Summary
Tot op heden zijn protocollen voor de gelijktijdige isolatie van alle belangrijke celtypen van het centrale zenuwstelsel uit dezelfde muis een onvervulde vraag. Het protocol toont een procedure die toepasbaar is bij naïeve en experimentele auto-immuun encefalomyelitis-muizen om complexe cellulaire netwerken tijdens neuro-inflammatie te onderzoeken en tegelijkertijd het vereiste aantal muizen te verminderen.
Abstract
Experimentele auto-immuun encefalomyelitis (EAE) is het meest voorkomende muizenmodel voor multiple sclerose (MS) en wordt vaak gebruikt om de nog onbekende etiologie van MS verder op te helderen om nieuwe behandelingsstrategieën te ontwikkelen. Het myeline-oligodendrocytglycoproteïnepeptide 35-55 (MOG35-55) EAE-model reproduceert een zelfbeperkend monofasisch ziekteverloop met oplopende verlamming binnen 10 dagen na immunisatie. De muizen worden dagelijks onderzocht met behulp van een klinisch scoresysteem. MS wordt aangedreven door verschillende pathomechanismen met een specifiek temporeel patroon, dus het onderzoek naar de rol van celtypes van het centrale zenuwstelsel (CZS) tijdens de progressie van de ziekte is van groot belang. Het unieke kenmerk van dit protocol is de gelijktijdige isolatie van alle belangrijke celtypen van het CZS (microglia, oligodendrocyten, astrocyten en neuronen) die van toepassing zijn op volwassen EAE en gezonde muizen. De dissociatie van de hersenen en het ruggenmerg van volwassen muizen wordt gevolgd door magnetisch geactiveerde celsortering (MACS) om microglia, oligodendrocyten, astrocyten en neuronen te isoleren. Flowcytometrie werd gebruikt om kwaliteitsanalyses uit te voeren van de gezuiverde eencellige suspensies, waarbij de levensvatbaarheid na celisolatie werd bevestigd en de zuiverheid van elk celtype van ongeveer 90% werd aangegeven. Kortom, dit protocol biedt een nauwkeurige en uitgebreide manier om complexe cellulaire netwerken in gezonde en EAE-muizen te analyseren. Bovendien kan het aantal benodigde muizen aanzienlijk worden verminderd, omdat alle vier de celtypen uit dezelfde muizen worden geïsoleerd.
Introduction
Multiple sclerose (MS) is een chronische inflammatoire auto-immuunziekte van het centrale zenuwstelsel (CZS) die wordt gekenmerkt door demyelinisatie, axonale schade, gliose en neurodegeneratie. Ondanks talrijke onderzoeksbenaderingen op dit gebied, wordt de pathofysiologie van MS nog steeds niet volledig begrepen 1,2,3,4. Het meest voorkomende diermodel voor het onderzoeken van MS is de myeline-oligodendrocytglycoproteïnepeptide 35-55 (MOG35-55)-geïnduceerde experimentele auto-immuunencefalomyelitis (EAE) die veel van zijn klinische en pathofysiologische kenmerken deelt 5,6,7,8,9 . Het is gebaseerd op de reactie van het immuunsysteem tegen CZS-specifieke antigenen die leiden tot ontsteking, demyelinisatie en neuroaxonale degeneratie. Experimentele auto-immuun encefalomyelitis (EAE) is een geschikt model voor het onderzoek van neuro-inflammatoire routes en signaalcascades die bij MS worden aangetroffen.
De huidige therapiemogelijkheden voor MS zijn slechts gedeeltelijk effectief en richten zich voornamelijk op de initiële ontstekingsfase van de ziekte. De neurodegeneratieve component van MS lijkt echter de grootste uitdaging te zijn voor therapeutische benaderingen op lange termijn. Daarom zijn reproduceerbare en nauwkeurige celisolatieprotocollen nodig om moleculaire en cellulaire mechanismen bij auto-immuunziekten op een alomvattende manier te onderzoeken. Zelfs als er enkele protocollen voor de isolatie van één enkel celtype bestaan 10,11,12,13,14,15, is er een onvervulde behoefte aan de gelijktijdige isolatie van verschillende CZS-residente celpopulaties tegelijk. Eerdere protocollen voor de isolatie van CZS-residente cellen missen het behoud van cellulaire functionaliteit en zuiverheid, wat resulteert in co-cultivatie met naburige cellen 16,17,18 of de ongeschiktheid voor complexe analyses van intracellulaire netwerken ex vivo19,20,21,22.
Het doel van dit protocol was om een reproduceerbare en alomvattende methode vast te stellen voor de gelijktijdige isolatie van zuivere levensvatbare eencellige suspensies van alle belangrijke CZS-residente celtypen die toepasbaar zijn bij volwassen gezonde en EAE-muizen. De verschillende celtypen werden geïsoleerd met behulp van magnetisch geactiveerde celsortering (MACS)23. De celscheiding kan worden bereikt door positieve selectie, d.w.z. magnetische etikettering van celtype-specifieke oppervlaktemarkers, of door negatieve selectie via biotinylering en uitputting van alle ongewenste cellen. Flowcytometrie werd toegepast om een zuiverheid van meer dan 90% en een levensvatbaarheid van ten minste 80% van de geïsoleerde eencellige suspensies te garanderen.
Concluderend was het belangrijkste doel om een protocol op te stellen voor de gelijktijdige isolatie van alle belangrijke CZS-residente celtypen als een veelzijdig hulpmiddel voor het onderzoek van neuro-inflammatoire routes die een uitgebreide en nauwkeurige analyse bieden van complexe cellulaire netwerken en biochemische signaleringscascades in gezonde en EAE-muizen.
Protocol
Alle EAE-experimenten werden geïnduceerd in vrouwelijke C57BL/6J-muizen op de leeftijd van 10-12 weken en goedgekeurd door de lokale autoriteiten (Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz Nordrhein-Westfalen). De naleving van de Duitse en EU-dierenbeschermingswetgeving werd ook op elk moment van de experimenten gegarandeerd. Alle muizen werden gehouden onder individueel geventileerde kooien en dierenverblijven.
OPMERKING: De volgende reagensvolumes verwijzen naar de hersenen en het ruggenmerg van één volwassen muizen, die hierna CZS-celsuspensie worden genoemd en ongeveer 20 mg tot 500 mg wegen. Als dissociatie van meer dan één CZS-celsuspensie is gepland, moeten alle reagensvolumes en materialen dienovereenkomstig worden opgeschaald. Het wordt aanbevolen om Dulbecco's fosfaatgebufferde zoutoplossing (D-PBS; 1x) met calcium en magnesium, aangevuld met 1 g/L glucose en 36 mg/L natriumpyruvaat) gedurende het hele experiment continu op ijs te bewaren. Als er daarna celkweek is gepland, voer dan alle stappen uit onder steriele omstandigheden met behulp van kappen. Anders hoeft geen van de volgende protocolsecties onder een motorkap te worden uitgevoerd. Bewaar de buffers op ijs. Gebruik alleen voorgekoelde oplossingen en vermijd vortexen tijdens het hele experiment. Zie afbeelding 1 voor de algemene workflow.
Figuur 1: Workflow voor de gelijktijdige isolatie van oligodendrocyten, microglia, astrocyten en neuronen in naïeve en EAE-muizen. De eerste stappen van de workflow zijn hetzelfde voor zowel naïeve als EAE-muizen. Als het werken met een EAE-replicaat gewenst is, moet EAE-inductie vooraf worden uitgevoerd (1). In het kort begint het protocol met de dissectie (2) en dissociatie (3) van de hersenen en het ruggenmerg van muizen, gevolgd door het verwijderen van puin (4) en rode bloedcellen (5). Vervolgens wordt de resulterende gezuiverde CZS-celsuspensie gesplitst in twee fracties voor de gelijktijdige isolatie van oligodendrocyten en microglia via MACS (6). Microglia worden gedetecteerd via anti-CD11b-microkorrels, terwijl oligodendrocyten worden geïsoleerd met behulp van anti-O4-microkorrels (positieve selecties). Uit de negatieve doorstroming van de oligodendrocyten (8) worden astrocyten geïsoleerd via anti-ACSA-2 microbolletjes (positieve selectie) en neuronen door biotine-labeling en uitputting van alle niet-neuronale cellen (negatieve selectie). Bij EAE-muizen wordt de isolatie van CD11b+-cellen gevolgd door fluorescentie-geactiveerde celsortering van CD45intCD11b-hoge cellen om andere CD11b+-immuuncellen zoals macrofagen, dendritische cellen, monocyten, granulocyten en natural killer-cellen te elimineren waarvan bekend is dat ze deelnemen aan neuro-inflammatieprocessen tijdens de EAE-kuur (7)27,28,48. Na de isolatie van de verschillende celtypen die in het CZS aanwezig zijn, kunnen zuiverheidsanalyses worden uitgevoerd (9). Afkortingen: Abs = antilichamen; ACSA-2 = antigeen-2 op het oppervlak van astrocytcellen; CD11b = cycline-afhankelijke kinase 11B; CD45 = tyrosine-eiwitfosfatase C van het receptortype; CZS = centraal zenuwstelsel; EAE = experimentele auto-immuun encefalomyelitis; MACS = magnetisch geactiveerde celsortering; O4 = oligodendrocyt marker O4. Dit cijfer is gewijzigd van49. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
1. Inductie van actieve EAE
- Bereiding van reagentia
- Voor celscheiding: Bereid de PB-buffer voor en bewaar deze maximaal 1 week bij 2-8 °C. Voeg voor de bereiding van de bouillonoplossing 475 ml 1x PBS zonder supplementen (pH 7,2) + 25 ml 0,5% runderserumalbumine (BSA) toe. Gebruik een verdunning van 1:20 bereid in BSA.
- Voor flowcytometrie en fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS): Bereid de FACS-buffer, PBS met 2% foetaal kalfsserum (FCS) en 2 mM EDTA en bewaar deze bij 2-8 °C. Voeg voor de bereiding 500 ml 1x PBS zonder supplementen en 10 ml FCS + 2 ml EDTA toe (uit 0,5 M EDTA-voorraad)
- Voer immunisatie uit volgens het protocol van Bittner et al. 5. In het kort, induceer EAE door subcutane injectie van een emulsie met 200 μg MOG35-55 peptide en 200 μL volledig Freud's adjuvans, inclusief 200 μg Mycobacterium tuberculosis.
- Verdoof de muis met 2% isofluraan met behulp van een anesthesiekamer met een isofluraanverdamper. Gebruik dierenartszalf op de ogen van het dier om uitdroging onder narcose te voorkomen.
- Injecteer na 2 uur een intraperitoneale injectie van 100 ng kinkhoesttoxine (PTx) opgelost in 100 μL 1x PBS volgens het protocol van Huntemann et al.24. Herhaal de PTx-injectie op dag 2 na immunisatie.
LET OP: Observeer elk dier totdat het weer voldoende bij bewustzijn is om sternale ligging te behouden. Muizen die de injectieprocedures hebben ondergaan, worden pas teruggebracht naar het gezelschap van de andere muizen als ze volledig hersteld zijn. Voor Mycobacterium tuberculosis en PTx: Vermijd inademing, inslikken en contact met de huid en ogen. Mycobacterium tuberculosis is een activator van het aangeboren immuunsysteem. PTx heeft veel biologische effecten. - Bewaak de EAE-progressie dagelijks, uitgevoerd door twee geblindeerde onderzoekers die het gewicht controleren en de muizen klinisch onderzoeken.
- Gebruik hiervoor het volgende scoresysteem: graad 0 - geen klinische symptomen van EAE, graad 1 - gedeeltelijke staartparese, graad 2 - volledige staartparese, graad 3 - matige zwakte van de achterpoten, graad 4 - volledige zwakte van de achterpoten en ataxische gang, graad 5 - milde paraparese, graad 6 - paraparese, graad 7 - paraplegie, graad 8 - tetraparese, graad 9 - quadriplegie, en graad 10-dood.
- Gebruik de volgende uitsluitingscriteria voor verdere deelname aan het experiment klinische score > 7 of een gewichtsverlies van meer dan 20% van het oorspronkelijke lichaamsgewicht.
- Voor de dissectie van de hersenen en het ruggenmerg, euthanaseer EAE-muizen op dag 16 na EAE-inductie die het maximale ziektemaximum vertegenwoordigt.
2. Voorbereiding van CZS-weefsel (duur: ongeveer 10 minuten per muis)
- Nadat je muizen hebt opgeofferd met kooldioxide, begin je met de transcardiale perfusie van elke muis met 20 ml 1x PBS. Herhaal de perfusie opnieuw met 20 ml 1x PBS.
- Plaats de muis in rugligging en fixeer de ledematen met canules. Breng 75% ethanol aan op het voorlichaam van het dier. Verdere steriliteitsmaatregelen zijn op dat moment niet nodig.
- Open de buik en borstkas door met behulp van een schaar een longitudinale doorsnede door de huid en fascia te maken.
- Snijd de ribben zijwaarts door en vouw de thorax omhoog om vrije toegang tot het hart te krijgen. Bevestig de naar boven gevouwen thorax met canules.
- Open het rechter atrium met een schaar. Breng 20 ml 1x PBS met een canule aan in de linker hartkamer om het bloed door de ingesneden rechter boezem te spoelen.
- Leg de schedel bloot door de huid bovenop de muizenkop via een longitudinale doorsnede door te snijden en de huid rond het hoofd te verschuiven met een pincet. Snijd de schedel in met behulp van een schaar langs de sagittale hechting.
- Steek de punt van een pincet langs de incisielijn om de calotte open te breken. Verwijder de resterende delen van de calotte met een tang zodat de hersenen volledig bloot komen te liggen.
- Verwijder de hersenen voorzichtig en plaats ze in een muizenhersenmatrix. Snijd de hersenen met een scheermesje in sagittale plakjes van 1 mm dik.
- Knip de wervelkolom met behulp van een schaar net boven de bekkenkam door, zodat de spuit in het wervelkanaal kan worden ingebracht.
OPMERKING: De eenvoudigste manier om het ruggenmerg te verwijderen, is door het met PBS uit het wervelkanaal te spoelen. Anders moeten de wervelbogen afzonderlijk met een schaar worden geopend en kan het ruggenmerg worden verwijderd. - Spoel het ruggenmerg uit het wervelkanaal van caudaal naar craniaal met behulp van een spuit van 20 ml met een naald van 20 G die 1x PBS bevat. Snijd het ruggenmerg met een scalpel in segmenten van 0,5 cm lang.
- Bewaar elke CZS-celsuspensie bestaande uit hersenen en bijbehorend ruggenmerg in één aparte petrischaal per muis, gevuld met ongeveer 3 ml koude D-PBS. Bewaar de gerechten op ijs tot verdere verwerking.
3. Dissociatie van CZS-weefsel (duur: ongeveer 1-1,5 uur, afhankelijk van het aantal CZS-celsuspensies)
OPMERKING: Neuraal weefsel van volwassen muizen wordt gedissocieerd door mechanische dissociatie te combineren met enzymatische afbraak van de extracellulaire matrix. Daardoor blijft de structurele integriteit behouden en kan de celsuspensie worden gebruikt voor verdere celisolatieprocedures.
- Bereid het juiste volume enzymmix 1 bestaande uit 50 μL enzym P en 1.900 μL buffer Z per CZS-celsuspensie. Beide reagentia behoren tot de dissociatiekit voor de hersenen bij volwassenen.
- Bereid het juiste volume enzymmix 2 bestaande uit 10 μL enzym A en 20 μL buffer Y per CZS-celsuspensie. Beide reagentia behoren tot de dissociatiekit voor de hersenen bij volwassenen.
- Breng 1.950 μL enzymmix 1 over in de C-buis en voeg daarna de weefselstukjes van een CZS-celsuspensie toe. Gebruik één C-buis per muis.
- Voeg 30 μL enzymmix 2 toe aan elke C-buis. Sluit de C-buizen goed af en bevestig ze ondersteboven op de huls van de celdissociator met verwarmers.
- Voer het juiste programma met de naam 37C_ABDK_01 uit (duurt 30 minuten). Neem ten minste de eerste 5 minuten van het programma in acht om ervoor te zorgen dat alle buizen met dezelfde snelheid draaien. Het optreden van fouten tijdens de run is mogelijk. Ga dan verder met stap 6.
- Plaats in de laatste 2 minuten van het programma een zeef van 70 μm op een buis van 50 ml voor elke gedissocieerde CZS-celsuspensie. Bevochtig deze zeefjes vooraf met 2 ml D-PBS.
- Bevestig na beëindiging van het programma de C-buizen van de dissociator en plaats ze in een centrifuge. Centrifugeer de monsters gedurende 1 minuut bij 300 x g en 4 °C om het monster op de bodem van de buis op te vangen.
- Resuspendeer het monster en breng het aan op de vooraf bevochtigde zeef. Voeg 10 ml koude D-PBS toe aan de lege C-buis en sluit deze. Schud het voorzichtig en breng de suspensie aan op de bijbehorende zeef.
- Gooi de zeefjes weg en sluit de buisjes van 50 ml. Centrifugeer de celsuspensie opnieuw bij 300 x g en 4 °C gedurende 10 min. Zuig daarna het hele supernatans heel voorzichtig op.
4. Puinverwijdering (duur: ongeveer 1,5-2 uur, afhankelijk van het aantal CZS-celsuspensies)
OPMERKING: Weefseldissociatie leidt vaak tot myeline en celresten die de stroomafwaartse analyse kunnen belemmeren. Door een oplossing voor het verwijderen van vuil toe te voegen, kan dit vuil efficiënt uit de suspensie van de CZS-cel worden verwijderd.
- Resuspendeer de celpellet zorgvuldig met 3.100 μL D-PBS voor elke CZS-celsuspensie. Draai niet vortex.
- Als u met meer dan één CZS-celsuspensie werkt, bundel dan maximaal twee CZS-celsuspensies afkomstig van één aandoening of experimentele groep in één buis van 15 ml.
- Voeg 900 μL van de puinverwijderingsoplossing uit de volwassen hersendissociatiekit toe aan één CZS-celsuspensie of 1.800 μL puinverwijderingsoplossing aan twee gepoolde CZS-celsuspensies.
- Keer de buis om en meng de suspensie. Bedek het daarna heel voorzichtig met 4 ml koude D-PBS. Er moet een duidelijk verloop zichtbaar zijn (figuur 2A).
- Centrifugeer de buisjes gedurende 10 minuten bij 3000 x g en 4 °C met volledige acceleratie en zonder rem.
- Als de scheiding plaatsvindt zoals bedoeld, worden er drie fasen gevormd (Figuur 2C). Zuig de twee bovenste fasen volledig op (Figuur 2C-1,2) en gooi ze weg. Het is belangrijk dat er geen myelineresten achterblijven (Figuur 2E).
NOTITIE: Als de gradiënt niet werkte en de cellen dringend nodig zijn, zuig dan de twee bovenste fasen niet af. Vul in plaats daarvan de buis van 15 ml met koude D-PBS tot 15 ml en keer deze meerdere keren om. Centrifugeer opnieuw bij 1000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C met volledige acceleratie en zonder rem. Zuig het supernatans eraf en herhaal de stappen 4.1-4.4. - Vul de buis met koude D-PBS tot 14 ml en sluit deze. Keer de buis krachtig om op de werkbank totdat de celkorrel loskomt van de bodem van de buis. Draai niet vortex.
- Centrifugeer het monster opnieuw bij 1000 x g en 4 °C gedurende 10 min. Stel volledige acceleratie en volledige rem in. Zuig het supernatans voorzichtig en volledig op.
Figuur 2: Do's en Dont's tijdens het verwijderen van puin. (A) Positief voorbeeld voor de gradiënt na het bedekken met 4 ml PBS. De bovenste fase, bestaande uit 4 ml PBS, is duidelijk te onderscheiden van de onderste fase, bestaande uit de CZS-celsuspensie met de oplossing voor het verwijderen van puin. (B) Negatief voorbeeld voor de gradiënt na bekleding met 4 ml PBS. De gradiënt mist een duidelijke scheiding tussen de PBS en de celsuspensie eronder. Een beetje van de PBS wordt in de celsuspensie verspreid. (C) Positief voorbeeld van de gradiënt na centrifugeren. Er zijn drie afzonderlijke fasen te onderscheiden. Er zijn geen myelineresiduen zichtbaar in de bovenste (1) of onderste fase (3) van de gradiënt. De middelste fase bevat alle myeline (2). De celkorrel is zichtbaar aan de onderkant van de buis van 15 ml. (D) Negatief voorbeeld voor de gradiënt na centrifugeren. Er is geen nauwkeurige scheiding tussen de drie fasen mogelijk. Sommige myelineresiduen zijn zichtbaar in de bovenste (1) en onderste fase (3) van de gradiënt. (E) Positief voorbeeld voor de gradiënt na het opzuigen van de twee bovenste fasen. Het resulterende monster bevat alleen de celpellet en een helder supernatans erboven. Er blijven geen myelineresten achter. (F) Negatief voorbeeld voor de helling na het opzuigen van de twee bovenste fasen. Het monster bevat nog enkele myelineresiduen (zwarte pijl). Afkortingen: CZS = centraal zenuwstelsel; PBS = fosfaatgebufferde zoutoplossing Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
5. Verwijdering van rode bloedcellen (duur: ongeveer 1 uur, afhankelijk van het aantal suspensies van CZS-cellen)
OPMERKING: Deze stap voorkomt latere besmetting door rode bloedcellen en zorgt voor een optimale lysis van erytrocyten met minimaal effect op de andere celtypen die uit het CZS-weefsel zijn geïsoleerd. De volgende volumes zijn geïndiceerd voor celsuspensies afgeleid van 100 mg tot 1 g neuronaal weefsel dat overeenkomt met twee volwassen muizenhersenen en ruggenmerg. Als u met meer dan twee CZS-celsuspensies werkt, moet u alle reagentia en de totale volumes dienovereenkomstig opschalen.
- Begin met de bereiding van oplossing voor het verwijderen van rode bloedcellen (RBCRS): per twee gepoolde CZS-celsuspensies. Verdun 100 μL oplossing voor het verwijderen van rode bloedcellen (10x) uit de dissociatiekit voor volwassen hersenen in 900 μL ddH2O om een uiteindelijke verdunning van 1:10 te bereiken.
- Bewaar de RBCRS bij 2-8 °C tot gebruik. Gooi ongebruikte resten aan het eind van de dag weg.
- Resuspendeer de celpellet van maximaal twee CZS-celsuspensies in 1 ml RBCRS. Vermijd vortexen. Incubeer de oplossing gedurende 10 minuten bij 4 °C.
- Voeg 10 ml koude PB-buffer toe aan twee gepoolde celsuspensies. Centrifugeer het monster gedurende 10 minuten bij 300 x g en 4 °C en zuig het supernatans daarna volledig op.
- Resuspendeer elke celpellet uit één CZS-celsuspensie in 80 μL PB-buffer door langzaam op en neer te pipetteren. Gebruik daarom 160 μl om celpellets te resuspenderen die zijn afgeleid van twee CZS-celsuspensies.
- Wanneer u werkt met verschillende CZS-celsuspensies uit dezelfde experimentele toestand, bundel dan al deze celsuspensies.
- Bepaal het celgetal, bijvoorbeeld met behulp van een verbeterde telkamer. De celsuspensies werden gewoonlijk verdund met 1:50 in PB-buffer, gevolgd door een verdere verdunning van 1:10 in 0,4% trypanblauwe oplossing.
6. Protocol voor magnetische kralen bij naïeve en EAE-muizen (duur: ongeveer 1 uur)
- Label de verschillende CZS-celtypen magnetisch met MicroBeads die specifiek zijn voor hun oppervlakte-antigeen. Plaats vervolgens de celsuspensie in de kolom en scheid magnetisch de gelabelde cellen die in de kolom zijn bewaard en de niet-gelabelde cellen die er doorheen lopen.
- Nadat u de kolom uit het magnetische veld hebt verwijderd, spoelt u magnetisch gelabelde cellen uit de kolom in een buis als de positief geselecteerde celfractie.
OPMERKING: De volumes voor het magnetische etiketteringsproces worden berekend voor maximaal 1 x 107 totale cellen. Als er meer cellen worden verkregen, schaalt u alle reagens en de totale volumes dienovereenkomstig op. Het wordt aanbevolen om snel te werken en alleen voorgekoelde oplossingen te gebruiken om het afdekken van antilichamen op het celoppervlak en niet-specifieke celetikettering te voorkomen en om een hoge levensvatbaarheid van de geïsoleerde celpopulaties te garanderen. Het is ook belangrijk om de wasstappen uit te voeren zodra het kolomreservoir leeg is door de PB-buffer toe te voegen zodat de kolommen niet uitdrogen. - Verdeel de gezuiverde onverdunde CZS-celsuspensie in twee fracties voor de volgende isolaties van microglia en oligodendrocyten. De verhouding van beide fracties hangt af van het gewenste celgetal van elk celtype.
OPMERKING: Verdere details (incubatieduur, gedetailleerde protocolstappen, volumes, reagentia en celtellingsmethode) zijn aangegeven in tabel 1.
Tabel 1: Workflow voor de gelijktijdige magnetische etikettering en isolatie van oligodendrocyten en microglia van naïeve muizen en EAE-muizen. Beide celtypen worden geïsoleerd via een positieve selectie. Stappen die in dezelfde rij worden vermeld, worden aangegeven om in één keer te worden uitgevoerd. Afkortingen: CD11b = cycline-afhankelijke kinase 11B; EAE = experimentele auto-immuun encefalomyelitis; FcR = Fc-receptorachtig eiwit; O4 =oligodendrocyt marker O4. Klik hier om deze tabel te downloaden.
7. Protocolwijziging: aanvullende sortering voor de isolatie van microglia in EAE-muizen (duur: ongeveer 1,5-2 uur)
OPMERKING: Bij het werken met EAE-muizen is het noodzakelijk om het op MACS gebaseerde celisolatieprotocol van FACS aan te vullen om andere CD11b+ -celpopulaties dan microglia (bijv. monocyten, macrofagen, natural killer-cellen, granulocyten of dendritische cellen) uit de CD11b+ -celfractie te verwijderen. Anders kan deze stap worden genegeerd.
- Bereid de kleuringsmastermix met 1x PBS aangevuld met CD11b FITC (kloon M1/70, 1:50) en CD45 APC/Cy7 (kloon 30-F11, 1:200). Gebruik 100 μL van de kleuringsmix per 5 x 106 cellen. Draai alle antilichamen voor gebruik.
- Centrifugeer de microgliacelsuspensie bij 300 x g en 4 °C gedurende 10 minuten en zuig het supernatans voorzichtig op.
- Resuspendeer de celpellet met 100 μL van de bereide kleuringsmastermix per 5 x 106 cellen. Incubeer gedurende 15 minuten in het donker bij kamertemperatuur (RT).
- Stop de reactie door 500 μL PBS toe te voegen en centrifugeer het monster opnieuw bij 300 x g en 4 °C gedurende 10 minuten.
- Zuig het supernatans voorzichtig op en resuspendeer de celpellet met 1x PBS aangevuld met 10 μg/ml DNAse om een eindconcentratie van 1 x 107 cellen per ml te bereiken. Bewaar de cellen bij 4 °C totdat het sorteren begint.
- Breng de celsuspensie aan op een zeef van 100 μm die op een nieuwe FACS-buis is geplaatst onmiddellijk voordat u met sorteren begint.
- Stel het debiet in op 1000 gebeurtenissen per seconde en gebruik het mondstuk van 100 μm. Sorteer de gewenste celpopulatie van CD45intCD11bhoge cellen in een nieuwe buis van 15 ml bereid met 1x PBS bij RT.
8. Bereiding van negatieve doorstroming van oligodendrocyten voor de isolatie van neuronen en astrocyten (duur: ongeveer 1 uur)
OPMERKING: De negatieve doorstroming van oligodendrocyten uit stap 6 wordt verzameld voor verdere isolatie van neuronen en astrocyten. Daartoe wordt de celsuspensie in twee delen gesplitst. Door de eerdere isolatie van oligodendrocyten uit de CZS-celsuspensie, wordt besmetting door O4+- cellen geminimaliseerd die anders zou worden waargenomen.
- Centrifugeer de negatieve doorstroming van de oligodendrocyten bij 300 x g en 4 °C gedurende 10 minuten en zuig het supernatans voorzichtig op.
- Resuspendeer de celpellet in 80 μL PB-buffer per gepoolde CZS-celsuspensie die eerder werd gebruikt voor de isolatie van de positieve fractie van de oligodendrocyt.
- Tel de cellen. Voer het tellen uit van cellen waarvan wordt aangenomen dat ze O4 zijn - met behulp van een verbeterde telkamer na verdunning van de celsuspensie 1:50 in PB-buffer, gevolgd door nog eens 1:10 verdunning in 0,4% trypanblauw.
- Splits de gezuiverde onverdunde celsuspensie in twee fracties voor de volgende gelijktijdige isolatie van neuronen en astrocyten. De verhouding van beide fracties hangt af van de voorkeurshoeveelheid van elk celtype.
OPMERKING: Verdere details (incubatieduur, gedetailleerde protocolstappen, volumes, reagentia en celtellingsmethode) zijn aangegeven in tabel 2.
Tabel 2: Workflow voor de gelijktijdige magnetische labeling en isolatie van neuronen en astrocyten van naïeve en EAE-muizen. Beide celtypen zijn geïsoleerd uit de negatieve doorstroming van oligodendrocyten. Astrocyten worden gescheiden als een positieve selectie via anti-ACSA-2 microkorrels, terwijl neuronen worden gezuiverd via biotinylering en uitputting van alle niet-neuronale cellen als een negatieve selectie. Stappen die in dezelfde rij worden vermeld, worden aangegeven om in één keer te worden uitgevoerd. Afkortingen: Anti-ACSA-2 = antigeen-2 op het oppervlak van astrocytcellen; EAE = experimentele auto-immuun encefalomyelitis; FcR = Fc-receptorachtig eiwit; MACS = magnetisch geactiveerde celsortering. Klik hier om deze tabel te downloaden.
9. Zuiverheidsanalyses van de geïsoleerde CZS-residente celtypen (duur: ongeveer 2 uur)
OPMERKING: Het uitvoeren van flowcytometrie van alle vier de geïsoleerde CZS-residente celpopulaties wordt aanbevolen om hun zuiverheid en levensvatbaarheid te meten en te vergelijken. Daarom is het noodzakelijk om alle celtypen te kleuren met een antilichaam dat is gelabeld met fluorofoor. Kleuring van levende/dode cellen wordt uitgevoerd met behulp van een fixeerbare levensvatbaarheidskleurstof (1:10.000).
- Zuiverheidspaneel - extracellulair kleuringsprotocol
- Gebruik 1 x 105 cellen opgelost in 50 μL PBS per kleuring.
- Bereid het kleuringsmastermengsel opgelost in PBS met 2% FCS/2 mM EDTA, bestaande uit de volgende fluorochroom-geconjugeerde monoklonale antilichamen die gericht zijn op celtype-specifieke oppervlaktemarkers: CD11b FITC (kloon 1/70, 1:100)25,26,27,28, Biotine-PE (kloon Bio3-18E7, 1:200)29,30,31,32, ACSA-2 PE-Vio615 (kloon REA-969, 1:200)33,34,35, O4 APC (kloon REA-576, 1:400) en CD45 BV510 (kloon 30-F11, 1:150)36,37. Voeg 1 μg anti-CD16/32 per 1 x 106 cellen toe om de Fc-receptor3 8,39 te blokkeren. Draai alle antilichamen voor gebruik.
- Centrifugeer de celsuspensie gedurende 5 minuten bij 540 x g en 4 °C en zuig het supernatans voorzichtig op.
- Resuspendeer de celpellet in 100 μl van het betreffende mastermengsel en incubeer het monster gedurende 15 minuten bij RT in het donker.
- Was de cellen met 500 μL 1x PBS met 2% FCS/2 mM EDTA en centrifugeer het monster gedurende 5 minuten bij 540 x g en 4 °C.
- Zuig het supernatans op en resuspendeer de celpellet met 70 μL 1x PBS met 2% FCS/2 mM EDTA.
- Draai het monster om de celpellet volledig te dissociëren. Vervolgens is het monster klaar voor flowcytometrie-analyse.
- Zuiverheidspaneel - intracellulair kleuringsprotocol met NeuN
- Gebruik 1 x 105 cellen van elke celpopulatie voor intracellulaire kleuring van NeuN, een neuronspecifieke nucleaire marker 40,41. Dit is een extra manier om levensvatbare neuronen te kleuren.
- Breng 1 x 105 cellen van elke celpopulatie over in een FACS-buis. Voeg 1 ml PBS toe met 2% FCS/2 mM EDTA per buisje. Centrifugeer de buisjes bij 540 x g en 4 °C gedurende 5 min.
- Bereid intussen het mastermengsel opgelost in PBS met 2% FCS/2 mM EDTA, bestaande uit de volgende fluorochroom-geconjugeerde monoklonale antilichamen die zich richten op celtype-specifieke oppervlaktemarkers: CD11b FITC (kloon M1/70, 1:100)25,26,27,28, Biotine-PE (kloon Bio3-18E7, 1:200)29,30,31,32, ACSA-2 PE-Vio615 (kloon REA-969, 1:200)33,34,35, en CD45 BV510 (kloon 30-F11, 1:150)36,37.
- Zuig het supernatans op en resuspendeer de cellen in 100 μl van het bereide mastermengsel en incubeer het monster gedurende 10 minuten bij RT in het donker.
- Was de cellen met 100 μL PBS met 2% FCS/2 mM EDTA en centrifugeer ze opnieuw op 540 x g en 4 °C gedurende 5 min.
- Bereid intussen 200 μl van de fixatie-/permeabilisatieoplossing: Voeg 50 μl van de geconcentreerde voorraad fixatie-/permeabilisatieconcentraat toe aan 150 μl fixatie-/permeabilisatieverdunningsmiddel om een uiteindelijke verdunning van 1:4 te bereiken.
- Zuig het supernatans op en resuspendeer de cellen in 100 μL 1x fixatie-/permeabilisatieoplossing. Incubeer het monster gedurende 30 minuten bij 4 °C.
- Bereid intussen 1 ml 1x permeabilisatie-/wasbuffer door 100 μL van de permeabilisatiebuffervoorraad toe te voegen aan 900 μL ddH2O om een uiteindelijke verdunning van 1:10 te bereiken.
- Was de cellen 1x met 100 μL 1x permeabilisatie/wasbuffer en centrifugeer het monster bij 540 x g en 4 °C gedurende 5 min.
- Bereid intussen nog een mastermix in 1x permeabilisatie/wasbuffer bestaande uit alleen NeuN (NeuN AF647, kloon EPR12763, 1:200) en 1 μg anti-CD16/32 per 106 cellen om de Fc-receptor te blokkeren.
- Aspireer de supernatant. Resuspendeer de gefixeerde en gepermeabiliseerde cellen in 50 μl van het tweede mastermengsel en incubeer gedurende 30 minuten bij 4 °C.
- Was het monster met 100 μL 1x permeabilisatie/wasbuffer en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 540 x g en 4 °C.
- Gooi het supernatans weg en resuspendeer de celpellet in 70 μL PBS met 2% FCS/2 mM EDTA. Vervolgens is het monster klaar voor de flowcytometrische analyse.
- Nadat u het paneel op de flowcytometer hebt ingesteld, verwerft u cellen voor zuiverheidsanalyse met behulp van flowcytometrie-analysesoftware.
10. Statistische analyse
- Voer statistische analyses uit en ontwerp grafieken met een grafisch analyseprogramma. Gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± SEM.
Representative Results
Het huidige protocol biedt de mogelijkheid om alle belangrijke CZS-residente cellen, d.w.z. microglia, oligodendrocyten, astrocyten en neuronen, tegelijkertijd te isoleren van één enkele CZS-replicatie. Dit is belangrijk voor de reductie van het aantal muizen dat nodig is voor dit soort experimenten en om de vergelijkbaarheid van moleculaire en biochemische analyses op cellulair niveau te waarborgen. Als de individuele celtypen worden geïsoleerd uit verschillende CZS-replicaten, kunnen cellulaire interacties niet waarheidsgetrouw in kaart worden gebracht en kunnen mogelijke technische afwijkingen tijdens de isolatieprocessen verdere stroomafwaartse analyses vertekenen. Bovendien zouden moleculaire en biochemische bevindingen van elk celtype niet met elkaar vergelijkbaar zijn, aangezien ze niet zijn afgeleid van dezelfde EAE-context. Een reeds bestaand MACS-protocol dat gebruik maakt van een commercieel systeem/kit werd aangepast om gelijktijdige isolatie van de bovengenoemde celtypen mogelijk te maken.
De isolatie van microglia werd uitgevoerd met behulp van anti-CD11b-microkorrels, oligodendrocyten werden geïsoleerd via anti-O4-microkorrels (tabel 1) en anti-ACSA-2-microkorrels werden gebruikt om astrocyten te isoleren (tabel 2). De isolatie van neuronen daarentegen vertegenwoordigt een negatieve selectie en werd bereikt door biotinylering en magnetische labeling van alle niet-neuronale cellen (Tabel 2). Alle niet-neuronale cellen (bijv. oligodendrocyten, microglia, astrocyten, endotheelcellen en fibroblasten) behalve bloedcellen kunnen magnetisch worden gelabeld met behulp van een biotine-geconjugeerd antilichaam, specifiek gericht tegen een oppervlakte-antigeen dat tot expressie wordt gebracht op deze niet-neuronale cellen (tabel 2). Door uitputting van deze magnetisch gelabelde niet-neuronale cellen kunnen zeer zuivere en levensvatbare neuronale celpopulaties worden gegenereerd 30,42,43.
Er werden twee nieuwe flowcytometriepanels ontworpen voor de zuiverheidsanalyses van de gegenereerde eencellige suspensies. Hier werden celtype-specifieke oppervlakte- en nucleaire markers gebruikt in combinatie met levende/dode celdiscriminatie.
De resulterende celopbrengsten per muis en celtype (Figuur 3A) werden geanalyseerd en leidden tot een gemiddelde van 8. 4 x 105 ± 3 x 104 microglia, 3,23 x 106 ± 1 x 105 oligodendrocyten, 8,6 x 105 ± 2 x 104 astrocyten en 4,5 x 105 ± 1 x 104 neuronen per naïeve muis.
In het kader van het doel om ziektemodellen van neuro-inflammatie te onderzoeken, werd het protocol ook toegepast op een muismodel van EAE. De muizen werden geëuthanaseerd op dag 16 na EAE-inductie die het ziektemaximum vertegenwoordigt. In deze EAE-setting werden ongeveer 2,9 x 106 ± 6,7 x 105 oligodendrocyten, 5,2 x 105 ± 9 x 104 astrocyten en 4,4 x 105 ± 4 x 104 neuronen geïsoleerd. De opbrengst van microgliacellen werd verlaagd tot ongeveer 1,7 x 105 ± 4 x 104 microglia per EAE-muis vanwege de extra celsortering na de MACS-stappen (Figuur 3A).
Na isolatie toonden fenotypische karakteriseringen van de verschillende celpopulaties via flowcytometrie aan dat levensvatbare eencellige suspensies met een zuiverheid van ongeveer 90% voor alle belangrijke CZS-residente celtypen (Figuur 3B) konden worden bereikt. Microglia werden afgeschermd als zijnde CD45intCD11bhoog zoals gedefinieerd in de literatuur 44,45,46,47.
In EAE moesten microglia worden gesorteerd uit alle CD11b+-cellen om ze te onderscheiden van andere CD11b+-immuuncellen zoals monocyten, neutrofielen, natural killer-cellen, granulocyten en macrofagen die tijdens neuro-inflammatie in het CZS immigreren 27,28,48. Daarom werden de microglia gesorteerd als CD45intCD11hoge cellen uit de CD11b+ celsuspensie. De hele sorteerstrategie van microglia is weergegeven in figuur 4. Bij naïeve muizen bedroeg de microgliapopulatie 91,16% van alle levende eencellige cellen (96% van de totale CD11b+-populatie) (Figuur 4A). Bij EAE-muizen bedroeg de microgliapopulatie 46,85% van alle levende eencellige cellen (55% van de totale CD11b+-populatie) (Figuur 4B). Hoewel zowel MACS- als FACS-procedures mechanische belasting toepassen op de afzonderlijke cellen, waren 75,41% ± 8,63% van de gesorteerde gezuiverde microglia levensvatbaar (Figuur 3B).
Astrocyten en neuronen die direct werden geïsoleerd uit de initiële CZS-celsuspensie vertoonden relevante besmetting met oligodendrocyten, wat leidde tot de veronderstelling dat de gelijktijdige isolatie van neuronen en astrocyten uit de negatieve doorstroming van oligodendrocyten deze besmetting zou kunnen voorkomen. Flowcytometrie-analyses bevestigden dat astrocyten geïsoleerd uit de negatieve doorstroming van oligodendrocyten een zuiverheid hadden van 89,23% ± 2,78% en een levensvatbaarheid van 80,56% ± 1,41% aantoonden. Net als bij deze resultaten was de zuiverheid van de neuronen geïsoleerd uit de O4-celfractie 81,25% ± 3,31% en de levensvatbaarheid 83,90% ± 2,61% (Figuur 3B). Deze bevindingen bevestigen ook dat de gelijktijdige isolatie van deze twee celtypen pas na de isolatie van oligodendrocyten geen invloed heeft op de hoeveelheid levensvatbare functionele cellen.
De resultaten met betrekking tot de levensvatbaarheid en zuiverheid van de geïsoleerde eencellige suspensies waren zeer vergelijkbaar bij EAE-muizen in vergelijking met die bij naïeve muizen, wat bevestigt dat dit protocol geschikt is voor gezonde muizen en in de context van EAE (Figuur 3B).
Figuur 3: Celopbrengsten en validatie op basis van flowcytometrie van geïsoleerde CZS-residente cellen. (A) Celopbrengst per muis en celtype na isolatie van CZS-residente cellen in naïeve muizen en EAE-muizen. Staafdiagrammen visualiseren de hoeveelheid celopbrengsten per muis en celtype na de implementatie van het gepresenteerde protocol. Vijf biologische replicaten werden verwerkt voor de resultaten in naïeve muizen en vier biologische replicaten werden geanalyseerd in EAE-muizen. Respectievelijke middelen ± SEM's worden afgebeeld. (B) Overeenkomstige zuiverheids- en levensvatbaarheidsanalyses van de gezuiverde celfracties. Staafdiagrammen geven de levensvatbaarheid en zuiverheid van de resulterende eencellige suspensies aan op basis van hun expressie van celtype-specifieke markers. NeuN werd gebruikt als een celtype-specifieke nucleaire marker voor neuronen. Vijf biologische replicaten werden verkregen en vergeleken voor elk celtype voor zowel gezonde als EAE-muizen. De respectieve middelen ± SEM's worden vermeld. Afkortingen: Anti-ACSA-2 = antigeen-2 op het oppervlak van astrocytcellen; CD11b = cycline-afhankelijke kinase 11B; CD45 = tyrosine-eiwitfosfatase C van het receptortype; CZS = centraal zenuwstelsel; EAE = experimentele auto-immuun encefalomyelitis; MACS = magnetisch geactiveerde celsortering; NeuN =RNA-bindend eiwit fox-1 homoloog 3; O4 = oligodendrocytmarker O4; SEM = standaardfout van het gemiddelde. Dit cijfer is gewijzigd van49. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Poortstrategie voor celsortering van microglia na isolatie van CD11b+ cellen. (A) Poortstrategie bij naïeve en (B) EAE-muizen. De bovenste rij van elk paneel toont de puntplots vóór het sorteren en de onderste rij na het sorteren. Na selectie van levende (SSC-A / FSC-A) en enkele cellen (FCS-H / FSC-W), werd de populatie van CD45intCD11b+ cellen gesorteerd als microgliapopulatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Discussion
Tot nu toe bieden methoden om in het CZS wonende cellen ex vivo in kaart te brengen door massaspectrometrie en RNA-sequencing te combineren, een zeer nauwkeurige cellulaire profilering op het gebied van gezondheid en ziekte, maar vereisen ambitieuze technische kennis en expertise op dit gebied50,51. Verder staan ze geen functionele analyses toe en zijn ze erg duur. Daarnaast bieden microfluïdische brain-on-a-chip-systemen een snelle en betaalbare screening op ziektemechanismen en het testen van nieuwe therapeutische benaderingen met de beperking van celgroei en migratie 52,53,54,55. CZS-organoïden zouden in de toekomst ook een gelijkwaardig alternatief kunnen zijn voor het onderzoek naar cellulaire modellering, intercellulaire verbindingen en interacties tijdens ziekteverloop 56,57,58,59. Fluorescentie- en magnetisch geactiveerde celsortering zijn momenteel echter de meest effectieve methoden om zuivere en levensvatbare eencellige suspensies ex vivo 35,60,61 te genereren. Zelfs als andere gevestigde productieprotocollen voor de isolatie van CZS-residente celtypen vergelijkbaar zijn met betrekking tot de afzonderlijke stappen van de magnetische isolatie en de voorafgaande celdissociatie, zijn ze bedoeld om voor elk celtype afzonderlijk te worden uitgevoerd. Daarentegen integreert het huidige protocol verschillende isolatiemethoden voor elk CZS-resident-celtype in een logische context, zodat ze tegelijkertijd en vanuit één enkele CZS-celsuspensie kunnen worden uitgevoerd (Tabel 1, Tabel 2). Het maakt dus multi-omics-analyses mogelijk van één enkele CZS-celsuspensie en, uiteindelijk, de verkenning van complexe neuronale netwerken. Ook al is het geen must om meerdere weefsels van meerdere dieren samen te voegen om dit protocol uit te voeren, deze pooling zorgt voor een voldoende aantal geïsoleerde cellen voor verdere stroomafwaartse analyse. Het gebruik van verschillende muizen voor de isolatie van de afzonderlijke celtypen zou de mogelijkheid uitsluiten om potentiële cellulaire interacties te analyseren. Daarnaast bespaart het combineren van individuele isolatiemethoden voor de verschillende CZS-celtypen, die allemaal een eerdere CZS-dissociatie volgen, materiaalkosten door één gedissocieerde CZS-celsuspensie te gebruiken voor alle volgende magnetische isolatiestappen. Bovendien wordt een mogelijke technische vooringenomenheid veroorzaakt door het gebruik van verschillende muizen geminimaliseerd.
Een beperking van het protocol zou het bijna exclusieve gebruik van vrouwelijke C57BL/6J-muizen kunnen zijn. Het EAE-immunisatieprotocol is ontworpen en vastgesteld voor vrouwelijke muizen, dus dit celisolatieprotocol werd ook geïmplementeerd in vrouwelijke C57BL/6J-muizen. Desalniettemin werden tijdens de ontwikkeling van dit protocol ook naïeve mannelijke muizen gebruikt, zonder enig effect op het resulterende celaantal of de zuiverheid te herkennen. Een andere beperking beïnvloedt de magnetische celisolatie van neuronen, aangezien er geen specifieke microkorrels bestaan voor de isolatie van neuronen in termen van een positieve selectie. Er werd verondersteld dat een zuivere eencellige suspensie kon worden verkregen via biotine-etikettering en uitputting van alle niet-neuronale cellen (tabel 2). Deze veronderstelling werd geverifieerd door het gebruik van NeuN als een specifieke nucleaire marker voor neuronen, geïntegreerd in het genoemde zuiverheidspaneel voor flowcytometrie. Een andere beperking betreft de isolatie van microglia in EAE-muizen. Hier worden de resulterende celopbrengsten verlaagd in vergelijking met de andere celtypen vanwege de extra sorteerstap na het MACS-protocol. Bovendien zou je kunnen stellen dat sorteren de mechanische belasting van de microglia verhoogt in vergelijking met de andere celpopulaties. Individuele sorteerstrategieën kunnen leiden tot verschillende hoeveelheden celopbrengsten. Als het aantal geïsoleerde cellen minder is dan verwacht of gewenst, wordt aanbevolen om de poortopstelling aan te passen en/of de onderscheid tussen levend en dood te verbeteren.
Een cruciale stap in het protocol is het verwijderen van puin. De gradiënt moet heel langzaam en voorzichtig worden gelaagd om de drie gewenste afzonderlijke fasen te creëren (Figuur 2A). Alleen als de myeline- en andere puinresten in de twee bovenste fasen volledig worden verwijderd (figuur 2E), kunnen zuivere eencellige suspensies worden gegenereerd en kan verdere verontreiniging worden verminderd. Als de resulterende celsuspensies niet zuiver zijn, is dit waarschijnlijk het deel van het protocol dat als eerste moet worden verbeterd, naast de zekerheid van het juiste gebruik van alle microkorrels.
Het verkrijgen van hoge niveaus van zuiverheid en levensvatbaarheid kan een uitdaging zijn in dit soort experimenten. Enkele aanbevelingen voor het oplossen van problemen zijn:
-Werken onder steriele omstandigheden is verplicht om besmetting van de verschillende microbolletjes te voorkomen en herhaald gebruik mogelijk te maken, vooral voor latere teelt.
-Etikettering van elke buis om verwisseling te voorkomen, wordt ten zeerste aanbevolen.
-Vermijd het gebruik van ongekoelde reagentia/buffers. Bewaar alle celsuspensies tijdens het hele experiment op ijs om een hoge levensvatbaarheid te garanderen.
-Houd de tijd tussen de verschillende werkstappen zo kort mogelijk. Er is geen specifiek onderdeel in het protocol waar het pauzeren van het experiment wordt aanbevolen.
-Het is zeer relevant om zich aan de gespecificeerde incubatietijden te houden.
Concluderend biedt dit huidige protocol voor de gelijktijdige isolatie van alle belangrijke CZS-residente celtypen uit één CZS-replicaat de mogelijkheid om complexe neuronale netwerken en neuro-inflammatoire routes ex vivo te analyseren vanuit één CZS-celsuspensie. Zo kunnen CZS-residente cellen worden onderzocht tijdens verschillende stadia van ziekteverloop, bijvoorbeeld tijdens neuro-inflammatie, neurodegeneratie en/of remissie bij EAE. Bovendien kunnen cel-celinteracties en biochemische routes op individueel niveau worden bestudeerd en kan de variabiliteit binnen experimentele groepen worden verminderd. Er is ook de mogelijkheid om fracties van de geïsoleerde CZS-cellen in monoculturen te kweken voor verdere functionele tests en validatie. Al met al biedt dit protocol aanzienlijke vooruitgang die mogelijk van invloed is op preklinische en klinische onderzoeksbenaderingen.
Disclosures
Alle auteurs verklaren geen belangenconflicten te hebben.
Acknowledgments
De figuren zijn gemaakt met Adobe Illustrator (versie 2023) en Servier Medical Art (https://smart.servier.com). Antonia Henes werd ondersteund door de Jürgen Manchot Stiftung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 70 μm cell strainers | Corning, MA, USA | 352350 | CNS tissue dissociation |
| ACSA-2 Antibody, anti-mouse, PE-Vio 615 (clone REA-969) | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany | 130-116-244 | Flow cytometry, store at 4 °C |
| Adult Brain Dissociation Kit, mouse, and rat | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany | 130-107-677 | Tissue dissociation,contains debris and red blood cell removal solutions; prepare aliquots of enzyme A and P upon arrival and store them at -20 °C; store the remaining kit at 4 °C |
| Anti-ACSA-2 MicroBead Kit, mouse | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany | 130-097-678 | MACS of astrocytes, store at 4 °C |
| Anti-mouse CD16/32 antibody | BioLegend, London, UK | 101301 | Flow cytometry, store at 4 °C |
| Anti-O4 MicroBeads, human, mouse, rat | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany | 130-094-543 | MACS of oligodendrocytes, store at 4 °C |
| AstroMACS Separation buffer | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany | 130-091-221 | MACS of astrocytes, store at 4 °C |
| Biotin Antibody, PE (clone Bio3-18E7) | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany | 130-113-853 | Flow cytometry, store at 4 °C |
| BRAND Neubauer counting chamber | Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA | 10195580 | Cell counting |
| Brilliant Violet 510 anti-mouse CD45 Antibody (clone 30-F11) | BioLegend, London, UK | 103137 | Flow cytometry, store at 4 °C |
| CD11b MicroBeads, human, mouse | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany | 130-049-601 | MACS of microglia, store at 4 °C |
| DNAse I, recombinant, Rnase-free | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | 4716728001 | Flow cytometry, store at -20° C |
| D-PBS with Calcium, Magnesium, Glucose, Pyruvat | Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA | 14287080 | Buffer, store at 4 °C |
| D-PBS, without calcium, without magnesium | Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA | 14190250 | Buffer, store at 4 °C |
| eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 780 | Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA | 65-0865-14 | Flow cytometry, store at 4 °C |
| eBioscience Foxp3/Transcription factor staining buffer set | Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA | 00-5523-00 | Flow cytometry, store at 4°C |
| Falcon (15 mL) | Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA | 11507411 | Cell tube |
| Falcon (50 mL) | Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA | 10788561 | Cell tube |
| Falcon Round-Bottom Polystyrene Test Tubes with Cell Strainer Snap Cap, 5 mL | Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA | 08-771-23 | Flow cytometry |
| FcR Blocking Reagent, mouse | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany | 130-092-575 | MACS of oligodendrocytes, store at 4 °C |
| Female C57BL/6J mice | Charles River Laboratories, Sulzfeld, Germany | Active EAE induction | |
| Fetal calf serum (FCS) | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | F2442-50ML | Flow cytometry, store at -5 to -20 °C |
| FITC Rat Anti-CD 11b (clone M1/70) | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | 553310 | Flow cytometry, store at 4 °C |
| Freund’s Complete adjuvant | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | AR001 | Active EAE induction, store at 4 °C |
| GentleMACS C Tubes | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany | 130-093-237 | CNS tissue dissociation |
| GentleMACS Octo Dissociator with Heaters | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany | 130-096-427 | CNS tissue dissociation |
| Graphpad Prism 8.4.3 | Graphpad by Dotmatics | Graphical Analysis | |
| Isoflurane | AbbVie, North Chicago, IL, USA | Active EAE induction, store at 4 °C | |
| Kaluza Analysis Software V2.1.1 | Beckman Coulter, Indianapolis, IN, USA | Flow cytometry analysis | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany | 130-042-401 | MACS |
| MACS BSA Stock Solution | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany | 130-091-376 | PB-buffer |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany | 130-042-303 | MACS |
| MOG35–55 peptide | Charité, Berlin, Germany; alternatives: Genosphere Biotechnologies (Paris, France) or sb-Peptide (Saint Egrève, France) | Active EAE induction, store at -20 °C | |
| Mycobacterium tuberculosis strain H37 Ra | Becton, Dickinson and Company (BD),Franklin Lakes, NJ, USA | Active EAE induction, store at 4 °C | |
| Neuron Isolation Kit, mouse | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany | 130-115-390 | MACS of neurons, store at 4 °C |
| O4 Antibody, anti-human/mouse/rat, APC, (clone REA-576) | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany | 130-119-897 | Flow cytometry, store at 4 °C |
| Pertussis toxin in glycerol | Hooke Laboratories Inc., Lawrence, MA, USA | BT-0105 | Active EAE induction; store at -20 °C |
| pluriStrainer Mini 100 μm | pluriSelect Life Science UG, Leipzig, Sachsen, Germany | 43-10100-40 | Flow cytometry |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany | 130-090-976 | MACS |
| Recombinant Alexa Fluor 647 Anti-NeuN antibody (clone EPR12763) | Abcam, Cambridge, UK | EPR12763 | Flow cytometry, store at -20 °C |
| Stainless Steel Brain Matrices, 1 mm | Ted Pella, Redding, CA, USA | 15067 | CNS tissue dissection |
| Trypan blue solution, 0.4% | Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA | 15250061 | Cell counting |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA | 15575020 | Flow cytometry, store at room temperature |
References
- Trapp, B. D., Nave, K. A. Multiple Sclerosis: An Immune or Neurodegenerative Disorder. Annu Rev Neurosci. 31 (1), 247-269 (2008).
- Stys, P. K., Zamponi, G. W., van Minnen, J., Geurts, J. J. Will the real multiple sclerosis please stand up. Nat Rev Neurosci. 13 (7), 507-514 (2012).
- Korn, T.
- Ward, M., Goldman, M. D. Epidemiology and Pathophysiology of Multiple Sclerosis. CONTINUUM. 28 (4), 988-1005 (2022).
- Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein (MOG35-55) Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 Mice. J Vis Exp. (86), 51275 (2014).
- Bittner, S., et al. The TASK1 channel inhibitor A293 shows efficacy in a mouse model of multiple sclerosis. Exp Neurol. 238 (2), 149-155 (2012).
- Göbel, K., et al. Plasma kallikrein modulates immune cell trafficking during neuroinflammation via PAR2 and bradykinin release. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (1), 271-276 (2019).
- Ballerini, C.
- Birmpili, D., Charmarke Askar, I., Bigaut, K., Bagnard, D. The Translatability of Multiple Sclerosis Animal Models for Biomarkers Discovery and Their Clinical Use. Int J Mol Sci. 23 (19), 11532 (2022).
- Tsatas, O., Ghasemlou, N. Isolation and RNA purification of macrophages/microglia from the adult mouse spinal cord. J Immunol Methods. 477, 112678 (2020).
- Calvo, B., Rubio, F., Fernández, M., Tranque, P. Dissociation of neonatal and adult mice brain for simultaneous analysis of microglia, astrocytes and infiltrating lymphocytes by flow cytometry. IBRO Rep. 8, 36-47 (2020).
- Diaz-Amarilla, P., et al. Isolation and characterization of neurotoxic astrocytes derived from adult triple transgenic Alzheimer's disease mice. Neurochem Int. 159, 105403 (2022).
- Galatro, T. F., Vainchtein, I. D., Brouwer, N., Boddeke, E. W. G. M., Eggen, B. J. L. Isolation of Microglia and Immune Infiltrates from Mouse and Primate Central Nervous System. Methods Mol Biol. 1559, 333-342 (2017).
- Altendorfer, B., et al. Transcriptomic Profiling Identifies CD8+ T Cells in the Brain of Aged and Alzheimer's Disease Transgenic Mice as Tissue-Resident Memory T Cells. J Immunol. 209 (7), 1272-1285 (2022).
- Lanfranco, M. F., Sepulveda, J., Kopetsky, G., Rebeck, G. W. Expression and secretion of apoE isoforms in astrocytes and microglia during inflammation. Glia. 69 (6), 1478-1493 (2021).
- Swire, M., Ffrench-Constant, C.
- Park, J., Koito, H., Li, J., Han, A. Microfluidic compartmentalized co-culture platform for CNS axon myelination research. Biomed Microdevices. 11 (6), 1145-1153 (2009).
- Facci, L., Barbierato, M., Skaper, S. D. Astrocyte/Microglia Cocultures as a Model to Study Neuroinflammation. Methods Mol Biol. 1727, 127-137 (2018).
- Speicher, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G., Pawlowski, M. Generating microglia from human pluripotent stem cells: novel in vitro models for the study of neurodegeneration. Mol Neurodegener. 14 (1), 46 (2019).
- Homayouni Moghadam, F., et al. Isolation and Culture of Embryonic Mouse Neural Stem Cells. J Vis Exp. (141), 58874 (2018).
- Santos, R., et al. Differentiation of Inflammation-Responsive Astrocytes from Glial Progenitors Generated from Human Induced Pluripotent Stem Cells. Stem Cell Reports. 8 (6), 1757-1769 (2017).
- Tcw, J., et al. An Efficient Platform for Astrocyte Differentiation from Human Induced Pluripotent Stem Cells. Stem Cell Reports. 9 (2), 600-614 (2017).
- Miltenyi, S., Müller, W., Weichel, W., Radbruch, A. High gradient magnetic cell separation with MACS. Cytometry. 11 (2), 231-238 (1990).
- Huntemann, N., et al. An optimized and validated protocol for inducing chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in C57BL/6J mice. J Neurosci Methods. 367, 109443 (2022).
- Martin, E., El-Behi, M., Fontaine, B., Delarasse, C. Analysis of Microglia and Monocyte-derived Macrophages from the Central Nervous System by Flow Cytometry. J Vis Exp. (124), 55781 (2017).
- Sarkar, S., et al. Rapid and Refined CD11b Magnetic Isolation of Primary Microglia with Enhanced Purity and Versatility. J Vis Exp. (122), 55364 (2017).
- Rodríguez Murúa, S., Farez, M. F., Quintana, F. J. The Immune Response in Multiple Sclerosis. Annu Rev Pathol. 17, 121-139 (2021).
- Engelhardt, B., Ransohoff, R. M. Capture, crawl, cross: the T cell code to breach the blood-brain barriers. Trends Immunol. 33 (12), 579-589 (2012).
- Elia, G. Biotinylation reagents for the study of cell surface proteins. Proteomics. 8 (19), 4012-4024 (2008).
- Berl, S., et al. Enrichment and isolation of neurons from adult mouse brain for ex vivo analysis. J Neurosci Methods. 283, 15-22 (2017).
- Turvy, D. N., Blum, J. S. Biotin Labeling and Quantitation of Cell-Surface Proteins. Curr Protoc Immunol. 18 (7), (2001).
- Mao, S. Y.
- Kantzer, C. G., et al. Anti-ACSA-2 defines a novel monoclonal antibody for prospective isolation of living neonatal and adult astrocytes. Glia. 65 (6), 990-1004 (2017).
- Batiuk, M. Y., et al. An immunoaffinity-based method for isolating ultrapure adult astrocytes based on ATP1B2 targeting by the ACSA-2 antibody. J Biol Chem. 292 (21), 8874-8891 (2017).
- Pan, J., Wan, J. Methodological comparison of FACS and MACS isolation of enriched microglia and astrocytes from mouse brain. J Immunol Methods. 486, 112834 (2020).
- Donovan, J. A., Koretzky, G. A.
- Hathcock, K. S., Hirano, H., Hodes, R. J. CD45 expression by murine B cells and T cells: Alteration of CD45 isoforms in subpopulations of activated B cells. Immunol Res. 12 (1), 21-36 (1993).
- Balogh, P., Tew, J. G., Szakal, A. K. Simultaneous blockade of Fc? receptors and indirect labeling of mouse lymphocytes by the selective detection of allotype-restricted epitopes on the kappa chain of rat monoclonal antibodies. Cytometry. 47 (2), 107-110 (2002).
- Becerril-García, M. A., et al. Langerhans Cells From Mice at Birth Express Endocytic- and Pattern Recognition-Receptors, Migrate to Draining Lymph Nodes Ferrying Antigen and Activate Neonatal T Cells in vivo. Front Immunol. 11, 744 (2020).
- Dent, M. A., Segura-Anaya, E., Alva-Medina, J., Aranda-Anzaldo, A. NeuN/Fox-3 is an intrinsic component of the neuronal nuclear matrix. FEBS Lett. 584 (13), 2767-2771 (2010).
- Duan, W., et al. Novel Insights into NeuN: from Neuronal Marker to Splicing Regulator. Mol Neurobiol. 53 (3), 1637-1647 (2016).
- Monteiro, R., Sivasubramanian, M. K., Balasubramanian, P., Subramanian, M. Obesity-Induced Sympathoexcitation is Associated with Glial Senescence in the Brainstem. FASEB J. 34 (S1), 1-1 (2020).
- Li, S., Chang, L., Teissie, J. Electroporation protocols: mircroorganism, mammalian system, and nanodevice. , Humana Press, New York. (2020).
- Kettenmann, H., Hanisch, U. K., Noda, M., Verkhratsky, A.
- Haage, V., et al. Comprehensive gene expression meta-analysis identifies signature genes that distinguish microglia from peripheral monocytes/macrophages in health and glioma. Acta Neuropathol Commun. 7 (1), 20 (2019).
- Kosior, N., Petkau, T. L., Connolly, C., Lu, G., Leavitt, B. R. Isolating cells from adult murine brain for validation of cell-type specific cre-mediated deletion. J Neurosci Methods. 328, 108422 (2019).
- Jurga, A. M., Paleczna, M., Kuter, K. Z. Overview of General and Discriminating Markers of Differential Microglia Phenotypes. Front Cell Neurosci. 14, 198 (2020).
- Man, S., Ubogu, E. E., Ransohoff, R. M. Inflammatory Cell Migration into the Central Nervous System: A Few New Twists on an Old Tale. Brain Pathol. 17 (2), 243-250 (2007).
- Schroeter, C. B., et al. One Brain-All Cells: A Comprehensive Protocol to Isolate All Principal CNS-Resident Cell Types from Brain and Spinal Cord of Adult Healthy and EAE Mice. Cells. 10 (3), 651 (2021).
- Sankowski, R., et al. Mapping microglia states in the human brain through the integration of high-dimensional techniques. Nate Neurosci. 22 (12), 2098-2110 (2019).
- Brennan, F. H., et al. Microglia coordinate cellular interactions during spinal cord repair in mice. Nat Commun. 13 (1), 4096 (2022).
- Enright, H. A., et al. Functional and transcriptional characterization of complex neuronal co-cultures. Sci Rep. 10 (1), 11007 (2020).
- Mofazzal Jahromi, M. A., et al. Microfluidic Brain-on-a-Chip: Perspectives for Mimicking Neural System Disorders. Mol Neurobiol. 56 (12), 8489-8512 (2019).
- Chin, E., Goh, E.
- Miccoli, B., Braeken, D., Li, Y. E. Brain-on-a-chip Devices for Drug Screening and Disease Modeling Applications. Curr Pharm Des. 24 (45), 5419-5436 (2019).
- Giandomenico, S. L., et al. Cerebral organoids at the air-liquid interface generate diverse nerve tracts with functional output. Nat Neurosci. 22 (4), 669-679 (2019).
- Pellegrini, L., et al. Human CNS barrier-forming organoids with cerebrospinal fluid production. Science. 369 (6500), eaaz5626 (2020).
- Chhibber, T., et al. CNS organoids: an innovative tool for neurological disease modeling and drug neurotoxicity screening. Drug Discov Today. 25 (2), 456-465 (2020).
- Tang, X. Y., et al. Human organoids in basic research and clinical applications. Signal Transduct TargetTher. 7 (1), 168 (2022).
- Sutermaster, B. A., Darling, E. M. Considerations for high-yield, high-throughput cell enrichment: fluorescence versus magnetic sorting. Sci Rep. 9 (1), 227 (2019).
- Doughty, D., et al. Development of a novel purification protocol to isolate and identify brain microglia. Exp Biol Med. 247 (16), 1433-1446 (2022).
