,64,65,66 . Det er vigtigt, at lysboksen, der anvendes i denne protokol, ikke tillader brugere uafhængigt at regulere individuelle brønde (i modsætning til Bugaj et al.52) eller give rumlig kontrol over lyseksponering. Rumligt lokaliseret optogenetisk aktivering er blevet demonstreret med bOpto-BMP38 og bOpto-Nodal39 ved hjælp af lasere i henholdsvis SPIM eller konfokale systemer og er også blevet realiseret med mange andre optogenetiske strategier i en række modelsystemer (diskuteret i Rogers og Müller12). Nogle tilgange har endda opnået subcellulær rumlig opløsning 29,30,31. Selvom implementeringen af rumligt lokaliserede lyseksponeringssystemer ligger uden for denne protokols anvendelsesområde, er rumlige aktiveringseksperimenter med bOpto-BMP / Nodal teoretisk mulige med specialudstyr såsom digitale mikrospejlenheder eller maskeringsmetoder. Læsere opfordres til at udforske den omfattende litteratur om DIY-lysbokse til optogenetiske eksperimenter, før de forpligter sig til en lyseksponeringsstrategi (se f.eks. Gerhardt et al.51, Bugaj et al.52, Kumar og Khammash53 og mere på https://www.optobase.org/materials/).
Molekylære optogenetiske strategier tilbyder ofte en højere grad af rumlig tidsmæssig kontrol over biologiske processer sammenlignet med historiske tilgange som mutanter, ektopisk genekspression, rekombinante proteiner og lægemidler. Læsere, der er interesseret i fordelene ved optogenetiske tilgange, kan udforske andre offentliggjorte værktøjer, der er tilgængelige i zebrafisk og andre organismer. Disse inkluderer værktøjer til at manipulere yderligere signalveje 32,65,67,68, regulere genekspression 61,64,66,69,70,71, ændre proteinlokalisering 31,72 og aktivere apoptose 62. Disse værktøjer og mange andre er bekvemt katalogiseret på OptoBase, en kurateret webressource til molekylær optogenetik tilgange28. For dem, der er inspireret til at skabe nye optogenetiske værktøjer, indeholder ressourcen også nyttige beskrivelser af lysresponsive proteiner, der er blevet anvendt i en lang række strategier, herunder lysresponsive proteiner, der reagerer på grønne, røde og nær-infrarøde bølgelængder. Vi er glade for, at det videnskabelige samfund kan realisere det fulde potentiale af molekylære optogenetiske tilgange.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Finansiering til denne protokol blev leveret af NICHD Intramural Program til KWR (ZIA HD009002-01). Vi takker Jeff Farrell og hans laboratorium for deres oplysende feedback, Will Anderson for fremragende teknisk support, Leanne Iannucci for at stressteste protokollen og måle bestråling og NIH Shared Zebrafish-anlægget for deres hårde arbejde med at holde zebrafisken sund.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Building a light box & Light exposure protocol | |||
| #8 x 1" Hex Self-drilling Screw | McMaster-Carr | 99663A222 | 1.4.5 |
| Digital Optical Power and Energy Meter | ThorLabs | PM100D | 1.7 4 |
| Incubator (142 liters) | Boekel Scientific | 139400 | 1.3.1 |
| Incubator Panel Mount (1/4" thick cast black acrylic) | Custom part / Piedmont Plastics | Incubator_panel | 1.4.4 |
| Large HSS Spiral Groove Step Drill Bit | CO-Z | SDB0001TA | 1.3.2 |
| LED lens gasket, Incubator gasket; 1/32" thick black silicone | McMaster-Carr | 5812T12 | 1.4.3 1.4.4 |
| LED microplate illuminator | Prizmatix | NA | 1.1 1.4.3 |
| M3 10mm Cube Standoff | Newark Eletronics | 005.60.533 | 1.4.1 |
| M3 x 10mm 316SS Flat Head Screw | McMaster-Carr | 91801A156 | 1.4.1 |
| M6 x 10mm 316SS Flat Head Screw | McMaster-Carr | 91801A305 | 1.4.3 |
| Memory card thermometer | Fisherbrand | 15-081-111 | 1.9 3.2.1 |
| Microscope Slide Power Meter Sensor Head (150 mW) | ThorLabs | S170C | 1.7 4 |
| Red gel filter paper #E106 | Rosco / B&H Foto & Electronics | 110084014805-E106 | 4.2.1 |
| Side Brackets (1/4" thick cast black acrylic) | Custom part / Piedmont Plastics | Side_bracket | 1.4.2 |
| Vertical Bracket (1/4" thick cast black acrylic) | Custom part / Piedmont Plastics | Vertical_bracket | 1.4.1 |
| Weather stripping: Light duty EPDM foam, 1/2" wd 1/4" tk | McMaster-Carr | 8694K12 | 1.8 |
| Generating mRNA | |||
| EZNA MicroElute Cycle Pure Kit | Omega | D6293-02 | 2.4 |
| GeneJET Miniprep Kit (250 rxns) | Thermo Scientific | K0503 | 2.2 |
| Microsample incubator (Hybex) | SciGene | 1057-30-0 | 2 |
| Microsample incubator 1.5 ml tube block (Hybex) | SciGene | 1057-34-0 | 2 |
| Nanodrop One Spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-ONE-W | 2.4 |
| NotI-HF restriction enzyme | New England Biolabs (NEB) | R3189L | 2.1 |
| pCS2-Opto-Alk3 | Addgene | 207614 | 2 |
| pCS2-Opto-Alk8 | Addgene | 207615 | 2 |
| pCS2-Opto-BMPR2a | Addgene | 207616 | 2 |
| RNeasy Mini Kit (250 rxns) | Qiagen | 74106 | 2.3 |
| Injecting mRNA | |||
| Agarose (UltraPure) | Invitrogen / Thermo Fisher | 16500500 | 3.1.1 |
| 250 ml glass beakers | Fisherbrand | FB100250 | 3.3.2 |
| 6-well dishes (case of 50) | Falcon | 08 772 1B | 3.1.6 |
| B-8A ball joint | Narishige | B-8A | 3.3 |
| Back pressure unit (microinjection rig component) | Applied Scientific Instrumentation (ASI) | BPU | 3.3 |
| Foot switch (microinjection rig component) | Applied Scientific Instrumentation (ASI) | FWS | 3.3 |
| GJ-1 magnetic stand | Narishige | GJ-1 | 3.3 |
| Glass capillaries (4 in, OD 1 mm, filament) | World Precision Instruments | 1B100F-4 | 3.1.11 |
| Glass petri dish bottoms (for dechorionating) | Pyrex | 08-748A | 3.3.2 |
| Glass pipettes (5 3/4" with wide tip) | Kimble-Chase | 63A53WT | 3.1.9 |
| Injection dish molds | Adaptive Science Tools | tu1 | 3.1.3 |
| IP iron plate | Narishige | IP | 3.3 |
| M-152 micromanipulator | Narishige | M-152 | 3.3 |
| Micro pipette holder kit (microinjection rig component) | Applied Scientific Instrumentation (ASI) | MIMPH-MPIP-Kit | 3.3 |
| Micrometers | Meiji Techno America | MA285 | 3.3 |
| MPPI-2 pressure injector (microinjection rig component) | Applied Scientific Instrumentation (ASI) | MPPI-3 | 3.3 |
| Needle puller | World Precision Instruments | PUL-1000 | 3.1.11 |
| Petri dishes (100 mm x 15 mm, case of 500) | Falcon | 08-757-100D | 3.1.2 |
| Pipettor (10 ml, green) | Bel-Art | F37898-0000 | 3.3 |
| Pronase | Roche | 11459643001 | 3.3.2 |
| Squeeze bottles (500 ml) | Nalgene / Thermo Scientific | 2402-0500 | 3.3 |
References
- Jones, W. D., Mullins, M. C. Cell signaling pathways controlling an axis organizing center in the zebrafish. Current Topics in Developmental Biology. 150, 149-209 (2022).
- Hill, C. S. Establishment and interpretation of NODAL and BMP signaling gradients in early vertebrate development. Current Topics in Developmental Biology. 149, 311-340 (2022).
- Zinski, J., Tajer, B., Mullins, M. C. TGF-β Family Signaling in Early Vertebrate Development. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 10 (6), a033274 (2018).
- Shore, E. M., Kaplan, F. S. Inherited human diseases of heterotopic bone formation. Nature Reviews. Rheumatology. 6 (9), 518-527 (2010).
- Hebron, K. E., Hernandez, E. R., Yohe, M. E. The RASopathies: from pathogenetics to therapeutics. Disease Models & Mechanisms. 15 (2), dmm049107 (2022).
- Grant, M. G., Patterson, V. L., Grimes, D. T., Burdine, R. D. Modeling Syndromic Congenital Heart Defects in Zebrafish. Current Topics in Developmental Biology. 124, 1-40 (2017).
- Nusse, R., Clevers, H. Wnt/beta-Catenin Signaling, Disease, and Emerging Therapeutic Modalities. Cell. 169 (6), 985-999 (2017).
- Farahani, P. E., Reed, E. H., Underhill, E. J., Aoki, K., Toettcher, J. E. Signaling, Deconstructed: Using Optogenetics to Dissect and Direct Information Flow in Biological Systems. Annual Review of Biomedical Engineering. 23, 61-87 (2021).
- Purvis, J. E., Lahav, G. Encoding and decoding cellular information through signaling dynamics. Cell. 152 (5), 945-956 (2013).
- Wibisana, J. N., Okada, M. Encoding and decoding NF-kappaB nuclear dynamics. Current Opinion in Cell Biology. 77, 102103 (2022).
- Friedel, L., Loewer, A. The guardian's choice: how p53 enables context-specific decision-making in individual cells. TheFEBS Journal. 289 (1), 40-52 (2022).
- Rogers, K. W., Müller, P. Optogenetic approaches to investigate spatiotemporal signaling during development. Current Topics in Developmental Biology. 137, 37-77 (2020).
- Johnson, H. E., Toettcher, J. E. Illuminating developmental biology with cellular optogenetics. Current Opinion in Biotechnology. 52, 42-48 (2018).
- Bosman, S. L., Sonnen, K. F.
- Li, P., Elowitz, M. B. Communication codes in developmental signaling pathways. Development. 146 (12), dev170977 (2019).
- Tucker, J. A., Mintzer, K. A., Mullins, M. C. The BMP signaling gradient patterns dorsoventral tissues in a temporally progressive manner along the anteroposterior axis. Developmental Cell. 14 (1), 108-119 (2008).
- van Boxtel, A. L., et al. A temporal window for signal activation dictates the dimensions of a Nodal signaling domain. Developmental Cell. 35 (2), 175-185 (2015).
- Sorre, B., Warmflash, A., Brivanlou, A. H., Siggia, E. D. Encoding of temporal signals by the TGF-β pathway and implications for embryonic patterning. Developmental Cell. 30 (3), 334-342 (2014).
- Economou, A. D., Hill, C. S. Temporal dynamics in the formation and interpretation of Nodal and BMP morphogen gradients. Current Topics in Developmental Biology. 137, 363-389 (2020).
- Rogers, K. W., Schier, A. F. Morphogen gradients: from generation to interpretation. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 27, 377-407 (2011).
- Barkai, N., Shilo, B. Z. Robust generation and decoding of morphogen gradients. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 1 (5), a001990 (2009).
- Johnson, H. E., Djabrayan, N. J. V., Shvartsman, S. Y., Toettcher, J. E. Optogenetic Rescue of a Patterning Mutant. Current Biology. 30 (17), 3414-3424 (2020).
- Imayoshi, I., et al. Oscillatory control of factors determining multipotency and fate in mouse neural progenitors. Science. 342 (6163), 1203-1208 (2013).
- Lin, B., et al. Synthetic spatially graded Rac activation drives cell polarization and movement. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (52), E3668-E3677 (2012).
- Cui, K. W., et al. Spatially controlled stem cell differentiation via morphogen gradients: A comparison of static and dynamic microfluidic platforms. Journal of Vacuum Science & Technology. A, Vaccum, Surfaces, and Films. 38 (3), 033205 (2020).
- Faden, F., Mielke, S., Lange, D., Dissmeyer, N. Generic tools for conditionally altering protein abundance and phenotypes on demand. Biological Chemistry. 395 (7-8), 737-762 (2014).
- Shoji, W., Sato-Maeda, M. Application of heat shock promoter in transgenic zebrafish. Development, Growth & Differentiation. 50 (6), 401-406 (2008).
- Kolar, K., Knobloch, C., Stork, H., Znidaric, M., Weber, W. OptoBase: A web platform for molecular optogenetics. ACS Synthetic Biology. 7 (7), 1825-1828 (2018).
- Benedetti, L., et al. Light-activated protein interaction with high spatial subcellular confinement. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (10), E2238-E2245 (2018).
- Krueger, D., De Renzis, S. Optogenetic Methods to Control Tissue Mechanics in Drosophila. Methods in Molecular Biology. 2540, 269-283 (2022).
- Buckley, C. E. Optogenetic Control of Subcellular Protein Location and Signaling in Vertebrate Embryos. Methods in Molecular Biology. 1920, 143-162 (2019).
- Čapek, D., et al. Light-activated Frizzled7 reveals a permissive role of non-canonical wnt signaling in mesendoderm cell migration. Elife. 8, e42093 (2019).
- Krishnamurthy, V. V., et al. Reversible optogenetic control of kinase activity during differentiation and embryonic development. Development. 143 (21), 4085-4094 (2016).
- Huang, A., Amourda, C., Zhang, S., Tolwinski, N. S., Saunders, T. E. Decoding temporal interpretation of the morphogen Bicoid in the early Drosophila embryo. Elife. 6, e26258 (2017).
- Johnson, H. E., Toettcher, J. E. Signaling dynamics control cell fate in the early Drosophila embryo. Developmental Cell. 48 (3), 361.e3-370.e3 (2019).
- Aoki, K., et al. Stochastic ERK activation induced by noise and cell-to-cell propagation regulates cell density-dependent proliferation. Molecular Cell. 52 (4), 529-540 (2013).
- Chow, R. W., Vermot, J. The rise of photoresponsive protein technologies applications in vivo: a spotlight on zebrafish developmental and cell biology. F1000Research. , (2017).
- Rogers, K. W., ElGamacy, M., Jordan, B. M., Müller, P. Optogenetic investigation of BMP target gene expression diversity. Elife. 9, e58641 (2020).
- Sako, K., et al. Optogenetic control of Nodal signaling reveals a temporal pattern of Nodal signaling regulating cell fate specification during gastrulation. Cell Reports. 16 (3), 866-877 (2016).
- Grusch, M., et al. Spatio-temporally precise activation of engineered receptor tyrosine kinases by light. The EMBO Journal. 33 (15), 1713-1726 (2014).
- Crossman, S. H., Janovjak, H. Light-activated receptor tyrosine kinases: Designs and applications. Current Opinion in Pharmacology. 63, 102197 (2022).
- Kainrath, S., Janovjak, H. Design and Application of Light-Regulated Receptor Tyrosine Kinases. Methods in Molecular Biology. 2173, 233-246 (2020).
- Takahashi, F., et al. AUREOCHROME, a photoreceptor required for photomorphogenesis in stramenopiles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (49), 19625-19630 (2007).
- Toyooka, T., Hisatomi, O., Takahashi, F., Kataoka, H., Terazima, M.
- Vopalensky, P., Pralow, S., Vastenhouw, N. L. Reduced expression of the Nodal co-receptor Oep causes loss of mesendodermal competence in zebrafish. Development. 145 (5), dev.158832 (2018).
- Kishimoto, Y., Lee, K. H., Zon, L., Hammerschmidt, M., Schulte-Merker, S. The molecular nature of zebrafish swirl: BMP2 function is essential during early dorsoventral patterning. Development. 124 (22), 4457-4466 (1997).
- Rogers, K. W., et al. Nodal patterning without Lefty inhibitory feedback is functional but fragile. Elife. 6, e28785 (2017).
- Dubrulle, J., et al. Response to Nodal morphogen gradient is determined by the kinetics of target gene induction. Elife. 4, e05042 (2015).
- Harvey, S. A., Smith, J. C. Visualisation and quantification of morphogen gradient formation in the zebrafish. PLoS Biology. 7 (5), e1000101 (2009).
- Zinski, J., Tuazon, F., Huang, Y., Mullins, M., Umulis, D. Imaging and Quantification of P-Smad1/5 in Zebrafish Blastula and Gastrula Embryos. Methods in Molecular Biology. 1891, 135-154 (2019).
- Gerhardt, K. P., Castillo-Hair, S. M., Tabor, J. J. DIY optogenetics: Building, programming, and using the Light Plate Apparatus. Methods in Enzymology. 624, 197-226 (2019).
- Bugaj, L. J., Lim, W. A. High-throughput multicolor optogenetics in microwell plates. Nature Protocols. 14 (7), 2205-2228 (2019).
- Kumar, S., Khammash, M. Platforms for Optogenetic Stimulation and Feedback Control. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 10, 918917 (2022).
- Urushibata, H., et al. Control of Developmental Speed in Zebrafish Embryos Using Different Incubation Temperatures. Zebrafish. 18 (5), 316-325 (2021).
- Rogers, K. W., Bläßle, A., Schier, A. F., Müller, P. Measuring protein stability in living zebrafish embryos using fluorescence decay after photoconversion (FDAP). Journal of Visualized Experiments. (95), e52266 (2015).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F.
- Feldman, B., et al. Zebrafish organizer development and germ-layer formation require nodal-related signals. Nature. 395 (6698), 181-185 (1998).
- Shimizu, T., et al. Cooperative roles of Bozozok/Dharma and Nodal-related proteins in the formation of the dorsal organizer in zebrafish. Mechanisms of Development. 91 (1-2), 293-303 (2000).
- Rebagliati, M. R., Toyama, R., Fricke, C., Haffter, P., Dawid, I. B. Zebrafish nodal-related genes are implicated in axial patterning and establishing left-right asymmetry. Developmental Biology. 199 (2), 261-272 (1998).
- Gritsman, K., Talbot, W. S., Schier, A. F.
- LaBelle, J., et al. TAEL 2.0: An Improved Optogenetic Expression System for Zebrafish. Zebrafish. 18 (1), 20-28 (2021).
- Mruk, K., Ciepla, P., Piza, P. A., Alnaqib, M. A., Chen, J. K. Targeted cell ablation in zebrafish using optogenetic transcriptional control. Development. 147 (12), dev183640 (2020).
- Johnson, H. E., et al. The spatiotemporal limits of developmental Erk signaling. Developmental Cell. 40 (2), 185-192 (2017).
- Motta-Mena, L. B., et al. An optogenetic gene expression system with rapid activation and deactivation kinetics. Nature Chemical Biology. 10 (3), 196-202 (2014).
- Patel, A. L., et al.
- LaBelle, J., Woo, S. Light-Induced GFP Expression in Zebrafish Embryos using the Optogenetic TAEL/C120 System. Journal of Visualized Experiments. (174), e62818 (2021).
- Kainrath, S., Stadler, M., Reichhart, E., Distel, M., Janovjak, H. Green-light-induced inactivation of receptor signaling using cobalamin-binding domains. Angewandte Chemie. 56 (16), 4608-4611 (2017).
- Benman, W., et al. Temperature-responsive optogenetic probes of cell signaling. Nat Chem Biol. 18 (2), 152-160 (2022).
- Reade, A., et al. TAEL: a zebrafish-optimized optogenetic gene expression system with fine spatial and temporal control. Development. 144 (2), 345-355 (2017).
- Putri, R. R., Chen, L. Spatiotemporal control of zebrafish (Danio rerio) gene expression using a light-activated CRISPR activation system. Gene. 677, 273-279 (2018).
- Liu, H., Gomez, G., Lin, S., Lin, S., Lin, C.
- Buckley, C. E., et al. Reversible optogenetic control of subcellular protein localization in a live vertebrate embryo. Developmental Cell. 36 (1), 117-126 (2016).
