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Developmental Biology

ज़ेब्राफिश भ्रूण में ऑप्टोजेनेटिक सिग्नलिंग सक्रियण

Published: October 27, 2023 doi: 10.3791/65733
Automatic Translation
*1, *1, 2, 2, 1
1Division of Developmental Biology, Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development, NIH, 2Instrumentation Development and Engineering Application Solutions, National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering, NIH
* These authors contributed equally

Summary

सिग्नलिंग मार्गों का ऑप्टोजेनेटिक हेरफेर यह जांचने के लिए एक शक्तिशाली रणनीति हो सकती है कि विकास, पुनर्जनन, होमियोस्टेसिस और बीमारी में सिग्नलिंग को कैसे डिकोड किया जाता है। यह प्रोटोकॉल प्रारंभिक जेब्राफिश भ्रूण में प्रकाश-ऑक्सीजन-वोल्टेज सेंसिंग डोमेन-आधारित नोडल और हड्डी मॉर्फोजेनिक प्रोटीन (बीएमपी) सिग्नलिंग एक्टिवेटर का उपयोग करने के लिए व्यावहारिक दिशानिर्देश प्रदान करता है।

Abstract

सिग्नलिंग रास्ते विकास, पुनर्जनन, होमियोस्टैसिस और बीमारी सहित मौलिक जैविक प्रक्रियाओं को ऑर्केस्ट्रेट करते हैं। प्रयोगात्मक रूप से सिग्नलिंग में हेरफेर करने के तरीकों को यह समझने की आवश्यकता है कि इन व्यापक संदर्भों में सिग्नलिंग की व्याख्या कैसे की जाती है। आणविक ऑप्टोजेनेटिक उपकरण उच्च स्तर के स्थानिक नियंत्रण के साथ सिग्नलिंग मार्ग गतिविधि के प्रतिवर्ती, ट्यून करने योग्य जोड़तोड़ प्रदान कर सकते हैं और इन विट्रो, पूर्व विवो और विवो में लागू किए गए हैं। ये उपकरण प्रकाश-उत्तरदायी प्रोटीन डोमेन को जोड़ते हैं, जैसे कि ब्लू लाइट होमोडीमेराइजिंग लाइट-ऑक्सीजन-वोल्टेज सेंसिंग (एलओवी) डोमेन, सिग्नलिंग प्रभावकों के साथ सिग्नलिंग पर प्रकाश-निर्भर प्रयोगात्मक नियंत्रण प्रदान करने के लिए। यह प्रोटोकॉल LOV-आधारित अस्थि morphogenetic प्रोटीन (BMP) और नोडल सिग्नलिंग एक्टिवेटर bOpto-BMP और bOpto-नोडल ऑप्टिकली सुलभ प्रारंभिक zebrafish भ्रूण में उपयोग करने के लिए व्यावहारिक दिशानिर्देश प्रदान करता है। यह दो नियंत्रण प्रयोगों का वर्णन करता है: उपयुक्त प्रयोगात्मक स्थितियों को निर्धारित करने के लिए एक त्वरित फेनोटाइप परख, और सीधे सिग्नलिंग का आकलन करने के लिए एक इम्यूनोफ्लोरेसेंस परख। साथ में, ये नियंत्रण प्रयोग प्रारंभिक जेब्राफिश भ्रूण में ऑप्टोजेनेटिक उपकरणों का उपयोग करने के लिए एक पाइपलाइन स्थापित करने में मदद कर सकते हैं। ये रणनीतियाँ विकास, स्वास्थ्य और शरीर विज्ञान में सिग्नलिंग की भूमिकाओं की जांच करने के लिए एक शक्तिशाली मंच प्रदान करती हैं।

Introduction

सिग्नलिंग मार्ग कोशिकाओं को अपने पर्यावरण का जवाब देने और ऊतक- और जीव-व्यापी तराजू पर गतिविधियों का समन्वय करने की अनुमति देते हैं। भ्रूण के विकास के लिए महत्वपूर्ण संकेतों में टीजीएफ-बीटा सुपरफैमिली के सदस्य हड्डी मॉर्फोजेनेटिक प्रोटीन (बीएमपी) और नोडल 1,2,3 शामिल हैं। भ्रूणजनन के दौरान, इन संकेतों और अन्य द्वारा विनियमित मार्ग जीन अभिव्यक्ति और अतिरिक्त प्रक्रियाओं को नियंत्रित करके शरीर की योजना को पैटर्न करते हैं ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि विविध ऊतक और अंग विकसित होते हैं और ठीक से इंटरफेस करते हैं। जन्म दोष और कैंसर सहित विकृति, तब हो सकती है जब सिग्नलिंग या सिग्नलिंग के जवाब 4,5,6,7 परेशान होते हैं। सिग्नलिंग में कठोर जांच के बावजूद, विशेष रूप से विकास 12,13,14,15,16,17,18,19 के दौरान विभिन्नसंदर्भों में स्तरों और गतिशीलता को कैसे डिकोड किया जाता है, इसके बारे में बहुत कुछ खोजा जाना बाकी है।

यह समझने के लिए कि सिग्नलिंग को कैसे डिकोड किया जाता है, एक आदर्श प्रयोग सिग्नलिंग स्तर, समय और/या गतिशीलता में हेरफेर करना होगा-उच्च स्तर के स्थानिक और लौकिक नियंत्रण के साथ-और परिणामों का आकलन करना। उदाहरण के लिए, सटीक स्थानिक संकेतन ढाल विकासशील ऊतकों20,21 पैटर्न करने के लिए प्रस्तावित कर रहे हैं. सिग्नलिंग ढाल स्थानिक वितरण को बदलने से इस परिकल्पना22 का परीक्षण करने में मदद मिलेगी। इसके अतिरिक्त, विविध सेलुलर प्रतिक्रियाओं को उत्पन्न करने में सिग्नलिंग गतिशीलता का महत्व स्पष्ट होता जा रहा है: एक ही सिग्नलिंग मार्ग कोशिकाओं को सिग्नलिंग आवृत्ति के आधार पर अंतर करने या प्रसार करने का निर्देश दे सकता है, उदाहरण के लिए 9,23। प्रायोगिक प्रतिमान जिसमें सिग्नलिंग गतिशीलता को आसानी से हेरफेर किया जा सकता है, गतिशीलता और सेल भाग्य निर्णयों 8,12,13,14,15के बीच संबंधों का पता लगाने के लिए मूल्यवान होगा।

ऐतिहासिक रूप से, विकासात्मक संदर्भों में सिग्नलिंग में हेरफेर करने के लिए कई तरीकों का इस्तेमाल किया गया है, जिससे मौलिक खोजें 1,2,3 हो गई हैं। सिग्नलिंग को पाथवे लॉस-ऑफ-फंक्शन म्यूटेंट, एक्टोपिक इनहिबिटर एक्सप्रेशन या विरोधी दवाओं का उपयोग करके अवरुद्ध किया जा सकता है। सिग्नलिंग को सक्रिय करने के तरीकों में एगोनिस्ट ड्रग्स, रिकॉम्बिनेंट लिगैंड्स, लिगेंड की एक्टोपिक अभिव्यक्ति या संवैधानिक रूप से सक्रिय रिसेप्टर्स, और पाथवे इनहिबिटर लॉस-ऑफ-फंक्शन म्यूटेंट शामिल हैं। ये विधियां प्रयोगात्मक नियंत्रण की निरंतरता के साथ होती हैं। उदाहरण के लिए, म्यूटेंट और एक्टोपिक अभिव्यक्ति सातत्य के स्लेजहैमर पक्ष पर गिर सकती है: इन दृष्टिकोणों के साथ, मार्ग गतिविधि में नाटकीय, प्रणालीगत परिवर्तन प्रारंभिक मृत्यु का कारण बन सकते हैं और बाद के चरणों में जांच को रोक सकते हैं, या समय के साथ प्लियोट्रोपिक प्रभाव हो सकते हैं जिन्हें अलग करना मुश्किल है। इसके अतिरिक्त, एक समय में एक सिग्नलिंग सुविधा में स्वतंत्र रूप से हेरफेर करना अक्सर चुनौतीपूर्ण होता है, जैसे स्तर या अवधि। सातत्य के दूसरे छोर की ओर, कुछ विधियां अधिक सटीक प्रयोगात्मक नियंत्रण प्रदान करती हैं, जैसे कि माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस जो नमूनों को अस्थायी और कभी-कभी स्थानिक नियंत्रण 18,24,25 के साथ दवाओं या पुनः संयोजक प्रोटीन को उजागर करते हैं, या आनुवंशिक तरीकों से, जिसमें गर्मी के झटके-इंड्यूसिबल और ऊतक-विशिष्ट प्रमोटर शामिल हैं जो समान लाभ16,26,27 प्रदान कर सकते हैं . हालांकि, इन विधियों को निष्पादित करना मुश्किल हो सकता है, प्रतिवर्ती नहीं हो सकता है, अपेक्षाकृत धीमी गति से कैनेटीक्स या खराब रिज़ॉल्यूशन हो सकता है, और कुछ मॉडल सिस्टम में अनुपलब्ध हो सकता है।

आणविक ऑप्टोजेनेटिक दृष्टिकोण इस टूलकिट के लिए एक शक्तिशाली अतिरिक्त हैं। ये दृष्टिकोण प्रोटीन का उपयोग करते हैं जो जैविक प्रक्रियाओं में हेरफेर करने के लिए विभिन्न प्रकाश तरंग दैर्ध्य का जवाब देते हैं, जिसमें सिग्नलिंग 8,12,13,14,15 शामिल है, और सेल संस्कृति से पूरे जानवरों12,13,28 तक विभिन्न प्रणालियों में उपयोग के लिए दशकों से विकसित किया गया है . ऐतिहासिक दृष्टिकोणों की तुलना में, आणविक ऑप्टोजेनेटिक्स अक्सर जैविक प्रक्रियाओं पर उच्च स्तर के स्थानिक नियंत्रण की पेशकश कर सकते हैं: ऑप्टोजेनेटिक सिस्टम में नियंत्रक हल्का है, और प्रकाश तरंग दैर्ध्य, तीव्रता, अवधि और जोखिम आवृत्ति का नियंत्रण अपेक्षाकृत सरल है। कॉन्फोकल और दो-फोटॉन माइक्रोस्कोप जैसी परिष्कृत प्रणालियों के साथ, उपकोशिकीय रेंज में स्थानिक नियंत्रण 29,30,31 संभव है। ऑप्टोजेनेटिक रूप से सिग्नलिंग में हेरफेर करने के लिए उपकरण कई प्रणालियों में विकसित और लागू किए गए हैं, जिनमें जॉनसन एट अल.22, एपेक एट अल.32, कृष्णमूर्ति एट अल.33, और हुआंग एट अल.34 में वर्णित हैं। उदाहरण के लिए, ऑप्टोजेनेटिक्स द्वारा वहन किए गए स्थानिक नियंत्रण का शोषण, इस रणनीति का उपयोग हाल ही में ड्रोसोफिला भ्रूण में एक सिग्नलिंग ढाल को संशोधित करने के लिए किया गया था, यह दर्शाता है कि मक्खी भ्रूणजनन इस ढाल22 में परिवर्तन के लिए आश्चर्यजनक रूप से मजबूत है। ऑप्टोजेनेटिक सिग्नलिंग एक्टिवेटर्स की उत्क्रमणीयता और तेजी से ऑन/ऑफ कैनेटीक्स ने उन्हें सिग्नलिंग डायनेमिक्स 8,12,13,14,15,34,35,36 के डिकोडिंग की जांच के लिए आकर्षक उपकरण भी बना दिया है।

प्रारंभिक ज़ेब्राफिश भ्रूण ऑप्टोजेनेटिक अध्ययन के लिए अच्छी तरह से अनुकूल विवो प्रणाली में है क्योंकि यह बाहरी रूप से निषेचित, पारदर्शी, माइक्रोस्कोपी-अनुकूल और आनुवंशिक रूप से ट्रैक्टेबल है। प्रकाश एक्सपोजर भ्रूण है कि मां के बाहर विकसित करने के लिए वितरित करने के लिए आसान है, प्रकाश घुसना और उनके गैर अपारदर्शी ऊतकों का उपयोग कर सकते हैं, जीवित zebrafish भ्रूण इमेजिंग अच्छी तरह से सहन (पारदर्शी होने के अलावा), और मौजूदा आनुवंशिक तरीकों नॉकडाउन और overexpression प्रयोगों के लिए सीधा अवसर प्रदान करते हैं, उपयोगी ट्रांसजेनिक्स37 के विकास के अलावा.

हाल ही में, ऑप्टोजेनेटिक उपकरण नीले प्रकाश जोखिम (चित्रा 1) के साथ जेब्राफिश भ्रूण में बीएमपी38 और नोडल39 सिग्नलिंग को सक्रिय करने के लिए विकसित किए गए थे। हम इन उपकरणों को bOpto-BMP और bOpto-Nodal (ब्लू लाइट-एक्टिवेटेड के लिए b और ऑप्टोजेनेटिक के लिए Opto) के रूप में संदर्भित करते हैं। bOpto-BMP/नोडल समान मार्ग सक्रियण तंत्र पर आधारित हैं। बीएमपी या नोडल लिगैंड को उनके संबंधित रिसेप्टर सेरीन-थ्रेओनीन किनेसेस के लिए बांधना रिसेप्टर किनेज डोमेन इंटरैक्शन को चलाता है जो सिग्नलिंग प्रभावकों के फॉस्फोराइलेशन की ओर ले जाता है (बीएमपी के लिए स्मैड 1/5/9 और नोडल के लिए स्मैड 2/3)। फॉस्फोराइलेटेड सिग्नलिंग प्रभावक तब नाभिक में स्थानांतरित होते हैं और लक्ष्य जीन अभिव्यक्ति3(चित्रा 1ए,डी)को विनियमित करते हैं। इन रिसेप्टर किनेज इंटरैक्शन को रिसेप्टर किनेसेस को प्रकाश-उत्तरदायी डिमराइजिंग प्रोटीन के साथ युग्मन करके प्रकाश-उत्तरदायी बनाया जा सकता है: प्रकाश जोखिम के साथ, इन काइमेरिक प्रोटीनों को मंद होना चाहिए, जिससे रिसेप्टर किनेज डोमेन बातचीत कर सकें और सिग्नलिंग को सक्रिय कर सकें (चित्रा 1 बी, सी, ई, एफ)। महत्वपूर्ण रूप से, अंतर्जात रिसेप्टर्स के विपरीत, बीओपीटीओ-बीएमपी/नोडल में बाह्य लिगैंड-बाइंडिंग डोमेन नहीं होते हैं, जो लिगैंड-स्वतंत्र गतिविधि(चित्रा 1सी, एफ)सुनिश्चित करते हैं। यह ऑप्टोजेनेटिक सक्रियण रणनीति पहले रिसेप्टर टायरोसिन किनेसेस40,41,42 के साथ हासिल की गई थी और फिर रिसेप्टर सेरीन-थ्रेओनीन किनेसेस पर लागू की गई थी।

bOpto-BMP/नोडल शैवाल Vaucheria fridiga AUREO1 प्रोटीन (VfLOV)43,44से नीले प्रकाश-उत्तरदायी (~ 450 एनएम) homodimerizing प्रकाश-ऑक्सीजन-वोल्टेज संवेदन (LOV) डोमेन का उपयोग करें। इन निर्माणों में एक झिल्ली-लक्ष्यीकरण मायरिस्टोइलेशन आकृति होती है, जिसके बाद बीएमपी या नोडल रिसेप्टर किनेज डोमेन होते हैं, जो एलओवी डोमेन(चित्रा 1बी,ई)से जुड़े होते हैं। ब्लू लाइट एक्सपोजर को एलओवी होमोडीमेराइजेशन का कारण बनना चाहिए, जिसके परिणामस्वरूप रिसेप्टर किनेज डोमेन इंटरैक्शन होता है जो संबंधित स्मैड फॉस्फोराइलेशन और मार्ग सक्रियण(चित्रा 1सी, एफ)का कारण बनता है। bOpto-BMP के लिए, Acvr1l (जिसे Alk8 के रूप में भी जाना जाता है) और BMPR1aa (जिसे Alk3 के रूप में भी जाना जाता है) से टाइप I रिसेप्टर किनेज डोमेन के साथ निर्माणों का संयोजन और BMPR2a से टाइप II रिसेप्टर किनेज डोमेन सिग्नलिंग38 (Addgene #207614, #207615, और #207616) को बेहतर ढंग से सक्रिय करने के लिए पाया गया था। bOpto-नोडल के लिए, Acvr1ba से टाइप I रिसेप्टर किनेज डोमेन और Acvr2ba से टाइप II रिसेप्टर किनेज डोमेन के साथ निर्माणों का एक संयोजन39 का उपयोग किया जाता है।

bOpto-BMP/Nodal को एक-कोशिका चरण में mRNA इंजेक्ट करके प्रारंभिक ज़ेब्राफिश भ्रूण में पेश किया गया है, और नोडल व्याख्या39 में सिग्नलिंग अवधि की भूमिका की जांच करने के लिए उपयोग किया जाता है, यह निर्धारित करने के लिए कि ज़ेब्राफिश नोडल45 का जवाब देने की क्षमता क्यों खो देती है, और यह जांचने के लिए कि बीएमपी लक्ष्य जीन विभिन्न बीएमपी सिग्नलिंग स्तरों38 पर कैसे प्रतिक्रिया देते हैं. यह संभावना है कि ये उपकरण भविष्य की जांच की एक विविध श्रेणी में उपयोगी बने रहेंगे। हालांकि, ऑप्टोजेनेटिक सिग्नलिंग एक्टिवेटर्स की ताकत भी उनकी कमजोरी है: अनजाने में एक्टोपिक सिग्नलिंग गतिविधि से बचने के लिए प्रकाश-संवेदनशील नमूनों को देखभाल के साथ इलाज किया जाना चाहिए। कमरे की रोशनी या सूरज की रोशनी के संपर्क में आने से bOpto-BMP/Nodal सक्रिय हो सकता है।

यह प्रोटोकॉल प्रारंभिक जेब्राफिश भ्रूण में एमआरएनए-एन्कोडेड एलओवी-आधारित बीएमपी और नोडल एक्टिवेटर का उपयोग करने के लिए व्यावहारिक सुझाव प्रदान करता है। यह वर्दी प्रकाश जोखिम और तापमान (चित्रा 2, पूरक फ़ाइल 1, पूरक फ़ाइल 2, पूरक फ़ाइल 3, पूरक फ़ाइल 4, पूरक फ़ाइल 5, पूरक फ़ाइल 6, पूरक फ़ाइल 7, पूरक फ़ाइल 8) को नियंत्रित करने के लिए एक प्रकाश बॉक्स बनाने के लिए एक रणनीति का विवरण देकर शुरू होता है। यह तब दो प्रमुख नियंत्रण प्रयोगों का वर्णन करता है जो यह निर्धारित करते हैं कि क्या एक ऑप्टोजेनेटिक सिग्नलिंग एक्टिवेटर अपेक्षित व्यवहार कर रहा है-यानी, प्रकाश (चित्रा 3) के संपर्क में आने पर केवल मार्ग गतिविधि को सक्रिय करना। पहले नियंत्रण परख प्रकाश-उजागर और अनपेक्षित भ्रूण(चित्रा 3ए)में एक दिन के बाद निषेचन में फेनोटाइप की जांच करना शामिल है। एमआरएनए-इंजेक्शन प्रकाश-उजागर भ्रूण, लेकिन अनपेक्षित भ्रूण नहीं, बीएमपी या नोडल ओवरएक्सप्रेशन (चित्रा 4ए, बी; विशेष रूप से बीएमपी फेनोटाइप इस समय बिंदु46 पर स्पष्ट रूप से अलग हैं)। यह परख एक तेजी से गतिविधि readout प्रदान करता है. दूसरे नियंत्रण परख में, यह निर्धारित करने के लिए कि क्या फेनोटाइप विशेष रूप से अतिरिक्त बीएमपी या नोडल सिग्नलिंग के कारण होते हैं और सीधे सिग्नलिंग स्तरों में परिवर्तन का निरीक्षण करने के लिए, इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला फॉस्फोराइलेटेड सिग्नलिंग प्रभावकों (pSmad1/5/9 या pSmad2/3, क्रमशः) का पता लगाने के लिए उपयोग किया जाता है) देर से ब्लास्टुला / प्रारंभिक गैस्ट्रुलेशन चरण के आसपास 20 मिनट के प्रकाश जोखिम के बाद, जब सिग्नलिंग गतिविधि अच्छी तरह से12 वर्णित की गई है, 16,17,47,48,49,50 (चित्र 3B और चित्र 4C)। (ध्यान दें कि, हालांकि स्थानिक रूप से स्थानीयकृत सक्रियण दोनों bOpto-BMP38 और bOpto-Nodal39 के लिए प्रदर्शित किया गया है, यह प्रोटोकॉल केवल समान प्रकाश जोखिम और सिग्नलिंग सक्रियण रणनीतियों का वर्णन करता है। आदर्श स्थानीय प्रयोगात्मक स्थितियों को निर्धारित करने के लिए विशिष्ट शोध प्रश्नों के लिए bOpto-BMP/Nodal लागू करने से पहले इन नियंत्रण प्रयोगों को निष्पादित करना उचित है।

Protocol

जेब्राफिश अनुसंधान प्रोटोकॉल की समीक्षा की गई और राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (एएसपी 21-008) में एनआईसीएचडी पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया। सभी ज़ेब्राफिश अध्ययन प्रयोगशाला जानवरों की देखभाल और उपयोग के लिए गाइड के अनुपालन में किए गए थे।

1. एक प्रकाश बॉक्स का निर्माण

  1. प्रकाश जोखिम और तापमान को नियंत्रित करने के लिए, एक प्रकाश बॉक्स का निर्माण करें जो प्रकाश स्रोत के रूप में प्रकाश उत्सर्जक डायोड (एलईडी) माइक्रोप्लेट प्रकाशक का उपयोग करता है (चित्र 2 ए, सामग्री की तालिका, पूरक फ़ाइल 1, पूरक फ़ाइल 2)। यह अनुकूलन योग्य प्रकाशक कई तरंग दैर्ध्य पर गतिशील, प्रोग्राम करने योग्य नियंत्रण प्रदान करता है।
    नोट: एक प्रकाश बॉक्स बनाने के लिए कई संभावित रणनीतियां हैं, और एक वैकल्पिक दृष्टिकोण अधिक उपयुक्त हो सकता है (उदाहरण के लिए, गेरहार्ट एट अल.51, बुगाज एट अल.52, कुमार और खम्माश 53, और https://www.optobase.org/materials/ पर और अधिक)।
  2. प्रकाश बॉक्स में निम्नलिखित विशेषताएं शामिल करें: तापमान नियंत्रण (28 डिग्री सेल्सियस जेब्राफिश भ्रूण के लिए आदर्श है), अवांछित प्रकाश (जैसे, कमरे की रोशनी और सूरज की रोशनी) का बहिष्कार, नीली रोशनी की समान डिलीवरी जो लक्ष्य क्षेत्र को कवर करती है (जैसे, 6-अच्छी तरह से प्लेट), और प्रकाश की तीव्रता और जोखिम गतिशीलता पर नियंत्रण।
    नोट: bOpto-BMP/नोडल नीली रोशनी से सक्रिय होते हैं, लेकिन कुछ ऑप्टोजेनेटिक उपकरण अन्य तरंग दैर्ध्य का जवाब देते हैं। ऑप्टोजेनेटिक उपकरण के लिए उपयुक्त तरंग दैर्ध्य का उपयोग करें।
  3. एक इनक्यूबेटर (चित्रा 2 बी) के शीर्ष के माध्यम से एक छेद ड्रिल करें जो एलईडी आउटपुट लेंस से थोड़ा व्यापक है।
    1. सुनिश्चित करें कि इनक्यूबेटर के शीर्ष में कोई विद्युत घटक नहीं हैं जो ड्रिलिंग (सामग्री की तालिका) द्वारा नष्ट हो जाएंगे। इनक्यूबेटर निर्माता से संपर्क करके और सीधे पूछकर इसका पता लगाया जा सकता है।
    2. यदि इनक्यूबेटर के शीर्ष पैनल पर कोई मौजूदा छेद है, तो छेद के आकार को 1.25 इंच तक बढ़ाने के लिए एक स्टेप ड्रिल का उपयोग करें। अन्यथा आर्बर के साथ देखे गए 1.25 इंच के छेद का उपयोग करें।
    3. यदि आंतरिक पैनल हैं जो प्रकाश स्रोत को अवरुद्ध करते हैं, तो यह सुनिश्चित करने के लिए उपयुक्त छेद आकार ड्रिल करें कि प्रकाश शंकु अवरुद्ध नहीं है (चित्र 2ए)। पैनल आमतौर पर पतली शीट धातु से बने होते हैं, इसलिए क्षति को रोकने के लिए धीमी गति और धातु ड्रिल बिट्स का उपयोग करें (कोबाल्ट ड्रिल बिट अनुशंसित)।
  4. इनक्यूबेटर के शीर्ष पर एलईडी माइक्रोप्लेट प्रकाशक को सुरक्षित करने के लिए एक एलईडी धारक का निर्माण करें (चित्र 2C, पूरक फ़ाइल 3, पूरक फ़ाइल 4, पूरक फ़ाइल 5, पूरक फ़ाइल 6, पूरक फ़ाइल 7, पूरक फ़ाइल 8)।
    1. M3 स्क्रू का उपयोग करके चार M3 क्यूब स्टैंडऑफ़ को वर्टिकल ब्रैकेट पीस पर माउंट करें।
    2. ऊर्ध्वाधर ब्रैकेट के क्यूब स्टैंडऑफ़ के बाईं और दाईं ओर दो साइड ब्रैकेट संलग्न करें। साइड ब्रैकेट पर बचे हुए छेद के लिए एक और क्यूब स्टैंडऑफ माउंट करें।
    3. M6 स्क्रू वापरून लंबवत ब्रॅकेट टुकडे LED मायक्रोप्लेट इल्लुमिनेटर असेंब्ली (सामग्रीची तालिका) वर माउंट करा. एलईडी लेंस गैसकेट को एलईडी सिस्टम लेंस के ऊपर रखें।
    4. इकट्ठे टुकड़ों को इनक्यूबेटर पैनल माउंट पर माउंट करें, फिर ऊर्ध्वाधर और साइड ब्रैकेट पर एम 3 स्टैंडऑफ पर। इनक्यूबेटर के शीर्ष पर ड्रिल किए गए छेद पर इनक्यूबेटर गैसकेट रखें।
    5. इनक्यूबेटर गैसकेट के शीर्ष पर इनक्यूबेटर पैनल माउंट रखें, गैसकेट और पैनल खोलने इनक्यूबेटर के छेद के साथ गाढ़ा कर रहे हैं सुनिश्चित करें. नंबर 8 स्क्रू का उपयोग करके इनक्यूबेटर टॉप पर माउंट पैनल। सुनिश्चित करें कि यह सील हल्की-तंग है।
  5. इनक्यूबेटर के शीर्ष शेल्फ पर एक 6 अच्छी तरह से थाली रखें. निर्धारित करें कि प्रकाश किरण समान रूप से प्लेट (चित्रा 2 ए) को कवर करती है या नहीं। प्रकाश कवरेज की कल्पना करने के लिए कागज की एक शीट का उपयोग करें।
  6. यदि पूरी प्लेट बीम द्वारा कवर नहीं की गई है, तो शेल्फ को नीचे ले जाकर एलईडी और प्लेट के बीच की दूरी बढ़ाएं। यहां वर्णित प्रणाली के लिए, एलईडी और शेल्फ के बीच ~ 14 इंच पर्याप्त है।
  7. विकिरण स्तर और स्थानिक एकरूपता (सामग्री की तालिका) निर्धारित करने के लिए एक प्रकाश मीटर का उपयोग करें।
  8. अनजाने धूप और कमरे के प्रकाश जोखिम से बचने के लिए, इनक्यूबेटर दरवाजा प्रकाश-तंग (चित्रा 2ए) है कि यह सुनिश्चित करने के लिए मौसम स्ट्रिपिंग का उपयोग करें।
  9. ज़ेब्राफिश भ्रूण 28 डिग्री सेल्सियस54 पर मजबूती से विकसित होते हैं। यह सुनिश्चित करने के लिए मेमोरी कार्ड थर्मामीटर का उपयोग करें कि प्रकाश बॉक्स में 28 डिग्री सेल्सियस है।

2. इंजेक्शन के लिए mRNA उत्पन्न करना

नोट: पीसीएस 2 + bOpto-BMP38 और bOpto-नोडल निर्माण39 के लिए वेक्टर रीढ़ है। यह वेक्टर एम्पीसिलीन प्रतिरोधी है। bOpto-BMP तीन निर्माणों (चित्रा 1B) से बना है: BMPR1aa-LOV (Addgene # 207614): प्रकार I BMPR1aa रिसेप्टर (जिसे Alk3 के रूप में भी जाना जाता है) का ख्यात किनेज डोमेन LOV से जुड़ा हुआ है; Acvr1l-LOV (Addgene # 207615): I Acvr1l रिसेप्टर (जिसे Alk8 के रूप में भी जाना जाता है) का ख्यात किनेज डोमेन LOV से जुड़ा हुआ है; और BMPR2a-LOV (Addgene # 207616): II BMPR2a रिसेप्टर टाइप का ख्यात किनेज डोमेन और निम्नलिखित C-टर्मिनल डोमेन LOV से जुड़े हुए हैं। bOpto-नोडल दो निर्माणों (चित्रा 1E) से बना है: Acvr1ba-LOV: प्रकार I Acvr1ba रिसेप्टर (जिसे Acvr1b के रूप में भी जाना जाता है) का ख्यात किनेज डोमेन LOV से जुड़ा हुआ है; Acvr2ba-LOV: II Acvr2ba रिसेप्टर (जिसे Acvr2b के रूप में भी जाना जाता है) का ख्यात किनेज डोमेन LOV से जुड़ा हुआ है।

  1. प्लास्मिड रैखिक करने के लिए, 1-3 घंटे (सामग्री की तालिका) के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर NotI प्रतिबंध एंजाइम का उपयोग कर 2-5 μg प्लाज्मिड डीएनए के बीच पचाना.
    नोट: पीसीआर टेम्पलेट के रूप में प्लाज्मिड का उपयोग करके रैखिक डीएनए उत्पन्न करना भी संभव है।
  2. एक मानक स्तंभ-आधारित शुद्धि किट (सामग्री की तालिका) का उपयोग करके डीएनए को शुद्ध करें।
  3. इन विट्रो SP6 ट्रांसक्रिप्शन किट का उपयोग करें जैसे कि mMessage mMachine किट रैखिक टेम्पलेट (सामग्री की तालिका) से RNA को स्थानांतरित करने के लिए। उच्च उपज सुनिश्चित करने के लिए निर्माता की सिफारिशों के अनुसार दो प्रतिक्रियाएं सेट करें।
  4. एक मानक कॉलम-आधारित आरएनए क्लीनअप किट (सामग्री की तालिका) का उपयोग करके आरएनए को शुद्ध करें। वर्षा के माध्यम से शुद्ध करना भी संभव है।

3. एमआरएनए इंजेक्शन करना

  1. इंजेक्शन से कम से कम 1 दिन पहले, इंजेक्शन व्यंजन और एग्रोज-लेपित 6-अच्छी प्लेटें बनाएं।
    1. जेब्राफिश भ्रूण माध्यम और माइक्रोवेव में 1% agarose के 200 एमएल तैयार जब तक agarose पूरी तरह से भंग कर दिया है. कोई भी मानक ज़ेब्राफिश भ्रूण माध्यम स्वीकार्य होना चाहिए; हालांकि, भ्रूण माध्यम से मेथिलीन ब्लू को बाहर करें क्योंकि यह अन्य अनुप्रयोगों में डाउनस्ट्रीम इमेजिंग को प्रभावित कर सकता है।
    2. ध्यान से पिघला हुआ agarose 100 मिमी x 15 मिमी प्लास्टिक पेट्री व्यंजन में डालना. बर्तन आधे से भरें।
    3. भ्रूण माध्यम के साथ एक इंजेक्शन डिश मोल्ड कुल्ला और पिघला हुआ agarose पर धीरे जगह है, सुनिश्चित करने के लिए कोई बुलबुले मोल्ड और agarose के बीच फंस रहे हैं. आसान प्लेसमेंट और पुनर्प्राप्ति के लिए मोल्ड के पीछे एक टैब बनाने के लिए टेप का उपयोग करें।
    4. मोल्ड को पिघले हुए अगारोज़ में तैरना चाहिए। यदि मोल्ड डूब जाता है, तो ध्यान से पिघले हुए अगारोज़ से हटा दें और चरण 3.1.3 दोहराएं।
    5. अगारोज़ के जमने के बाद, मोल्ड को धीरे से हटाने के लिए टैब का उपयोग करें। डिश को 4 डिग्री सेल्सियस पर रखकर इसे तेज किया जा सकता है।
    6. immunofluorescence प्रयोगों के लिए dechorionated भ्रूण के साथ काम कर अगर agarose-लेपित 6 अच्छी तरह से प्लेटें बनाओ.
    7. एक डिस्पोजेबल 10 एमएल प्लास्टिक विंदुक का प्रयोग करने के लिए पर्याप्त पिघला हुआ agarose हस्तांतरण करने के लिए एक 6 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से के नीचे कवर.
    8. इंजेक्शन व्यंजन और 4 डिग्री सेल्सियस पर 6 अच्छी तरह से प्लेटें स्टोर करें। उन्हें तुरंत इस्तेमाल किया जा सकता है या तब तक संग्रहीत किया जा सकता है जब तक कि एगरोज सूख न जाए या दूषित न हो जाए (आमतौर पर 2-3 सप्ताह)।
    9. Flamed ग्लास विंदुक युक्तियाँ तैयार अगर immunofluorescence प्रयोगों के लिए dechorionated भ्रूण के साथ काम कर रहे हैं.
    10. एक बन्सन बर्नर लौ में एक ग्लास विंदुक के अंत डालें और किनारों चिकनी हैं जब तक लगातार घुमाएँ. Dechorionated भ्रूण आराम से विंदुक के अंत के माध्यम से फिट होना चाहिए. भ्रूण के व्यास के नीचे उद्घाटन को सिकुड़ने की अनुमति न दें।
    11. या तो माइक्रोइंजेक्शन सुइयों (सामग्री की तालिका) खरीदें या खींचें। प्रतिस्थापन आवश्यक होने की स्थिति में इंजेक्शन के दिन अतिरिक्त सुइयों को उपलब्ध कराने की सलाह दी जाती है।
  2. इंजेक्शन से एक दिन पहले, संस्थान के मानक संचालन प्रक्रियाओं (एसओपी) के अनुसार जेब्राफिश प्रजनकों की स्थापना करें। नर और मादा को अलग रखें।
    1. 28 डिग्री सेल्सियस बनाए रखने के लिए प्रकाश बॉक्स तापमान नियामक पर स्विच करें। यह सुनिश्चित करने के लिए कि प्रकाश बॉक्स का तापमान 28 डिग्री सेल्सियस पर रहता है, मेमोरी कार्ड थर्मामीटर (सामग्री की तालिका) का उपयोग करके तापमान की निगरानी करें।
    2. एमआरएनए इंजेक्शन मिश्रण (तों) तैयार करें। प्रत्येक निर्माण की समतुल्य मात्रा इंजेक्ट करें। अनुभवजन्य रूप से यह निर्धारित करना आवश्यक है कि किस राशि को इंजेक्ट करना है।
    3. bOpto-BMP प्रतिलेख आकार निम्नानुसार हैं:
      Acvr1l-LOV = 2007 न्यूक्लियोटाइड (nt)
      बीएमपीआर 1 एए-एलओवी = 1983 एनटी
      बीएमपीआर 2 ए-एलओवी = 3409 एनटी
    4. इक्विमोलर मात्रा इंजेक्ट करने के लिए, BMPR1aa की तुलना में Acvr1l निर्माण का 1.01x अधिक इंजेक्ट करें; BMPR1.72a की तुलना में BMPR2a निर्माण का 1x अधिक इंजेक्ट करें।
    5. bOpto-नोडल प्रतिलेख आकार इस प्रकार हैं:
      Acvr1ba-LOV और Acvr2ba-LOV दोनों 1962 एनटी हैं।
    6. इक्विमोलर मात्रा इंजेक्ट करने के लिए, प्रत्येक निर्माण की समान मात्रा इंजेक्ट करें।
    7. इक्विमोलर इंजेक्शन मिक्स तैयार करें, एक इंजेक्शन मिश्रण में एक मार्ग को लक्षित करने वाले सभी एमआरएनए का संयोजन। यदि वांछित हो तो फिनोल लाल इंजेक्शन अनुरेखक शामिल करें। चित्र 4 में दिखाए गए डेटा के लिए, प्रत्येक bOpto-नोडल निर्माण (Acvr1ba-LOV और Acvr2ba-LOV) के 15 pg का उपयोग किया गया था, और bOpto-BMP 7.8 pg Acvr1l-LOV और BMPR1aa-LOV के लिए, और 13.4 pg BMPR2a-LOV का उपयोग किया गया था।
    8. स्टोर इंजेक्शन -20 डिग्री सेल्सियस पर घोला जा सकता है. एक बार इंजेक्शन मिश्रण का इष्टतम एकाग्रता निर्धारित किया गया है, 5-10 माइक्रोन एलिकोट बनाने और -20 डिग्री सेल्सियस या -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  3. इंजेक्शन का दिन
    1. यदि एक फेनोटाइपिंग परख (चित्रा 3 ए) का प्रदर्शन करते हैं, तो कोरियन के माध्यम से सीधे अपनी प्रयोगशाला के एसओपी के अनुसार एक-कोशिका चरण में सेल के केंद्र में इंजेक्ट करें। कोरियोन भ्रूण को पर्यावरणीय तनावों से बचाता है और लाइस्ड भ्रूण को निहित रखता है। यह lysed भ्रूण(चित्रा 4ए,बी)की सटीक मात्रा का ठहराव के लिए स्कोरिंग के दौरान सहायक है.
    2. यदि एक इम्यूनोफ्लोरेसेंस परख (चित्रा 3बी)प्रदर्शन कर रहे हैं, तो भ्रूण को अंततः इमेजिंग(चित्रा 4सी)के लिए अशोरियोनेट करने की आवश्यकता होगी। इसलिए, एक कोशिका चरण में dechorionated भ्रूण की कोशिका के केंद्र में सीधे इंजेक्षन (प्रोटोकॉल dechorionating के लिए रोजर्स एट al.55 देखें). वैकल्पिक रूप से, भ्रूण मैन्युअल निर्धारण के बाद dechorionated किया जा सकता है, लेकिन यह pronase के साथ dechorionating की तुलना में अधिक बोझिल है.
    3. dechorionated भ्रूण (3.1.10 कदम) संभाल करने के लिए flamed ग्लास पिपेट का प्रयोग करें. ध्यान रखें कि dechorionated भ्रूण को हवा या प्लास्टिक के संपर्क में न लाएं, जिससे भ्रूण लाइज़ हो जाएगा। dechorionated भ्रूण धीरे संभाल.
    4. मंच प्रगति का मूल्यांकन करने के लिए एक प्रॉक्सी के रूप में गैर इंजेक्शन भ्रूण की एक अतिरिक्त डिश तैयार (4.3.5 कदम देखें). सुनिश्चित करें कि प्रॉक्सी भ्रूण प्रयोगात्मक भ्रूण के एक ही सेट से हैं, जैसे कि सभी भ्रूण एक ही माता-पिता से एक ही समय में निषेचित थे। यह इम्यूनोफ्लोरेसेंस परख के लिए उपयोगी है जहां चरण प्रासंगिक है लेकिन फेनोटाइपिंग परख के लिए अनावश्यक है।
    5. फेनोटाइपिंग और इम्यूनोफ्लोरेसेंस परख दोनों के लिए निम्नलिखित स्थितियों का उपयोग करें: 1) गैर-इंजेक्शन, अनएक्सपोज्ड, 2) गैर-इंजेक्शन, प्रकाश के संपर्क में, 3) इंजेक्शन, अनएक्सपोज्ड, 4) इंजेक्शन, प्रकाश के संपर्क में। हालत प्रति कम से कम 30 भ्रूण का चयन करें. इष्टतम भ्रूण स्वास्थ्य के लिए, एक 6 अच्छी तरह से थाली में अच्छी तरह से प्रति 30 से अधिक भ्रूण सेते नहीं है.
    6. इंजेक्शन के बाद, लेबल पेट्री व्यंजन या agarose-लेपित 6 अच्छी तरह से प्लेटें (dechorionated भ्रूण के लिए) और 28 डिग्री सेल्सियस पर सेते करने के लिए भ्रूण हस्तांतरण. भ्रूण अभी तक प्रकाश संवेदनशील नहीं हैं। इंजेक्शन भ्रूण का इलाज करें जैसे कि वे 1.5 घंटे के बाद निषेचन (एचपीएफ) के बाद हल्के संवेदनशील हैं।

4. प्रकाश जोखिम प्रयोग

नोट: 450 W/m45 के विकिरण के साथ ~ 2 एनएम प्रकाश के संपर्क में स्पष्ट फोटोटॉक्सिसिटी के बिना bOpto-BMP/नोडल को मजबूती से सक्रिय करता है (प्रकाश मीटर की जानकारी के लिए, सामग्री की तालिकादेखें)। ऑप्टोजेनेटिक रूप से सक्रिय सिग्नलिंग के स्तर को विकिरण मूल्योंको बदलकर ट्यून किया जा सकता है 38. हालांकि, उच्च विकिरण पर फोटोटॉक्सिसिटी का मूल्यांकन करने की आवश्यकता होगी।

  1. समय के प्रति संवेदनशील कदम। 4- से 16-सेल चरण में, लगभग 1.5 एचपीएफ, अनिषेचित और अस्वास्थ्यकर भ्रूण को हटा दें। प्रत्येक कुएं में भ्रूण की समान संख्या सुनिश्चित करने के लिए यदि आवश्यक हो तो पुनर्वितरित करें (30 से अधिक नहीं)।
    नोट: 4 से 16 सेल चरण के आसपास इस कदम को करना महत्वपूर्ण है क्योंकि भ्रूण प्रकाश संवेदनशील हो जाएगा क्योंकि इंजेक्शन एमआरएनए प्रोटीन में अनुवादित है। हमने सबूत नहीं देखा है कि भ्रूण 1.5 एचपीएफ से पहले काफी हल्के संवेदनशील होते हैं। 1.5 एचपीएफ के बाद भ्रूण का आकलन करते समय अनजाने फोटोएक्टिवेशन को कम करने के लिए, लाल बत्ती का उपयोग करें, या माइक्रोस्कोप चरणों सहित प्रकाश स्रोतों को कवर करें-लाल जेल फिल्टर पेपर के साथ जो एलओवी-डिमराइजिंग ब्लू वेवलेंथ (सामग्री की तालिका) को अवरुद्ध करता है।
    1. शर्तों और प्रयोगों के बीच निष्पक्ष वितरण सुनिश्चित करने के लिए लगातार भ्रूण का मूल्यांकन करें।
  2. फेनोटाइपिंग परख के लिए, 1.5 एचपीएफ(चित्रा 3ए)से शुरू होने वाले निम्नलिखित 1-दिवसीय प्रकाश एक्सपोजर प्रोटोकॉल का उपयोग करें।
    1. अनएक्सपोज़्ड कंट्रोल प्लेट को एल्युमिनियम फॉयल में लपेटें। इस थाली दोनों गैर इंजेक्शन और इंजेक्शन भ्रूण शामिल होना चाहिए. सुनिश्चित करें कि प्लेट पूरी तरह से ढकी हुई है और ध्यान रखें कि पन्नी में आँसू न डालें। इस प्लेट को 28 डिग्री सेल्सियस लाइट बॉक्स (चित्रा 2 ए) के निचले शेल्फ पर रखें।
    2. उजागर प्लेट को 28 डिग्री सेल्सियस प्रकाश बॉक्स(चित्रा 2ए)के शीर्ष शेल्फ पर रखें। सुनिश्चित करें कि भ्रूण मध्यम वाष्पीकरण से बचने के लिए कवर डिश पर है। नीली बत्ती चालू करें (45 W/m2 का विकिरण सिग्नलिंग को मजबूती से सक्रिय करता है)।
    3. अनजाने में कमरे की रोशनी के संपर्क से बचने के लिए लाइट बॉक्स का दरवाजा बंद कर दें। यदि वांछित है, तो दरवाजा बंद करने से पहले प्रकाश बॉक्स के अंदर एक मेमोरी कार्ड थर्मामीटर शामिल करें। 1-दिवसीय पोस्ट-निषेचन (डीपीएफ; चरण 5.1 देखें) पर फेनोटाइप स्कोरिंग तक दरवाजा न खोलें।
  3. इम्यूनोफ्लोरेसेंस परख के लिए, लगभग 40% एपिबोली56 (~ 6 एचपीएफ) शुरू करने वाले 20 मिनट के लिए भ्रूण को नीली रोशनी में उजागर करें और प्रकाश जोखिम के तुरंत बाद ठीक करें, साथ में अनपेक्षित नियंत्रण(चित्रा 3बी)के साथ। 40% epiboly reproducibly पर एक 20 मिनट नीले प्रकाश जोखिम reproducibly सिग्नलिंग को सक्रिय करता है.
    1. लगभग 1.5 एचपीएफ, अलग-अलग उजागर और अनएक्सपोज्ड दोनों व्यंजनों को एल्युमिनियम फॉयल में लपेटें। सुनिश्चित करें कि व्यंजन पूरी तरह से ढके हुए हैं और ध्यान रखें कि पन्नी में आँसू न डालें। प्रॉक्सी डिश को खुला छोड़ दें। लिपटे व्यंजन और 28 डिग्री सेल्सियस प्रकाश बॉक्स (चित्रा 2 ए) में अलिखित प्रॉक्सी डिश रखें। एलईडी को अभी तक चालू न करें।
    2. यदि एक से अधिक एमआरएनए राशि का परीक्षण किया जाता है, तो अनपेक्षित स्थिति के लिए, अलग-अलग मात्रा में इंजेक्शन किए गए भ्रूण को अलग-अलग एगरोज़-लेपित 6-अच्छी प्लेटों में इंजेक्ट किया जाता है, जो बाद के निर्धारण के दौरान अनजाने प्रकाश जोखिम को कम करने में मदद करेगा।
    3. अनजाने में कमरे की रोशनी के संपर्क से बचने के लिए लाइट बॉक्स का दरवाजा बंद कर दें।
    4. फॉर्मलाडेहाइड स्टॉक को 1x फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) में 4% तक पतला करें और पूर्व-लेबल वाले 2 एमएल राउंड बॉटम माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में 1 एमएल, प्रति स्थिति एक ट्यूब। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    5. 5 एचपीएफ के आसपास, गैर-इंजेक्शन भ्रूण युक्त प्रॉक्सी डिश को हटा दें और एक विदारक गुंजाइश का उपयोग करके विकास के चरण का आकलन करें। प्रॉक्सी भ्रूण के चरण लिपटे व्यंजनों में प्रकाश के प्रति संवेदनशील भ्रूण के चरण को प्रतिबिंबित करना चाहिए.
    6. लपेटे हुए व्यंजनों को भी हटा दें, ताकि सभी व्यंजन समान तापमान का अनुभव करें। प्रॉक्सी भ्रूण 40% epiboly (~ 6 hpf) तक पहुँच गया है जब तक दोहराएँ. भ्रूणजनन प्रगति तापमान के प्रति संवेदनशील54 है; इसलिए, अब व्यंजन इनक्यूबेटर के बाहर हैं, अब यह भ्रूण के लिए 40% epiboly तक पहुँचने के लिए ले जाएगा.
    7. एक बार प्रॉक्सी भ्रूण 40% epiboly तक पहुँच गया है, उजागर पकवान खोलना और प्रकाश बॉक्स (चित्रा 2A) के शीर्ष शेल्फ पर जगह है. अनएक्सपोज़्ड डिश को लपेटकर निचले शेल्फ पर रखें। तुरंत नीली बत्ती चालू करें, दरवाजा बंद करें, और 20 मिनट के लिए टाइमर सेट करें (45 W/m2 का विकिरण सिग्नलिंग को मजबूती से सक्रिय करता है)।
    8. निर्धारण के लिए तैयार करने के लिए, जितना संभव हो उतना कमरे की रोशनी को खत्म करें (खिड़की के अंधा को बंद करें, ओवरहेड रोशनी बंद करें, स्क्रीन बंद करें, आदि)। सुनिश्चित करें कि फॉर्मलाडेहाइड युक्त ट्यूबों को उचित रूप से लेबल किया गया है। इसके तुरंत पहले निर्धारण, formaldehyde युक्त ट्यूबों को 4 डिग्री सेल्सियस से हटा दें और प्रकाश बॉक्स के बगल में जगह.
    9. समय- और प्रकाश-संवेदनशील कदम। 20 मिनट प्रकाश जोखिम के अंत में जल्दी से स्थानांतरित करने के लिए तैयार रहें। 20 मिनट के बाद, लाइट बॉक्स का दरवाजा खोलें और अनएक्सपोज़्ड डिश को हटा दें।
    10. प्रकाश के प्रति संवेदनशील भ्रूण को जल्दी लेकिन धीरे से 4% फॉर्मलाडेहाइड की तैयार इसी ट्यूब में स्थानांतरित करने के लिए एक फ्लेम्ड ग्लास विंदुक टिप का उपयोग करें।
    11. अनजाने प्रकाश जोखिम से बचने के लिए प्रकाश के प्रति संवेदनशील भ्रूण के स्थानांतरण समय (<45 एस) को कम से कम करें। सुनिश्चित करें कि विंदुक में कोई हवाई बुलबुले नहीं हैं। वायु जोखिम dechorionated भ्रूण को नष्ट कर देगा.
    12. भ्रूण को फॉर्मलाडेहाइड में बाहर निकालने के लिए, फॉर्मलाडेहाइड में ग्लास पिपेट टिप को डुबोएं और भ्रूण को तरल में डूबने दें। भ्रूण माध्यम है कि टिप के अंत में भ्रूण रखने के द्वारा formaldehyde के लिए स्थानांतरित किया जाता है की मात्रा को कम.
    13. भ्रूण स्थानांतरित कर रहे हैं के बाद, एक ही अच्छी तरह से और विंदुक के लिए विंदुक लौटने के लिए और नीचे किसी भी अटक भ्रूण नापसंद करने के लिए. यह भ्रूण को गलती से एक ट्यूब में समाप्त होने वाली कई स्थितियों से रोकता है।
    14. तुरंत unexposed, गैर इंजेक्शन भ्रूण के लिए 4.3.11-4.3.13 कदम दोहराएँ, उजागर भ्रूण (इंजेक्शन और गैर इंजेक्शन) के बाद.
    15. रातोंरात 4 डिग्री सेल्सियस पर तय भ्रूण की दुकान.

5. प्रयोग मूल्यांकन

  1. फेनोटाइप स्कोरिंग और इमेजिंग
    1. 1 डीपीएफ पर, आदर्श रूप से 24-32 एचपीएफ के बीच, एक विदारक गुंजाइश का उपयोग करके फेनोटाइप का आकलन करने और स्कोरिंग रूब्रिक बनाने के लिए प्रकाश बॉक्स से भ्रूण को हटा दें। यह प्रयोगात्मक समापन बिंदु है; अनजाने फोटोएक्टिवेशन अब चिंता का विषय नहीं है।
    2. स्कोर भ्रूण जबकि अभी भी आसानी के लिए chorion में. कई कोणों से देखने के लिए भ्रूण को स्थानांतरित करने के लिए एक विंदुक या जांच का उपयोग करें।
      1. अतिरिक्त बीएमपी सिग्नलिंग का अनुभव करने वाले भ्रूण को गंभीरता की अलग-अलग डिग्री के साथ वेंट्रलाइज्ड किया जाएगा जैसा कि किशिमोटो एट अल में विस्तार से वर्णित है। 199746 (चित्रा 4 ए, बाएं पैनल)। अतिरिक्त नोडल सिग्नलिंग का अनुभव करने वाले भ्रूण में अतिरिक्त मेसेंडोडर्म(चित्रा 4ए, दायां पैनल)1,3,47,57,58,59,60से संबंधित विकासात्मक दोषों की एक श्रृंखला होगी। वे अक्सर 1 डीपीएफ द्वारा झूठ बोलेंगे।
    3. सभी स्थितियों (चित्रा 4 बी) में प्रत्येक भ्रूण स्कोर. प्रत्येक अच्छी तरह से में सभी भ्रूण की एक सिंहावलोकन छवि प्राप्त करें. यदि वांछित, dechorionate और छवि मिथाइलसेलुलोज(चित्रा 4A)में व्यक्तिगत प्रतिनिधि भ्रूण.
  2. इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला और इमेजिंग
    1. रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर 4% फॉर्मलाडेहाइड में भ्रूण को इनक्यूबेट करने के बाद, फॉर्मलाडेहाइड को हटा दें और ट्वीन20 (पीबीएसटी) के साथ 1x फॉस्फेट-बफर खारा के साथ 3-5x धो लें। पीबीएसटी निकालें और 100% मेथनॉल जोड़ें।
    2. बंद ट्यूबों और धीरे अवशिष्ट पीबीएसटी और मेथनॉल मिश्रण करने के लिए उन्हें पलटना. मेथनॉल के साथ 2x धोएं और कम से कम 2 घंटे तक -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    3. pSmad1/5/9 (BMP) इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रोटोकॉल के लिए रोजर्स एट अल.38 देखें। pSmad2/3 (नोडल) इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रोटोकॉल के लिए वैन बॉक्सटेल एट अल.17 और रोजर्स एट अल.47 देखें।
    4. छवि immunostained भ्रूण, ऑप्टिकल सेक्शनिंग (जैसे, एक confocal या प्रकाश शीट माइक्रोस्कोप) में सक्षम एक माइक्रोस्कोप का उपयोग कर. संतृप्ति से बचें और एक ही एंटीबॉडी के साथ दाग सभी नमूनों के बीच समान इमेजिंग शर्तों को बनाए रखने.
    5. इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला होने को पूरा करने के 5 दिनों के भीतर छवि क्योंकि प्रतिदीप्ति समय के साथ फीका हो सकता है।

Representative Results

यहां वर्णित दो नियंत्रण प्रयोगों का लक्ष्य यह निर्धारित करना है कि क्या बीओपीटीओ-बीएमपी / नोडल प्रकाश की अनुपस्थिति में सिग्नलिंग को प्रभावित किए बिना नीले प्रकाश जोखिम के जवाब में अपने संबंधित मार्गों को सक्रिय करता है, जैसा कि अपेक्षित है। ब्याज के अपने शोध प्रश्नों के लिए bOpto-BMP/Nodal लागू करने से पहले अपनी प्रयोगशाला में उपयुक्त प्रयोगात्मक वर्कफ़्लो स्थापित करने के लिए इन नियंत्रणों का उपयोग करें।

फेनोटाइपिंग परख केवल 2 दिनों में पूरा किया जा सकता है और सिग्नलिंग गतिविधि और फोटोटॉक्सिसिटी(चित्रा 3ए)का एक उपयोगी संकेत प्रदान करता है। इंजेक्शन, नीले प्रकाश उजागर भ्रूण phenocopy अतिरिक्त बीएमपी संकेत चाहिए (ventralization46; चित्रा 4 ए, बाएं पैनल) या नोडल सिग्नलिंग (अतिरिक्त मेसेंडोडर्म 1,3,47,57,58,59,60 (चित्रा 4 ए, दाएं पैनल)) से संबंधित विकासात्मक दोष)। यदि इंजेक्ट किया जाता है, तो प्रकाश-उजागर भ्रूण एफेनोटाइपिक होते हैं, एमआरएनए की गुणवत्ता का परीक्षण करें और अधिक इंजेक्शन लगाने पर विचार करें, और उज्ज्वल प्रकाश के निरंतर संपर्क को सुनिश्चित करने के लिए प्रकाश जोखिम रणनीति को दोबारा जांचें (~ 450 डब्ल्यू / एम 2 के विकिरण के साथ2 एनएम प्रकाश को सिग्नलिंग को दृढ़ता से सक्रिय करना चाहिए)। इसके विपरीत, इंजेक्शन, अनपेक्षित भ्रूण को गैर-इंजेक्शन वाले भाई-बहनों के समान दिखना चाहिए। यदि इंजेक्शन, अनपेक्षित भ्रूण फेनोटाइप प्रदर्शित करते हैं, तो एमआरएनए इंजेक्शन की मात्रा को कम करते हैं और यह सुनिश्चित करने के लिए प्रयोगात्मक सेट अप का पुनर्मूल्यांकन करते हैं कि अनपेक्षित भ्रूण प्रकाश जोखिम से सुरक्षित हैं। चित्रा 4 बी में दिखाया गया डेटा उचित एमआरएनए मात्रा और जोखिम की स्थिति के साथ ठेठ फेनोटाइपिंग प्रयोगों से परिणाम दिखाता है: मजबूत सिग्नलिंग गतिविधि इंजेक्शन, प्रकाश-उजागर भ्रूण में स्पष्ट होती है, जिसमें इंजेक्शन, अनपेक्षित भ्रूण का केवल एक छोटा सा अंश होता है जो फेनोटाइप प्रदर्शित करता है।

फेनोटाइपिंग परख भी फोटोटॉक्सिसिटी का आकलन करने का अवसर प्रदान करता है। यदि फोटोटॉक्सिसिटी नगण्य है, तो गैर-इंजेक्शन, प्रकाश-उजागर भ्रूण जंगली प्रकार दिखाई देना चाहिए, गैर-इंजेक्शन, अनपेक्षित भ्रूण के समान। यदि गैर-इंजेक्शन, प्रकाश-उजागर भ्रूण में दोष होते हैं, लेकिन गैर-इंजेक्शन, अनपेक्षित भ्रूण नहीं होते हैं, तो प्रकाश विकिरण को कम करने पर विचार करें। 45 W/m2 का विकिरण स्पष्ट फोटोटॉक्सिसिटी के बिना सिग्नलिंग को मजबूती से सक्रिय करता है। चित्रा 4 बी में दिखाया गया डेटा गैर-इंजेक्शन, प्रकाश-उजागर और गैर-इंजेक्शन, अनपेक्षित भ्रूण के बीच कोई अंतर नहीं दिखाता है, जो नगण्य फोटोटॉक्सिसिटी का संकेत देता है।

हालांकि इम्यूनोफ्लोरेसेंस परख को फेनोटाइपिंग परख (2 दिन) की तुलना में अधिक समय और प्रयास (~ 1 सप्ताह) की आवश्यकता होती है, इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला हो जाना सिग्नलिंग मार्ग गतिविधि का प्रत्यक्ष रीडआउट प्रदान करता है और सूक्ष्म सिग्नलिंग परिवर्तनों को प्रकट कर सकता है जो सकल आकृति विज्ञान द्वारा परिलक्षित नहीं हो सकते हैं। इम्यूनोफ्लोरेसेंस विशेष रूप से बोप्टो-नोडल की प्रतिक्रियाओं का आकलन करने के लिए महत्वपूर्ण है, क्योंकि अतिरिक्त नोडल सिग्नलिंग के परिणामस्वरूप अक्सर 1 डीपीएफ द्वारा भ्रूण लाइसिंग होता है - जिसके कई कारण हो सकते हैं-अतिरिक्त बीएमपी सिग्नलिंग46 (चित्रा 4ए) की विशिष्ट वेंट्रलाइजेशन फेनोटाइप विशेषता के विपरीत। इंजेक्शन, नीले प्रकाश उजागर भ्रूण गैर इंजेक्शन, प्रकाश उजागर भ्रूण की तुलना में Smad1/5/9 या Smad2/3 फॉस्फोराइलेशन में एक समान वृद्धि का प्रदर्शन करना चाहिए. यदि स्तर में वृद्धि नहीं हुई है, या केवल कमजोर रूप से वृद्धि हुई है, तो एमआरएनए की गुणवत्ता का परीक्षण करें और अधिक इंजेक्शन लगाने पर विचार करें, और प्रकाश जोखिम रणनीति को दोबारा जांचें। 45% एपिबोली के आसपास 40% एपिबोली केविकिरण के साथ नीली रोशनी के लिए 20 मिनट का जोखिम दृढ़ता से सिग्नलिंग को सक्रिय करना चाहिए। यदि pSmad धुंधला गैर-समान है, तो सेल के केंद्र (जर्दी के बजाय) में mRNA इंजेक्ट करने का प्रयास करें, जिसके परिणामस्वरूप अधिक समान mRNA वितरण हो सकता है।

इंजेक्शन, अनपेक्षित भ्रूण में गैर-इंजेक्शन वाले भ्रूण के बराबर pSmad स्तर होना चाहिए। अनजाने में, हमने bOpto-BMP की तुलना में bOpto-Nodal के साथ लीकियर स्मैड फॉस्फोराइलेशन देखा है। यदि इंजेक्शन, अनपेक्षित भ्रूण में pSmad का स्तर बढ़ जाता है, तो mRNA इंजेक्शन की मात्रा कम हो जाती है। इसके अलावा, 1) अनपेक्षित भ्रूण अनजाने में प्रकाश के संपर्क में नहीं हैं, और 2) निर्धारण के दौरान प्रकाश जोखिम कम से कम है सुनिश्चित करने के लिए प्रयोगात्मक सेट अप का पुनर्मूल्यांकन करें. निर्धारण चरण के दौरान, प्रकाश बॉक्स से हटाने और फॉर्मलाडेहाइड में विसर्जन के बीच 45 से अधिक एस की अनुमति देना महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, इस चरण के दौरान खिड़की के अंधा बंद करके, सफेद प्रकाश स्रोतों को बंद करके, लाल रोशनी का उपयोग करके, या नीले प्रकाश को अवरुद्ध करने वाले जेल फिल्टर पेपर (सामग्री की तालिका) के साथ सफेद प्रकाश स्रोतों को कवर करके कमरे की रोशनी और सूरज की रोशनी के संपर्क को कम करें।

चित्रा 4 सी में डेटा उचित एमआरएनए मात्रा और प्रकाश जोखिम की स्थिति के साथ ठेठ इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला प्रयोगों से परिणाम दिखाता है: पीएसएमएडी स्तर गैर-इंजेक्शन और अनएक्सपोज्ड भ्रूण में समान होते हैं, जबकि इंजेक्शन, प्रकाश-उजागर भ्रूण स्मैड फॉस्फोराइलेशन के उच्च स्तर का प्रदर्शन करते हैं।

Figure 1
चित्रा 1: bOpto-BMP और -नोडल सिग्नलिंग सक्रियण रणनीति। (ए) अंतर्जात बीएमपी सिग्नलिंग मार्ग बीएमपी लिगैंड बाइंडिंग द्वारा सक्रिय होता है, जिससे एक प्रकार I/II रिसेप्टर कॉम्प्लेक्स का निर्माण होता है, जिससे स्मैड 1/5/9 का फॉस्फोराइलेशन और बीएमपी लक्ष्य जीन की अभिव्यक्ति होती है। टाइप I रिसेप्टर्स BMPR1aa और Acvr1l को क्रमशः Alk3 और Alk8 के रूप में भी जाना जाता है। BMPR2a एक प्रकार II रिसेप्टर है। (बी) बीओपीटीओ-बीएमपी38 का निर्माण करता है। BMPR1aa और Acvr1l के ख्यात किनेज डोमेन LOV से जुड़े हुए हैं; BMPR2a-LOV फ्यूजन में ख्यात किनेज डोमेन और रिसेप्टर सी-टर्मिनल डोमेन (CTD) शामिल हैं। सभी संलयन एक myristoylation आकृति (Myr) के साथ झिल्ली-लक्षित हैं। डोमेन को ग्लाइसिन-सेरीन (जीएस) लिंकर्स द्वारा अलग किया जाता है। निर्माणों को सीटीडी में एचए एपिटोप टैग के साथ टैग किया जाता है। तीन निर्माणों का यह संयोजन बीएमपी सिग्नलिंग को बेहतर ढंग से सक्रिय करने के लिए पाया गया था। (सी) bOpto-BMP-मध्यस्थता बीएमपी सिग्नलिंग सक्रियण। नीली रोशनी के संपर्क में आने पर, LOV डोमेन मंद हो जाते हैं, जो जटिल गठन और सिग्नलिंग सक्रियण को ट्रिगर करने के लिए सोचा जाता है। (डी) अंतर्जात नोडल सिग्नलिंग मार्ग नोडल लिगैंड बाइंडिंग द्वारा सक्रिय होता है, जिससे टाइप I/II रिसेप्टर कॉम्प्लेक्स का निर्माण होता है, स्मैड 2/3 का फॉस्फोराइलेशन और नोडल लक्ष्य जीन की अभिव्यक्ति होती है। टाइप I रिसेप्टर Acvr1ba और टाइप II रिसेप्टर Acvr2ba को क्रमशः Acvr1b और Acvr2b के रूप में भी जाना जाता है। (ङ) बीओपीटीओ-नोडल निर्माण39. Acvr1ba और Acvr2ba के ख्यात किनेज डोमेन LOV से जुड़े हुए हैं। सभी संलयन एक myristoylation आकृति (Myr) के साथ झिल्ली-लक्षित हैं। डोमेन जीएस लिंकर्स द्वारा अलग किए जाते हैं। निर्माणों को सीटीडी में एचए एपिटोप टैग के साथ टैग किया जाता है। (एफ) बीओपीटीओ-नोडल-मध्यस्थता नोडल सिग्नलिंग सक्रियण। नीली रोशनी के संपर्क में आने पर, LOV डोमेन मंद हो जाते हैं, जो जटिल गठन और सिग्नलिंग सक्रियण को ट्रिगर करने के लिए सोचा जाता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: ऑप्टोजेनेटिक प्रयोगों के लिए तापमान नियंत्रित प्रकाश बॉक्स । (ए) एक एलईडी माइक्रोप्लेट प्रकाशक एक कस्टम-निर्मित एलईडी धारक का उपयोग करके इनक्यूबेटर के शीर्ष पर लगाया जाता है। पहली शेल्फ पर एक 6 अच्छी तरह से थाली में Zebrafish भ्रूण इनक्यूबेटर के शीर्ष में ड्रिल एक छेद के माध्यम से प्रकाश के संपर्क में हैं. निचले शेल्फ एक एल्यूमीनियम पन्नी लिपटे 6 अच्छी तरह से थाली में उजागर नियंत्रण भ्रूण का एक दूसरा सेट रखती है. इनक्यूबेटर के दरवाजे को कमरे की रोशनी या सूरज की रोशनी के अनजाने में जोखिम को रोकने के लिए मौसम स्ट्रिपिंग के साथ पंक्तिबद्ध किया गया है। (बी)एक कदम ड्रिल का उपयोग इनक्यूबेटर में एक छेद बनाने के लिए प्रक्रिया का विस्तार. यहां उपयोग किए जाने वाले इनक्यूबेटर मॉडल में एक आंतरिक पैनल होता है जिसे एक दूसरा, बड़ा छेद (सामग्री की तालिका) ड्रिलिंग की आवश्यकता होती है। (सी) तीन-तरंग दैर्ध्य रोशनी प्रणाली के लिए डिज़ाइन किए गए कस्टम एलईडी धारक का विस्तार। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: bOpto-BMP/नोडल प्रयोग वर्कफ़्लो। फेनोटाइप परख और pSmad इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला हो जाना bOpto-BMP/Nodal की गतिविधि का परीक्षण करने के लिए। भ्रूण को एक-कोशिका चरण में एमआरएनए के साथ इंजेक्ट किया जाता है और 1.5 घंटे के बाद निषेचन (एचपीएफ) से बाद में एक प्रकाश बॉक्स में स्थानांतरित नहीं किया जाता है। (ए) फेनोटाइप परख। इंजेक्शन भ्रूण और गैर-इंजेक्शन वाले भाई-बहनों को अंधेरे में पाला जाता है या 1.5 एचपीएफ से शुरू होने वाली समान नीली रोशनी के संपर्क में 1-दिवसीय पोस्ट-निषेचन (डीपीएफ) तक लाया जाता है। ऑप्टोजेनेटिक सिग्नलिंग गतिविधि का मूल्यांकन अतिरिक्त मार्ग गतिविधि के अनुरूप फेनोटाइप के लिए भ्रूण को स्कोर करके किया जा सकता है। (बी) pSmad immunofluorescence धुंधला हो जाना. इंजेक्शन भ्रूण और गैर-इंजेक्शन वाले भाई-बहनों को 40% एपिबोली (~ 6 एचपीएफ) तक अंधेरे में पाला जाता है। इंजेक्शन के आधे और गैर इंजेक्शन भ्रूण के आधे तो 20 मिनट के लिए वर्दी नीले प्रकाश के संपर्क में हैं. एक्सपोजर के बाद, सभी भ्रूण तय किए जाते हैं और pSmad के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला हो जाते हैं। pSmad1/5/9 या pSmad2/3 का ऊंचा स्तर क्रमशः BMP या नोडल सिग्नलिंग के ऑप्टोजेनेटिक सक्रियण को दर्शाता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: जेब्राफिश भ्रूण में प्रकाश-सक्रिय सिग्नलिंग प्रतिक्रियाओं का आकलन करना। ज़ेब्राफिश भ्रूण को एमआरएनए एन्कोडिंग बीओपीटीओ-बीएमपी / नोडल के साथ एक-कोशिका चरण में इंजेक्ट किया गया था। (ए) भ्रूण या तो अंधेरे में पाले गए थे या 1.5 घंटे पोस्ट निषेचन (एचपीएफ) से शुरू होने वाली समान नीली रोशनी के संपर्क में थे। फेनोटाइप को 1 दिन के बाद निषेचन (डीपीएफ) में स्कोर किया गया था। प्रतिनिधि फेनोटाइप दिखाए जाते हैं। अतिरिक्त बीएमपी सिग्नलिंग वेंट्रलाइजेशन (बाएं पैनल) की ओर जाता है, जबकि अतिरिक्त नोडल सिग्नलिंग अतिरिक्त मेसेंडोडर्म (दाएं पैनल) से जुड़े विकास संबंधी दोषों का कारण बनता है। स्केल बार = 500 माइक्रोन। (बी) फेनोटाइप परिमाणीकरण। इंजेक्शन भ्रूण और गैर-इंजेक्शन वाले भाई-बहनों को 1.5 एचपीएफ (ब्लैक बल्ब) से शुरू होने वाले अंधेरे में पाला गया था। इंजेक्शन के आधे और गैर-इंजेक्शन वाले भ्रूण के आधे समान नीले प्रकाश (नीले बल्ब) के संपर्क में थे। (सी) इंजेक्शन भ्रूण और गैर-इंजेक्शन वाले भाई-बहनों को 1.5 एचपीएफ (ब्लैक बल्ब) से शुरू होने वाले अंधेरे में पाला गया था। 40% एपिबोली (~ 6 एचपीएफ) पर, इंजेक्शन के आधे और गैर-इंजेक्शन वाले भ्रूण के आधे समान नीले प्रकाश (नीले बल्ब) के संपर्क में थे। 20 मिनट के बाद, सभी भ्रूण तय किए गए थे और फॉस्फोराइलेटेड स्मैड 1/5/9 या स्मैड 2/3 के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला हो जाना था। उच्च pSmad तीव्रता क्रमशः BMP/नोडल सिग्नलिंग में वृद्धि का संकेत देती है। स्केल बार = 200 माइक्रोन. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक फ़ाइल 1: लाइट बॉक्स पूर्ण विधानसभा। 3D PDF फ़ाइल पूर्ण प्रकाश बॉक्स असेंबली का 3D दृश्य दिखा रही है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक फ़ाइल 2: लाइट बॉक्स विस्फोट दृश्य। 3D PDF फ़ाइल विस्फोट प्रकाश बॉक्स असेंबली का 3D दृश्य दिखा रही है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक फ़ाइल 3: बड़ी हल्की गैसकेट। सीएडी ड्राइंग फ़ाइल (. DWG प्रारूप) लेजर कटर का उपयोग करके एलईडी धारक के लिए बड़े प्रकाश गैसकेट को बनाने के लिए। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक फ़ाइल 4: छोटे प्रकाश गैसकेट। सीएडी ड्राइंग फ़ाइल (. DWG प्रारूप) लेजर कटर का उपयोग करके एलईडी धारक के लिए छोटे प्रकाश गैसकेट को बनाने के लिए। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक फ़ाइल 5: ऐक्रेलिक मंच आधार। सीएडी ड्राइंग फ़ाइल (. DWG प्रारूप) एक लेजर कटर का उपयोग करके एलईडी धारक ऐक्रेलिक प्लेटफॉर्म बेस बनाने के लिए। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक फ़ाइल 6: ऐक्रेलिक मंच ऊर्ध्वाधर। सीएडी ड्राइंग फ़ाइल (. DWG प्रारूप) एक लेजर कटर का उपयोग करके एलईडी धारक ऐक्रेलिक प्लेटफॉर्म ऊर्ध्वाधर बनाने के लिए। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक फ़ाइल 7: ऐक्रेलिक समर्थन छोड़ दिया। सीएडी ड्राइंग फ़ाइल (. DWG प्रारूप) एक लेजर कटर का उपयोग करके एलईडी धारक ऐक्रेलिक बाएं समर्थन को बनाने के लिए। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक फ़ाइल 8: ऐक्रेलिक समर्थन सही। सीएडी ड्राइंग फ़ाइल (. DWG प्रारूप) लेजर कटर का उपयोग करके एलईडी धारक ऐक्रेलिक सही समर्थन बनाने के लिए। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

एमआरएनए का इंजेक्शन जेब्राफिश भ्रूण को bOpto-BMP/Nodal देने की वर्तमान रणनीति है। इस पद्धति में कई कमियां हैं। सबसे पहले, एमआरएनए की उचित मात्रा प्रयोगशालाओं के बीच भिन्न होती है। उपयोग की जाने वाली राशि प्रकाश जोखिम के साथ मजबूती से सिग्नलिंग को सक्रिय करने के लिए पर्याप्त होनी चाहिए, लेकिन अनजाने अंधेरे सक्रियण के बिना। इष्टतम एमआरएनए स्तरों को खोजने के लिए कई मात्राओं का परीक्षण करना एक अच्छा विचार है, और एक बार स्थापित होने के बाद, एमआरएनए की समान मात्रा को पुन: प्रस्तुत करने के लिए मास्टर मिक्स के विभाज्य बनाएं। दूसरा, इंजेक्शन mRNA के असमान वितरण से असमान सिग्नलिंग सक्रियण हो सकता है। सेल के केंद्र में इंजेक्शन (जर्दी नहीं) भी mRNA वितरण को बढ़ावा देने के लिए सोचा है. अंत में, क्योंकि इंजेक्शन mRNA समय के साथ नीचा दिखाता है, यह दृष्टिकोण पुराने भ्रूण में प्रयोगों के लिए उपयुक्त नहीं हो सकता है। भविष्य में, इन समस्याओं को ट्रांसजेनिक जेब्राफिश लाइनों द्वारा सर्वव्यापी रूप से व्यक्त किया जा सकता है जो मातृ या दवा-इंड्यूसिबल प्रमोटर के साथ बीओपीटी-बीएमपी / यद्यपि संभावित प्रकाश-संवेदनशील वयस्क जेब्राफिश के साथ काम करना इस संदर्भ में एक चुनौती हो सकती है, ज़ेब्राफिश 61,62 और ड्रोसोफिला 22,34,35,63 ट्रांसजेनिक्स को ऑप्टोजेनेटिक उपकरणों को सफलतापूर्वक विकसित किया गया है।

अनजाने फोटोएक्टिवेशन से बचना ऑप्टोजेनेटिक टूल के साथ एक सामान्य चुनौती है। सादगी के लिए, 1.5 एचपीएफ से अधिक पुराने इंजेक्शन भ्रूण को प्रकाश संवेदनशील के रूप में मानें। अनजाने प्रकाश जोखिम को अक्सर केवल प्लेटों या व्यंजनों को एल्यूमीनियम पन्नी के साथ लपेटकर बचा जा सकता है। हालांकि, 1.5 एचपीएफ से पुराने जीवित भ्रूण के दृश्य अवलोकन की आवश्यकता वाले प्रयोगों के लिए, लाल प्रकाश स्रोतों का उपयोग करना या सस्ती जेल फिल्टर पेपर के साथ सफेद प्रकाश स्रोतों को कवर करना संभव है जो एलओवी-डिमराइजिंग तरंग दैर्ध्य (सामग्री की तालिका) को अवरुद्ध करता है।

यहां वर्णित प्रकाश बॉक्स विशिष्ट अनुप्रयोगों के लिए डिज़ाइन किया गया है जिसमें प्रकाश विकिरण स्तर, गतिशीलता और तरंग दैर्ध्य (चित्रा 2) पर सटीक नियंत्रण की आवश्यकता होती है। इस प्रकाश बॉक्स के अन्य लाभों में वर्दी प्रकाश जोखिम, नगण्य अनजाने नमूना हीटिंग, कई 6-अच्छी प्लेटों के लिए पर्याप्त स्थान, और लंबे समय तक जीवित रहने वाले, वर्णक्रमीय रूप से अच्छी तरह से विशेषता वाले प्रकाश स्रोत शामिल हैं। हालांकि, अनुसंधान अनुप्रयोग के आधार पर विभिन्न प्रकाश जोखिम रणनीतियों को बेहतर किया जा सकता है। कई प्रयोगशालाओं ने छोटे पैरों के निशान के साथ सरल और अधिक लागत प्रभावी समान प्रकाश एक्सपोजर सिस्टम विकसित किए हैं, जिसमें एलईडी स्ट्रिप्स के साथ इनक्यूबेटरों को अस्तर, नमूनों पर एलईडी पैनलों को निलंबित करना, या संस्कृति डिश ढक्कन 32,38,39,40,64,65,66 में एल ई डी को शामिल करना शामिल है. महत्वपूर्ण बात यह है कि इस प्रोटोकॉल में उपयोग किया जाने वाला प्रकाश बॉक्स उपयोगकर्ताओं को स्वतंत्र रूप से व्यक्तिगत कुओं (बुगाज एट अल.52 के विपरीत) को विनियमित करने या प्रकाश जोखिम पर स्थानिक नियंत्रण प्रदान करने की अनुमति नहीं देता है। स्थानिक स्थानीयकृत optogenetic सक्रियण क्रमशः SPIM या confocal सिस्टम में लेज़रों का उपयोग bOpto-BMP38 और bOpto-नोडल39 के साथ प्रदर्शन किया गया है, और यह भी मॉडल प्रणालियों की एक किस्म में कई अन्य optogenetic रणनीतियों के साथ महसूस किया गया है (रोजर्स और मुलर12 में चर्चा की). कुछ दृष्टिकोणों ने उप-कोशिकीय स्थानिक संकल्प 29,30,31 भी हासिल किया है। यद्यपि स्थानिक रूप से स्थानीयकृत प्रकाश एक्सपोजर सिस्टम का कार्यान्वयन इस प्रोटोकॉल के दायरे से बाहर है, लेकिन बीओपीटीओ-बीएमपी / नोडल के साथ स्थानिक सक्रियण प्रयोग सैद्धांतिक रूप से डिजिटल माइक्रोमिरर डिवाइस या मास्किंग दृष्टिकोण जैसे विशेष उपकरणों के साथ संभव हैं। पाठकों को प्रकाश जोखिम रणनीति के लिए प्रतिबद्ध होने से पहले ऑप्टोजेनेटिक प्रयोगों के लिए DIY प्रकाश बक्से पर व्यापक साहित्य का पता लगाने के लिए प्रोत्साहित किया जाता है (उदाहरण के लिए, गेरहार्ट एट अल.51, बुगाज एट अल.52, कुमार और खम्माश 53 और https://www.optobase.org/materials/ पर अधिक देखें)।

आणविक ऑप्टोजेनेटिक रणनीतियों अक्सर म्यूटेंट, एक्टोपिक जीन अभिव्यक्ति, पुनः संयोजक प्रोटीन और दवाओं जैसे ऐतिहासिक दृष्टिकोणों की तुलना में जैविक प्रक्रियाओं पर उच्च स्तर के स्थानिक नियंत्रण की पेशकश करते हैं। पाठक जो ऑप्टोजेनेटिक दृष्टिकोण के लाभों में रुचि रखते हैं, वे ज़ेब्राफिश और अन्य जीवों में उपलब्ध अन्य प्रकाशित उपकरणों का पता लगा सकते हैं। इनमें अतिरिक्त सिग्नलिंग रास्ते 32,65,67,68 में हेरफेर करने, जीन अभिव्यक्ति 61,64,66,69,70,71 को विनियमित करने, प्रोटीन स्थानीयकरण31,72 को बदलने और एपोप्टोसिस 62 को सक्रिय करने के लिए उपकरण शामिल हैं . इन उपकरणों और कई अन्य लोगों को आसानी से OptoBase पर सूचीबद्ध कर रहे हैं, आणविक optogenetics दृष्टिकोण28 के लिए एक क्यूरेटेड वेब संसाधन. उपन्यास ऑप्टोजेनेटिक उपकरण बनाने के लिए प्रेरित लोगों के लिए, संसाधन में प्रकाश-उत्तरदायी प्रोटीन के उपयोगी विवरण भी शामिल हैं जिन्हें रणनीतियों की एक विस्तृत श्रृंखला में नियोजित किया गया है, जिसमें प्रकाश-उत्तरदायी प्रोटीन शामिल हैं जो हरे, लाल और निकट-अवरक्त तरंग दैर्ध्य का जवाब देते हैं। हम वैज्ञानिक समुदाय के लिए आणविक ऑप्टोजेनेटिक दृष्टिकोण की पूरी क्षमता का एहसास करने के लिए उत्साहित हैं।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस प्रोटोकॉल के लिए फंडिंग NICHD इंट्राम्यूरल प्रोग्राम द्वारा KWR (ZIA HD009002-01) को प्रदान की गई थी। हम जेफ फैरेल और उनकी प्रयोगशाला को उनकी रोशन प्रतिक्रिया के लिए धन्यवाद देते हैं, उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए विल एंडरसन, प्रोटोकॉल के तनाव परीक्षण और विकिरण को मापने के लिए लीन इन्नुची, और जेब्राफिश को स्वस्थ रखने के लिए उनकी कड़ी मेहनत के लिए एनआईएच साझा ज़ेब्राफिश सुविधा।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Building a light box & Light exposure protocol
#8 x 1" Hex Self-drilling Screw McMaster-Carr 99663A222 1.4.5
Digital Optical Power and Energy Meter ThorLabs PM100D 1.7
4
Incubator (142 liters) Boekel Scientific 139400 1.3.1
Incubator Panel Mount (1/4" thick cast black acrylic) Custom part / Piedmont Plastics Incubator_panel 1.4.4
Large HSS Spiral Groove Step Drill Bit CO-Z SDB0001TA 1.3.2
LED lens gasket, Incubator gasket; 1/32" thick black silicone McMaster-Carr 5812T12 1.4.3
1.4.4
LED microplate illuminator Prizmatix NA 1.1
1.4.3
M3 10mm Cube Standoff Newark Eletronics 005.60.533 1.4.1
M3 x 10mm 316SS Flat Head Screw McMaster-Carr 91801A156 1.4.1
M6 x 10mm 316SS Flat Head Screw McMaster-Carr 91801A305 1.4.3
Memory card thermometer Fisherbrand 15-081-111 1.9
3.2.1
Microscope Slide Power Meter Sensor Head (150 mW) ThorLabs S170C 1.7
4
Red gel filter paper #E106 Rosco / B&H Foto & Electronics 110084014805-E106 4.2.1
Side Brackets (1/4" thick cast black acrylic) Custom part / Piedmont Plastics Side_bracket 1.4.2
Vertical Bracket (1/4" thick cast black acrylic) Custom part / Piedmont Plastics Vertical_bracket 1.4.1
Weather stripping: Light duty EPDM foam, 1/2" wd 1/4" tk McMaster-Carr 8694K12 1.8
Generating mRNA
EZNA MicroElute Cycle Pure Kit Omega D6293-02 2.4
GeneJET Miniprep Kit (250 rxns) Thermo Scientific K0503 2.2
Microsample incubator (Hybex) SciGene 1057-30-0 2
Microsample incubator 1.5 ml tube block (Hybex) SciGene 1057-34-0 2
Nanodrop One Spectrophotometer Thermo Scientific ND-ONE-W 2.4
NotI-HF restriction enzyme New England Biolabs (NEB) R3189L 2.1
pCS2-Opto-Alk3 Addgene 207614 2
pCS2-Opto-Alk8 Addgene 207615 2
pCS2-Opto-BMPR2a Addgene 207616 2
RNeasy Mini Kit (250 rxns) Qiagen 74106 2.3
Injecting mRNA
Agarose (UltraPure) Invitrogen / Thermo Fisher 16500500 3.1.1
250 ml glass beakers Fisherbrand FB100250 3.3.2
6-well dishes (case of 50) Falcon 08 772 1B 3.1.6
B-8A ball joint Narishige B-8A 3.3
Back pressure unit (microinjection rig component) Applied Scientific Instrumentation (ASI) BPU 3.3
Foot switch (microinjection rig component) Applied Scientific Instrumentation (ASI) FWS 3.3
GJ-1 magnetic stand Narishige GJ-1 3.3
Glass capillaries (4 in, OD 1 mm, filament) World Precision Instruments 1B100F-4 3.1.11
Glass petri dish bottoms (for dechorionating) Pyrex 08-748A 3.3.2
Glass pipettes (5 3/4" with wide tip) Kimble-Chase 63A53WT 3.1.9
Injection dish molds Adaptive Science Tools tu1 3.1.3
IP iron plate Narishige IP 3.3
M-152 micromanipulator Narishige M-152 3.3
Micro pipette holder kit (microinjection rig component) Applied Scientific Instrumentation (ASI) MIMPH-MPIP-Kit 3.3
Micrometers Meiji Techno America MA285 3.3
MPPI-2 pressure injector (microinjection rig component) Applied Scientific Instrumentation (ASI) MPPI-3 3.3
Needle puller World Precision Instruments PUL-1000 3.1.11
Petri dishes (100 mm x 15 mm, case of 500) Falcon 08-757-100D 3.1.2
Pipettor (10 ml, green) Bel-Art F37898-0000 3.3
Pronase Roche 11459643001 3.3.2
Squeeze bottles (500 ml) Nalgene / Thermo Scientific 2402-0500 3.3

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References

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Saul, A. J., Rogers, C. E., Garmendia-Cedillos, M., Pohida, T., Rogers, K. W. Optogenetic Signaling Activation in Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (200), e65733, doi:10.3791/65733 (2023).

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