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Neuroscience

वयस्क ऑटोइम्यून एन्सेफेलोमाइलाइटिस चूहों से प्रिंसिपल सेंट्रल नर्वस सिस्टम-रेजिडेंट सेल प्रकारों का एक साथ अलगाव

Published: October 6, 2023 doi: 10.3791/65735
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 2, 1, *1, 1
1Department of Neurology, Medical Faculty, Heinrich Heine University Duesseldorf, 2Department of Neurology, Institute of Translational Neurology, University Hospital Muenster
* These authors contributed equally

Summary

तिथि करने के लिए, एक ही माउस से सभी प्रमुख केंद्रीय तंत्रिका तंत्र निवासी सेल प्रकार के एक साथ अलगाव के लिए प्रोटोकॉल एक unmet मांग कर रहे हैं. प्रोटोकॉल भोले और प्रयोगात्मक ऑटोइम्यून एन्सेफैलोमाइलाइटिस चूहों में लागू एक प्रक्रिया को दर्शाता है ताकि न्यूरोइन्फ्लेमेशन के दौरान जटिल सेलुलर नेटवर्क की जांच की जा सके और साथ ही आवश्यक चूहों की संख्या को कम किया जा सके।

Abstract

प्रायोगिक ऑटोइम्यून एन्सेफैलोमाइलाइटिस (ईएई) मल्टीपल स्केलेरोसिस (एमएस) के लिए सबसे आम म्यूरिन मॉडल है और अक्सर नई उपचार रणनीतियों को विकसित करने के लिए एमएस के अभी भी अज्ञात एटियलजि को स्पष्ट करने के लिए उपयोग किया जाता है। माइलिन ऑलिगोडेंड्रोसाइट ग्लाइकोप्रोटीन पेप्टाइड 35-55 (एमओजी35-55) ईएई मॉडल टीकाकरण के बाद 10 दिनों के भीतर आरोही पक्षाघात के साथ एक आत्म-सीमित मोनोफैसिक रोग पाठ्यक्रम को पुन: पेश करता है। नैदानिक स्कोरिंग प्रणाली का उपयोग करके चूहों की दैनिक जांच की जाती है। एमएस एक विशिष्ट अस्थायी पैटर्न के साथ विभिन्न पैथोमैकेनिज्म द्वारा संचालित होता है, इस प्रकार रोग की प्रगति के दौरान केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) -निवासी सेल प्रकारों की भूमिका की जांच बहुत रुचि रखती है। इस प्रोटोकॉल की अनूठी विशेषता वयस्क ईएई और स्वस्थ चूहों में लागू सभी प्रमुख सीएनएस-निवासी सेल प्रकारों (माइक्रोग्लिया, ऑलिगोडेंड्रोसाइट्स, एस्ट्रोसाइट्स और न्यूरॉन्स) का एक साथ अलगाव है। वयस्क चूहों से मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी के पृथक्करण के बाद माइक्रोग्लिया, ऑलिगोडेंड्रोसाइट्स, एस्ट्रोसाइट्स और न्यूरॉन्स को अलग करने के लिए चुंबकीय-सक्रिय सेल सॉर्टिंग (एमएसीएस) किया जाता है। फ्लो साइटोमेट्री का उपयोग शुद्ध एकल-सेल निलंबन की गुणवत्ता विश्लेषण करने के लिए किया गया था, जो सेल अलगाव के बाद व्यवहार्यता की पुष्टि करता है और लगभग 90% के प्रत्येक सेल प्रकार की शुद्धता का संकेत देता है। अंत में, इस प्रोटोकॉल स्वस्थ और EAE चूहों में जटिल सेलुलर नेटवर्क का विश्लेषण करने के लिए एक सटीक और व्यापक तरीका प्रदान करता है. इसके अलावा, आवश्यक चूहों की संख्या काफी हद तक कम हो सकती है क्योंकि सभी चार सेल प्रकार एक ही चूहों से अलग होते हैं।

Introduction

मल्टीपल स्केलेरोसिस (एमएस) केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) की एक पुरानी सूजन ऑटोइम्यून बीमारी है जो डिमाइलिनेशन, एक्सोनल डैमेज, ग्लियोसिस और न्यूरोडीजेनेरेशन की विशेषता है। इस क्षेत्र में कई शोध दृष्टिकोणों के बावजूद, एमएस के पैथोफिज़ियोलॉजी को अभी भीपूरी तरह से 1,2,3,4 समझा नहीं गया है। एमएस की जांच के लिए सबसे आम पशु मॉडल माइलिन ऑलिगोडेंड्रोसाइट ग्लाइकोप्रोटीन पेप्टाइड 35-55 (एमओजी35-55) -प्रेरित प्रयोगात्मक ऑटोइम्यून एन्सेफैलोमाइलाइटिस (ईएई) है जो इसकी कई नैदानिक और पैथोफिजियोलॉजिकल विशेषताओं को साझा करता है 5,6,7,8,9. यह सीएनएस-विशिष्ट एंटीजन के खिलाफ प्रतिरक्षा प्रणाली की प्रतिक्रिया पर आधारित है जो सूजन, विमुद्रीकरण और न्यूरोएक्सोनल अध: पतन के लिए अग्रणी है। प्रायोगिक ऑटोइम्यून एन्सेफैलोमाइलाइटिस (ईएई) एमएस में पाए जाने वाले न्यूरोइन्फ्लेमेटरी रास्ते और सिग्नलिंग कैस्केड की जांच के लिए एक उपयुक्त मॉडल है।

एमएस के लिए वर्तमान चिकित्सा विकल्प केवल आंशिक रूप से प्रभावी हैं और मुख्य रूप से रोग के प्रारंभिक भड़काऊ चरण पर ध्यान केंद्रित करते हैं। हालांकि, एमएस का न्यूरोडीजेनेरेटिव घटक दीर्घकालिक चिकित्सीय दृष्टिकोणों के लिए बड़ी चुनौती प्रतीत होता है। इसलिए, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य, और सटीक सेल अलगाव प्रोटोकॉल एक व्यापक तरीके से autoimmune रोगों में आणविक और सेलुलर तंत्र की जांच करने के लिए आवश्यक हैं. यहां तक कि अगर एक एकल सेल प्रकार के अलगाव के लिए कुछ प्रोटोकॉल 10,11,12,13,14,15 मौजूद हैं, तो एक ही बार में कई सीएनएस-निवासी सेल आबादी के एक साथ अलगाव की आवश्यकता है। सीएनएस-निवासी कोशिकाओं के अलगाव के लिए पिछले प्रोटोकॉल सेलुलर कार्यक्षमता और शुद्धता के संरक्षण में कमी है, जिसके परिणामस्वरूप पड़ोसी कोशिकाओं 16,17,18 के साथ सह-खेती या इंट्रासेल्युलर नेटवर्क के जटिल विश्लेषण के लिए अनुपयुक्तता पूर्व विवो 19,20,21,22।

इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य वयस्क स्वस्थ और ईएई चूहों में लागू सभी प्रमुख सीएनएस-निवासी सेल प्रकारों के शुद्ध व्यवहार्य एकल-सेल निलंबन के एक साथ अलगाव के लिए एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और व्यापक विधि स्थापित करना था। विभिन्न सेल प्रकारों को चुंबकीय-सक्रिय सेल सॉर्टिंग (एमएसीएस)23का उपयोग करके अलग किया गया था। सेल पृथक्करण या तो सकारात्मक चयन, यानी, सेल-प्रकार-विशिष्ट सतह मार्करों के चुंबकीय लेबलिंग, या बायोटिनाइलेशन और सभी अवांछित कोशिकाओं की कमी के माध्यम से नकारात्मक चयन द्वारा पूरा किया जा सकता है। फ्लो साइटोमेट्री को 90% से ऊपर की शुद्धता और पृथक एकल-सेल निलंबन के कम से कम 80% की व्यवहार्यता सुनिश्चित करने के लिए लागू किया गया था।

अंत में, मुख्य लक्ष्य स्वस्थ और ईएई चूहों में जटिल सेलुलर नेटवर्क और जैव रासायनिक सिग्नलिंग कैस्केड के व्यापक और सटीक विश्लेषण की पेशकश करने वाले न्यूरोइन्फ्लेमेटरी मार्गों की जांच के लिए एक बहुमुखी उपकरण के रूप में सभी मुख्य सीएनएस-निवासी सेल प्रकारों के एक साथ अलगाव के लिए एक प्रोटोकॉल स्थापित करना था।

Protocol

सभी EAE प्रयोगों को 57-6 सप्ताह की उम्र में महिला C10BL/12J चूहों में प्रेरित किया गया था और स्थानीय अधिकारियों (Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz Nordrhein-Westfalen) द्वारा अनुमोदित किया गया था। प्रयोगों के किसी भी समय जर्मन और यूरोपीय संघ के पशु संरक्षण कानून का अनुपालन भी सुनिश्चित किया गया था। सभी चूहों को व्यक्तिगत रूप से हवादार पिंजरों पशु आवास की स्थिति के तहत रखा गया था।

नोट: निम्नलिखित अभिकर्मक वॉल्यूम एक वयस्क murine मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी को संदर्भित करते हैं, जिन्हें निम्नलिखित में सीएनएस सेल निलंबन नाम दिया गया है और वजन लगभग 20 मिलीग्राम से 500 मिलीग्राम है। यदि एक से अधिक सीएनएस सेल निलंबन के पृथक्करण की योजना बनाई है, तो सभी अभिकर्मक संस्करणों और सामग्रियों को तदनुसार बढ़ाया जाना चाहिए। पूरे प्रयोग के दौरान बर्फ पर लगातार 1 ग्राम/एल ग्लूकोज और 36 मिलीग्राम/एल सोडियम पाइरूवेट के साथ पूरक कैल्शियम और मैग्नीशियम के साथ Dulbecco के फॉस्फेट बफर खारा (D-PBS; 1x) को स्टोर करने की सिफारिश की जाती है। यदि सेल की खेती बाद में योजना बनाई है, हुड के उपयोग से बाँझ शर्तों के तहत सभी कदम प्रदर्शन. अन्यथा, निम्न प्रोटोकॉल वर्गों में से कोई भी एक हुड के तहत प्रदर्शन करने की आवश्यकता है. बफ़र्स को बर्फ पर स्टोर करें। केवल पूर्व ठंडा समाधान का प्रयोग करें और पूरे प्रयोग भर भंवर से बचें. समग्र वर्कफ़्लो के लिए चित्र 1 देखें।

Figure 1
चित्रा 1: भोले और ईएई चूहों में ऑलिगोडेंड्रोसाइट्स, माइक्रोग्लिया, एस्ट्रोसाइट्स और न्यूरॉन्स के एक साथ अलगाव के लिए वर्कफ़्लो। वर्कफ़्लो के पहले चरण भोले और ईएई चूहों दोनों के लिए समान हैं। यदि ईएई प्रतिकृति के साथ काम करना वांछित है, तो ईएई प्रेरण पहले से किया जाना चाहिए (1)। संक्षेप में, प्रोटोकॉल विच्छेदन के साथ शुरू होता है (2) और पृथक्करण (3) murine मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी के मलबे को हटाने के बाद (4) और लाल रक्त कोशिकाओं (5). इसके बाद, परिणामस्वरूप शुद्ध सीएनएस सेल निलंबन एमएसीएस के माध्यम से ऑलिगोडेंड्रोसाइट्स और माइक्रोग्लिया के एक साथ अलगाव के लिए दो अंशों में विभाजित है (6). माइक्रोग्लिया का पता एंटी-सीडी 11 बी माइक्रो-बीड्स के माध्यम से लगाया जाता है जबकि ऑलिगोडेंड्रोसाइट्स को एंटी-ओ 4 माइक्रो-बीड्स (सकारात्मक चयन) का उपयोग करके अलग किया जाता है। ऑलिगोडेंड्रोसाइट्स (8) के नकारात्मक प्रवाह से, एस्ट्रोसाइट्स को एंटी-एसीएसए -2 माइक्रो-बीड्स (सकारात्मक चयन) और बायोटिन लेबलिंग और सभी गैर-न्यूरोनल कोशिकाओं (नकारात्मक चयन) की कमी द्वारा न्यूरॉन्स के माध्यम से अलग किया जाता है। ईएई चूहों में, सीडी 11 बी + कोशिकाओं के अलगाव के बाद सीडी 45इंटसीडी 11 बीउच्च कोशिकाओं की प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल सॉर्टिंग होती है ताकि मैक्रोफेज, डेंड्राइटिक कोशिकाओं, मोनोसाइट्स, ग्रैनुलोसाइट्स और प्राकृतिक हत्यारा कोशिकाओं जैसे अन्य सीडी 11 बी + प्रतिरक्षा कोशिकाओं को खत्म किया जा सके जो ईएई पाठ्यक्रम के दौरान न्यूरोइन्फ्लेमेशन प्रक्रियाओं में भाग लेने के लिए जाने जाते हैं (7)27,28,48. विभिन्न सीएनएस-निवासी सेल प्रकारों के अलगाव के बाद, शुद्धता विश्लेषण किया जा सकता है (9). संक्षिप्ताक्षर: Abs = एंटीबॉडी; एसीएसए -2 = एस्ट्रोसाइट सेल सतह एंटीजन -2; CD11b = साइक्लिन-निर्भर किनेज 11B; सीडी 45 = रिसेप्टर-प्रकार टाइरोसिन-प्रोटीन फॉस्फेट सी; CNS = केंद्रीय तंत्रिका तंत्र; ईएई = प्रयोगात्मक ऑटोइम्यून एन्सेफैलोमाइलाइटिस; एमएसीएस = चुंबकीय-सक्रिय सेल छँटाई; O4 = ऑलिगोडेंड्रोसाइट मार्कर O4. इस आंकड़े को49 से संशोधित किया गया है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

1. सक्रिय ईएई का प्रेरण

  1. अभिकर्मकों की तैयारी
    1. सेल जुदाई के लिए: पीबी बफर तैयार करें और अधिकतम 1 सप्ताह के लिए 2-8 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। स्टॉक समाधान तैयार करने के लिए, पूरक के बिना 1x पीबीएस के 475 एमएल (पीएच 7.2) + 0.5% गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन (बीएसए) के 25 एमएल जोड़ें। बीएसए में तैयार 1:20 कमजोर पड़ने का प्रयोग करें।
    2. प्रवाह साइटोमेट्री और प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छँटाई (एफएसीएस) के लिए: एफएसीएस बफर, 2% भ्रूण बछड़ा सीरम (एफसीएस) और 2 मिमी EDTA के साथ पीबीएस तैयार करें और इसे 2-8 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। तैयार करने के लिए, पूरक के बिना 1x पीबीएस के 500 एमएल और एफसीएस + 2 एमएल ईडीटीए (0.5 एम ईडीटीए स्टॉक से) के 10 एमएल जोड़ें
    3. बिटनर एट अल से प्रोटोकॉल के अनुसार टीकाकरण करें। संक्षेप में, 200 μg MOG35-55 पेप्टाइड और 200 μg माइकोबैक्टीरियम ट्यूबरकुलोसिस सहित पूर्ण फ्रायड के सहायक के 200 μL युक्त एक पायस के चमड़े के नीचे इंजेक्शन द्वारा EAE को प्रेरित करें।
    4. एक isoflurane vaporizer के साथ एक संज्ञाहरण कक्ष का उपयोग करके 2% isoflurane के साथ माउस Anesthetize. संज्ञाहरण के तहत सूखापन को रोकने के लिए जानवर की आंखों पर पशु चिकित्सक मरहम का प्रयोग करें।
    5. 2 घंटे के बाद, हंटेमैन एट अल.24से प्रोटोकॉल के अनुसार 1x पीबीएस के 100 माइक्रोन में भंग 100 एनजी पर्टुसिस विष (पीटीएक्स) के इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन इंजेक्ट करें। टीकाकरण के बाद दिन 2 पर PTx इंजेक्शन दोहराएं।
      चेतावनी: प्रत्येक जानवर का निरीक्षण करें जब तक कि वह स्टर्नल पुनरावृत्ति को बनाए रखने के लिए पर्याप्त चेतना प्राप्त न कर ले। इंजेक्शन प्रक्रियाओं से गुजरने वाले चूहों को अन्य चूहों की कंपनी में वापस नहीं किया जाता है जब तक कि वे पूरी तरह से ठीक नहीं हो जाते। माइकोबैक्टीरियम ट्यूबरकुलोसिस और पीटीएक्स के लिए: साँस लेना, अंतर्ग्रहण और त्वचा और आंखों के संपर्क से बचें। माइकोबैक्टीरियम ट्यूबरकुलोसिस जन्मजात प्रतिरक्षा प्रणाली का एक उत्प्रेरक है। पीटीएक्स के कई जैविक प्रभाव हैं।
    6. दैनिक ईएई प्रगति की निगरानी करें, दो अंधे जांचकर्ताओं द्वारा किया जाता है जो वजन की निगरानी करते हैं और चूहों की चिकित्सकीय जांच करते हैं।
    7. इस प्रयोजन के लिए, निम्नलिखित स्कोरिंग प्रणाली का उपयोग ग्रेड 0-ईएई के कोई नैदानिक संकेत नहीं था, ग्रेड 1- आंशिक पूंछ पैरेसिस, ग्रेड 2-पूर्ण पूंछ पैरेसिस, ग्रेड 3-मध्यम हिंद अंग कमजोरी, ग्रेड 4-पूर्ण हिंद अंग कमजोरी और एटैक्सिक चाल, ग्रेड 5-हल्के पैरापेरेसिस, ग्रेड 6-पैरापेरेसिस, ग्रेड 7-पैरापलेजिया, ग्रेड 8-टेट्रापेरिसिस, ग्रेड 9-क्वाड्रिप्लेजिया, और ग्रेड 10-मृत्यु।
    8. प्रयोग नैदानिक स्कोर में आगे की भागीदारी के लिए निम्नलिखित बहिष्करण मानदंड का उपयोग करें > 7 या प्रारंभिक शरीर के वजन के 20% से अधिक वजन घटाने।
    9. मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी के विच्छेदन के लिए, ईएई प्रेरण के बाद दिन 16 पर ईएई चूहों को इच्छामृत्यु करें जो अधिकतम रोग का प्रतिनिधित्व करते हैं।

2. सीएनएस ऊतक तैयारी (अवधि: चूहों प्रति लगभग 10 मिनट)

  1. कार्बन डाइऑक्साइड के साथ चूहों बलिदान के बाद, 1x पीबीएस के 20 एमएल के साथ प्रत्येक माउस के transcardial छिड़काव के साथ शुरू. 1x पीबीएस के 20 एमएल के साथ फिर से छिड़काव दोहराएं।
  2. लापरवाह स्थिति में माउस प्लेस और cannulas के साथ अंगों को ठीक. पशु के सामने शरीर पर 75% इथेनॉल लागू करें. उस बिंदु पर आगे बाँझपन के उपाय आवश्यक नहीं हैं।
  3. कैंची की मदद से त्वचा और प्रावरणी के माध्यम से एक अनुदैर्ध्य खंड बनाकर पेट और वक्ष खोलें।
  4. पसलियों को बाद में काटें और हृदय तक मुफ्त पहुंच प्राप्त करने के लिए वक्ष को मोड़ें। कैनुला के साथ ऊपर की ओर मुड़े हुए वक्ष को ठीक करें।
  5. कैंची का उपयोग कर सही आलिंद खोलें. एक प्रवेशनी के साथ बाएं वेंट्रिकल में 1x पीबीएस के 20 एमएल लागू करने के लिए उकसाया सही आलिंद के माध्यम से रक्त बाहर फ्लश करने के लिए.
  6. एक अनुदैर्ध्य खंड के माध्यम से murine सिर के शीर्ष पर त्वचा को काटने के द्वारा खोपड़ी बेनकाब और एक संदंश का उपयोग सिर के आसपास त्वचा बदलाव. बाण के समान सिवनी के साथ एक कैंची की मदद से खोपड़ी को चीरें।
  7. चीरा लाइन के साथ एक संदंश की नोक डालें कैलोट खोलने दरार. संदंश के साथ कैलोट के शेष भागों निकालें ताकि मस्तिष्क पूरी तरह से उजागर हो.
  8. मस्तिष्क को ध्यान से निकालें और इसे एक murine मस्तिष्क मैट्रिक्स में रखें। एक रेजर ब्लेड का उपयोग करके 1 मिमी मोटी बाण के बराबर स्लाइस में मस्तिष्क में कटौती.
  9. इलियाक शिखा के ठीक ऊपर कैंची की मदद से कशेरुक स्तंभ को काटें ताकि सिरिंज को रीढ़ की हड्डी की नहर में डाला जा सके।
    नोट: रीढ़ की हड्डी को हटाने का सबसे आसान तरीका यह पीबीएस के साथ रीढ़ की हड्डी नहर से बाहर फ्लश करने के लिए है। अन्यथा, कशेरुक मेहराब को कैंची के साथ व्यक्तिगत रूप से खोला जाना चाहिए और फिर रीढ़ की हड्डी को हटाया जा सकता है।
  10. 1x पीबीएस युक्त 20G सुई के साथ 20 एमएल सिरिंज का उपयोग करके रीढ़ की हड्डी को दुम से कपाल तक रीढ़ की हड्डी से बाहर फ्लश करें। एक स्केलपेल का उपयोग करके रीढ़ की हड्डी को 0.5 सेमी लंबे खंडों में काटें।
  11. ठंड डी-पीबीएस के लगभग 3 एमएल से भरा माउस प्रति एक अलग पेट्री डिश में मस्तिष्क और इसी रीढ़ की हड्डी से मिलकर प्रत्येक सीएनएस सेल निलंबन की दुकान. आगे की प्रक्रिया तक बर्फ पर व्यंजन स्टोर करें।

3. सीएनएस ऊतक पृथक्करण (अवधि: सीएनएस सेल निलंबन की संख्या के आधार पर लगभग 1-1.5 घंटे)

नोट: वयस्क चूहों से तंत्रिका ऊतक बाह्य मैट्रिक्स के एंजाइमी गिरावट के साथ यांत्रिक पृथक्करण के संयोजन से अलग हो जाता है। इस प्रकार, संरचनात्मक अखंडता बनी हुई है, और सेल निलंबन का उपयोग आगे सेल अलगाव प्रक्रियाओं के लिए किया जा सकता है।

  1. एंजाइम मिश्रण 1 की उचित मात्रा तैयार करें जिसमें एंजाइम पी के 50 माइक्रोन और सीएनएस सेल निलंबन प्रति बफर जेड के 1,900 माइक्रोन शामिल हैं। दोनों अभिकर्मक वयस्क मस्तिष्क पृथक्करण किट से संबंधित हैं।
  2. एंजाइम मिश्रण 2 की उचित मात्रा तैयार करें जिसमें एंजाइम ए के 10 माइक्रोन और बफर वाई के 20 माइक्रोन प्रति सीएनएस सेल निलंबन शामिल हैं। दोनों अभिकर्मक वयस्क मस्तिष्क पृथक्करण किट से संबंधित हैं।
  3. एंजाइम मिश्रण 1 के 1,950 माइक्रोन को सी ट्यूब में स्थानांतरित करें और बाद में एक सीएनएस सेल निलंबन के ऊतक टुकड़े जोड़ें। प्रति माउस एक सी ट्यूब का प्रयोग करें।
  4. प्रत्येक सी ट्यूब में एंजाइम मिश्रण 2 के 30 माइक्रोन जोड़ें। सी ट्यूबों को कसकर बंद करें और उन्हें हीटर के साथ सेल डिसोसिएटर की आस्तीन पर उल्टा संलग्न करें।
  5. 37C_ABDK_01 नाम उपयुक्त कार्यक्रम चलाने (30 मिनट लगते हैं). यह सुनिश्चित करने के लिए कार्यक्रम के कम से कम पहले 5 मिनट का निरीक्षण करें कि सभी ट्यूब एक ही वेग से बदल जाते हैं। रन के दौरान त्रुटियों की घटना संभव है। फिर, चरण 6 पर जाएं।
  6. कार्यक्रम के अंतिम 2 मिनट में, प्रत्येक अलग सीएनएस सेल निलंबन के लिए एक 50 एमएल ट्यूब पर एक 70 माइक्रोन झरनी रखें। डी-पीबीएस के 2 एमएल के साथ इन छलनी को पूर्व-गीला करें।
  7. कार्यक्रम की समाप्ति के बाद, विघटनकर्ता से सी ट्यूबों को संलग्न करें और उन्हें एक अपकेंद्रित्र में रखें। ट्यूब के तल पर नमूना एकत्र करने के लिए 1 मिनट के लिए 300 x ग्राम और 4 डिग्री सेल्सियस पर नमूनों को सेंट्रीफ्यूगेट करें।
  8. नमूने को फिर से निलंबित करें और इसे पूर्व-सिक्त छलनी पर लागू करें। खाली सी ट्यूब में ठंडे डी-पीबीएस के 10 एमएल जोड़ें और इसे बंद करें। इसे धीरे से हिलाएं और निलंबन को संबंधित छलनी पर लागू करें।
  9. छलनी त्यागें और 50 एमएल ट्यूबों को बंद करें। सेल निलंबन को फिर से 300 x ग्राम और 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रीफ्यूगेट करें। बाद में, पूरे सतह पर तैरनेवाला बहुत सावधानी से महाप्राण है.

4. मलबे को हटाने (अवधि: सीएनएस सेल निलंबन की संख्या के आधार पर लगभग 1.5-2 घंटे)

नोट: ऊतक पृथक्करण अक्सर माइलिन और सेल मलबे की ओर जाता है जो डाउनस्ट्रीम विश्लेषण को खराब कर सकता है। मलबे हटाने के समाधान को जोड़कर, इस मलबे को सीएनएस सेल निलंबन से कुशलता से हटाया जा सकता है।

  1. प्रत्येक सीएनएस सेल निलंबन के लिए डी-पीबीएस के 3,100 माइक्रोन के साथ सेल गोली को ध्यान से निलंबित करें। भंवर मत करो।
  2. यदि एक से अधिक सीएनएस सेल निलंबन के साथ काम कर रहे हैं, तो पूल अधिकतम दो सीएनएस सेल निलंबन एक 15 एमएल ट्यूब में एक शर्त या प्रयोगात्मक समूह से प्राप्त होते हैं।
  3. वयस्क मस्तिष्क पृथक्करण किट से मलबे को हटाने के समाधान के 900 माइक्रोन को एक सीएनएस सेल निलंबन या मलबे हटाने के समाधान के 1,800 माइक्रोन को दो पूल किए गए सीएनएस सेल निलंबन में जोड़ें।
  4. ट्यूब को उल्टा करें और निलंबन मिलाएं। बाद में, ठंड डी-पीबीएस के 4 एमएल के साथ इसे बहुत धीरे से ओवरले करें। एक स्पष्ट ढाल दिखाई देना चाहिए (चित्रा 2 ए)।
  5. पूर्ण त्वरण और कोई ब्रेक के साथ 3000 x ग्राम और 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए ट्यूबों अपकेंद्रित्र.
  6. यदि पृथक्करण इरादा के रूप में होता है, तो तीन चरण बनते हैं (चित्र 2C)। दो शीर्ष चरणों को पूरी तरह से (चित्रा 2 सी -1,2) एस्पिरेट करें और उन्हें त्याग दें। यह महत्वपूर्ण है कि कोई माइलिन अवशेष पीछे नहीं छोड़ा जाता है (चित्र 2ई)।
    नोट: यदि ढाल काम नहीं करता है और कोशिकाओं को तत्काल आवश्यकता होती है, तो दो शीर्ष चरणों को चूसना न करें। इसके बजाय, 15 एमएल तक ठंडे डी-पीबीएस के साथ 15 एमएल ट्यूब भरें और कई बार पलटें। पूर्ण त्वरण और कोई ब्रेक के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 1000 x ग्राम पर फिर से अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला बंद चूसो और 4.1- 4.4 कदम दोहराएँ.
  7. ट्यूब को 14 एमएल तक ठंडे डी-पीबीएस से भरें और इसे बंद करें। ट्यूब को काम बेंच पर शक्तिशाली रूप से पलटें जब तक कि सेल गोली ट्यूब के नीचे से अलग न हो जाए। भंवर मत करो।
  8. नमूना को फिर से 1000 x ग्राम और 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रीफ्यूगेट करें। पूर्ण त्वरण और पूर्ण ब्रेक सेट करें। सतह पर तैरनेवाला ध्यान से और पूरी तरह से महाप्राण एस्पिरेट.

Figure 2
चित्रा 2: मलबे को हटाने के दौरान क्या करें और क्या न करें। (ए) पीबीएस के 4 एमएल के साथ ओवरले करने के बाद ढाल के लिए सकारात्मक उदाहरण। पीबीएस के 4 एमएल से मिलकर ऊपरी चरण मलबे हटाने के समाधान के साथ सीएनएस सेल निलंबन से मिलकर निचले चरण से स्पष्ट रूप से अलग है। (बी) पीबीएस के 4 एमएल के साथ ओवरले करने के बाद ढाल के लिए नकारात्मक उदाहरण। ढाल पीबीएस और नीचे सेल निलंबन के बीच एक स्पष्ट जुदाई का अभाव है. पीबीएस का एक सा सेल निलंबन में फैल गया है. (सी) सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद ढाल के लिए सकारात्मक उदाहरण। तीन अलग-अलग चरणों को आसानी से प्रतिष्ठित किया जा सकता है। ढाल के ऊपरी (1) या निचले चरण (3) में कोई माइलिन अवशेष दिखाई नहीं देता है। मध्य चरण में सभी माइलिन (2) होते हैं। सेल गोली 15 एमएल ट्यूब के तल पर दिखाई दे रहा है. (डी) सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद ढाल के लिए नकारात्मक उदाहरण। तीन चरणों के बीच कोई सटीक अलगाव संभव नहीं है। कुछ माइलिन अवशेष ढाल के ऊपरी (1) और निचले चरण (3) में दिखाई देते हैं। (ई) दो शीर्ष चरणों की महाप्राणता के बाद ढाल के लिए सकारात्मक उदाहरण। परिणामी नमूने में केवल सेल गोली और ऊपर एक स्पष्ट सतह पर तैरनेवाला होता है। कोई माइलिन अवशेष पीछे नहीं छोड़ा जाता है। (एफ) दो शीर्ष चरणों की आकांक्षा के बाद ढाल के लिए नकारात्मक उदाहरण। नमूने में अभी भी कुछ माइलिन अवशेष (काला तीर) हैं। संक्षिप्ताक्षर: सीएनएस = केंद्रीय तंत्रिका तंत्र; पीबीएस = फॉस्फेट-बफर खारा कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

5. लाल रक्त कोशिका हटाने (अवधि: लगभग 1 सीएनएस सेल निलंबन की संख्या के आधार पर)

नोट: यह कदम लाल रक्त कोशिकाओं द्वारा बाद में संदूषण को रोकता है और सीएनएस ऊतक से अलग अन्य सेल प्रकारों पर न्यूनतम प्रभाव के साथ एरिथ्रोसाइट्स का एक इष्टतम लसीका सुनिश्चित करता है। निम्नलिखित संस्करणों सेल निलंबन के लिए संकेत दिया जाता है 100 दो वयस्क माउस दिमाग और रीढ़ की हड्डी के लिए इसी 1 जी न्यूरोनल ऊतक के लिए मिलीग्राम. यदि दो से अधिक सीएनएस सेल निलंबन के साथ काम कर रहे हैं, तो तदनुसार सभी अभिकर्मकों और कुल संस्करणों को बढ़ाएं।

  1. लाल रक्त कोशिका हटाने समाधान (RBCRS) की तैयारी के साथ शुरू करें: प्रति दो पूल सीएनएस सेल निलंबन। 1:10 के अंतिम कमजोर पड़ने तक पहुंचने के लिए डीडीएच2ओ के 900 माइक्रोन में वयस्क मस्तिष्क पृथक्करण किट से लाल रक्त कोशिका हटाने वाले स्टॉक समाधान (10x) के 100 माइक्रोन को पतला करें।
  2. उपयोग करने तक आरबीसीआरएस को 2-8 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। दिन के अंत में अप्रयुक्त अवशेषों को त्यागें।
  3. RBCRS के 1 एमएल में दो सीएनएस सेल निलंबन अप करने के सेल गोली resuspension. भंवर से बचें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए समाधान सेते हैं।
  4. दो पूल सेल निलंबन के लिए ठंड पीबी बफर के 10 एमएल जोड़ें. 10 मिनट के लिए 300 x ग्राम और 4 डिग्री सेल्सियस पर नमूना अपकेंद्रित्र और बाद में पूरी तरह से सतह पर तैरनेवाला महाप्राण.
  5. पीबी बफर के 80 माइक्रोन में एक सीएनएस सेल निलंबन से प्रत्येक सेल गोली को धीरे-धीरे ऊपर और नीचे पाइप करके फिर से निलंबित करें। तदनुसार, दो सीएनएस सेल निलंबन से व्युत्पन्न सेल छर्रों को फिर से निलंबित करने के लिए 160 माइक्रोन का उपयोग करें।
  6. एक ही प्रयोगात्मक हालत से कई सीएनएस सेल निलंबन के साथ काम करते समय, इन सेल निलंबन के सभी पूल.
  7. सेल गिनती निर्धारित करें, उदाहरण के लिए, एक बेहतर गिनती कक्ष का उपयोग करके। सेल निलंबन आमतौर पर पीबी बफर में 1:50 पतला कर रहे थे, 0.4% trypan नीले समाधान में 1:10 के एक और कमजोर पड़ने के बाद.

6. भोले और EAE चूहों में चुंबकीय मोती प्रोटोकॉल (अवधि: लगभग 1 एच)

  1. चुंबकीय रूप से विभिन्न सीएनएस सेल प्रकारों को उनकी सतह एंटीजन के लिए विशिष्ट माइक्रोबीड्स के साथ लेबल करें। फिर, स्तंभ में सेल निलंबन जगह और चुंबकीय अलग लेबल कोशिकाओं स्तंभ और unlabeled कोशिकाओं है कि के माध्यम से चलाने के भीतर बनाए रखा.
  2. चुंबकीय क्षेत्र से स्तंभ को हटाने के बाद, सकारात्मक चयनित सेल अंश के रूप में एक ट्यूब में स्तंभ से चुंबकीय लेबल कोशिकाओं बाहर फ्लश.
    नोट: चुंबकीय लेबलिंग प्रक्रिया के लिए वॉल्यूम की गणना 1 x 107 कुल कोशिकाओं के लिए की जाती है। यदि अधिक कोशिकाओं को प्राप्त कर रहे हैं, सभी अभिकर्मक और कुल मात्रा तदनुसार पैमाने. यह तेजी से काम करने के लिए और केवल पूर्व ठंडा समाधान का उपयोग करने के लिए सेल की सतह और गैर विशिष्ट सेल लेबलिंग पर एंटीबॉडी के कैपिंग को रोकने के रूप में अच्छी तरह से पृथक सेल आबादी की एक उच्च व्यवहार्यता सुनिश्चित करने के लिए सिफारिश की है. यह भी स्तंभ जलाशय पीबी बफर जोड़कर खाली है के रूप में जल्द ही के रूप में धोने कदम प्रदर्शन करने के लिए इतना है कि स्तंभ बाहर सूखी नहीं है.
  3. माइक्रोग्लिया और ऑलिगोडेंड्रोसाइट्स के निम्नलिखित अलगाव के लिए शुद्ध undiluted सीएनएस सेल निलंबन को दो अंशों में विभाजित करें। दोनों अंशों का अनुपात प्रत्येक सेल प्रकार की वांछित सेल गणना पर निर्भर करता है।
    नोट: आगे के विवरण (इनक्यूबेशन की अवधि, विस्तृत प्रोटोकॉल कदम, वॉल्यूम, अभिकर्मकों, और सेल गणना विधि) तालिका 1 में संकेत दिया जाता है.

तालिका 1: भोले और ईएई चूहों से ऑलिगोडेंड्रोसाइट्स और माइक्रोग्लिया के एक साथ चुंबकीय लेबलिंग और अलगाव के लिए वर्कफ़्लो। दोनों सेल प्रकारों को एक सकारात्मक चयन के माध्यम से अलग किया जाता है। एक ही पंक्ति में सूचीबद्ध चरणों को एक बार में निष्पादित करने के लिए इंगित किया जाता है। संक्षिप्ताक्षर: CD11b = साइक्लिन-निर्भर किनेज 11B; ईएई = प्रयोगात्मक ऑटोइम्यून एन्सेफैलोमाइलाइटिस; FcR = Fc रिसेप्टर जस्तै प्रोटीन; O4 = ऑलिगोडेंड्रोसाइट मार्कर O4। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

7. प्रोटोकॉल संशोधन: ईएई चूहों में माइक्रोग्लिया के अलगाव के लिए अतिरिक्त छँटाई (अवधि: लगभग 1.5-2 एच)

नोट: ईएई चूहों के साथ काम करते समय, सीडी 11 बी + सेल अंश से माइक्रोग्लिया (जैसे, मोनोसाइट्स, मैक्रोफेज, प्राकृतिक हत्यारा कोशिकाओं, ग्रैनुलोसाइट्स, या डेंड्राइटिक कोशिकाओं) के अलावा सीडी 11 बी + सेल आबादी को हटाने के लिए एफएसीएस द्वारा एमएसीएस-आधारित सेल अलगाव प्रोटोकॉल को पूरक करना आवश्यक है। अन्यथा, इस चरण को अनदेखा किया जा सकता है।

  1. सीडी11बी एफआईटीसी (क्लोन एम 1/70, 1:50) और सीडी 45 एपीसी / Cy7 (क्लोन 30-एफ 11, 1: 200) द्वारा पूरक 1x पीबीएस युक्त धुंधला मास्टर मिश्रण तैयार करें। धुंधला मास्टर मिश्रण के 100 माइक्रोन प्रति 5 x 106 कोशिकाओं का उपयोग करें। उपयोग करने से पहले सभी एंटीबॉडी भंवर।
  2. 10 मिनट के लिए 300 x ग्राम और 4 डिग्री सेल्सियस पर माइक्रोग्लिया सेल निलंबन को सेंट्रीफ्यूगेट करें और सतह पर तैरनेवाला सावधानी से महाप्राण करें।
  3. तैयार धुंधला मास्टर मिश्रण के 100 माइक्रोन के साथ सेल गोली को 5 x 106 कोशिकाओं के साथ फिर से निलंबित करें। कमरे के तापमान (आरटी) पर अंधेरे में 15 मिनट के लिए सेते हैं.
  4. पीबीएस के 500 माइक्रोन जोड़कर प्रतिक्रिया बंद करें और नमूना को फिर से 300 x ग्राम और 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर अपकेंद्रित्र करें।
  5. सतह पर तैरनेवाला ध्यान से महाप्राण और 1x पीबीएस 10 μg/mL डीएनए द्वारा पूरक 1x पीबीएस के साथ सेल गोली resuspended 1 x 107 एमएल प्रति कोशिकाओं की एक अंतिम एकाग्रता तक पहुँचने के लिए. छँटाई शुरू होने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं की दुकान.
  6. छँटाई के साथ शुरू करने से तुरंत पहले एक नई FACS ट्यूब पर रखा एक 100 माइक्रोन झरनी पर सेल निलंबन लागू करें.
  7. प्रवाह दर प्रति सेकंड 1000 घटनाओं के लिए सेट और 100 माइक्रोन नोजल का उपयोग करें. आरटी पर 1x पीबीएस के साथ तैयार एक नई 15 एमएल ट्यूब में सीडी 45इंटसीडी 11 बीउच्च कोशिकाओं की वांछित सेल आबादी को क्रमबद्ध करें।

8. न्यूरॉन्स और एस्ट्रोसाइट्स के अलगाव के लिए ऑलिगोडेंड्रोसाइट्स के नकारात्मक प्रवाह के माध्यम से तैयारी (अवधि: लगभग 1 एच)

नोट: चरण 6 से ऑलिगोडेंड्रोसाइट्स के नकारात्मक प्रवाह के माध्यम से न्यूरॉन्स और एस्ट्रोसाइट्स के आगे अलगाव के लिए एकत्र किया जाता है। यह अंत करने के लिए, सेल निलंबन दो भागों में विभाजित है। सीएनएस सेल निलंबन से ऑलिगोडेंड्रोसाइट्स के पिछले अलगाव के कारण, ओ 4 + कोशिकाओं द्वारा संदूषण को कम से कम किया जाता है जो अन्यथा देखा जाएगा।

  1. 10 मिनट के लिए 300 x ग्राम और 4 डिग्री सेल्सियस पर ऑलिगोडेंड्रोसाइट्स के नकारात्मक प्रवाह के माध्यम से अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला ध्यान से महाप्राण करें।
  2. पीबी बफर प्रति पूल सीएनएस सेल निलंबन के 80 माइक्रोन में सेल गोली को फिर से निलंबित करें जो पहले ऑलिगोडेंड्रोसाइट सकारात्मक अंश के अलगाव के लिए उपयोग किया जाता था।
  3. कोशिकाओं की गिनती. कोशिकाओं O4 माना जाता है की गिनती प्रदर्शन- पीबी बफर में सेल निलंबन 1:50 पतला करने के बाद एक बेहतर गिनती कक्ष का उपयोग करने के बाद 0.4% trypan नीले रंग में एक और 1:10 कमजोर पड़ने के बाद.
  4. न्यूरॉन्स और एस्ट्रोसाइट्स के निम्नलिखित एक साथ अलगाव के लिए शुद्ध undiluted सेल निलंबन को दो अंशों में विभाजित करें। दोनों अंशों का अनुपात प्रत्येक सेल प्रकार की पसंदीदा मात्रा पर निर्भर करता है।
    नोट: आगे के विवरण (इनक्यूबेशन की अवधि, विस्तृत प्रोटोकॉल कदम, वॉल्यूम, अभिकर्मकों, और सेल गणना विधि) तालिका 2 में संकेत दिया है.

तालिका 2: भोले और ईएई चूहों से न्यूरॉन्स और एस्ट्रोसाइट्स के एक साथ चुंबकीय लेबलिंग और अलगाव के लिए वर्कफ़्लो। दोनों सेल प्रकार ऑलिगोडेंड्रोसाइट्स के नकारात्मक प्रवाह-थ्रू से अलग हैं। एस्ट्रोसाइट्स को एंटी-एसीएसए -2 माइक्रो-बीड्स के माध्यम से एक सकारात्मक चयन के रूप में अलग किया जाता है, जबकि न्यूरॉन्स को बायोटिनाइलेशन और नकारात्मक चयन के रूप में सभी गैर-न्यूरोनल कोशिकाओं की कमी के माध्यम से शुद्ध किया जाता है। एक ही पंक्ति में सूचीबद्ध चरणों को एक बार में निष्पादित करने के लिए इंगित किया जाता है। संक्षिप्ताक्षर: एंटी-एसीएसए -2 = एस्ट्रोसाइट सेल सतह एंटीजन -2; ईएई = प्रयोगात्मक ऑटोइम्यून एन्सेफैलोमाइलाइटिस; FcR = Fc रिसेप्टर जस्तै प्रोटीन; एमएसीएस = चुंबकीय-सक्रिय सेल सॉर्टिंग। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

9. पृथक सीएनएस-निवासी सेल प्रकारों की शुद्धता विश्लेषण (अवधि: लगभग 2 एच)

नोट: सभी चार पृथक सीएनएस-निवासी सेल आबादी के प्रवाह साइटोमेट्री का प्रदर्शन उनकी शुद्धता और व्यवहार्यता को मापने और तुलना करने की सिफारिश की जाती है। इसलिए, फ्लोरोफोरे के साथ लेबल किए गए एंटीबॉडी के साथ सभी सेल प्रकारों को दागना आवश्यक है। लाइव/मृत सेल धुंधला एक fixable व्यवहार्यता डाई (1: 10,000) का उपयोग कर लागू किया जाता है.

  1. शुद्धता पैनल - बाह्य धुंधला प्रोटोकॉल
    1. धुंधला प्रति पीबीएस के 50 माइक्रोन में भंग 1 एक्स 105 कोशिकाओं का उपयोग करें।
    2. 2% FCS/2 एमएम EDTA के साथ पीबीएस में भंग धुंधला मास्टर मिश्रण तैयार करें जिसमें सेल-प्रकार-विशिष्ट सतह मार्करों को लक्षित करने वाले निम्नलिखित फ्लोरोक्रोम-संयुग्मित मोनोक्लोनल एंटीबॉडी शामिल हैं: सीडी 11 बी एफआईटीसी (क्लोन 1/70, 1:100) 25,26,27,28, बायोटिन-पीई (क्लोन बायो 3-18 ई 7, 1:200) 29,30,31,32, एसीएसए -2 पीई-वीआईओ 615 (क्लोन आरईए -969, 1: 200) 33,34,35, O4 APC (क्लोन REA-576, 1:400), और CD45 BV510 (क्लोन 30-F11, 1:150)36,37। एफसी रिसेप्टर3 8,39 को ब्लॉक करने के लिए एंटी-सीडी 16/32 प्रति 1 एक्स 106 कोशिकाओं का 1 माइक्रोग्राम जोड़ें। उपयोग से पहले सभी एंटीबॉडी भंवर।
    3. 540 x ग्राम और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए सेल निलंबन को सेंट्रीफ्यूगेट करें और सतह पर तैरनेवाला सावधानी से महाप्राण करें।
    4. संबंधित मास्टर मिश्रण के 100 माइक्रोन में सेल गोली को फिर से निलंबित करें और अंधेरे में आरटी पर 15 मिनट के लिए नमूना सेते हैं।
    5. 2% एफसीएस/2 एमएम ईडीटीए के साथ 1x पीबीएस के 500 माइक्रोन के साथ कोशिकाओं को धोएं और 540 x ग्राम और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए नमूना सेंट्रीफ्यूज करें।
    6. सतह पर तैरनेवाला महाप्राण और 2% एफसीएस/2 एमएम ईडीटीए के साथ 1x पीबीएस के 70 माइक्रोन के साथ सेल गोली को फिर से निलंबित करें।
    7. भंवर नमूना सेल गोली पूरी तरह से अलग करने के लिए. इसके बाद, नमूना प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण के लिए तैयार है।
  2. शुद्धता पैनल - NeuN के साथ इंट्रासेल्युलर धुंधला प्रोटोकॉल
    1. न्यूएन के इंट्रासेल्युलर धुंधला के लिए प्रत्येक सेल आबादी के 1 x 105 कोशिकाओं का उपयोग करें जो एक न्यूरॉन-विशिष्ट परमाणु मार्कर 40,41है। यह व्यवहार्य न्यूरॉन्स को दागने का एक अतिरिक्त तरीका है।
    2. प्रत्येक सेल आबादी के 1 x 105 कोशिकाओं को FACS ट्यूब में स्थानांतरित करें। 2% एफसीएस/2 एमएम ईडीटीए प्रति ट्यूब के साथ पीबीएस के 1 एमएल जोड़ें। 5 मिनट के लिए 540 x ग्राम और 4 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूबों को सेंट्रीफ्यूगेट करें।
    3. इस बीच, सेल प्रकार विशिष्ट सतह मार्करों को लक्षित निम्नलिखित फ्लोरोक्रोम संयुग्मित मोनोक्लोनल एंटीबॉडी से मिलकर 2% FCS/2 मिमी EDTA के साथ पीबीएस में भंग मास्टर मिश्रण तैयार: CD11b FITC (क्लोन M1/70, 1:100)25,26,27,28, Biotin-पीई (क्लोन Bio3-18E7, 1:200)29,30,31,32, ACSA-2 PE-Vio615 (क्लोन REA-969, 1:200)33, 34,35, और सीडी 45 बीवी 510 (क्लोन 30-एफ 11, 1: 150) 36,37।
    4. सतह पर तैरनेवाला महाप्राण और तैयार मास्टर मिश्रण के 100 माइक्रोन में कोशिकाओं resuspended और अंधेरे में आरटी पर 10 मिनट के लिए नमूना सेते हैं.
    5. 2% एफसीएस/2 एमएम ईडीटीए के साथ पीबीएस के 100 माइक्रोन के साथ कोशिकाओं को धोएं और उन्हें 5 मिन के लिए 540 x ग्राम और 4 डिग्री सेल्सियस पर फिर से सेंट्रीफ्यूगेट करें।
    6. इस बीच, निर्धारण/पारगम्यता समाधान के 200 माइक्रोन तैयार करें: 1: 4 के अंतिम कमजोर पड़ने तक पहुंचने के लिए निर्धारण/पारगम्यता के केंद्रित स्टॉक के 50 माइक्रोन को 150 माइक्रोन तक निर्धारण/पारगम्यता मंदक के 150 माइक्रोन तक जोड़ें।
    7. सतह पर तैरनेवाला महाप्राण और 1x निर्धारण / permeabilization समाधान के 100 माइक्रोन में कोशिकाओं resuspend. 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए नमूना सेते हैं.
    8. इस बीच, 1:10 के अंतिम कमजोर पड़ने तक पहुंचने के लिए डीडीएच2ओ के 900 माइक्रोन में पारगम्यता बफर स्टॉक के 100 माइक्रोन जोड़कर 1x पारगम्यता/वॉश बफर के 1 एमएल तैयार करें।
    9. कोशिकाओं को 1x पारगम्यता/वॉश बफर के 100 माइक्रोन से धोएं और नमूना को 540 x ग्राम और 5 मिन के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रीफ्यूज करें।
    10. इस बीच, एफसी रिसेप्टर को ब्लॉक करने के लिए केवल NeuN (NeuN AF647, क्लोन EPR12763, 1:200) और एंटी-CD16/32 के 1 μg से मिलकर 1x पारगम्यता/वॉश बफर में एक और मास्टर मिक्स तैयार करें।
    11. सतह पर तैरनेवाला महाप्राण। दूसरे मास्टर मिश्रण के 50 माइक्रोन में निश्चित और पारगम्य कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिन के लिए इनक्यूबेट करें।
    12. 5 मिनट के लिए 540 x ग्राम और 4 डिग्री सेल्सियस पर 1x पारगम्यीकरण/धोने बफर और अपकेंद्रित्र के 100 माइक्रोन के साथ नमूना धो लें।
    13. सतह पर तैरनेवाला त्यागें और 2% एफसीएस/2 एमएम ईडीटीए के साथ पीबीएस के 70 माइक्रोन में सेल गोली को फिर से निलंबित करें। इसके बाद, नमूना प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण के लिए तैयार है।
    14. प्रवाह साइटोमीटर पर पैनल स्थापित करने के बाद, प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके शुद्धता विश्लेषण के लिए कोशिकाओं का अधिग्रहण करें।

10. सांख्यिकीय विश्लेषण

  1. एक ग्राफिकल विश्लेषण प्रोग्राम के साथ सांख्यिकीय विश्लेषण और डिजाइन ग्राफ निष्पादित करें। डेटा को माध्य ± SEM के रूप में प्रस्तुत किया जाता है।

Representative Results

वर्तमान प्रोटोकॉल एक साथ सभी प्रमुख सीएनएस-निवासी कोशिकाओं, यानी माइक्रोग्लिया, ऑलिगोडेंड्रोसाइट्स, एस्ट्रोसाइट्स और न्यूरॉन्स को एक एकल सीएनएस प्रतिकृति से अलग करने की संभावना प्रदान करता है। यह प्रयोगों के इन प्रकार के लिए आवश्यक चूहों संख्या में कमी के लिए और सेलुलर स्तर पर आणविक और जैव रासायनिक विश्लेषण की तुलनात्मकता सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है. यदि अलग-अलग सेल प्रकारों को अलग-अलग सीएनएस प्रतिकृतियों से अलग किया जाता है, तो सेलुलर इंटरैक्शन को सच्चाई से मैप नहीं किया जा सकता है और अलगाव प्रक्रियाओं के दौरान संभावित तकनीकी विचलन आगे डाउनस्ट्रीम विश्लेषण को पूर्वाग्रह कर सकते हैं। इसके अलावा, प्रत्येक सेल प्रकार से आणविक और जैव रासायनिक निष्कर्ष एक दूसरे के साथ तुलनीय नहीं होंगे क्योंकि वे एक ही ईएई संदर्भ से प्राप्त नहीं होते हैं। किट का उपयोग करके एक पूर्व-मौजूदा एमएसीएस प्रोटोकॉल को उपर्युक्त सेल प्रकारों के एक साथ अलगाव को सक्षम करने के लिए अनुकूलित किया गया था।

माइक्रोग्लिया का अलगाव एंटी-सीडी 11 बी माइक्रो-मोतियों का उपयोग करके किया गया था, ऑलिगोडेंड्रोसाइट्स को एंटी-ओ 4 माइक्रो-मोती(तालिका 1)के माध्यम से अलग किया गया था, और एंटी-एसीएसए-2 माइक्रो-बीड्स का उपयोग एस्ट्रोसाइट्स(तालिका 2)को अलग करने के लिए किया गया था। इसके विपरीत, न्यूरॉन्स का अलगाव एक नकारात्मक चयन का प्रतिनिधित्व करता है और सभी गैर-न्यूरोनल कोशिकाओं(तालिका 2)के बायोटिनाइलेशन और चुंबकीय लेबलिंग द्वारा पूरा किया गया था। रक्त कोशिकाओं को छोड़कर सभी गैर-न्यूरोनल कोशिकाओं (जैसे, ऑलिगोडेंड्रोसाइट्स, माइक्रोग्लिया, एस्ट्रोसाइट्स, एंडोथेलियल कोशिकाओं और फाइब्रोब्लास्ट्स) को बायोटिन-संयुग्मित एंटीबॉडी का उपयोग करके चुंबकीय रूप से लेबल किया जा सकता है, विशेष रूप से इन गैर-न्यूरोनल कोशिकाओं (तालिका 2) पर व्यक्त सतह एंटीजन के खिलाफ निर्देशित किया जा सकता है। इन चुंबकीय लेबल गैर-न्यूरोनल कोशिकाओं की कमी से, अत्यधिक शुद्ध और व्यवहार्य न्यूरोनल सेल आबादी 30,42,43उत्पन्न की जा सकती है।

उत्पन्न एकल-कोशिका निलंबन की शुद्धता विश्लेषण के लिए दो नए प्रवाह साइटोमेट्री पैनल डिजाइन किए गए थे। यहां, सेल-प्रकार-विशिष्ट सतह और परमाणु मार्करों को जीवित / मृत सेल भेदभाव के साथ संयुक्त किया गया था।

माउस और सेल प्रकार (चित्रा 3 ए) प्रति परिणामी सेल पैदावार का विश्लेषण किया गया और 8 की एक औसत के लिए नेतृत्व किया. 4 x 105 ± 3 x 104 माइक्रोग्लिया, 3.23 x 106 ± 1 x 105 ओलिगोडेंड्रोसाइट्स, 8.6 x 105 ± 2 x 104 एस्ट्रोसाइट्स, और 4.5 x 105 ± 1 x 104 न्यूरॉन्स प्रति भोले माउस।

न्यूरोइन्फ्लेमेशन के रोग मॉडल की जांच करने के उद्देश्य के संदर्भ में, प्रोटोकॉल को ईएई के माउस मॉडल पर भी लागू किया गया था। ईएई प्रेरण के बाद चूहों को दिन 16 पर इच्छामृत्यु दी गई थी, जो रोग का अधिकतम प्रतिनिधित्व करता था। इस ईएई सेटिंग में, लगभग 2.9 x 106 ± 6.7 x 105 ऑलिगोडेंड्रोसाइट्स, 5.2 x 105 ± 9 x 104 एस्ट्रोसाइट्स और 4.4 x 105 ± 4 x 104 न्यूरॉन्स को अलग किया गया था। माइक्रोग्लिया सेल उपज लगभग 1.7 एक्स 105 ± 4 एक्स 104 माइक्रोग्लिया प्रति ईएई माउस क्योंकि एमएसीएस कदम (चित्रा 3 ए) के बाद अतिरिक्त सेल छँटाई की कमी आई थी.

अलगाव के बाद, प्रवाह साइटोमेट्री के माध्यम से विभिन्न सेल आबादी के फेनोटाइपिक लक्षण वर्णन ने साबित कर दिया कि सभी मुख्य सीएनएस-निवासी सेल प्रकारों (चित्रा 3बी)के लिए लगभग 90% की शुद्धता के साथ व्यवहार्य एकल-सेल निलंबन प्राप्त किया जा सकता है। माइक्रोग्लिया को सीडी 45इंटसीडी 11 बीउच्च होने के रूप में वर्गीकृत किया गया था जैसा कि साहित्य में परिभाषित किया गया है 44,45,46,47।

ईएई में, माइक्रोग्लिया को सभी सीडी 11 बी + कोशिकाओं से क्रमबद्ध किया जाना था ताकि उन्हें अन्य सीडी 11 बी + प्रतिरक्षा कोशिकाओं जैसे मोनोसाइट्स, न्यूट्रोफिल, प्राकृतिक हत्यारा कोशिकाओं, ग्रैनुलोसाइट्स और मैक्रोफेज से अलग किया जा सके जो न्यूरोइन्फ्लेमेशन 27,28,48 के दौरान सीएनएस में आप्रवासन करते हैं। इसलिए, माइक्रोग्लिया को CD11b+ सेल निलंबन से CD45intCD11उच्च कोशिकाओं के रूप में क्रमबद्ध किया गया था। पूरे माइक्रोग्लिया छँटाई रणनीति चित्रा 4 में दर्शाया गया है. भोले चूहों में, माइक्रोग्लिया आबादी सभी जीवित एकल कोशिकाओं (कुल सीडी 11 बी + जनसंख्या का 96%) (चित्रा 4 ए) का 91.16% थी। ईएई चूहों में, माइक्रोग्लिया आबादी सभी जीवित एकल कोशिकाओं (कुल सीडी 11 बी + जनसंख्या का 55%) (चित्रा 4 बी) का 46.85% थी। हालांकि एमएसीएस और एफएसीएस दोनों प्रक्रियाएं एकल कोशिकाओं पर यांत्रिक तनाव लागू करती हैं, 75.41% ± 8.63% सॉर्ट किए गए शुद्ध माइक्रोग्लिया व्यवहार्य थे (चित्र 3बी)।

प्रारंभिक सीएनएस सेल निलंबन से सीधे अलग किए गए एस्ट्रोसाइट्स और न्यूरॉन्स ने ऑलिगोडेंड्रोसाइट्स के साथ प्रासंगिक संदूषण दिखाया, जिसके कारण यह धारणा बनी कि ऑलिगोडेंड्रोसाइट्स के नकारात्मक प्रवाह से न्यूरॉन्स और एस्ट्रोसाइट्स का एक साथ अलगाव इस संदूषण को रोक सकता है। फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण ने पुष्टि की कि ऑलिगोडेंड्रोसाइट्स के नकारात्मक प्रवाह-थ्रू से अलग एस्ट्रोसाइट्स में 89.23% ± 2.78% की शुद्धता थी और 80.56% ± 1.41% की व्यवहार्यता का प्रदर्शन किया। इन परिणामों के समान, ओ 4 सेल अंश से अलग न्यूरॉन्स की शुद्धता 3.31% ± 81.25% थी और व्यवहार्यता 2.61% ± 83.90% थी (चित्रा 3बी)। ये निष्कर्ष यह भी पुष्टि करते हैं कि इन दो सेल प्रकारों के एक साथ अलगाव केवल बाद में ऑलिगोडेंड्रोसाइट्स के अलगाव के लिए व्यवहार्य कार्यात्मक कोशिकाओं की मात्रा पर कोई प्रभाव नहीं पड़ता है।

पृथक एकल कोशिका निलंबन की व्यवहार्यता और शुद्धता के बारे में परिणाम भोले चूहों में प्राप्त लोगों की तुलना में ईएई चूहों में बहुत समान थे, यह पुष्टि करते हुए कि यह प्रोटोकॉल स्वस्थ चूहों के साथ-साथ ईएई(चित्रा 3बी)के संदर्भ में उपयुक्त है।

Figure 3
चित्रा 3: सेल पैदावार और पृथक सीएनएस-निवासी कोशिकाओं के प्रवाह साइटोमेट्री-आधारित सत्यापन। (ए) भोले और ईएई चूहों में सीएनएस-निवासी कोशिकाओं के अलगाव के बाद माउस और सेल-प्रकार प्रति सेल पैदावार। बार ग्राफ प्रस्तुत प्रोटोकॉल के कार्यान्वयन के बाद माउस और सेल प्रकार प्रति सेल पैदावार की मात्रा कल्पना. भोले चूहों में परिणामों के लिए पांच जैविक प्रतिकृतियों को संसाधित किया गया था, और ईएई चूहों में चार जैविक प्रतिकृतियों का विश्लेषण किया गया था। एसईएम ± संबंधित साधनों को दर्शाया गया है। (बी)शुद्ध सेल अंशों की इसी शुद्धता और व्यवहार्यता विश्लेषण। बार ग्राफ सेल-प्रकार-विशिष्ट मार्करों की उनकी अभिव्यक्ति के आधार पर परिणामी एकल-सेल निलंबन की व्यवहार्यता और शुद्धता का संकेत देते हैं। न्यून का उपयोग न्यूरॉन्स के लिए सेल-प्रकार के विशिष्ट परमाणु मार्कर के रूप में किया गया था। पांच जैविक प्रतिकृतियों का अधिग्रहण किया गया और स्वस्थ और ईएई चूहों दोनों के लिए प्रत्येक सेल प्रकार के लिए तुलना की गई। एसईएम ± संबंधित साधनों का संकेत दिया गया है। संक्षिप्ताक्षर: एंटी-एसीएसए -2 = एस्ट्रोसाइट सेल सतह एंटीजन -2; CD11b = साइक्लिन-निर्भर किनेज 11B; सीडी 45 = रिसेप्टर-प्रकार टाइरोसिन-प्रोटीन फॉस्फेट सी; CNS = केंद्रीय तंत्रिका तंत्र; ईएई = प्रयोगात्मक ऑटोइम्यून एन्सेफैलोमाइलाइटिस; एमएसीएस = चुंबकीय-सक्रिय सेल छँटाई; NeuN = आरएनए बाध्यकारी प्रोटीन लोमड़ी -1 homolog 3; O4 = ऑलिगोडेंड्रोसाइट मार्कर O4; SEM = माध्य की मानक त्रुटि। इस आंकड़े को49 से संशोधित किया गया है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: सीडी 11 बी + कोशिकाओं के अलगाव के बाद माइक्रोग्लिया के सेल सॉर्टिंग के लिए गेटिंग रणनीति। (ए) भोले में गेटिंग रणनीति और (बी) ईएई चूहों। प्रत्येक पैनल की ऊपरी पंक्ति छँटाई से पहले डॉट प्लॉट दिखाती है और छँटाई के बाद निचली पंक्ति। लाइव (SSC-A / FSC-A) और एकल कोशिकाओं (FCS-H / FSC-W) के चयन के बाद, CD45intCD11b+ कोशिकाओं की आबादी को माइक्रोग्लिया आबादी के रूप में क्रमबद्ध किया गया था। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

अब तक, मास स्पेक्ट्रोमेट्री और आरएनए अनुक्रमण के संयोजन से सीएनएस-निवासी कोशिकाओं पूर्व विवो को मैप करने के तरीके स्वास्थ्य और बीमारी में एक बहुत ही सटीक सेलुलर रूपरेखा प्रदान करते हैं लेकिन इस क्षेत्र में महत्वाकांक्षी तकनीकी ज्ञान और विशेषज्ञता की आवश्यकता होती है50,51. इसके अलावा, वे कार्यात्मक विश्लेषण की अनुमति नहीं देते हैं और बहुत महंगे हैं। इसके अलावा, माइक्रोफ्लुइडिक ब्रेन-ऑन-ए-चिप सिस्टम रोग तंत्र के लिए तेजी से और सस्ती स्क्रीनिंग प्रदान करते हैं और सेल विकास और प्रवासन52,53,54,55 के प्रतिबंध के साथ नए चिकित्सीय दृष्टिकोणों का परीक्षण करते हैं। सीएनएस ऑर्गेनोइड भविष्य में सेलुलर मॉडलिंग, अंतर-सेलुलर कनेक्शन और रोग पाठ्यक्रमों के दौरान बातचीत के लिए एक समकक्ष विकल्प का भी प्रतिनिधित्व कर सकते हैं 56,57,58,59. हालांकि, प्रतिदीप्ति- और चुंबकीय-सक्रिय सेल छँटाई वर्तमान में शुद्ध और व्यवहार्य एकल-सेल निलंबन पूर्व विवो 35,60,61 उत्पन्न करने के लिए सबसे प्रभावी तरीके हैं। यहां तक कि अगर सीएनएस-निवासी सेल प्रकारों के अलगाव के लिए अन्य स्थापित विनिर्माण प्रोटोकॉल चुंबकीय अलगाव और पूर्व सेल पृथक्करण के व्यक्तिगत चरणों के बारे में समान हैं, तो उनका उद्देश्य प्रत्येक सेल प्रकार के लिए अलग से प्रदर्शन करना है। इसके विपरीत, वर्तमान प्रोटोकॉल एक तार्किक संदर्भ में प्रत्येक सीएनएस-निवासी सेल प्रकार के लिए विभिन्न अलगाव विधियों को एकीकृत करता है ताकि उन्हें एक बार में और एक एकल सीएनएस सेल निलंबन(तालिका 1, तालिका 2)से एक साथ प्रदर्शन किया जा सके। इस प्रकार, यह एक एकल सीएनएस सेल निलंबन से बहु-ओमिक्स विश्लेषण और अंततः, जटिल न्यूरोनल नेटवर्क की खोज को सक्षम बनाता है। यहां तक कि अगर यह इस प्रोटोकॉल को करने के लिए कई जानवरों से कई ऊतकों को पूल करने के लिए जरूरी नहीं है, तो यह पूलिंग आगे डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए पर्याप्त संख्या में पृथक कोशिकाओं को सुनिश्चित करता है। एकल कोशिका प्रकारों के अलगाव के लिए विभिन्न चूहों का उपयोग संभावित सेलुलर इंटरैक्शन का विश्लेषण करने की संभावना को बाहर करेगा। इसके अलावा, विभिन्न सीएनएस सेल प्रकारों के लिए अलग-अलग अलगाव विधियों का संयोजन, जो सभी एक पूर्व सीएनएस पृथक्करण का पालन करते हैं, सभी निम्नलिखित चुंबकीय अलगाव चरणों के लिए एक अलग सीएनएस सेल निलंबन का उपयोग करके सामग्री लागत बचाता है। इसके अतिरिक्त, विभिन्न चूहों के उपयोग के कारण होने वाले संभावित तकनीकी पूर्वाग्रह को कम से कम किया जाता है।

प्रोटोकॉल की एक सीमा महिला C57BL/6J चूहों के लगभग अनन्य उपयोग हो सकता है. ईएई टीकाकरण प्रोटोकॉल को महिला चूहों के लिए डिजाइन और स्थापित किया गया है, इसलिए इस सेल अलगाव प्रोटोकॉल को महिला सी 57 बीएल / 6 जे चूहों में भी लागू किया गया था। फिर भी, भोले पुरुष चूहों भी जिसके परिणामस्वरूप सेल संख्या या शुद्धता पर किसी भी प्रभाव को पहचानने के बिना, इस प्रोटोकॉल के विकास के दौरान इस्तेमाल किया गया. एक और प्रतिबंध न्यूरॉन्स के चुंबकीय कोशिका अलगाव को प्रभावित करता है क्योंकि सकारात्मक चयन के संदर्भ में न्यूरॉन्स के अलगाव के लिए कोई विशिष्ट सूक्ष्म मोती मौजूद नहीं है। यह मान लिया गया था कि एक शुद्ध एकल कोशिका निलंबन बायोटिन लेबलिंग और सभी गैर न्यूरोनल कोशिकाओं(तालिका 2)की कमी के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है. इस धारणा को न्यूरॉन्स के लिए एक विशिष्ट परमाणु मार्कर के रूप में न्यून के उपयोग द्वारा सत्यापित किया गया था, जो उल्लिखित प्रवाह साइटोमेट्री शुद्धता पैनल में एकीकृत है। एक और सीमा ईएई चूहों में माइक्रोग्लिया के अलगाव की चिंता करती है। यहां, एमएसीएस प्रोटोकॉल के बाद अतिरिक्त छँटाई कदम के कारण अन्य सेल प्रकारों की तुलना में परिणामी सेल पैदावार कम हो जाती है। इसके अलावा, कोई यह तर्क दे सकता है कि छँटाई अन्य सेल आबादी की तुलना में माइक्रोग्लिया के यांत्रिक तनाव को बढ़ाती है। व्यक्तिगत छँटाई रणनीतियों सेल पैदावार की अलग अलग मात्रा के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. यदि पृथक सेल नंबर अपेक्षा या वांछित से कम है, तो गेटिंग सेट अप को समायोजित करने और/या जीवित/मृत भेदभाव में सुधार करने की सिफारिश की जाती है।

प्रोटोकॉल में एक महत्वपूर्ण कदम मलबे को हटाने का प्रतिनिधित्व करता है। ढाल बहुत धीरे धीरे और धीरे स्तरित किया जाना चाहिए तीन अलग अलग चरणों (चित्रा 2 ए) बनाने के लिए. केवल अगर दो शीर्ष चरणों में माइलिन और अन्य मलबे के अवशेषों को पूरी तरह से हटा दिया जाता है (चित्र 2E), शुद्ध एकल-कोशिका निलंबन उत्पन्न किया जा सकता है, और आगे संदूषण को कम किया जा सकता है। यदि परिणामी सेल निलंबन शुद्धता की कमी है, तो यह संभवतः प्रोटोकॉल का वह खंड है जिसे पहले सभी माइक्रो-बीड्स के सही उपयोग के आश्वासन के बगल में सुधार किया जाना चाहिए।

शुद्धता और व्यवहार्यता में उच्च स्तर प्राप्त करना इस प्रकार के प्रयोग में चुनौतीपूर्ण हो सकता है। समस्या निवारण के लिए कुछ अनुशंसाएँ हैं:

-बाँझ परिस्थितियों में काम करना विभिन्न सूक्ष्म मोतियों के संदूषण को रोकने और बार-बार उपयोग को सक्षम करने के लिए अनिवार्य है, विशेष रूप से बाद की खेती के लिए।
मिश्रण अप को रोकने के लिए प्रत्येक ट्यूब के लेबलिंग अत्यधिक सिफारिश की है.
-बिना ठंडा अभिकर्मकों/बफ़र्स के उपयोग से बचें। उच्च व्यवहार्यता सुनिश्चित करने के लिए पूरे प्रयोग के दौरान बर्फ पर सभी सेल निलंबन स्टोर करें।
-विभिन्न कार्य चरणों के बीच का समय यथासंभव कम रखें। प्रोटोकॉल में कोई विशिष्ट हिस्सा नहीं है जहां प्रयोग को रोकने की सिफारिश की जाती है।
-निर्दिष्ट इनक्यूबेशन अवधियों का पालन करना अत्यधिक प्रासंगिक है।

अंत में, एक सीएनएस प्रतिकृति से सभी मुख्य सीएनएस-निवासी सेल प्रकारों के एक साथ अलगाव के लिए यह वर्तमान प्रोटोकॉल एक सीएनएस सेल निलंबन से जटिल न्यूरोनल नेटवर्क और न्यूरोइन्फ्लेमेटरी मार्गों का विश्लेषण करने की संभावना प्रदान करता है। इस प्रकार, सीएनएस-निवासी कोशिकाओं की जांच रोग पाठ्यक्रमों के विभिन्न चरणों के दौरान की जा सकती है, उदाहरण के लिए, न्यूरोइन्फ्लेमेशन, न्यूरोडीजेनेरेशन और / या ईएई में छूट के दौरान। इसके अलावा, सेल-सेल इंटरैक्शन और जैव रासायनिक मार्गों का अध्ययन व्यक्तिगत स्तर पर किया जा सकता है और प्रयोगात्मक समूहों के भीतर परिवर्तनशीलता को कम किया जा सकता है। आगे कार्यात्मक परख और सत्यापन के लिए मोनोकल्चर में पृथक सीएनएस कोशिकाओं के अंशों की खेती करने का अवसर भी है। सभी एक में, यह प्रोटोकॉल संभावित रूप से प्रीक्लिनिकल और नैदानिक अनुसंधान दृष्टिकोणों को प्रभावित करने वाली महत्वपूर्ण प्रगति प्रदान करता है।

Disclosures

सभी लेखकों ने हितों का कोई टकराव नहीं होने की घोषणा की।

Acknowledgments

Adobe Illustrator (संस्करण 2023) और Servier Medical Art (https://smart.servier.com) का उपयोग करके आंकड़े बनाए गए थे। एंटोनिया हेन्स को जुरगेन मंचोट स्टिफ्टंग का समर्थन प्राप्त था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
70 μm cell strainers Corning, MA, USA 352350 CNS tissue dissociation
ACSA-2 Antibody, anti-mouse, PE-Vio 615 (clone REA-969) Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany 130-116-244 Flow cytometry, store at 4 °C
Adult Brain Dissociation Kit, mouse, and rat Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany 130-107-677 Tissue dissociation,contains debris and red blood cell removal solutions; prepare aliquots of enzyme A and P upon arrival and store them at -20 °C; store the remaining kit at 4 °C
Anti-ACSA-2 MicroBead Kit, mouse Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany 130-097-678 MACS of astrocytes, store at 4 °C
Anti-mouse CD16/32 antibody  BioLegend, London, UK 101301 Flow cytometry, store at 4 °C
Anti-O4 MicroBeads, human, mouse, rat Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany 130-094-543 MACS of oligodendrocytes, store at 4 °C
AstroMACS Separation buffer Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany 130-091-221 MACS of astrocytes, store at 4 °C
Biotin Antibody, PE (clone Bio3-18E7) Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany 130-113-853 Flow cytometry, store at 4 °C
BRAND Neubauer counting chamber Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA 10195580 Cell counting 
Brilliant Violet 510 anti-mouse CD45 Antibody (clone 30-F11) BioLegend, London, UK 103137 Flow cytometry, store at 4 °C
CD11b MicroBeads, human, mouse Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany 130-049-601 MACS of microglia, store at 4 °C
DNAse I, recombinant, Rnase-free Merck KGaA, Darmstadt, Germany 4716728001 Flow cytometry, store at -20° C
D-PBS with Calcium, Magnesium, Glucose, Pyruvat Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA 14287080 Buffer, store at 4 °C
D-PBS, without calcium, without magnesium Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA 14190250 Buffer, store at 4 °C
eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 780 Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA 65-0865-14 Flow cytometry, store at 4 °C
eBioscience Foxp3/Transcription factor staining buffer set Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA 00-5523-00 Flow cytometry, store at 4°C
Falcon (15 mL) Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA 11507411 Cell tube
Falcon (50 mL) Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA 10788561 Cell tube 
Falcon Round-Bottom Polystyrene Test Tubes with Cell Strainer Snap Cap, 5 mL Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA 08-771-23 Flow cytometry
FcR Blocking Reagent, mouse  Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany 130-092-575 MACS of oligodendrocytes, store at 4 °C
Female C57BL/6J mice Charles River Laboratories, Sulzfeld, Germany Active EAE induction 
Fetal calf serum (FCS) Merck KGaA, Darmstadt, Germany F2442-50ML Flow cytometry, store at -5 to -20 °C
FITC Rat Anti-CD 11b  (clone M1/70) BD Biosciences, San Jose, CA, USA 553310 Flow cytometry, store at 4 °C
Freund’s Complete adjuvant Merck KGaA, Darmstadt, Germany AR001 Active EAE induction, store at 4 °C
GentleMACS C Tubes Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany 130-093-237 CNS tissue dissociation
GentleMACS Octo Dissociator with Heaters Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany 130-096-427 CNS tissue dissociation
Graphpad Prism 8.4.3 Graphpad by Dotmatics Graphical Analysis
Isoflurane AbbVie, North Chicago, IL, USA Active EAE induction, store at 4 °C
Kaluza Analysis Software V2.1.1 Beckman Coulter, Indianapolis, IN, USA Flow cytometry analysis
LS Columns Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany 130-042-401 MACS
MACS BSA Stock Solution Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany 130-091-376 PB-buffer
MACS MultiStand Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany 130-042-303 MACS 
MOG35–55 peptide Charité, Berlin, Germany; alternatives: Genosphere Biotechnologies (Paris, France) or sb-Peptide (Saint Egrève, France) Active EAE induction, store at -20 °C
Mycobacterium tuberculosis strain H37 Ra Becton, Dickinson and Company (BD),Franklin Lakes, NJ, USA Active EAE induction, store at 4 °C
Neuron Isolation Kit, mouse  Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany 130-115-390 MACS of neurons, store at 4 °C
O4 Antibody, anti-human/mouse/rat, APC, (clone REA-576) Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany 130-119-897 Flow cytometry, store at 4 °C
Pertussis toxin in glycerol Hooke Laboratories Inc., Lawrence, MA, USA BT-0105 Active EAE induction; store at -20 °C
pluriStrainer Mini 100 μm  pluriSelect Life Science UG, Leipzig, Sachsen, Germany 43-10100-40 Flow cytometry
QuadroMACS Separator  Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany 130-090-976 MACS
Recombinant Alexa Fluor 647 Anti-NeuN antibody (clone EPR12763) Abcam, Cambridge, UK EPR12763 Flow cytometry, store at -20 °C
Stainless Steel Brain Matrices, 1 mm Ted Pella, Redding, CA, USA 15067 CNS tissue dissection
Trypan blue solution, 0.4% Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA 15250061 Cell counting 
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA 15575020 Flow cytometry, store at room temperature

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तंत्रिका विज्ञान अंक 200 वयस्क ऑटोइम्यून एन्सेफेलोमाइलाइटिस चूहे ईएई मॉडल मल्टीपल स्केलेरोसिस एमएस के एटियलजि उपचार रणनीतियाँ MOG35-55 EAE मॉडल आरोही पक्षाघात क्लिनिकल स्कोरिंग सिस्टम पैथोमैकेनिज्म सीएनएस-निवासी सेल प्रकार माइक्रोग्लिया ओलिगोडेंड्रोसाइट्स एस्ट्रोसाइट्स न्यूरॉन्स मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी पृथक्करण चुंबकीय-सक्रिय सेल सॉर्टिंग (एमएसीएस) फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण एकल-सेल निलंबन
वयस्क ऑटोइम्यून एन्सेफेलोमाइलाइटिस चूहों से प्रिंसिपल सेंट्रल नर्वस सिस्टम-रेजिडेंट सेल प्रकारों का एक साथ अलगाव
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Schroeter, C. B., Henes, A., Vogelsang, A., Herrmann, A. M., Lichtenberg, S., Cengiz, D., Dobelmann, V., Huntemann, N., Nelke, C., Eichler, S., Albrecht, P., Meuth, S. G., Ruck, T. Simultaneous Isolation of Principal Central Nervous System-Resident Cell Types from Adult Autoimmune Encephalomyelitis Mice. J. Vis. Exp. (200), e65735, doi:10.3791/65735 (2023).

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