Summary
Hidtil er protokoller til samtidig isolering af alle de vigtigste celletyper, der er hjemmehørende i centralnervesystemet, fra den samme mus et uopfyldt behov. Protokollen viser en procedure, der kan anvendes i naive og eksperimentelle autoimmune encephalomyelitis-mus til at undersøge komplekse cellulære netværk under neuroinflammation og samtidig reducere det krævede museantal.
Abstract
Eksperimentel autoimmun encephalomyelitis (EAE) er den mest almindelige murinmodel for multipel sklerose (MS) og bruges ofte til yderligere at belyse den stadig ukendte ætiologi af MS for at udvikle nye behandlingsstrategier. Myelin oligodendrocytglycoprotein peptid 35-55 (MOG35-55) EAE-modellen reproducerer et selvbegrænsende monofasisk sygdomsforløb med stigende lammelse inden for 10 dage efter immunisering. Musene undersøges dagligt ved hjælp af et klinisk scoringssystem. MS drives af forskellige patomekanismer med et specifikt tidsmæssigt mønster, og derfor er undersøgelsen af centralnervesystemets (CNS) -residente celletypers rolle under sygdomsprogression af stor interesse. Det unikke ved denne protokol er samtidig isolering af alle de vigtigste CNS-residente celletyper (mikroglia, oligodendrocytter, astrocytter og neuroner), der gælder hos voksne EAE og raske mus. Dissociationen af hjernen og rygmarven fra voksne mus efterfølges af magnetisk aktiveret cellesortering (MACS) for at isolere mikroglia, oligodendrocytter, astrocytter og neuroner. Flowcytometri blev anvendt til at udføre kvalitetsanalyser af de oprensede enkeltcellesuspensioner, hvilket bekræftede levedygtigheden efter celleisolering og indikerede renheden af hver celletype på ca. 90%. Afslutningsvis tilbyder denne protokol en præcis og omfattende måde at analysere komplekse cellulære netværk hos raske mus og EAE-mus på. Desuden kan antallet af påkrævede mus reduceres væsentligt, da alle fire celletyper isoleres fra de samme mus.
Introduction
Multipel sklerose (MS) er en kronisk inflammatorisk autoimmun sygdom i centralnervesystemet (CNS) karakteriseret ved demyelinisering, aksonal skade, gliose og neurodegeneration. På trods af talrige forskningsmetoder på dette område er patofysiologien af MS stadig ikke fuldt ud forstået 1,2,3,4. Den mest almindelige dyremodel til undersøgelse af MS er myelin oligodendrocytglycoprotein peptid 35-55 (MOG35-55)-induceret eksperimentel autoimmun encephalomyelitis (EAE), som deler mange af dets kliniske og patofysiologiske egenskaber 5,6,7,8,9 . Det er baseret på immunsystemets respons mod CNS-specifikke antigener, der fører til inflammation, demyelinering og neuroaxonal degeneration. Eksperimentel autoimmun encephalomyelitis (EAE) er en passende model til undersøgelse af neuroinflammatoriske veje og signalkaskader fundet i MS.
De nuværende behandlingsmuligheder for MS er kun delvist effektive og fokuserer primært på sygdommens indledende inflammatoriske fase. Imidlertid synes den neurodegenerative komponent i MS at være den største udfordring for langsigtede terapeutiske tilgange. Derfor kræves reproducerbare og præcise celleisoleringsprotokoller for at undersøge molekylære og cellulære mekanismer i autoimmune sygdomme på en omfattende måde. Selv hvis der findes nogle protokoller til isolering af en enkelt celletype 10,11,12,13,14,15, er der et uopfyldt behov for samtidig isolering af flere CNS-residente cellepopulationer på én gang. Tidligere protokoller til isolering af CNS-residente celler mangler at bevare cellulær funktionalitet og renhed, hvilket resulterer i samdyrkning med naboceller 16,17,18 eller uegnethed til komplekse analyser af intracellulære netværk ex vivo 19,20,21,22.
Formålet med denne protokol var at etablere en reproducerbar og omfattende metode til samtidig isolering af rene levedygtige enkeltcellesuspensioner af alle de vigtigste CNS-residente celletyper, der kan anvendes i voksne raske mus og EAE-mus. De forskellige celletyper blev isoleret ved hjælp af magnetisk aktiveret cellesortering (MACS)23. Celleseparationen kan opnås enten ved positiv selektion, dvs. magnetisk mærkning af celletypespecifikke overflademarkører eller ved negativ selektion via biotinylering og udtømning af alle uønskede celler. Flowcytometri blev anvendt for at sikre en renhed på over 90% og en levedygtighed på mindst 80% af de isolerede enkeltcellesuspensioner.
Afslutningsvis var hovedmålet at etablere en protokol til samtidig isolering af alle de vigtigste CNS-residente celletyper som et alsidigt værktøj til undersøgelse af neuroinflammatoriske veje, der tilbyder en omfattende og præcis analyse af komplekse cellulære netværk og biokemiske signalkaskader hos raske mus og EAE-mus.
Protocol
Alle EAE-forsøg blev induceret i C57BL/6J-hunmus i en alder af 10-12 uger og godkendt af lokale myndigheder (Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz Nordrhein-Westfalen). Overholdelsen af den tyske og EU's dyrebeskyttelseslovgivning blev også sikret på ethvert tidspunkt under forsøgene. Alle mus blev holdt under individuelt ventilerede bure dyrestaldforhold.
BEMÆRK: Følgende reagensvolumener refererer til en voksen murinhjerne og rygmarv, som kaldes CNS-cellesuspension i det følgende og vejer ca. ca. 20 mg til 500 mg. Hvis der planlægges dissociation af mere end én CNS-cellesuspension, skal alle reagensvolumener og -materialer skaleres op i overensstemmelse hermed. Det anbefales at opbevare Dulbeccos fosfatbufferede saltvand (D-PBS; 1x) med calcium og magnesium, suppleret med 1 g/l glucose og 36 mg/l natriumpyruvat) kontinuerligt på is under hele forsøget. Hvis celledyrkning planlægges bagefter, skal du udføre alle trin under sterile forhold ved brug af hætter. Ellers behøver ingen af følgende protokolafsnit at blive udført under en hætte. Opbevar bufferne på is. Brug kun forkølede opløsninger og undgå hvirvelstrøm gennem hele eksperimentet. Se figur 1 for den overordnede arbejdsgang.
Figur 1: Arbejdsproces til samtidig isolering af oligodendrocytter, mikroglia, astrocytter og neuroner i naive mus og EAE-mus. De første trin i arbejdsgangen er de samme for både naive mus og EAE-mus. Hvis der ønskes arbejde med en EAE-replikat, skal EAE-induktion udføres på forhånd (1). Kort fortalt begynder protokollen med dissektion (2) og dissociation (3) af murin hjerne og rygmarv efterfulgt af fjernelse af snavs (4) og røde blodlegemer (5). Derefter opdeles den resulterende oprensede CNS-cellesuspension i to fraktioner til samtidig isolering af oligodendrocytter og mikroglia via MACS (6). Microglia detekteres via anti-CD11b mikroperler, mens oligodendrocytter isoleres ved hjælp af anti-O4 mikroperler (positive selektioner). Fra den negative gennemstrømning af oligodendrocytterne (8) isoleres astrocytter via anti-ACSA-2 mikroperler (positiv selektion) og neuroner ved biotinmærkning og udtømning af alle ikke-neuronale celler (negativ selektion). I EAE-mus efterfølges isoleringen af CD11b + -celler af fluorescensaktiveret cellesortering af CD45intCD11bhøje celler for at eliminere andre CD11b + immunceller som makrofager, dendritiske celler, monocytter, granulocytter og naturlige dræberceller, der vides at deltage i neuroinflammationsprocesser under EAE-kurset (7) 27,28,48. Efter isolering af de forskellige CNS-residente celletyper kan renhedsanalyser udføres (9). Forkortelser: Abs = antistoffer; ACSA-2 = astrocytcelleoverfladeantigen-2; CD11b = cyclinafhængig kinase 11B; CD45 = receptor-type tyrosin-proteinphosphatase C; CNS = centralnervesystemet; EAE = eksperimentel autoimmun encephalomyelitis; MACS = magnetisk aktiveret cellesortering; O4 = oligodendrocytmarkør O4. Dette tal er ændret fra49. Klik her for at se en større version af denne figur.
1. Induktion af aktive EAE
- Fremstilling af reagenser
- Til celleseparation: Forbered PB-bufferen og opbevar den ved 2-8 °C i højst 1 uge. For at forberede stamopløsning tilsættes 475 ml 1x PBS uden tilskud (pH 7,2) + 25 ml 0,5% bovint serumalbumin (BSA). Brug en 1:20 fortynding fremstillet i BSA.
- Til flowcytometri og fluorescensaktiveret cellesortering (FACS): Forbered FACS-bufferen, PBS med 2% føtalt kalveserum (FCS) og 2 mM EDTA og opbevar den ved 2-8 °C. For at forberede tilsættes 500 ml 1x PBS uden kosttilskud og 10 ml FCS + 2 ml EDTA (fra 0,5 M EDTA-lager)
- Udfør immunisering i henhold til protokollen fra Bittner et al. 5. Kort sagt, inducer EAE ved subkutan injektion af en emulsion indeholdende 200 μg MOG35-55 peptid og 200 μL komplet Freuds adjuvans inklusive 200 μg Mycobacterium tuberculosis.
- Bedøv musen med 2% isofluran ved hjælp af et anæstesikammer med en isofluranfordamper. Brug dyrlægesalve på dyrets øjne for at forhindre tørhed under anæstesi.
- Efter 2 timer injiceres en intraperitoneal injektion af 100 ng kighostetoksin (PTx) opløst i 100 μL 1x PBS i henhold til protokollen fra Huntemann et al.24. Gentag PTx-injektionen på dag 2 efter immunisering.
FORSIGTIG: Overhold hvert dyr, indtil det har genvundet tilstrækkelig bevidsthed til at opretholde brystliggende. Mus, der har gennemgået injektionsprocedurerne, returneres ikke til de andre mus' selskab, før de er kommet sig helt. For Mycobacterium tuberculosis og PTx: Undgå indånding, indtagelse og kontakt med hud og øjne. Mycobacterium tuberculosis er en aktivator af det medfødte immunsystem. PTx har mange biologiske virkninger. - Overvåg EAE-progression dagligt, udført af to blindede efterforskere, der overvåger vægten og undersøger musene klinisk.
- Til dette formål skal du bruge følgende scoringssystem var grad 0-ingen kliniske tegn på EAE, grad 1- delvis haleparese, grad 2-komplet haleparese, grad 3-moderat svaghed i bagbenene, grad 4-komplet svaghed i bagbenene og ataxisk gang, grad 5-mild paraparese, grad 6-paraparese, grad 7-paraplegi, grad 8-tetraparese, grad 9-quadriplegi, og grad 10-død.
- Brug følgende eksklusionskriterier for yderligere deltagelse i eksperimentet: klinisk score > 7 eller et vægttab, der overstiger 20% af den oprindelige kropsvægt.
- Til dissektion af hjernen og rygmarven skal du aflive EAE-mus på dag 16 efter EAE-induktion, der repræsenterer sygdomsmaksimum.
2. CNS-vævsforberedelse (varighed: ca. 10 min pr. Mus)
- Efter at have ofret mus med kuldioxid, skal du starte med transkardieperfusionen af hver mus med 20 ml 1x PBS. Gentag perfusion igen med 20 ml 1x PBS.
- Placer musen i liggende stilling og fastgør lemmerne med kanyler. Påfør 75% ethanol på dyrets forside. Yderligere sterilitetsforanstaltninger er ikke nødvendige på dette tidspunkt.
- Åbn maven og thoraxen ved at lave en langsgående sektion gennem huden og fascia ved hjælp af en saks.
- Skær ribbenene sideværts og fold brystkassen op for at få fri adgang til hjertet. Fastgør thoraxen foldet opad med kanyler.
- Åbn højre atrium ved hjælp af en saks. Påfør 20 ml 1x PBS i venstre ventrikel med en kanyle for at skylle blodet ud gennem det indskårne højre atrium.
- Udsæt kraniet ved at skære huden oven på murinhovedet via en langsgående sektion og skift huden rundt om hovedet ved hjælp af en tang. Skær kraniet ved hjælp af en saks langs sagittal sutur.
- Indsæt spidsen af en tang langs snitlinjen for at åbne kalotten. Fjern resterende dele af calotten med tang, så hjernen er fuldt udsat.
- Fjern hjernen forsigtigt og placer den i en murin hjernematrix. Skær hjernen i 1 mm tykke sagittale skiver ved hjælp af et barberblad.
- Skær rygsøjlen ved hjælp af en saks lige over iliac kammen, så sprøjten kan indsættes i rygmarvskanalen.
BEMÆRK: Den nemmeste måde at fjerne rygmarven på er at skylle den ud af rygmarven med PBS. Ellers skal vertebrale buer åbnes individuelt med en saks, og derefter kan rygmarven fjernes. - Skyl rygmarven ud af rygmarven fra kaudal til kranial ved hjælp af en 20 ml sprøjte med en 20G kanyle indeholdende 1x PBS. Skær rygmarven i 0,5 cm lange segmenter ved hjælp af en skalpel.
- Hver CNS-cellesuspension bestående af hjerne og tilsvarende rygmarv opbevares i en separat petriskål pr. mus fyldt med ca. 3 ml kold D-PBS. Opbevar opvasken på is indtil videre behandling.
3. CNS-vævsdissociation (varighed: ca. 1-1,5 timer afhængigt af antallet af CNS-cellesuspensioner)
BEMÆRK: Neuralt væv fra voksne mus dissocieres ved at kombinere mekanisk dissociation med enzymatisk nedbrydning af den ekstracellulære matrix. Derved forbliver den strukturelle integritet, og cellesuspensionen kan anvendes til yderligere celleisoleringsprocedurer.
- Der fremstilles et passende volumen enzymblanding 1 bestående af 50 μL enzym P og 1.900 μL buffer Z pr. CNS-cellesuspension. Begge reagenser tilhører det voksne hjernedissociationssæt.
- Der fremstilles et passende volumen enzymblanding 2 bestående af 10 μl enzym A og 20 μl buffer Y pr. CNS-cellesuspension. Begge reagenser tilhører det voksne hjernedissociationssæt.
- 1.950 μL enzymblanding 1 overføres til C-røret, og vævsstykkerne fra en CNS-cellesuspension tilsættes bagefter. Brug et C-rør pr. Mus.
- Der tilsættes 30 μL enzymblanding 2 til hvert C-rør. Luk C-rørene tæt og fastgør dem på hovedet på celledissociatorens ærme med varmeapparater.
- Kør det relevante program med navnet 37C_ABDK_01 (tager 30 minutter). Overhold mindst de første 5 minutter af programmet for at sikre, at alle rør drejer med samme hastighed. Forekomsten af fejl under kørslen er mulig. Fortsæt derefter til trin 6.
- I de sidste 2 minutter af programmet anbringes en 70 μm si på et 50 ml rør for hver dissocieret CNS-cellesuspension. Fugt disse sier med 2 ml D-PBS.
- Efter afslutning af programmet skal du fastgøre C-rørene fra dissociatoren og placere dem i en centrifuge. Prøverne centrifugeres ved 300 x g og 4 °C i 1 minut for at opsamle prøven i bunden af glasset.
- Resuspender prøven og påfør den på den fugtede si. Tilsæt 10 ml kold D-PBS til det tomme C-rør og luk det. Ryst det forsigtigt og påfør suspensionen på den tilsvarende si.
- Kassér sierne, og luk de 50 ml rør. Cellesuspensionen centrifugeres igen ved 300 x g og 4 °C i 10 minutter. Derefter suges hele supernatanten meget omhyggeligt.
4. Fjernelse af affald (varighed: Ca. 1,5-2 timer afhængigt af antallet af CNS-cellesuspensioner)
BEMÆRK: Vævsdissociation fører ofte til myelin og celleaffald, der kan forringe nedstrømsanalysen. Ved at tilføje en løsning til fjernelse af snavs kan dette affald effektivt fjernes fra CNS-cellesuspensionen.
- Resuspender cellepellet forsigtigt med 3.100 μL D-PBS for hver CNS-cellesuspension. Må ikke hvirvel.
- Hvis der arbejdes med mere end én CNS-cellesuspension, samles maksimalt to CNS-cellesuspensioner afledt af en tilstand eller eksperimentel gruppe i et 15 ml rør.
- Tilsæt 900 μL af opløsningen til fjernelse af affald fra det voksne hjernedissociationssæt til en CNS-cellesuspension eller 1.800 μL opløsning til fjernelse af affald til to poolede CNS-cellesuspensioner.
- Vend røret og bland suspensionen. Derefter overlejres det meget forsigtigt med 4 ml kold D-PBS. En klar gradient skal være synlig (figur 2A).
- Centrifuger slangerne i 10 minutter ved 3000 x g og 4 °C med fuld acceleration og ingen bremse.
- Hvis adskillelsen sker som beregnet, dannes tre faser (figur 2C). De to øverste faser suges fuldstændigt (figur 2C-1,2) suges til syn, og de kasseres. Det er vigtigt, at der ikke efterlades myelinrester (figur 2E).
BEMÆRK: Hvis gradienten ikke fungerede, og cellerne er nødvendige hurtigt, skal du ikke suge de to øverste faser af. Fyld i stedet 15 ml røret med koldt D-PBS op til 15 ml og inverter flere gange. Der centrifugeres igen ved 1000 x g i 10 minutter ved 4 °C med fuld acceleration og ingen bremse. Sug supernatanten af, og gentag trin 4.1-4.4. - Fyld røret op med kold D-PBS op til 14 ml og luk det. Vend røret kraftigt på arbejdsbordet, indtil cellepillen løsner sig fra bunden af røret. Må ikke hvirvel.
- Prøven centrifugeres igen ved 1000 x g og 4 °C i 10 minutter. Indstil fuld acceleration og fuld bremse. Supernatanten suges forsigtigt og fuldstændigt.
Figur 2: Må og må under fjernelse af affald. (A) Positivt eksempel for gradienten efter overlejring med 4 ml PBS. Den øverste fase bestående af 4 ml PBS kan tydeligt skelnes fra den nedre fase, der består af CNS-cellesuspensionen med opløsningen til fjernelse af affald. (B) Negativt eksempel for gradienten efter overlejring med 4 ml PBS. Gradienten mangler en klar adskillelse mellem PBS og cellesuspensionen nedenfor. En smule af PBS diffunderes ind i cellesuspensionen. C) Positivt eksempel på gradienten efter centrifugering. Der kan let skelnes mellem tre separate faser. Der er ingen synlige myelinrester i gradientens øvre (1) eller nedre fase (3). Den midterste fase indeholder alt myelin (2). Cellepillen er synlig i bunden af 15 ml røret. D) Negativt eksempel for gradienten efter centrifugering. Der er ingen nøjagtig adskillelse mellem de tre faser mulig. Nogle myelinrester er synlige i gradientens øvre (1) og nedre fase (3). E) Positivt eksempel på gradienten efter aspirering af de to øverste faser. Den resulterende prøve indeholder kun cellepellet og en klar supernatant ovenfor. Ingen myelinrester efterlades. (F) Negativt eksempel for gradienten efter aspirering af de to øverste faser. Prøven indeholder stadig nogle myelinrester (sort pil). Forkortelser: CNS = centralnervesystemet; PBS = fosfatbufret saltvand Klik her for at se en større version af denne figur.
5. Fjernelse af røde blodlegemer (Varighed: Ca. 1 time afhængigt af antallet af CNS-cellesuspensioner)
BEMÆRK: Dette trin forhindrer senere kontaminering med røde blodlegemer og sikrer en optimal lysering af erytrocytter med minimal effekt på de andre celletyper isoleret fra CNS-vævet. Følgende volumener er indiceret for cellesuspensioner afledt af 100 mg til 1 g neuronalt væv svarende til to voksne musehjerner og rygmarv. Hvis du arbejder med mere end to CNS-cellesuspensioner, skal du skalere alle reagenser og samlede volumener i overensstemmelse hermed.
- Start med fremstilling af opløsning til fjernelse af røde blodlegemer (RBCRS): pr. To poolede CNS-cellesuspensioner. 100 μL stamopløsning til fjernelse af røde blodlegemer (10x) fortyndes fra det voksne hjernedissociationssæt i 900 μL ddH2O for at nå en endelig fortynding på 1:10.
- RBCRS opbevares ved 2-8 °C indtil brug. Kassér ubrugte rester sidst på dagen.
- Resuspender cellepelleten fra op til to CNS-cellesuspensioner i 1 ml RBCRS. Undgå hvirvelstrøm. Inkuber opløsningen i 10 minutter ved 4 °C.
- Der tilsættes 10 ml kold PB-buffer til to poolede cellesuspensioner. Prøven centrifugeres ved 300 x g og 4 °C i 10 minutter, hvorefter supernatanten suges helt op.
- Hver cellepellet resuspenderes fra en CNS-cellesuspension i 80 μL PB-buffer ved at pipettere langsomt op og ned. Brug derfor 160 μL til at resuspendere cellepellets afledt af to CNS-cellesuspensioner.
- Når du arbejder med flere CNS-cellesuspensioner fra samme eksperimentelle tilstand, skal du samle alle disse cellesuspensioner.
- Bestem celleantallet, f.eks. ved hjælp af et forbedret tællekammer. Cellesuspensionerne blev sædvanligvis fortyndet 1:50 i PB-buffer efterfulgt af en yderligere fortynding på 1:10 i 0,4 % trypanblåt opløsning.
6. Protokol med magnetiske perler i naive mus og EAE-mus (varighed: Ca. 1 time)
- Mærk magnetisk de forskellige CNS-celletyper med MicroBeads, der er specifikke for deres overfladeantigen. Placer derefter cellesuspensionen i kolonnen og magnetisk adskille mærkede celler, der bevares i kolonnen, og umærkede celler, der løber igennem.
- Når du har fjernet søjlen fra magnetfeltet, skylles magnetisk mærkede celler ud af kolonnen i et rør som den positivt valgte cellefraktion.
BEMÆRK: Volumenerne for den magnetiske mærkningsproces beregnes for op til 1 x 107 celler i alt. Hvis der opnås flere celler, skal du skalere alt reagens og samlede volumener i overensstemmelse hermed. Det anbefales at arbejde hurtigt og kun bruge forkølede opløsninger for at forhindre capping af antistoffer på celleoverfladen og ikke-specifik cellemærkning samt for at sikre en høj levedygtighed af de isolerede cellepopulationer. Det er også vigtigt at udføre vasketrinnene, så snart søjlebeholderen er tom, ved at tilføje PB-bufferen, så søjlerne ikke tørrer ud. - Den rensede ufortyndede CNS-cellesuspension opdeles i to fraktioner til følgende isolering af mikroglia og oligodendrocytter. Forholdet mellem begge fraktioner afhænger af det ønskede celleantal for hver celletype.
BEMÆRK: Yderligere detaljer (inkubationens varighed, detaljerede protokoltrin, volumener, reagenser og celletællingsmetode) er angivet i tabel 1.
Tabel 1: Arbejdsproces for samtidig magnetisk mærkning og isolering af oligodendrocytter og mikroglia fra naive mus og EAE-mus. Begge celletyper isoleres via en positiv selektion. Trin, der er angivet i samme række, er angivet til at blive udført på én gang. Forkortelser: CD11b = cyclinafhængig kinase 11B; EAE = eksperimentel autoimmun encephalomyelitis; FcR = Fc receptorlignende protein; O4 = oligodendrocytmarkør O4. Klik her for at downloade denne tabel.
7. Protokolændring: supplerende sortering til isolering af mikroglia i EAE-mus (varighed: ca. 1,5-2 timer)
BEMÆRK: Når du arbejder med EAE-mus, er det nødvendigt at supplere den MACS-baserede celleisolationsprotokol med FACS for at fjerne CD11b + cellepopulationer bortset fra mikroglia (f.eks. Monocytter, makrofager, naturlige dræberceller, granulocytter eller dendritiske celler) fra CD11b + cellefraktionen. Ellers kan dette trin ignoreres.
- Forbered farvningsmasterblandingen indeholdende 1x PBS suppleret med CD11b FITC (klon M1/70, 1:50) og CD45 APC/Cy7 (klon 30-F11, 1:200). Brug 100 μL af farvningsmasterblandingen pr. 5 x 106 celler. Vortex alle antistoffer før brug.
- Microglia-cellesuspensionen centrifugeres ved 300 x g og 4 °C i 10 minutter, og supernatanten suges forsigtigt.
- Resuspender cellepellet med 100 μL af den tilberedte farvningsmasterblanding pr. 5 x 106 celler. Inkuber i 15 minutter i mørke ved stuetemperatur (RT).
- Reaktionen standses ved tilsætning af 500 μL PBS, og prøven centrifugeres igen ved 300 x g og 4 °C i 10 minutter.
- Supernatanten suges forsigtigt og opslæmmes cellepellet med 1x PBS suppleret med 10 μg/ml DNAse for at nå en slutkoncentration på 1 x 107 celler pr. ml. Opbevar cellerne ved 4 °C, indtil sorteringen begynder.
- Påfør cellesuspensionen på en 100 μm si, der er anbragt på et nyt FACS-rør, umiddelbart før sorteringen påbegyndes.
- Indstil strømningshastigheden til 1000 hændelser pr. sekund, og brug 100 μm dysen. Sorter den ønskede cellepopulation af CD45intCD11bhøje celler i et nyt 15 ml rør forberedt med 1x PBS ved RT.
8. Forberedelse af negativ gennemstrømning af oligodendrocytter til isolering af neuroner og astrocytter (varighed: Ca. 1 time)
BEMÆRK: Den negative gennemstrømning af oligodendrocytter fra trin 6 indsamles til yderligere isolering af neuroner og astrocytter. Til dette formål opdeles cellesuspensionen i to dele. På grund af den tidligere isolering af oligodendrocytter fra CNS-cellesuspensionen minimeres forurening med O4+ celler, som ellers ville blive observeret.
- Oligodendrocytternes negative gennemstrømning centrifugeres ved 300 x g og 4 °C i 10 minutter, og supernatanten suges forsigtigt.
- Cellepellet resuspenderes i 80 μL PB-buffer pr. poolet CNS-cellesuspension, der tidligere blev anvendt til isolering af den oligodendrocytpositive fraktion.
- Tæl cellerne. Optællingen af celler, der antages at være O4, foretages ved hjælp af et forbedret tællekammer efter fortynding af cellesuspensionen 1:50 i PB-buffer efterfulgt af en yderligere 1:10-fortynding i 0,4 % trypanblåt.
- Opdel den rensede ufortyndede cellesuspension i to fraktioner til følgende samtidige isolering af neuroner og astrocytter. Forholdet mellem begge fraktioner afhænger af den foretrukne mængde af hver celletype.
BEMÆRK: Yderligere detaljer (inkubationens varighed, detaljerede protokoltrin, volumener, reagenser og celletællingsmetode) er angivet i tabel 2.
Tabel 2: Arbejdsproces for samtidig magnetisk mærkning og isolering af neuroner og astrocytter fra naive og EAE-mus. Begge celletyper er isoleret fra den negative gennemstrømning af oligodendrocytter. Astrocytter adskilles som en positiv selektion via anti-ACSA-2 mikroperler, mens neuroner renses via biotinylering og udtømning af alle ikke-neuronale celler som en negativ selektion. Trin, der er angivet i samme række, er angivet til at blive udført på én gang. Forkortelser: Anti-ACSA-2 = astrocytcelleoverfladeantigen-2; EAE = eksperimentel autoimmun encephalomyelitis; FcR = Fc receptorlignende protein; MACS = magnetisk aktiveret cellesortering. Klik her for at downloade denne tabel.
9. Renhedsanalyser af de isolerede CNS-residente celletyper (varighed: Ca. 2 timer)
BEMÆRK: Det anbefales at udføre flowcytometri af alle fire isolerede CNS-residente cellepopulationer for at måle og sammenligne deres renhed og levedygtighed. Derfor er det nødvendigt at plette alle celletyper med et antistof mærket med fluorofor. Farvning af levende / døde celler implementeres ved hjælp af et fikserbart levedygtighedsfarvestof (1: 10.000).
- Renhedspanel - ekstracellulær farvningsprotokol
- Brug 1 x 105 celler opløst i 50 μL PBS pr. Farvning.
- Forbered farvningsmasterblandingen opløst i PBS med 2% FCS / 2 mM EDTA bestående af følgende fluorkromkonjugerede monoklonale antistoffer rettet mod celletypespecifikke overflademarkører: CD11b FITC (klon 1/70, 1:100)25,26,27,28, Biotin-PE (klon Bio3-18E7, 1:200)29,30,31,32, ACSA-2 PE-Vio615 (klon REA-969, 1:200)33,34,35, O4 APC (klon REA-576, 1:400) og CD45 BV510 (klon 30-F11, 1:150)36,37. Der tilsættes 1 μg anti-CD16/32 pr. 1 x 106 celler for at blokere Fc-receptoren3 8,39. Vortex alle antistoffer før brug.
- Cellesuspensionen centrifugeres i 5 minutter ved 540 x g og 4 °C, og supernatanten suges forsigtigt.
- Cellepillen resuspenderes i 100 μL af den respektive masterblanding, og prøven inkuberes i 15 minutter ved RT i mørke.
- Cellerne vaskes med 500 μL 1x PBS med 2% FCS/2 mM EDTA og centrifugeres prøven i 5 minutter ved 540 x g og 4 °C.
- Supernatanten suges til syn, og cellepelletsen opslæmmes igen med 70 μL 1x PBS med 2 % FCS/2 mM EDTA.
- Vortex prøven for at adskille cellepillen fuldstændigt. Derefter er prøven klar til flowcytometrianalyse.
- Renhedspanel - intracellulær farvningsprotokol med NeuN
- Brug 1 x 105 celler i hver cellepopulation til intracellulær farvning af NeuN, som er en neuronspecifik nuklear markør 40,41. Dette er en ekstra måde at plette levedygtige neuroner på.
- Overfør 1 x 105 celler fra hver cellepopulation til et FACS-rør. Tilsæt 1 ml PBS med 2% FCS/2 mM EDTA pr. rør. Centrifuger glassene ved 540 x g og 4 °C i 5 minutter.
- I mellemtiden fremstilles masterblandingen opløst i PBS med 2% FCS/2 mM EDTA bestående af følgende fluorkromkonjugerede monoklonale antistoffer rettet mod celletypespecifikke overflademarkører: CD11b FITC (klon M1/70, 1:100)25,26,27,28, Biotin-PE (klon Bio3-18E7, 1:200)29,30,31,32, ACSA-2 PE-Vio615 (klon REA-969, 1:200)33,34,35 og CD45 BV510 (klon 30-F11, 1:150)36,37.
- Supernatanten suges til syn, og cellerne resuspenderes i 100 μl af den tilberedte masterblanding, og prøven inkuberes i 10 minutter ved RT i mørke.
- Cellerne vaskes med 100 μL PBS med 2% FCS/2 mM EDTA og centrifugeres igen ved 540 x g og 4 °C i 5 minutter.
- I mellemtiden fremstilles 200 μL af fikserings-/permeabiliseringsopløsningen: Der tilsættes 50 μL af det koncentrerede lager af fikserings-/permeabiliseringskoncentrat til 150 μL fikserings-/permeabiliseringsfortyndingsmiddel for at opnå en endelig fortynding på 1:4.
- Supernatanten suges til syn, og cellerne resuspenderes i 100 μl 1x fikserings-/permeabiliseringsopløsning. Prøven inkuberes i 30 minutter ved 4 °C.
- I mellemtiden fremstilles 1 ml 1x permeabiliserings-/vaskebuffer ved at tilsætte 100 μL permeabiliseringsbufferlager til 900 μL ddH2O for at nå en endelig fortynding på 1:10.
- Cellerne vaskes 1x med 100 μL 1x permeabiliserings-/vaskebuffer og centrifugeres prøven ved 540 x g og 4 °C i 5 min.
- I mellemtiden fremstilles en anden masterblanding i 1x permeabiliserings-/vaskebuffer, der kun består af NeuN (NeuN AF647, klon EPR12763, 1:200) og 1 μg anti-CD16/32 pr. 106 celler for at blokere Fc-receptoren.
- Opsug supernatanten. De faste og permeabiliserede celler resuspenderes i 50 μL af den anden masterblanding og inkuberes i 30 minutter ved 4 °C.
- Prøven vaskes med 100 μL 1x permeabiliserings-/vaskebuffer og centrifugeres ved 540 x g og 4 °C i 5 min.
- Supernatanten kasseres, og cellepelletsen resuspenderes i 70 μL PBS med 2 % FCS/2 mM EDTA. Derefter er prøven klar til flowcytometrisk analyse.
- Efter opsætning af panelet på flowcytometeret skal du erhverve celler til renhedsanalyse ved hjælp af en flowcytometrianalysesoftware.
10. Statistisk analyse
- Udfør statistiske analyser og design grafer med et grafisk analyseprogram. Data præsenteres som middelværdi ± SEM.
Representative Results
Den nuværende protokol giver mulighed for samtidig at isolere alle de vigtigste CNS-residente celler, dvs. mikroglia, oligodendrocytter, astrocytter og neuroner fra en enkelt CNS-replikation. Dette er vigtigt for at reducere antallet af mus, der er nødvendige for denne type eksperimenter, og for at sikre sammenligneligheden af molekylære og biokemiske analyser på celleniveau. Hvis de enkelte celletyper isoleres fra forskellige CNS-replikater, kan cellulære interaktioner ikke kortlægges sandfærdigt, og potentielle tekniske afvigelser under isolationsprocesserne kan skævvride yderligere downstream-analyser. Derudover ville molekylære og biokemiske fund fra hver celletype ikke være sammenlignelige med hinanden, da de ikke stammer fra den samme EAE-sammenhæng. En allerede eksisterende MACS-protokol ved hjælp af et kommercielt system/kit blev tilpasset for at muliggøre samtidig isolering af ovennævnte celletyper.
Isoleringen af mikroglia blev udført ved hjælp af anti-CD11b mikroperler, oligodendrocytter blev isoleret via anti-O4 mikroperler (tabel 1), og anti-ACSA-2 mikroperler blev brugt til at isolere astrocytter (tabel 2). I modsætning hertil repræsenterer isoleringen af neuroner en negativ selektion og blev opnået ved biotinylering og magnetisk mærkning af alle ikke-neuronale celler (tabel 2). Alle ikke-neuronale celler (fx oligodendrocytter, mikroglia, astrocytter, endotelceller og fibroblaster) undtagen blodlegemer kan magnetisk mærkes ved anvendelse af et biotinkonjugeret antistof, specifikt rettet mod et overfladeantigen udtrykt på disse ikke-neuronale celler (tabel 2). Ved udtømning af disse magnetisk mærkede ikke-neuronale celler kan der genereres meget rene og levedygtige neuronale cellepopulationer 30,42,43.
To nye flowcytometripaneler til renhedsanalyser af de genererede enkeltcellesuspensioner blev designet. Her blev celletypespecifikke overflade- og nukleare markører kombineret med levende / døde cellediskrimination brugt.
De resulterende celleudbytter pr. mus og celletype (figur 3A) blev analyseret og førte til et gennemsnit på 8. 4 x 105 ± 3 x 104 mikroglia, 3,23 x 106 ± 1 x 105 oligodendrocytter, 8,6 x 105 ± 2 x 104 astrocytter og 4,5 x 105 ± 1 x 104 neuroner pr. naiv mus.
I forbindelse med målet om at undersøge sygdomsmodeller for neuroinflammation blev protokollen også anvendt på en musemodel af EAE. Musene blev aflivet på dag 16 efter EAE-induktion, der repræsenterer sygdommens maksimum. I denne EAE-indstilling blev ca. 2,9 x 106 ± 6,7 x 105 oligodendrocytter, 5,2 x 105 ± 9 x 104 astrocytter og 4,4 x 105 ± 4 x 104 neuroner isoleret. Microglia-celleudbyttet blev reduceret til ca. 1,7 x 105 ± 4 x 104 mikroglia pr. EAE-mus på grund af den ekstra cellesortering efter MACS-trinnene (figur 3A).
Efter isolering viste fænotypiske karakteriseringer af de forskellige cellepopulationer via flowcytometri, at levedygtige enkeltcellesuspensioner med en renhed på ca. 90% for alle de vigtigste CNS-residente celletyper (figur 3B) kunne opnås. Microglia blev gated som værende CD45intCD11bhøj som defineret i litteraturen 44,45,46,47.
I EAE måtte microglia sorteres fra alle CD11b + celler for at differentiere dem fra andre CD11b + immunceller som monocytter, neutrofiler, naturlige dræberceller, granulocytter og makrofager, der immigrerer ind i CNS under neuroinflammation 27,28,48. Derfor blev mikroglia sorteret som CD45intCD11høje celler fra CD11b + cellesuspensionen. Hele microglia-sorteringsstrategien er vist i figur 4. Hos naive mus var mikrogliapopulationen 91,16% af alle levende enkeltceller (96% af den samlede CD11b+ population) (figur 4A). I EAE-mus var mikrogliapopulationen 46,85% af alle levende enkeltceller (55% af den samlede CD11b + -population) (figur 4B). Selvom både MACS- og FACS-procedurer anvender mekanisk belastning på de enkelte celler, var 75,41% ± 8,63% af de sorterede rensede mikroglia levedygtige (figur 3B).
Astrocytter og neuroner, der var direkte isoleret fra den oprindelige CNS-cellesuspension, viste relevant forurening med oligodendrocytter, hvilket førte til antagelsen om, at samtidig isolering af neuroner og astrocytter fra den negative gennemstrømning af oligodendrocytter kunne forhindre denne forurening. Flowcytometrianalyser bekræftede, at astrocytter isoleret fra den negative gennemstrømning af oligodendrocytter havde en renhed på 89,23% ± 2,78% og viste en levedygtighed på 80,56% ± 1,41%. I lighed med disse resultater var renheden af neuronerne isoleret fra O4-cellefraktionen 81,25% ± 3,31%, og levedygtigheden var 83,90% ± 2,61% (figur 3B). Disse fund bekræfter også, at samtidig isolering af disse to celletyper først efterfølgende til isolering af oligodendrocytter ikke har nogen indflydelse på mængden af levedygtige funktionelle celler.
Resultaterne vedrørende levedygtigheden og renheden af de isolerede enkeltcellesuspensioner var meget ens i EAE-mus sammenlignet med dem, der blev modtaget i naive mus, hvilket bekræfter, at denne protokol er egnet til raske mus såvel som i forbindelse med EAE (figur 3B).
Figur 3: Celleudbytter og flowcytometribaseret validering af isolerede CNS-residente celler. (A) Celleudbytter pr. mus og celletype efter isolering af CNS-residente celler i naive mus og EAE-mus. Søjlediagrammer visualiserer mængden af celleudbytter pr. Mus og celletype efter implementeringen af den præsenterede protokol. Fem biologiske replikater blev behandlet for resultaterne i naive mus, og fire biologiske replikater blev analyseret i EAE-mus. Respektive midler ± SEM'er er afbildet. B) Tilsvarende renheds- og levedygtighedsanalyser af de oprensede cellefraktioner. Søjlediagrammer angiver levedygtigheden og renheden af de resulterende enkeltcellesuspensioner baseret på deres ekspression af celletypespecifikke markører. NeuN blev brugt som en celletypespecifik nuklear markør for neuroner. Fem biologiske replikater blev erhvervet og sammenlignet for hver celletype for både raske og EAE-mus. Respektive midler ± SEM'er er angivet. Forkortelser: Anti-ACSA-2 = astrocytcelleoverfladeantigen-2; CD11b = cyclinafhængig kinase 11B; CD45 = receptor-type tyrosin-proteinphosphatase C; CNS = centralnervesystemet; EAE = eksperimentel autoimmun encephalomyelitis; MACS = magnetisk aktiveret cellesortering; NeuN = RNA bindende protein fox-1 homolog 3; O4 = oligodendrocytmarkør O4; SEM = standardfejl i middelværdien. Dette tal er ændret fra49. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Gating strategi for cellesortering af microglia efter isolering af CD11b + celler. (A) Gating strategi i naive og (B) EAE mus. Den øverste række i hvert panel viser punktdiagrammer før sortering og den nederste række efter sortering. Efter udvælgelse af levende (SSC-A / FSC-A) og enkeltceller (FCS-H / FSC-W) blev populationen af CD45intCD11b + celler sorteret som mikrogliapopulation. Klik her for at se en større version af denne figur.
Discussion
Indtil videre tilbyder metoder til kortlægning af CNS-residente celler ex vivo ved at kombinere massespektrometri og RNA-sekventering en meget præcis cellulær profilering inden for sundhed og sygdom, men kræver ambitiøs teknisk viden og ekspertise på dette område50,51. Desuden tillader de ikke funktionelle analyser og er meget dyre. Derudover giver mikrofluidiske hjerne-på-en-chip-systemer en hurtig og overkommelig screening for sygdomsmekanismer og test af nye terapeutiske tilgange med begrænsning af cellevækst og migration 52,53,54,55. CNS-organoider kunne også repræsentere et tilsvarende alternativ i fremtiden til undersøgelse af cellulær modellering, intercellulære forbindelser og interaktioner under sygdomsforløb 56,57,58,59. Imidlertid er fluorescens- og magnetaktiveret cellesortering i øjeblikket de mest effektive metoder til at generere rene og levedygtige enkeltcellesuspensioner ex vivo 35,60,61. Selv om andre etablerede fremstillingsprotokoller til isolering af CNS-residente celletyper ligner hinanden med hensyn til de enkelte trin i den magnetiske isolering og den forudgående celledissociation, er de beregnet til at blive udført separat for hver celletype. I modsætning hertil integrerer den nuværende protokol forskellige isolationsmetoder for hver CNS-resident celletype i en logisk sammenhæng, så de kan udføres samtidigt på én gang og fra en enkelt CNS-cellesuspension (tabel 1, tabel 2). Således muliggør det multi-omics-analyser fra en enkelt CNS-cellesuspension og i sidste ende udforskning af komplekse neuronale netværk. Selv om det ikke er et must at samle flere væv fra flere dyr for at udføre denne protokol, sikrer denne pooling et tilstrækkeligt antal isolerede celler til yderligere downstream-analyse. Brugen af forskellige mus til isolering af de enkelte celletyper ville udelukke muligheden for at analysere potentielle cellulære interaktioner. Derudover sparer kombinationen af individuelle isolationsmetoder for de forskellige CNS-celletyper, som alle følger en tidligere CNS-dissociation, materialeomkostninger ved at bruge en dissocieret CNS-cellesuspension til alle følgende magnetiske isolationstrin. Derudover minimeres en potentiel teknisk bias forårsaget af brugen af forskellige mus.
En begrænsning af protokollen kunne være den næsten eksklusive brug af kvindelige C57BL/6J-mus. EAE-immuniseringsprotokollen er designet og etableret til hunmus, så denne celleisoleringsprotokol blev også implementeret i kvindelige C57BL / 6J-mus. Ikke desto mindre blev naive hanmus også brugt under udviklingen af denne protokol uden at genkende nogen effekt på det resulterende celleantal eller renheder. En anden begrænsning påvirker neuronernes magnetiske celleisolering, da der ikke findes nogen specifikke mikroperler til isolering af neuroner med hensyn til en positiv udvælgelse. Det blev antaget, at en ren enkeltcellesuspension kunne opnås via biotinmærkning og udtømning af alle ikke-neuronale celler (tabel 2). Denne antagelse blev verificeret ved brugen af NeuN som en specifik nuklear markør for neuroner, integreret i det nævnte flowcytometrirenhedspanel. En anden begrænsning vedrører isolering af mikroglia i EAE-mus. Her reduceres resulterende celleudbytter sammenlignet med de andre celletyper på grund af det ekstra sorteringstrin efter MACS-protokollen. Desuden kan man argumentere for, at sortering øger mikrogliaens mekaniske belastning sammenlignet med de andre cellepopulationer. Individuelle sorteringsstrategier kan føre til forskellige mængder celleudbytter. Hvis det isolerede celleantal er mindre end forventet eller ønsket, anbefales det at justere gating-opsætningen og/eller forbedre diskriminationen mellem levende og døde.
Et kritisk trin i protokollen repræsenterer fjernelse af affald. Gradienten skal lagdeles meget langsomt og forsigtigt for at skabe de tre ønskede separate faser (figur 2A). Kun hvis myelin og andre rester af affald i de to øverste faser fjernes fuldstændigt (figur 2E), kan der dannes rene enkeltcellesuspensioner, og yderligere kontaminering kan reduceres. Hvis de resulterende cellesuspensioner mangler renhed, er dette sandsynligvis den del af protokollen, der først skal forbedres ved siden af forsikringen om den rigtige brug af alle mikroperler.
Modtagelse af høje niveauer i renhed og levedygtighed kan være udfordrende i denne type eksperiment. Nogle anbefalinger til fejlfinding er:
-Arbejde under sterile forhold er obligatorisk for at forhindre kontaminering af de forskellige mikroperler og muliggøre gentagen brug, især til efterfølgende dyrkning.
-Mærkning af hvert rør for at forhindre forveksling anbefales stærkt.
-Undgå brug af ukølede reagenser/buffere. Opbevar alle cellesuspensioner på is under hele eksperimentet for at sikre høj levedygtighed.
-Hold tiden mellem de forskellige arbejdstrin så kort som muligt. Der er ingen specifik del i protokollen, hvor det anbefales at sætte eksperimentet på pause.
-Det er yderst relevant at overholde de angivne inkubationsperioder.
Afslutningsvis giver denne nuværende protokol til samtidig isolering af alle de vigtigste CNS-residente celletyper fra en CNS-replikat mulighed for at analysere komplekse neuronale netværk og neuroinflammatoriske veje ex vivo fra en CNS-cellesuspension. Således kan CNS-residente celler undersøges i forskellige stadier af sygdomsforløb, fx under neuroinflammation, neurodegeneration og / eller remission i EAE. Desuden kan celle-celle-interaktioner og biokemiske veje studeres på individuelt niveau, og variabiliteten inden for eksperimentelle grupper kan reduceres. Der er også mulighed for at dyrke fraktioner af de isolerede CNS-celler i monokulturer til yderligere funktionelle assays og validering. Alt i alt tilbyder denne protokol betydelige fremskridt, der potentielt påvirker prækliniske og kliniske forskningsmetoder.
Disclosures
Alle forfattere erklærer ikke at have nogen interessekonflikter.
Acknowledgments
Figurerne blev oprettet ved hjælp af Adobe Illustrator (version 2023) og Servier Medical Art (https://smart.servier.com). Antonia Henes blev støttet af Jürgen Manchot Stiftung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 70 μm cell strainers | Corning, MA, USA | 352350 | CNS tissue dissociation |
| ACSA-2 Antibody, anti-mouse, PE-Vio 615 (clone REA-969) | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany | 130-116-244 | Flow cytometry, store at 4 °C |
| Adult Brain Dissociation Kit, mouse, and rat | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany | 130-107-677 | Tissue dissociation,contains debris and red blood cell removal solutions; prepare aliquots of enzyme A and P upon arrival and store them at -20 °C; store the remaining kit at 4 °C |
| Anti-ACSA-2 MicroBead Kit, mouse | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany | 130-097-678 | MACS of astrocytes, store at 4 °C |
| Anti-mouse CD16/32 antibody | BioLegend, London, UK | 101301 | Flow cytometry, store at 4 °C |
| Anti-O4 MicroBeads, human, mouse, rat | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany | 130-094-543 | MACS of oligodendrocytes, store at 4 °C |
| AstroMACS Separation buffer | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany | 130-091-221 | MACS of astrocytes, store at 4 °C |
| Biotin Antibody, PE (clone Bio3-18E7) | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany | 130-113-853 | Flow cytometry, store at 4 °C |
| BRAND Neubauer counting chamber | Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA | 10195580 | Cell counting |
| Brilliant Violet 510 anti-mouse CD45 Antibody (clone 30-F11) | BioLegend, London, UK | 103137 | Flow cytometry, store at 4 °C |
| CD11b MicroBeads, human, mouse | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany | 130-049-601 | MACS of microglia, store at 4 °C |
| DNAse I, recombinant, Rnase-free | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | 4716728001 | Flow cytometry, store at -20° C |
| D-PBS with Calcium, Magnesium, Glucose, Pyruvat | Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA | 14287080 | Buffer, store at 4 °C |
| D-PBS, without calcium, without magnesium | Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA | 14190250 | Buffer, store at 4 °C |
| eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 780 | Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA | 65-0865-14 | Flow cytometry, store at 4 °C |
| eBioscience Foxp3/Transcription factor staining buffer set | Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA | 00-5523-00 | Flow cytometry, store at 4°C |
| Falcon (15 mL) | Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA | 11507411 | Cell tube |
| Falcon (50 mL) | Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA | 10788561 | Cell tube |
| Falcon Round-Bottom Polystyrene Test Tubes with Cell Strainer Snap Cap, 5 mL | Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA | 08-771-23 | Flow cytometry |
| FcR Blocking Reagent, mouse | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany | 130-092-575 | MACS of oligodendrocytes, store at 4 °C |
| Female C57BL/6J mice | Charles River Laboratories, Sulzfeld, Germany | Active EAE induction | |
| Fetal calf serum (FCS) | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | F2442-50ML | Flow cytometry, store at -5 to -20 °C |
| FITC Rat Anti-CD 11b (clone M1/70) | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | 553310 | Flow cytometry, store at 4 °C |
| Freund’s Complete adjuvant | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | AR001 | Active EAE induction, store at 4 °C |
| GentleMACS C Tubes | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany | 130-093-237 | CNS tissue dissociation |
| GentleMACS Octo Dissociator with Heaters | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany | 130-096-427 | CNS tissue dissociation |
| Graphpad Prism 8.4.3 | Graphpad by Dotmatics | Graphical Analysis | |
| Isoflurane | AbbVie, North Chicago, IL, USA | Active EAE induction, store at 4 °C | |
| Kaluza Analysis Software V2.1.1 | Beckman Coulter, Indianapolis, IN, USA | Flow cytometry analysis | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany | 130-042-401 | MACS |
| MACS BSA Stock Solution | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany | 130-091-376 | PB-buffer |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany | 130-042-303 | MACS |
| MOG35–55 peptide | Charité, Berlin, Germany; alternatives: Genosphere Biotechnologies (Paris, France) or sb-Peptide (Saint Egrève, France) | Active EAE induction, store at -20 °C | |
| Mycobacterium tuberculosis strain H37 Ra | Becton, Dickinson and Company (BD),Franklin Lakes, NJ, USA | Active EAE induction, store at 4 °C | |
| Neuron Isolation Kit, mouse | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany | 130-115-390 | MACS of neurons, store at 4 °C |
| O4 Antibody, anti-human/mouse/rat, APC, (clone REA-576) | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany | 130-119-897 | Flow cytometry, store at 4 °C |
| Pertussis toxin in glycerol | Hooke Laboratories Inc., Lawrence, MA, USA | BT-0105 | Active EAE induction; store at -20 °C |
| pluriStrainer Mini 100 μm | pluriSelect Life Science UG, Leipzig, Sachsen, Germany | 43-10100-40 | Flow cytometry |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany | 130-090-976 | MACS |
| Recombinant Alexa Fluor 647 Anti-NeuN antibody (clone EPR12763) | Abcam, Cambridge, UK | EPR12763 | Flow cytometry, store at -20 °C |
| Stainless Steel Brain Matrices, 1 mm | Ted Pella, Redding, CA, USA | 15067 | CNS tissue dissection |
| Trypan blue solution, 0.4% | Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA | 15250061 | Cell counting |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA | 15575020 | Flow cytometry, store at room temperature |
References
- Trapp, B. D., Nave, K. A. Multiple Sclerosis: An Immune or Neurodegenerative Disorder. Annu Rev Neurosci. 31 (1), 247-269 (2008).
- Stys, P. K., Zamponi, G. W., van Minnen, J., Geurts, J. J. Will the real multiple sclerosis please stand up. Nat Rev Neurosci. 13 (7), 507-514 (2012).
- Korn, T.
- Ward, M., Goldman, M. D. Epidemiology and Pathophysiology of Multiple Sclerosis. CONTINUUM. 28 (4), 988-1005 (2022).
- Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein (MOG35-55) Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 Mice. J Vis Exp. (86), 51275 (2014).
- Bittner, S., et al. The TASK1 channel inhibitor A293 shows efficacy in a mouse model of multiple sclerosis. Exp Neurol. 238 (2), 149-155 (2012).
- Göbel, K., et al. Plasma kallikrein modulates immune cell trafficking during neuroinflammation via PAR2 and bradykinin release. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (1), 271-276 (2019).
- Ballerini, C.
- Birmpili, D., Charmarke Askar, I., Bigaut, K., Bagnard, D. The Translatability of Multiple Sclerosis Animal Models for Biomarkers Discovery and Their Clinical Use. Int J Mol Sci. 23 (19), 11532 (2022).
- Tsatas, O., Ghasemlou, N. Isolation and RNA purification of macrophages/microglia from the adult mouse spinal cord. J Immunol Methods. 477, 112678 (2020).
- Calvo, B., Rubio, F., Fernández, M., Tranque, P. Dissociation of neonatal and adult mice brain for simultaneous analysis of microglia, astrocytes and infiltrating lymphocytes by flow cytometry. IBRO Rep. 8, 36-47 (2020).
- Diaz-Amarilla, P., et al. Isolation and characterization of neurotoxic astrocytes derived from adult triple transgenic Alzheimer's disease mice. Neurochem Int. 159, 105403 (2022).
- Galatro, T. F., Vainchtein, I. D., Brouwer, N., Boddeke, E. W. G. M., Eggen, B. J. L. Isolation of Microglia and Immune Infiltrates from Mouse and Primate Central Nervous System. Methods Mol Biol. 1559, 333-342 (2017).
- Altendorfer, B., et al. Transcriptomic Profiling Identifies CD8+ T Cells in the Brain of Aged and Alzheimer's Disease Transgenic Mice as Tissue-Resident Memory T Cells. J Immunol. 209 (7), 1272-1285 (2022).
- Lanfranco, M. F., Sepulveda, J., Kopetsky, G., Rebeck, G. W. Expression and secretion of apoE isoforms in astrocytes and microglia during inflammation. Glia. 69 (6), 1478-1493 (2021).
- Swire, M., Ffrench-Constant, C.
- Park, J., Koito, H., Li, J., Han, A. Microfluidic compartmentalized co-culture platform for CNS axon myelination research. Biomed Microdevices. 11 (6), 1145-1153 (2009).
- Facci, L., Barbierato, M., Skaper, S. D. Astrocyte/Microglia Cocultures as a Model to Study Neuroinflammation. Methods Mol Biol. 1727, 127-137 (2018).
- Speicher, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G., Pawlowski, M. Generating microglia from human pluripotent stem cells: novel in vitro models for the study of neurodegeneration. Mol Neurodegener. 14 (1), 46 (2019).
- Homayouni Moghadam, F., et al. Isolation and Culture of Embryonic Mouse Neural Stem Cells. J Vis Exp. (141), 58874 (2018).
- Santos, R., et al. Differentiation of Inflammation-Responsive Astrocytes from Glial Progenitors Generated from Human Induced Pluripotent Stem Cells. Stem Cell Reports. 8 (6), 1757-1769 (2017).
- Tcw, J., et al. An Efficient Platform for Astrocyte Differentiation from Human Induced Pluripotent Stem Cells. Stem Cell Reports. 9 (2), 600-614 (2017).
- Miltenyi, S., Müller, W., Weichel, W., Radbruch, A. High gradient magnetic cell separation with MACS. Cytometry. 11 (2), 231-238 (1990).
- Huntemann, N., et al. An optimized and validated protocol for inducing chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in C57BL/6J mice. J Neurosci Methods. 367, 109443 (2022).
- Martin, E., El-Behi, M., Fontaine, B., Delarasse, C. Analysis of Microglia and Monocyte-derived Macrophages from the Central Nervous System by Flow Cytometry. J Vis Exp. (124), 55781 (2017).
- Sarkar, S., et al. Rapid and Refined CD11b Magnetic Isolation of Primary Microglia with Enhanced Purity and Versatility. J Vis Exp. (122), 55364 (2017).
- Rodríguez Murúa, S., Farez, M. F., Quintana, F. J. The Immune Response in Multiple Sclerosis. Annu Rev Pathol. 17, 121-139 (2021).
- Engelhardt, B., Ransohoff, R. M. Capture, crawl, cross: the T cell code to breach the blood-brain barriers. Trends Immunol. 33 (12), 579-589 (2012).
- Elia, G. Biotinylation reagents for the study of cell surface proteins. Proteomics. 8 (19), 4012-4024 (2008).
- Berl, S., et al. Enrichment and isolation of neurons from adult mouse brain for ex vivo analysis. J Neurosci Methods. 283, 15-22 (2017).
- Turvy, D. N., Blum, J. S. Biotin Labeling and Quantitation of Cell-Surface Proteins. Curr Protoc Immunol. 18 (7), (2001).
- Mao, S. Y.
- Kantzer, C. G., et al. Anti-ACSA-2 defines a novel monoclonal antibody for prospective isolation of living neonatal and adult astrocytes. Glia. 65 (6), 990-1004 (2017).
- Batiuk, M. Y., et al. An immunoaffinity-based method for isolating ultrapure adult astrocytes based on ATP1B2 targeting by the ACSA-2 antibody. J Biol Chem. 292 (21), 8874-8891 (2017).
- Pan, J., Wan, J. Methodological comparison of FACS and MACS isolation of enriched microglia and astrocytes from mouse brain. J Immunol Methods. 486, 112834 (2020).
- Donovan, J. A., Koretzky, G. A.
- Hathcock, K. S., Hirano, H., Hodes, R. J. CD45 expression by murine B cells and T cells: Alteration of CD45 isoforms in subpopulations of activated B cells. Immunol Res. 12 (1), 21-36 (1993).
- Balogh, P., Tew, J. G., Szakal, A. K. Simultaneous blockade of Fc? receptors and indirect labeling of mouse lymphocytes by the selective detection of allotype-restricted epitopes on the kappa chain of rat monoclonal antibodies. Cytometry. 47 (2), 107-110 (2002).
- Becerril-García, M. A., et al. Langerhans Cells From Mice at Birth Express Endocytic- and Pattern Recognition-Receptors, Migrate to Draining Lymph Nodes Ferrying Antigen and Activate Neonatal T Cells in vivo. Front Immunol. 11, 744 (2020).
- Dent, M. A., Segura-Anaya, E., Alva-Medina, J., Aranda-Anzaldo, A. NeuN/Fox-3 is an intrinsic component of the neuronal nuclear matrix. FEBS Lett. 584 (13), 2767-2771 (2010).
- Duan, W., et al. Novel Insights into NeuN: from Neuronal Marker to Splicing Regulator. Mol Neurobiol. 53 (3), 1637-1647 (2016).
- Monteiro, R., Sivasubramanian, M. K., Balasubramanian, P., Subramanian, M. Obesity-Induced Sympathoexcitation is Associated with Glial Senescence in the Brainstem. FASEB J. 34 (S1), 1-1 (2020).
- Li, S., Chang, L., Teissie, J. Electroporation protocols: mircroorganism, mammalian system, and nanodevice. , Humana Press, New York. (2020).
- Kettenmann, H., Hanisch, U. K., Noda, M., Verkhratsky, A.
- Haage, V., et al. Comprehensive gene expression meta-analysis identifies signature genes that distinguish microglia from peripheral monocytes/macrophages in health and glioma. Acta Neuropathol Commun. 7 (1), 20 (2019).
- Kosior, N., Petkau, T. L., Connolly, C., Lu, G., Leavitt, B. R. Isolating cells from adult murine brain for validation of cell-type specific cre-mediated deletion. J Neurosci Methods. 328, 108422 (2019).
- Jurga, A. M., Paleczna, M., Kuter, K. Z. Overview of General and Discriminating Markers of Differential Microglia Phenotypes. Front Cell Neurosci. 14, 198 (2020).
- Man, S., Ubogu, E. E., Ransohoff, R. M. Inflammatory Cell Migration into the Central Nervous System: A Few New Twists on an Old Tale. Brain Pathol. 17 (2), 243-250 (2007).
- Schroeter, C. B., et al. One Brain-All Cells: A Comprehensive Protocol to Isolate All Principal CNS-Resident Cell Types from Brain and Spinal Cord of Adult Healthy and EAE Mice. Cells. 10 (3), 651 (2021).
- Sankowski, R., et al. Mapping microglia states in the human brain through the integration of high-dimensional techniques. Nate Neurosci. 22 (12), 2098-2110 (2019).
- Brennan, F. H., et al. Microglia coordinate cellular interactions during spinal cord repair in mice. Nat Commun. 13 (1), 4096 (2022).
- Enright, H. A., et al. Functional and transcriptional characterization of complex neuronal co-cultures. Sci Rep. 10 (1), 11007 (2020).
- Mofazzal Jahromi, M. A., et al. Microfluidic Brain-on-a-Chip: Perspectives for Mimicking Neural System Disorders. Mol Neurobiol. 56 (12), 8489-8512 (2019).
- Chin, E., Goh, E.
- Miccoli, B., Braeken, D., Li, Y. E. Brain-on-a-chip Devices for Drug Screening and Disease Modeling Applications. Curr Pharm Des. 24 (45), 5419-5436 (2019).
- Giandomenico, S. L., et al. Cerebral organoids at the air-liquid interface generate diverse nerve tracts with functional output. Nat Neurosci. 22 (4), 669-679 (2019).
- Pellegrini, L., et al. Human CNS barrier-forming organoids with cerebrospinal fluid production. Science. 369 (6500), eaaz5626 (2020).
- Chhibber, T., et al. CNS organoids: an innovative tool for neurological disease modeling and drug neurotoxicity screening. Drug Discov Today. 25 (2), 456-465 (2020).
- Tang, X. Y., et al. Human organoids in basic research and clinical applications. Signal Transduct TargetTher. 7 (1), 168 (2022).
- Sutermaster, B. A., Darling, E. M. Considerations for high-yield, high-throughput cell enrichment: fluorescence versus magnetic sorting. Sci Rep. 9 (1), 227 (2019).
- Doughty, D., et al. Development of a novel purification protocol to isolate and identify brain microglia. Exp Biol Med. 247 (16), 1433-1446 (2022).
