Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Samtidig isolering av hovedcelletyper i sentralnervesystemet fra voksne autoimmune encefalopatimus

Published: October 6, 2023 doi: 10.3791/65735
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 2, 1, *1, 1
1Department of Neurology, Medical Faculty, Heinrich Heine University Duesseldorf, 2Department of Neurology, Institute of Translational Neurology, University Hospital Muenster
* These authors contributed equally

Summary

Hittil er protokoller for samtidig isolering av alle de viktigste celletypene i sentralnervesystemet fra samme mus et udekket behov. Protokollen viser en prosedyre som kan brukes i naive og eksperimentelle autoimmune encefalomyelittmus for å undersøke komplekse cellulære nettverk under nevroinflammasjon og samtidig redusere de nødvendige musetallene.

Abstract

Eksperimentell autoimmun encefalomyelitt (EAE) er den vanligste murinmodellen for multippel sklerose (MS) og brukes ofte til å ytterligere belyse den fortsatt ukjente etiologien til MS for å utvikle nye behandlingsstrategier. Myelinoligodendrocyttglykoproteinpeptid 35-55 (MOG35-55) EAE-modellen gjengir et selvbegrensende monofasisk sykdomsforløp med stigende lammelse innen 10 dager etter immunisering. Musene undersøkes daglig ved hjelp av et klinisk skåringssystem. MS drives av ulike patomekanismer med et spesifikt temporalt mønster, og undersøkelsen av rollen til celletyper bosatt i sentralnervesystemet (CNS) under sykdomsprogresjon er derfor av stor interesse. Den unike egenskapen til denne protokollen er samtidig isolering av alle viktigste CNS-residente celletyper (mikroglia, oligodendrocytter, astrocytter og nevroner) som gjelder hos voksne EAE og friske mus. Dissosiasjonen av hjernen og ryggmargen fra voksne mus etterfølges av magnetisk aktivert cellesortering (MACS) for å isolere mikroglia, oligodendrocytter, astrocytter og nevroner. Flowcytometri ble brukt til å utføre kvalitetsanalyser av de rensede encellede suspensjonene som bekreftet levedyktighet etter celleisolering og indikerte renheten til hver celletype på ca. 90 %. Avslutningsvis tilbyr denne protokollen en presis og omfattende måte å analysere komplekse cellulære nettverk i sunne og EAE-mus. Videre kan antallet nødvendige mus reduseres betydelig ettersom alle fire celletyper er isolert fra de samme musene.

Introduction

Multippel sklerose (MS) er en kronisk inflammatorisk autoimmun sykdom i sentralnervesystemet (CNS) preget av demyelinisering, aksonal skade, gliose og nevrodegenerasjon. Til tross for mange forskningstilnærminger på dette feltet, er patofysiologien til MS fortsatt ikke fullt ut forstått 1,2,3,4. Den vanligste dyremodellen for å undersøke MS er myelinoligodendrocytt glykoproteinpeptid 35-55 (MOG35-55)-indusert eksperimentell autoimmun encefalomyelitt (EAE) som deler mange av sine kliniske og patofysiologiske egenskaper 5,6,7,8,9 . Den er basert på immunsystemets respons mot CNS-spesifikke antigener som fører til betennelse, demyelinisering og nevroaksonal degenerasjon. Eksperimentell autoimmun encefalomyelitt (EAE) er en egnet modell for undersøkelse av nevroinflammatoriske veier og signalkaskader funnet ved MS.

Nåværende behandlingsalternativer for MS er bare delvis effektive og fokuserer primært på den første inflammatoriske fasen av sykdommen. Imidlertid synes den neurodegenerative komponenten av MS å være den største utfordringen for langsiktige terapeutiske tilnærminger. Derfor er reproduserbare og presise celleisolasjonsprotokoller nødvendig for å undersøke molekylære og cellulære mekanismer i autoimmune sykdommer på en omfattende måte. Selv om noen protokoller for isolering av en enkelt celletype eksisterer 10,11,12,13,14,15, er det et udekket behov for samtidig isolering av flere CNS-residente cellepopulasjoner samtidig. Tidligere protokoller for isolering av CNS-residente celler mangler å bevare cellulær funksjonalitet og renhet, noe som resulterer i samdyrking med naboceller 16,17,18 eller uegnethet for komplekse analyser av intracellulære nettverk ex vivo 19,20,21,22.

Målet med denne protokollen var å etablere en reproduserbar og omfattende metode for samtidig isolering av rene levedyktige enkeltcellesuspensjoner av alle de viktigste CNS-residente celletypene som er anvendelige hos voksne friske og EAE-mus. De ulike celletypene ble isolert ved hjelp av magnetisk aktivert cellesortering (MACS)23. Celleseparasjonen kan oppnås enten ved positivt utvalg, dvs. magnetisk merking av celletypespesifikke overflatemarkører, eller ved negativ seleksjon via biotinylering og uttømming av alle uønskede celler. Flowcytometri ble anvendt for å sikre en renhet på over 90 % og en levedyktighet på minst 80 % av de isolerte encellede suspensjonene.

Avslutningsvis var hovedmålet å etablere en protokoll for samtidig isolering av alle hoved CNS-residente celletyper som et allsidig verktøy for undersøkelse av nevroinflammatoriske veier som tilbyr en omfattende og presis analyse av komplekse cellulære nettverk og biokjemiske signalkaskader hos friske og EAE-mus.

Protocol

Alle EAE-eksperimenter ble indusert hos hunnmus C57BL/6J i en alder av 10-12 uker og godkjent av lokale myndigheter (Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz Nordrhein-Westfalen). Overholdelse av den tyske og EUs dyrevernlov ble også sikret når som helst av forsøkene. Alle musene ble holdt under individuelt ventilerte bur dyrehus.

MERK: Følgende reagensvolumer refererer til en voksen murin hjerne og ryggmarg, som kalles CNS-cellesuspensjon i det følgende og veier ca. 20 mg til 500 mg. Hvis dissosiasjon av mer enn én CNS-cellesuspensjon planlegges, må alle reagensvolumer og materialer skaleres opp tilsvarende. Det anbefales å lagre Dulbeccos fosfatbufrede saltvann (D-PBS; 1x) med kalsium og magnesium, supplert med 1 g/l glukose og 36 mg/l natriumpyruvat) kontinuerlig på is under hele forsøket. Hvis celledyrking er planlagt etterpå, utfør alle trinnene under sterile forhold ved bruk av hetter. Ellers trenger ingen av følgende protokollseksjoner utføres under en hette. Oppbevar bufferne på is. Bruk bare forhåndskjølte løsninger og unngå virvel gjennom hele eksperimentet. Se figur 1 for generell arbeidsflyt.

Figure 1
Figur 1 Arbeidsflyt for samtidig isolering av oligodendrocytter, mikroglia, astrocytter og nevroner hos naive og EAE-mus. De første trinnene i arbeidsflyten er de samme for både naive og EAE-mus. Hvis det er ønskelig å arbeide med en EAE-replikat, må EAE-induksjon utføres på forhånd (1). Kort fortalt starter protokollen med disseksjon (2) og dissosiasjon (3) av murine hjerne og ryggmarg etterfulgt av fjerning av debris (4) og røde blodlegemer (5). Deretter splittes den resulterende rensede CNS-cellesuspensjonen i to fraksjoner for samtidig isolering av oligodendrocytter og mikroglia via MACS (6). Mikroglia påvises via anti-CD11b mikroperler, mens oligodendrocytter isoleres ved hjelp av anti-O4 mikroperler (positive seleksjoner). Fra den negative gjennomstrømningen av oligodendrocyttene (8) isoleres astrocytter via anti-ACSA-2 mikroperler (positivt utvalg) og nevroner ved biotinmerking og uttømming av alle ikke-nevronale celler (negativt utvalg). I EAE-mus følges isoleringen av CD11b + -celler av fluorescensaktivert cellesortering av CD45intCD11bhøye celler for å eliminere andre CD11b + immunceller som makrofager, dendrittiske celler, monocytter, granulocytter og naturlige dreperceller som er kjent for å delta i nevroinflammasjonsprosesser under EAE-kurset (7) 27,28,48. Etter isolering av de ulike CNS-residente celletypene kan man gjøre renhetsanalyser (9). Forkortelser: Abs = antistoffer; ACSA-2 = astrocytcelleoverflateantigen-2; CD11b = syklinavhengig kinase 11B; CD45 = reseptor-type tyrosin-protein fosfatase C; CNS = sentralnervesystemet; EAE = eksperimentell autoimmun encefalomyelitt; MACS = magnetisk aktivert cellesortering; O4 = oligodendrocyttmarkør O4. Dette tallet er endret fra49. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

1. Induksjon av aktiv EAE

  1. Fremstilling av reagenser
    1. Ved celleseparasjon: Klargjør PB-bufferen og oppbevar den ved 2-8 °C i maksimalt 1 uke. For å tilberede stamoppløsning, tilsett 475 ml 1x PBS uten tilskudd (pH 7,2) + 25 ml 0,5% bovint serumalbumin (BSA). Bruk en 1:20 fortynning klargjort i BSA.
    2. For flowcytometri og fluorescensaktivert cellesortering (FACS): Klargjør FACS-bufferen, PBS med 2 % kalveserum (FCS) og 2 mM EDTA, og oppbevar den ved 2-8 °C. For å forberede, legg til 500 ml 1x PBS uten kosttilskudd og 10 ml FCS + 2 ml EDTA (fra 0,5 M EDTA-lager)
    3. Utføre immunisering i henhold til protokollen fra Bittner et al. 5. Kort sagt, indusere EAE ved subkutan injeksjon av en emulsjon inneholdende 200 μg MOG35-55 peptid og 200 μL komplett Freuds adjuvans inkludert 200 μg Mycobacterium tuberculosis.
    4. Bedøv musen med 2% isofluran ved å bruke et anestesikammer med isofluran fordamper. Bruk veterinærsalve på dyrets øyne for å forhindre tørrhet under anestesi.
    5. Etter 2 timer, injiser en intraperitoneal injeksjon av 100 ng kikhostetoksin (PTx) oppløst i 100 μL 1x PBS i henhold til protokollen fra Huntemann et al.24. Gjenta PTx-injeksjonen på dag 2 etter immunisering.
      FORSIKTIG: Observer hvert dyr til det har gjenvunnet tilstrekkelig bevissthet til å opprettholde sternal hvile. Mus som har gjennomgått injeksjonsprosedyrene, blir ikke returnert til selskapet til de andre musene før de har fullstendig gjenopprettet. For Mycobacterium tuberculosis og PTx: Unngå innånding, inntak og kontakt med hud og øyne. Mycobacterium tuberculosis er en aktivator av det medfødte immunsystemet. PTx har mange biologiske effekter.
    6. Overvåk EAE-progresjon daglig, utført av to blindede etterforskere som overvåker vekten og undersøker musene klinisk.
    7. For dette formålet var følgende skåringssystem grad 0-ingen kliniske tegn på EAE, grad 1- delvis haleparese, grad 2-komplett haleparese, grad 3-moderat svakhet i bakbenet, grad 4-komplett svakhet i bakbenet og ataktisk gange, grad 5-mild paraparese, grad 6-paraparese, grad 7-paraplegi, grad 8-tetraparese, grad 9-kvadriplegi, og grad 10-død.
    8. Bruk følgende eksklusjonskriterier for videre deltakelse i eksperimentets kliniske score > 7 eller et vekttap som overstiger 20 % av den opprinnelige kroppsvekten.
    9. For disseksjon av hjernen og ryggmargen, avlive EAE-mus på dag 16 etter EAE-induksjon som representerer sykdomsmaksimum.

2. CNS vevspreparat (Varighet: ca. 10 min per mus)

  1. Etter å ha ofret mus med karbondioksid, start med transkardial perfusjon av hver mus med 20 ml 1x PBS. Gjenta perfusjonen igjen med 20 ml 1x PBS.
  2. Plasser musen i den bakre posisjonen og fest lemmer med kanyler. Påfør 75% etanol på dyrets forside. Ytterligere sterilitetstiltak er ikke nødvendig på dette tidspunktet.
  3. Åpne magen og brystkassen ved å lage en langsgående del gjennom huden og fascia ved hjelp av en saks.
  4. Klipp ribbeina sideveis og brett opp brystkassen for å få fri tilgang til hjertet. Fest thorax brettet oppover med kanyler.
  5. Åpne høyre atrium ved hjelp av saks. Påfør 20 ml 1x PBS i venstre ventrikkel med en kanyle for å skylle ut blodet gjennom det snittede høyre atriumet.
  6. Eksponer hodeskallen ved å kutte huden på toppen av murinhodet via en langsgående seksjon og skift huden rundt hodet ved hjelp av en tang. Snitt skallen ved hjelp av en saks langs sagittal suturen.
  7. Sett spissen av en tang langs snittlinjen for å knekke opp kalotten. Fjern gjenværende deler av kalotten med tang slik at hjernen er helt eksponert.
  8. Fjern hjernen forsiktig og legg den inn i en murine hjernematrise. Skjær hjernen i 1 mm tykke sagittale skiver ved hjelp av et barberblad.
  9. Klipp vertebral kolonnen ved hjelp av saks like over hoftekammen slik at sprøyten kan settes inn i ryggraden.
    MERK: Den enkleste måten å fjerne ryggmargen på er å skylle den ut av ryggraden med PBS. Ellers må vertebralbuene åpnes individuelt med saks og deretter kan ryggmargen fjernes.
  10. Skyll ryggmargen ut av spinalkanalen fra kaudal til kranial ved å bruke en 20 ml sprøyte med en 20G nål inneholdende 1x PBS. Klipp ryggmargen i 0,5 cm lange segmenter ved hjelp av en skalpell.
  11. Oppbevar hver CNS-cellesuspensjon bestående av hjerne og tilhørende ryggmarg i en separat petriskål per mus fylt med ca. 3 ml kald D-PBS. Oppbevar oppvasken på is til videre behandling.

3. CNS-vevsdissosiasjon (varighet: ca. 1-1,5 timer avhengig av antall CNS-cellesuspensjoner)

MERK: Nevralvev fra voksne mus dissosieres ved å kombinere mekanisk dissosiasjon med enzymatisk nedbrytning av den ekstracellulære matrisen. Dermed forblir den strukturelle integriteten, og cellesuspensjonen kan brukes til ytterligere celleisolasjonsprosedyrer.

  1. Klargjør passende volum av enzymblanding 1 bestående av 50 μL enzym P og 1 900 μL buffer Z per CNS-cellesuspensjon. Begge reagensene tilhører det voksne hjernedissosiasjonssettet.
  2. Klargjør riktig volum enzymblanding 2 bestående av 10 μL enzym A og 20 mikrol buffer Y per CNS-cellesuspensjon. Begge reagensene tilhører det voksne hjernedissosiasjonssettet.
  3. Overfør 1,950 μL enzymblanding 1 til C-rør og tilsett vevsbitene av en CNS-cellesuspensjon etterpå. Bruk ett C-rør per mus.
  4. Tilsett 30 μL enzymblanding 2 til hvert C-rør. Lukk C-rørene tett og fest dem opp ned på hylsen til celledissosiatoren med varmeovner.
  5. Kjør det aktuelle programmet som heter 37C_ABDK_01 (tar 30 min). Observer minst de første 5 minuttene av programmet for å sikre at alle rørene svinger med samme hastighet. Forekomsten av feil under kjøringen er mulig. Gå deretter videre til trinn 6.
  6. I de siste 2 minuttene av programmet, plasser en 70 μm sil på et 50 ml rør for hver dissosiert CNS-cellesuspensjon. Forfukt disse silene med 2 ml D-PBS.
  7. Etter avslutning av programmet, fest C-rørene fra dissosiatoren og legg dem i en sentrifuge. Sentrifuger prøvene ved 300 x g og 4 °C i 1 min for å samle prøven i bunnen av røret.
  8. Suspender prøven og påfør den på den fuktede silen. Tilsett 10 ml kald D-PBS til det tomme C-røret og lukk det. Rist den forsiktig og påfør suspensjonen på den tilsvarende silen.
  9. Kast silene og lukk 50 ml rørene. Sentrifuger cellesuspensjonen igjen ved 300 x g og 4 °C i 10 minutter. Etterpå aspirerer du hele supernatanten veldig nøye.

4. Fjerning av rusk (Varighet: Ca. 1,5-2 timer avhengig av antall CNS-cellesuspensjoner)

MERK: Vev dissosiasjon fører ofte til myelin og celleavfall som kan svekke nedstrøms analyse. Ved å legge til en løsning for fjerning av rusk, kan dette rusket effektivt fjernes fra CNS-cellesuspensjonen.

  1. Resuspender cellepelleten forsiktig med 3,100 μL D-PBS for hver CNS-cellesuspensjon. Ikke virvel.
  2. Hvis du arbeider med mer enn én CNS-cellesuspensjon, basseng maksimalt to CNS-cellesuspensjoner avledet fra en tilstand eller eksperimentell gruppe i ett 15 ml rør.
  3. Tilsett 900 μL av ruskfjerningsløsningen fra det voksne hjernedissosiasjonssettet til en CNS-cellesuspensjon eller 1,800 μL ruskfjerningsløsning til to samlede CNS-cellesuspensjoner.
  4. Snu røret og bland suspensjonen. Etterpå overlapper du den veldig forsiktig med 4 ml kald D-PBS. En tydelig gradient skal være synlig (figur 2A).
  5. Sentrifuger rørene i 10 minutter ved 3000 x g og 4 °C med full akselerasjon og ingen brems.
  6. Hvis separasjonen skjer som tiltenkt, dannes tre faser (figur 2C). Aspirer de to øverste fasene helt (figur 2C-1,2) og kast dem. Det er viktig at det ikke blir etterlatt myelinrester (figur 2E).
    MERK: Hvis gradienten ikke fungerte og cellene trengs raskt, må du ikke suge av de to øverste fasene. Fyll i stedet opp 15 ml røret med kald D-PBS opp til 15 ml og inverter flere ganger. Sentrifuger igjen ved 1000 x g i 10 minutter ved 4 °C med full akselerasjon og ingen brems. Sug av supernatanten og gjenta trinn 4.1- 4.4.
  7. Fyll opp røret med kald D-PBS opp til 14 ml og lukk det. Snu røret kraftig på arbeidsbenken til cellepelleten løsner fra bunnen av røret. Ikke virvel.
  8. Sentrifuger prøven igjen ved 1000 x g og 4 °C i 10 minutter. Sett full akselerasjon og full brems. Aspirer supernatanten nøye og fullstendig.

Figure 2
Figur 2: Gjør og ikke gjør under fjerning av rusk. (A) Positivt eksempel på gradienten etter overlegg med 4 ml PBS. Den øvre fasen bestående av 4 ml PBS kan tydelig skilles fra den nedre fase bestående av CNS-cellesuspensjonen med ruskfjerningsløsningen. (B) Negativt eksempel på gradienten etter overlegg med 4 ml PBS. Gradienten mangler en klar separasjon mellom PBS og cellesuspensjonen nedenfor. Litt av PBS er diffundert inn i cellesuspensjonen. (C) Positivt eksempel på gradienten etter sentrifugering. Tre separate faser kan enkelt skilles. Ingen myelinrester er synlige i øvre (1) eller nedre fase (3) av gradienten. Den midterste fasen inneholder alt myelinet (2). Cellepelleten er synlig i bunnen av 15 ml røret. (D) Negativt eksempel på gradienten etter sentrifugering. Det er ingen nøyaktig separasjon mellom de tre fasene mulig. Noen myelinrester er synlige i øvre (1) og nedre fase (3) av gradienten. (E) Positivt eksempel på gradienten etter aspirasjon av de to øverste fasene. Den resulterende prøven inneholder bare cellepelleten og en klar supernatant ovenfor. Ingen myelinrester blir etterlatt. (F) Negativt eksempel på gradienten etter aspirasjon av de to øverste fasene. Prøven inneholder fortsatt noen myelinrester (svart pil). Forkortelser: CNS = sentralnervesystemet; PBS = fosfatbufret saltvann Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

5. Fjerning av røde blodlegemer (Varighet: ca. 1 time avhengig av antall CNS-cellesuspensjoner)

MERK: Dette trinnet forhindrer senere kontaminering av røde blodlegemer og sikrer en optimal lysering av erytrocytter med minimal effekt på de andre celletypene isolert fra CNS-vevet. Følgende volumer er indisert for cellesuspensjoner avledet fra 100 mg til 1 g nevronvev tilsvarende to voksne musehjerner og ryggmarger. Hvis du arbeider med mer enn to CNS-cellesuspensjoner, skaler du opp alle reagenser og totale volumer tilsvarende.

  1. Start med fremstilling av oppløsning av røde blodlegemer fjerningsløsning (RBCRS): per to samlede CNS-cellesuspensjoner. Fortynn 100 mikrol oppløsning av røde blodlegemer (10x) fra dissosiasjonssettet for voksne hjerner i 900 mikrol ddH2O for å nå en endelig fortynning på 1:10.
  2. Oppbevar RBCRS ved 2-8 °C inntil bruk. Kast ubrukte rester på slutten av dagen.
  3. Resuspender cellepelleten på opptil to CNS-cellesuspensjoner i 1 ml RBCR. Unngå vortexing. Inkuber oppløsningen i 10 minutter ved 4 °C.
  4. Tilsett 10 ml kald PB-buffer til to sammenslåtte cellesuspensjoner. Sentrifuger prøven ved 300 x g og 4 °C i 10 minutter og aspirer supernatanten helt etterpå.
  5. Resuspender hver cellepellet fra en CNS-cellesuspensjon i 80 mikrol PB-buffer ved å pipettere sakte opp og ned. Bruk derfor 160 μL til å resuspendere cellepellets avledet fra to CNS-cellesuspensjoner.
  6. Når du arbeider med flere CNS-cellesuspensjoner fra samme eksperimentelle tilstand, slå sammen alle disse cellesuspensjonene.
  7. Bestem antall celler, for eksempel ved hjelp av et forbedret tellekammer. Cellesuspensjonene ble vanligvis fortynnet 1:50 i PB-buffer, etterfulgt av en ytterligere fortynning på 1:10 i 0,4 % trypanblå oppløsning.

6. Magnetisk perleprotokoll i naive og EAE-mus (Varighet: Ca. 1 time)

  1. Merk de forskjellige CNS-celletypene magnetisk med mikroperler som er spesifikke for overflateantigenet. Deretter plasserer du cellesuspensjonen i kolonnen og magnetisk separerte merkede celler som beholdes i kolonnen og umerkede celler som går gjennom.
  2. Etter å ha fjernet kolonnen fra magnetfeltet, skyll ut magnetisk merkede celler fra kolonnen inn i et rør som den positivt valgte cellefraksjonen.
    MERK: Volumene for den magnetiske merkingsprosessen beregnes for opptil 1 x 107 celler totalt. Hvis flere celler oppnås, skaler du opp alt reagens og totalt volum tilsvarende. Det anbefales å arbeide raskt og bare bruke forkjølte løsninger for å forhindre kapping av antistoffer på celleoverflaten og ikke-spesifikk cellemerking, samt for å sikre høy levedyktighet av de isolerte cellepopulasjonene. Det er også viktig å utføre vasketrinnene så snart kolonnereservoaret er tomt ved å legge til PB-bufferen slik at kolonnene ikke tørker ut.
  3. Del den rensede, ufortynnede CNS-cellesuspensjonen i to fraksjoner for følgende isoleringer av mikroglia og oligodendrocytter. Forholdet mellom begge fraksjonene avhenger av ønsket celletall for hver celletype.
    MERK: Ytterligere detaljer (inkubasjonsvarighet, detaljerte protokolltrinn, volumer, reagenser og celletellingsmetode) er angitt i tabell 1.

Tabell 1: Arbeidsflyt for samtidig magnetisk merking og isolering av oligodendrocytter og mikroglia fra naive og EAE-mus. Begge celletyper isoleres via et positivt utvalg. Trinn som er oppført i samme rad, angis for å utføres samtidig. Forkortelser: CD11b = syklinavhengig kinase 11B; EAE = eksperimentell autoimmun encefalomyelitt; FcR = Fc-reseptorlignende protein; O4 =oligodendrocyttmarkør O4. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

7. Protokollendring: tilleggssortering for isolering av mikroglia hos EAE-mus (Varighet: Ca. 1,5-2 timer)

MERK: Når du arbeider med EAE-mus, er det nødvendig å komplementere den MACS-baserte celleisolasjonsprotokollen fra FACS for å fjerne andre CD11b+ -cellepopulasjoner enn mikroglia (f.eks. monocytter, makrofager, naturlige drepeceller, granulocytter eller dendrittiske celler) fra CD11b+ -cellefraksjonen. Ellers kan dette trinnet ignoreres.

  1. Forbered fargemasterblandingen som inneholder 1x PBS supplert med CD11b FITC (klon M1/70, 1:50) og CD45 APC/Cy7 (klon 30-F11, 1:200). Bruk 100 μL av fargemasterblandingen per 5 x 106 celler. Vortex alle antistoffer før bruk.
  2. Sentrifuger mikrogliacellesuspensjonen ved 300 x g og 4 °C i 10 minutter og aspirer supernatanten forsiktig.
  3. Resuspender cellepelleten med 100 μL av den tilberedte fargemasterblandingen per 5 x 106 celler. Inkuber i 15 minutter i mørket ved romtemperatur (RT).
  4. Stopp reaksjonen ved å tilsette 500 mikrol PBS og sentrifuger prøven igjen ved 300 x g og 4 °C i 10 minutter.
  5. Aspirer supernatanten forsiktig og resuspender cellepelleten med 1x PBS supplert med 10 μg / ml DNAse for å nå en endelig konsentrasjon på 1 x 107 celler per ml. Oppbevar cellene ved 4 °C til sorteringen starter.
  6. Påfør cellesuspensjonen på en 100 μm sil plassert på et nytt FACS-rør umiddelbart før du begynner med sortering.
  7. Sett strømningshastigheten til 1000 hendelser per sekund og bruk 100 μm dysen. Sorter ønsket cellepopulasjon av CD45intCD11bhøye celler i et nytt 15 ml rør fremstilt med 1x PBS ved RT.

8. Fremstilling av negativ gjennomstrømning av oligodendrocytter for isolering av nevroner og astrocytter (Varighet: Ca. 1 time)

MERK: Den negative gjennomstrømningen av oligodendrocytter fra trinn 6 samles for ytterligere isolering av nevroner og astrocytter. Til dette formål er cellesuspensjonen delt inn i to deler. På grunn av den tidligere isoleringen av oligodendrocytter fra CNS-cellesuspensjonen, minimeres forurensning av O4 + -celler som ellers ville bli observert.

  1. Sentrifugere den negative gjennomstrømningen av oligodendrocyttene ved 300 x g og 4 °C i 10 minutter og aspirer supernatanten forsiktig.
  2. Resuspender cellepelleten i 80 mikrol PB-buffer per samlet CNS-cellesuspensjon som tidligere ble brukt til isolering av den positive oligodendrocyttfraksjonen.
  3. Tell cellene. Utfør telling av celler antatt å være O4- ved hjelp av et forbedret tellekammer etter fortynning av cellesuspensjonen 1:50 i PB-buffer etterfulgt av ytterligere 1:10 fortynning i 0,4% trypanblått.
  4. Del den rensede ufortynnede cellesuspensjonen i to fraksjoner for følgende samtidige isolering av nevroner og astrocytter. Forholdet mellom begge fraksjonene avhenger av den foretrukne mengden av hver celletype.
    MERK: Ytterligere detaljer (inkubasjonsvarighet, detaljerte protokolltrinn, volumer, reagenser og celletellingsmetode) er angitt i tabell 2.

Tabell 2: Arbeidsflyt for samtidig magnetisk merking og isolering av nevroner og astrocytter fra naive og EAE-mus. Begge celletyper er isolert fra den negative gjennomstrømningen av oligodendrocytter. Astrocytter separeres som et positivt utvalg via anti-ACSA-2 mikroperler, mens nevroner renses via biotinylering og uttømming av alle ikke-nevronale celler som et negativt utvalg. Trinn som er oppført i samme rad, angis for å utføres samtidig. Forkortelser: Anti-ACSA-2 = astrocyttcelleoverflateantigen-2; EAE = eksperimentell autoimmun encefalomyelitt; FcR = Fc-reseptorlignende protein; MACS = magnetisk aktivert cellesortering. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

9. Renhetsanalyser av de isolerte CNS-residente celletypene (Varighet: Ca. 2 timer)

MERK: Det anbefales å utføre flowcytometri av alle fire isolerte CNS-residente cellepopulasjoner for å måle og sammenligne renhet og levedyktighet. Derfor er det nødvendig å flekke alle celletyper med et antistoff merket med fluorofor. Levende / døde cellefarging implementeres ved hjelp av et fikserbart levedyktighetsfargestoff (1: 10,000).

  1. Renhetspanel - ekstracellulær fargeprotokoll
    1. Bruk 1 x 105 celler oppløst i 50 μL PBS per farging.
    2. Forbered fargemasterblandingen oppløst i PBS med 2% FCS/2 mM EDTA bestående av følgende fluorokromkonjugerte monoklonale antistoffer rettet mot celletypespesifikke overflatemarkører: CD11b FITC (klon 1/70, 1:100)25,26,27,28, Biotin-PE (klon Bio3-18E7, 1:200)29,30,31,32, ACSA-2 PE-Vio615 (klon REA-969, 1:200)33,34,35, O4 APC (klone REA-576, 1:400) og CD45 BV510 (klon 30-F11, 1:150)36,37. Tilsett 1 μg anti-CD16/32 per 1 x 106 celler for å blokkere Fc-reseptoren3 8,39. Vortex alle antistoffer før bruk.
    3. Sentrifuger cellesuspensjonen i 5 minutter ved 540 x g og 4 °C og aspirer supernatanten forsiktig.
    4. Resuspender cellepelleten i 100 μL av den respektive masterblandingen og inkuber prøven i 15 minutter ved RT i mørket.
    5. Vask cellene med 500 μL 1x PBS med 2 % FCS/2 mM EDTA og sentrifuger prøven i 5 minutter ved 540 x g og 4 °C.
    6. Aspirer supernatanten og resuspender cellepelleten med 70 μL 1x PBS med 2 % FCS/2 mM EDTA.
    7. Vortex prøven for å dissosiere cellepelleten helt. Deretter er prøven klar for flowcytometrianalyse.
  2. Renhetspanel - intracellulær fargeprotokoll med NeuN
    1. Bruk 1 x 105 celler av hver cellepopulasjon for intracellulær farging av NeuN som er en nevronspesifikk nukleær markør 40,41. Dette er en ekstra måte å flekke levedyktige nevroner på.
    2. Overfør 1 x 105 celler av hver cellepopulasjon til et FACS-rør. Tilsett 1 ml PBS med 2% FCS/2 mM EDTA per tube. Sentrifuger rørene ved 540 x g og 4 °C i 5 minutter.
    3. I mellomtiden forbereder du masterblandingen oppløst i PBS med 2 % FCS/2 mM EDTA bestående av følgende fluorokromkonjugerte monoklonale antistoffer rettet mot celletypespesifikke overflatemarkører: CD11b FITC (klon M1/70, 1:100)25,26,27,28, Biotin-PE (klon Bio3-18E7, 1:200)29,30,31,32, ACSA-2 PE-Vio615 (klon REA-969, 1:200)33,34,35 og CD45 BV510 (klone 30-F11, 1:150)36,37.
    4. Aspirer supernatanten og resuspendere cellene i 100 μL av den fremstilte masterblandingen og inkuber prøven i 10 minutter ved RT i mørket.
    5. Vask cellene med 100 μL PBS med 2 % FCS/2 mM EDTA og sentrifugere dem igjen ved 540 x g og 4 °C i 5 minutter.
    6. I mellomtiden klargjør du 200 μL av fikserings-/permeabiliseringsløsningen: Tilsett 50 μL av den konsentrerte fikserings-/permeabiliseringskonsentraten til 150 mikrol fikserings-/permeabiliseringsfortynningsmiddel for å nå en endelig fortynning på 1:4.
    7. Aspirer supernatanten og resuspender cellene i 100 mikrol 1x fikserings-/permeabiliseringsløsning. Inkuber prøven i 30 minutter ved 4 °C.
    8. I mellomtiden forbereder du 1 ml 1x permeabiliserings-/vaskebuffer ved å tilsette 100 μL av permeabiliseringsbufferlageret til 900 μL ddH2O for å nå en endelig fortynning på 1:10.
    9. Vask cellene 1x med 100 μL 1x permeabilisering/vaskebuffer og sentrifuger prøven ved 540 x g og 4 °C i 5 minutter.
    10. I mellomtiden forbereder du en annen masterblanding i 1x permeabiliserings-/vaskebuffer som bare består av NeuN (NeuN AF647, klon EPR12763, 1:200) og 1 μg anti-CD16/32 per 106 celler for å blokkere Fc-reseptoren.
    11. Aspirer supernatanten. Resuspender de faste og permeabiliserte cellene i 50 μL av den andre masterblandingen og inkuber i 30 minutter ved 4 °C.
    12. Vask prøven med 100 μL 1x permeabilisering/vaskebuffer og sentrifugat ved 540 x g og 4 °C i 5 minutter.
    13. Kast supernatanten og resuspender cellepelleten i 70 mikrol PBS med 2 % FCS/2 mM EDTA. Deretter er prøven klar for flowcytometrisk analyse.
    14. Etter å ha satt opp panelet på flowcytometeret, anskaffer du celler for renhetsanalyse ved hjelp av en programvare for flowcytometrianalyse.

10. Statistisk analyse

  1. Utføre statistiske analyser og designe grafer med et grafisk analyseprogram. Data er presentert som gjennomsnitt ± SEM.

Representative Results

Den nåværende protokollen gir muligheten til samtidig å isolere alle de viktigste CNS-residente cellene, dvs. mikroglia, oligodendrocytter, astrocytter og nevroner fra en enkelt CNS-replikasjon. Dette er viktig for reduksjonen av antall mus som trengs for slike eksperimenter og for å sikre sammenlignbarheten av molekylære og biokjemiske analyser på cellenivå. Hvis de enkelte celletypene er isolert fra forskjellige CNS-replikater, kan cellulære interaksjoner ikke kartlegges sannferdig, og potensielle tekniske avvik under isolasjonsprosessene kan forstyrre ytterligere nedstrømsanalyser. I tillegg vil molekylære og biokjemiske funn fra hver celletype ikke være sammenlignbare med hverandre, da de ikke er avledet fra samme EAE-kontekst. En eksisterende MACS-protokoll ved hjelp av et kommersielt system/sett ble tilpasset for å muliggjøre samtidig isolering av de ovennevnte celletypene.

Isoleringen av mikroglia ble utført med anti-CD11b-mikroperler, oligodendrocytter ble isolert via anti-O4-mikroperler (tab 1) og anti-ACSA-2-mikroperler ble brukt til å isolere astrocytter (tab 2). I motsetning til dette representerer isoleringen av nevroner et negativt utvalg og ble oppnådd ved biotinylering og magnetisk merking av alle ikke-nevronale celler (tabell 2). Alle ikke-nevronale celler (f.eks. oligodendrocytter, mikroglia, astrocytter, endotelceller og fibroblaster) unntatt blodceller kan magnetisk merkes ved å bruke et biotinkonjugert antistoff, spesielt rettet mot et overflateantigen uttrykt på disse ikke-nevronale cellene (tabell 2). Ved uttømming av disse magnetisk merkede ikke-nevronale cellene, kan svært rene og levedyktige nevroncellepopulasjoner genereres 30,42,43.

To nye flowcytometripaneler for renhetsanalyser av de genererte encellede suspensjonene ble designet. Her ble celletypespesifikke overflate- og nukleære markører kombinert med diskriminering av levende / døde celler brukt.

De resulterende celleutbyttene per mus og celletype (figur 3A) ble analysert og førte til et gjennomsnitt på 8. 4 x 105 ± 3 x 104 mikroglia, 3,23 x 106 ± 1 x 105 oligodendrocytter, 8,6 x 105 ± 2 x 104 astrocytter og 4,5 x 105 ± 1 x 104 nevroner per naiv mus.

I sammenheng med målet om å undersøke sykdomsmodeller av nevroinflammasjon, ble protokollen også brukt på en musemodell av EAE. Musene ble avlivet på dag 16 etter EAE-induksjon som representerte sykdommens maksimum. I denne EAE-settingen ble ca. 2,9 x 106 ± 6,7 x 105 oligodendrocytter, 5,2 x 105 ± 9 x 104 astrocytter og 4,4 x 105 ± 4 x 104 nevroner isolert. Utbyttet fra mikrogliaceller ble redusert til ca. 1,7 x 105 ± 4 x 104 mikroglia per EAE-mus på grunn av den ekstra cellesorteringen etter MACS-trinnene (figur 3A).

Fenotypiske karakteriseringer av de ulike cellepopulasjonene via flowcytometri viste etter isolering at levedyktige encellesuspensjoner med en renhet på ca. 90 % for alle CNS-residente celletyper (figur 3B) kunne oppnås. Mikroglia ble klassifisert som CD45intCD11bhøy som definert i litteraturen 44,45,46,47.

I EAE måtte mikroglia sorteres fra alle CD11b+-celler for å skille dem fra andre CD11b+-immunceller som monocytter, nøytrofiler, naturlige drepeceller, granulocytter og makrofager som immigrerer inn i CNS under nevroinflammasjon 27,28,48. Derfor ble mikroglia sortert som CD45intCD11høye celler fra CD11b + cellesuspensjon. Hele sorteringsstrategien for mikroglia er vist i figur 4. Hos naive mus var mikrogliapopulasjonen 91,16 % av alle levende enkeltceller (96 % av den totale CD11b+-populasjonen) (figur 4A). I EAE-mus var mikrogliapopulasjonen 46,85 % av alle levende enkeltceller (55 % av den totale CD11b+-populasjonen) (figur 4B). Selv om både MACS- og FACS-prosedyrer påfører mekanisk belastning på enkeltcellene, var 75,41 % ± 8,63 % av de sorterte rensede mikrogliaene levedyktige (figur 3B).

Astrocytter og nevroner som var direkte isolert fra den opprinnelige CNS-cellesuspensjonen viste relevant forurensning med oligodendrocytter, noe som førte til antagelsen om at samtidig isolering av nevroner og astrocytter fra den negative gjennomstrømningen av oligodendrocytter kunne forhindre denne forurensningen. Flowcytometrianalyser bekreftet at astrocytter isolert fra den negative gjennomstrømningen av oligodendrocytter hadde en renhet på 89,23 % ± 2,78 % og viste en levedyktighet på 80,56 % ± 1,41 %. I likhet med disse resultatene var renheten til nevronene isolert fra O4-cellefraksjonen 81,25% ± 3,31% og levedyktigheten var 83,90% ± 2,61% (figur 3B). Disse funnene bekrefter også at samtidig isolering av disse to celletyper bare senere til isolering av oligodendrocytter ikke har noen innvirkning på mengden levedyktige funksjonelle celler.

Resultatene angående levedyktigheten og renheten til de isolerte encellede suspensjonene var svært like i EAE-mus sammenlignet med de som ble mottatt hos naive mus, noe som bekrefter at denne protokollen er egnet for friske mus, så vel som i sammenheng med EAE (figur 3B).

Figure 3
Figur 3 Celleutbytte og flowcytometribasert validering av isolerte CNS-residente celler. (A) Celleutbytte per mus og celletype etter isolering av CNS-residente celler i naive og EAE-mus. Bargrafer visualiserer mengden celleutbytter per mus og celletype etter implementeringen av den presenterte protokollen. Fem biologiske replikater ble behandlet for resultatene i naive mus, og fire biologiske replikater ble analysert i EAE-mus. Respektive midler ± SEM er avbildet. (B) Tilsvarende renhets- og levedyktighetsanalyser av de rensede cellefraksjonene. Søylediagrammer indikerer levedyktigheten og renheten til de resulterende encellede suspensjonene basert på deres uttrykk for celletypespesifikke markører. NeuN ble brukt som en celletypespesifikk nukleær markør for nevroner. Fem biologiske replikater ble anskaffet og sammenlignet for hver celletype for både friske og EAE-mus. Respektive midler ± SEM er angitt. Forkortelser: Anti-ACSA-2 = astrocyttcelleoverflateantigen-2; CD11b = syklinavhengig kinase 11B; CD45 = reseptor-type tyrosin-protein fosfatase C; CNS = sentralnervesystemet; EAE = eksperimentell autoimmun encefalomyelitt; MACS = magnetisk aktivert cellesortering; NeuN = RNA-bindende protein fox-1 homolog 3; O4 = oligodendrocyttmarkør O4; SEM = standardfeil av gjennomsnittet. Dette tallet er endret fra49. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Gating strategi for cellesortering av mikroglia etter isolering av CD11b+ celler. (A) Gating strategi i naive og (B) EAE mus. Den øverste raden i hvert panel viser punktdiagrammer før sortering og den nederste raden etter sortering. Etter seleksjon av levende (SSC-A/FSC-A) og enkeltceller (FCS-H/FSC-W) ble populasjonen av CD45intCD11b+ -celler sortert som mikrogliapopulasjon. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Discussion

Så langt har metoder for å kartlegge CNS-residente celler ex vivo ved å kombinere massespektrometri og RNA-sekvensering gitt en svært presis cellulær profilering innen helse og sykdom, men krever ambisiøs teknisk kunnskap og kompetanse på dette feltet50,51. Videre tillater de ikke funksjonelle analyser og er svært dyre. Dessuten gir mikrofluidiske hjerne-på-brikke-systemer en rask og rimelig screening for sykdomsmekanismer og testing av nye terapeutiske tilnærminger med begrensning av cellevekst og migrasjon 52,53,54,55. CNS-organoider kan også i fremtiden representere et tilsvarende alternativ for undersøkelse av cellulær modellering, intercellulære forbindelser og interaksjoner under sykdomsforløp 56,57,58,59. Imidlertid er fluorescens- og magnetisk aktivert cellesortering for tiden de mest effektive metodene for å generere rene og levedyktige enkeltcellesuspensjoner ex vivo 35,60,61. Selv om andre etablerte produksjonsprotokoller for isolering av CNS-residente celletyper er like med hensyn til de enkelte trinnene i den magnetiske isolasjonen og den tidligere celledissosiasjonen, er de ment å utføres for hver celletype separat. Derimot integrerer den nåværende protokollen forskjellige isolasjonsmetoder for hver CNS-residente celletype i en logisk kontekst, slik at de kan utføres samtidig samtidig og fra en enkelt CNS-cellesuspensjon (tabell 1, tabell 2). Dermed muliggjør det multi-omics-analyser fra en enkelt CNS-cellesuspensjon og til slutt utforskning av komplekse nevrale nettverk. Selv om det ikke er et must å samle flere vev fra flere dyr for å utføre denne protokollen, sikrer denne sammenslåingen et tilstrekkelig antall isolerte celler for videre nedstrømsanalyse. Bruken av forskjellige mus for isolering av enkeltcelletyper vil utelukke muligheten for å analysere potensielle cellulære interaksjoner. Dessuten sparer kombinasjonen av individuelle isolasjonsmetoder for de forskjellige CNS-celletypene, som alle følger en tidligere CNS-dissosiasjon, materialkostnader ved å bruke en dissosiert CNS-cellesuspensjon for alle følgende magnetiske isolasjonstrinn. I tillegg minimeres en potensiell teknisk skjevhet forårsaket av bruk av forskjellige mus.

En begrensning av protokollen kan være den nesten eksklusive bruken av kvinnelige C57BL/6J-mus. EAE-immuniseringsprotokollen er designet og etablert for kvinnelige mus, så denne celleisolasjonsprotokollen ble også implementert i kvinnelige C57BL/6J-mus. Likevel ble naive hannmus også brukt under utviklingen av denne protokollen, uten å gjenkjenne noen effekt på det resulterende celleantallet eller renhetene. En annen begrensning påvirker magnetcelleisoleringen av nevroner, da det ikke eksisterer noen spesifikke mikroperler for isolering av nevroner når det gjelder et positivt utvalg. Man antok at en ren encellesuspensjon kunne oppnås via biotinmerking og deplesjon av alle ikke-nevronale celler (tab 2). Denne antagelsen ble bekreftet ved bruk av NeuN som en spesifikk nukleær markør for nevroner, integrert i det nevnte renhetspanelet for flowcytometri. En annen begrensning gjelder isolering av mikroglia i EAE-mus. Her reduseres resulterende celleutbytter i forhold til de andre celletypene på grunn av det ekstra sorteringstrinnet etter MACS-protokollen. Videre kan man argumentere for at sortering øker den mekaniske belastningen av mikroglia sammenlignet med de andre cellepopulasjonene. Individuelle sorteringsstrategier kan føre til forskjellige mengder celleutbytter. Hvis det isolerte celletallet er mindre enn forventet eller ønsket, anbefales det å justere gatingoppsettet og/eller forbedre diskrimineringen av levende/døde.

Et kritisk trinn i protokollen representerer fjerning av rusk. Gradienten må legges veldig sakte og forsiktig for å skape de tre ønskede separate fasene (figur 2A). Bare hvis myelin- og andre rester av rusk i de to øverste fasene fjernes helt (figur 2E), kan rene encellede suspensjoner genereres, og ytterligere forurensning kan reduseres. Hvis de resulterende cellesuspensjonene mangler renhet, er dette sannsynligvis den delen av protokollen som bør forbedres først ved siden av forsikringen om riktig bruk av alle mikroperler.

Å motta høye nivåer i renhet og levedyktighet kan være utfordrende i denne typen eksperiment. Noen anbefalinger for feilsøking er:

-Arbeid under sterile forhold er obligatorisk for å forhindre kontaminering av de forskjellige mikrokulene og muliggjøre gjentatt bruk, spesielt for senere dyrking.
-Merking av hver tube for å forhindre blandinger er sterkt anbefalt.
-Unngå bruk av ukjølte reagenser/buffere. Oppbevar alle cellesuspensjoner på is under hele forsøket for å sikre høy levedyktighet.
-Hold tiden mellom de ulike arbeidstrinnene så kort som mulig. Det er ingen spesifikk del i protokollen der det anbefales å sette eksperimentet på pause.
-Det er svært relevant å følge de angitte inkubasjonsperiodene.

Avslutningsvis gir denne nåværende protokollen for samtidig isolering av alle hoved CNS-residente celletyper fra en CNS-replikat muligheten til å analysere komplekse nevrale nettverk og nevroinflammatoriske veier ex vivo fra en CNS-cellesuspensjon. Dermed kan CNS-residente celler undersøkes under ulike stadier av sykdomsforløp, for eksempel under nevroinflammasjon, nevrodegenerasjon og/eller remisjon i EAE. Videre kan celle-celle-interaksjoner og biokjemiske veier studeres på individnivå, og variasjon innen eksperimentelle grupper kan reduseres. Det er også mulighet for å dyrke fraksjoner av de isolerte CNS-cellene i monokulturer for videre funksjonelle analyser og validering. Alt i ett tilbyr denne protokollen betydelige fremskritt som potensielt påvirker prekliniske og kliniske forskningsmetoder.

Disclosures

Alle forfattere erklærer å ikke ha noen interessekonflikter.

Acknowledgments

Figurene er laget med Adobe Illustrator (versjon 2023) og Servier Medical Art (https://smart.servier.com). Antonia Henes ble støttet av Jürgen Manchot Stiftung.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
70 μm cell strainers Corning, MA, USA 352350 CNS tissue dissociation
ACSA-2 Antibody, anti-mouse, PE-Vio 615 (clone REA-969) Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany 130-116-244 Flow cytometry, store at 4 °C
Adult Brain Dissociation Kit, mouse, and rat Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany 130-107-677 Tissue dissociation,contains debris and red blood cell removal solutions; prepare aliquots of enzyme A and P upon arrival and store them at -20 °C; store the remaining kit at 4 °C
Anti-ACSA-2 MicroBead Kit, mouse Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany 130-097-678 MACS of astrocytes, store at 4 °C
Anti-mouse CD16/32 antibody  BioLegend, London, UK 101301 Flow cytometry, store at 4 °C
Anti-O4 MicroBeads, human, mouse, rat Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany 130-094-543 MACS of oligodendrocytes, store at 4 °C
AstroMACS Separation buffer Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany 130-091-221 MACS of astrocytes, store at 4 °C
Biotin Antibody, PE (clone Bio3-18E7) Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany 130-113-853 Flow cytometry, store at 4 °C
BRAND Neubauer counting chamber Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA 10195580 Cell counting 
Brilliant Violet 510 anti-mouse CD45 Antibody (clone 30-F11) BioLegend, London, UK 103137 Flow cytometry, store at 4 °C
CD11b MicroBeads, human, mouse Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany 130-049-601 MACS of microglia, store at 4 °C
DNAse I, recombinant, Rnase-free Merck KGaA, Darmstadt, Germany 4716728001 Flow cytometry, store at -20° C
D-PBS with Calcium, Magnesium, Glucose, Pyruvat Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA 14287080 Buffer, store at 4 °C
D-PBS, without calcium, without magnesium Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA 14190250 Buffer, store at 4 °C
eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 780 Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA 65-0865-14 Flow cytometry, store at 4 °C
eBioscience Foxp3/Transcription factor staining buffer set Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA 00-5523-00 Flow cytometry, store at 4°C
Falcon (15 mL) Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA 11507411 Cell tube
Falcon (50 mL) Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA 10788561 Cell tube 
Falcon Round-Bottom Polystyrene Test Tubes with Cell Strainer Snap Cap, 5 mL Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA 08-771-23 Flow cytometry
FcR Blocking Reagent, mouse  Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany 130-092-575 MACS of oligodendrocytes, store at 4 °C
Female C57BL/6J mice Charles River Laboratories, Sulzfeld, Germany Active EAE induction 
Fetal calf serum (FCS) Merck KGaA, Darmstadt, Germany F2442-50ML Flow cytometry, store at -5 to -20 °C
FITC Rat Anti-CD 11b  (clone M1/70) BD Biosciences, San Jose, CA, USA 553310 Flow cytometry, store at 4 °C
Freund’s Complete adjuvant Merck KGaA, Darmstadt, Germany AR001 Active EAE induction, store at 4 °C
GentleMACS C Tubes Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany 130-093-237 CNS tissue dissociation
GentleMACS Octo Dissociator with Heaters Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany 130-096-427 CNS tissue dissociation
Graphpad Prism 8.4.3 Graphpad by Dotmatics Graphical Analysis
Isoflurane AbbVie, North Chicago, IL, USA Active EAE induction, store at 4 °C
Kaluza Analysis Software V2.1.1 Beckman Coulter, Indianapolis, IN, USA Flow cytometry analysis
LS Columns Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany 130-042-401 MACS
MACS BSA Stock Solution Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany 130-091-376 PB-buffer
MACS MultiStand Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany 130-042-303 MACS 
MOG35–55 peptide Charité, Berlin, Germany; alternatives: Genosphere Biotechnologies (Paris, France) or sb-Peptide (Saint Egrève, France) Active EAE induction, store at -20 °C
Mycobacterium tuberculosis strain H37 Ra Becton, Dickinson and Company (BD),Franklin Lakes, NJ, USA Active EAE induction, store at 4 °C
Neuron Isolation Kit, mouse  Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany 130-115-390 MACS of neurons, store at 4 °C
O4 Antibody, anti-human/mouse/rat, APC, (clone REA-576) Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany 130-119-897 Flow cytometry, store at 4 °C
Pertussis toxin in glycerol Hooke Laboratories Inc., Lawrence, MA, USA BT-0105 Active EAE induction; store at -20 °C
pluriStrainer Mini 100 μm  pluriSelect Life Science UG, Leipzig, Sachsen, Germany 43-10100-40 Flow cytometry
QuadroMACS Separator  Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany 130-090-976 MACS
Recombinant Alexa Fluor 647 Anti-NeuN antibody (clone EPR12763) Abcam, Cambridge, UK EPR12763 Flow cytometry, store at -20 °C
Stainless Steel Brain Matrices, 1 mm Ted Pella, Redding, CA, USA 15067 CNS tissue dissection
Trypan blue solution, 0.4% Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA 15250061 Cell counting 
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA 15575020 Flow cytometry, store at room temperature

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Trapp, B. D., Nave, K. A. Multiple Sclerosis: An Immune or Neurodegenerative Disorder. Annu Rev Neurosci. 31 (1), 247-269 (2008).
  2. Stys, P. K., Zamponi, G. W., van Minnen, J., Geurts, J. J. Will the real multiple sclerosis please stand up. Nat Rev Neurosci. 13 (7), 507-514 (2012).
  3. Korn, T. Pathophysiology of multiple sclerosis. J Neurol. 255 (Suppl 6), 2-6 (2008).
  4. Ward, M., Goldman, M. D. Epidemiology and Pathophysiology of Multiple Sclerosis. CONTINUUM. 28 (4), 988-1005 (2022).
  5. Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein (MOG35-55) Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 Mice. J Vis Exp. (86), 51275 (2014).
  6. Bittner, S., et al. The TASK1 channel inhibitor A293 shows efficacy in a mouse model of multiple sclerosis. Exp Neurol. 238 (2), 149-155 (2012).
  7. Göbel, K., et al. Plasma kallikrein modulates immune cell trafficking during neuroinflammation via PAR2 and bradykinin release. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (1), 271-276 (2019).
  8. Ballerini, C. Experimental Autoimmune Encephalomyelitis. Methods Mol Biol. 2285, 375-384 (2021).
  9. Birmpili, D., Charmarke Askar, I., Bigaut, K., Bagnard, D. The Translatability of Multiple Sclerosis Animal Models for Biomarkers Discovery and Their Clinical Use. Int J Mol Sci. 23 (19), 11532 (2022).
  10. Tsatas, O., Ghasemlou, N. Isolation and RNA purification of macrophages/microglia from the adult mouse spinal cord. J Immunol Methods. 477, 112678 (2020).
  11. Calvo, B., Rubio, F., Fernández, M., Tranque, P. Dissociation of neonatal and adult mice brain for simultaneous analysis of microglia, astrocytes and infiltrating lymphocytes by flow cytometry. IBRO Rep. 8, 36-47 (2020).
  12. Diaz-Amarilla, P., et al. Isolation and characterization of neurotoxic astrocytes derived from adult triple transgenic Alzheimer's disease mice. Neurochem Int. 159, 105403 (2022).
  13. Galatro, T. F., Vainchtein, I. D., Brouwer, N., Boddeke, E. W. G. M., Eggen, B. J. L. Isolation of Microglia and Immune Infiltrates from Mouse and Primate Central Nervous System. Methods Mol Biol. 1559, 333-342 (2017).
  14. Altendorfer, B., et al. Transcriptomic Profiling Identifies CD8+ T Cells in the Brain of Aged and Alzheimer's Disease Transgenic Mice as Tissue-Resident Memory T Cells. J Immunol. 209 (7), 1272-1285 (2022).
  15. Lanfranco, M. F., Sepulveda, J., Kopetsky, G., Rebeck, G. W. Expression and secretion of apoE isoforms in astrocytes and microglia during inflammation. Glia. 69 (6), 1478-1493 (2021).
  16. Swire, M., Ffrench-Constant, C. Oligodendrocyte-Neuron Myelinating Coculture. Methods Mol Biol. 1936, 111-128 (2019).
  17. Park, J., Koito, H., Li, J., Han, A. Microfluidic compartmentalized co-culture platform for CNS axon myelination research. Biomed Microdevices. 11 (6), 1145-1153 (2009).
  18. Facci, L., Barbierato, M., Skaper, S. D. Astrocyte/Microglia Cocultures as a Model to Study Neuroinflammation. Methods Mol Biol. 1727, 127-137 (2018).
  19. Speicher, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G., Pawlowski, M. Generating microglia from human pluripotent stem cells: novel in vitro models for the study of neurodegeneration. Mol Neurodegener. 14 (1), 46 (2019).
  20. Homayouni Moghadam, F., et al. Isolation and Culture of Embryonic Mouse Neural Stem Cells. J Vis Exp. (141), 58874 (2018).
  21. Santos, R., et al. Differentiation of Inflammation-Responsive Astrocytes from Glial Progenitors Generated from Human Induced Pluripotent Stem Cells. Stem Cell Reports. 8 (6), 1757-1769 (2017).
  22. Tcw, J., et al. An Efficient Platform for Astrocyte Differentiation from Human Induced Pluripotent Stem Cells. Stem Cell Reports. 9 (2), 600-614 (2017).
  23. Miltenyi, S., Müller, W., Weichel, W., Radbruch, A. High gradient magnetic cell separation with MACS. Cytometry. 11 (2), 231-238 (1990).
  24. Huntemann, N., et al. An optimized and validated protocol for inducing chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in C57BL/6J mice. J Neurosci Methods. 367, 109443 (2022).
  25. Martin, E., El-Behi, M., Fontaine, B., Delarasse, C. Analysis of Microglia and Monocyte-derived Macrophages from the Central Nervous System by Flow Cytometry. J Vis Exp. (124), 55781 (2017).
  26. Sarkar, S., et al. Rapid and Refined CD11b Magnetic Isolation of Primary Microglia with Enhanced Purity and Versatility. J Vis Exp. (122), 55364 (2017).
  27. Rodríguez Murúa, S., Farez, M. F., Quintana, F. J. The Immune Response in Multiple Sclerosis. Annu Rev Pathol. 17, 121-139 (2021).
  28. Engelhardt, B., Ransohoff, R. M. Capture, crawl, cross: the T cell code to breach the blood-brain barriers. Trends Immunol. 33 (12), 579-589 (2012).
  29. Elia, G. Biotinylation reagents for the study of cell surface proteins. Proteomics. 8 (19), 4012-4024 (2008).
  30. Berl, S., et al. Enrichment and isolation of neurons from adult mouse brain for ex vivo analysis. J Neurosci Methods. 283, 15-22 (2017).
  31. Turvy, D. N., Blum, J. S. Biotin Labeling and Quantitation of Cell-Surface Proteins. Curr Protoc Immunol. 18 (7), (2001).
  32. Mao, S. Y. Biotinylation of Antibodies. Methods Mol Biol. 115, 39-41 (1999).
  33. Kantzer, C. G., et al. Anti-ACSA-2 defines a novel monoclonal antibody for prospective isolation of living neonatal and adult astrocytes. Glia. 65 (6), 990-1004 (2017).
  34. Batiuk, M. Y., et al. An immunoaffinity-based method for isolating ultrapure adult astrocytes based on ATP1B2 targeting by the ACSA-2 antibody. J Biol Chem. 292 (21), 8874-8891 (2017).
  35. Pan, J., Wan, J. Methodological comparison of FACS and MACS isolation of enriched microglia and astrocytes from mouse brain. J Immunol Methods. 486, 112834 (2020).
  36. Donovan, J. A., Koretzky, G. A. CD45 and the immune response. J Am Soc Nephrol. 4 (4), 976-985 (1993).
  37. Hathcock, K. S., Hirano, H., Hodes, R. J. CD45 expression by murine B cells and T cells: Alteration of CD45 isoforms in subpopulations of activated B cells. Immunol Res. 12 (1), 21-36 (1993).
  38. Balogh, P., Tew, J. G., Szakal, A. K. Simultaneous blockade of Fc? receptors and indirect labeling of mouse lymphocytes by the selective detection of allotype-restricted epitopes on the kappa chain of rat monoclonal antibodies. Cytometry. 47 (2), 107-110 (2002).
  39. Becerril-García, M. A., et al. Langerhans Cells From Mice at Birth Express Endocytic- and Pattern Recognition-Receptors, Migrate to Draining Lymph Nodes Ferrying Antigen and Activate Neonatal T Cells in vivo. Front Immunol. 11, 744 (2020).
  40. Dent, M. A., Segura-Anaya, E., Alva-Medina, J., Aranda-Anzaldo, A. NeuN/Fox-3 is an intrinsic component of the neuronal nuclear matrix. FEBS Lett. 584 (13), 2767-2771 (2010).
  41. Duan, W., et al. Novel Insights into NeuN: from Neuronal Marker to Splicing Regulator. Mol Neurobiol. 53 (3), 1637-1647 (2016).
  42. Monteiro, R., Sivasubramanian, M. K., Balasubramanian, P., Subramanian, M. Obesity-Induced Sympathoexcitation is Associated with Glial Senescence in the Brainstem. FASEB J. 34 (S1), 1-1 (2020).
  43. Li, S., Chang, L., Teissie, J. Electroporation protocols: mircroorganism, mammalian system, and nanodevice. , Humana Press, New York. (2020).
  44. Kettenmann, H., Hanisch, U. K., Noda, M., Verkhratsky, A. Physiology of Microglia. Physiol Rev. 91 (2), 461-553 (2011).
  45. Haage, V., et al. Comprehensive gene expression meta-analysis identifies signature genes that distinguish microglia from peripheral monocytes/macrophages in health and glioma. Acta Neuropathol Commun. 7 (1), 20 (2019).
  46. Kosior, N., Petkau, T. L., Connolly, C., Lu, G., Leavitt, B. R. Isolating cells from adult murine brain for validation of cell-type specific cre-mediated deletion. J Neurosci Methods. 328, 108422 (2019).
  47. Jurga, A. M., Paleczna, M., Kuter, K. Z. Overview of General and Discriminating Markers of Differential Microglia Phenotypes. Front Cell Neurosci. 14, 198 (2020).
  48. Man, S., Ubogu, E. E., Ransohoff, R. M. Inflammatory Cell Migration into the Central Nervous System: A Few New Twists on an Old Tale. Brain Pathol. 17 (2), 243-250 (2007).
  49. Schroeter, C. B., et al. One Brain-All Cells: A Comprehensive Protocol to Isolate All Principal CNS-Resident Cell Types from Brain and Spinal Cord of Adult Healthy and EAE Mice. Cells. 10 (3), 651 (2021).
  50. Sankowski, R., et al. Mapping microglia states in the human brain through the integration of high-dimensional techniques. Nate Neurosci. 22 (12), 2098-2110 (2019).
  51. Brennan, F. H., et al. Microglia coordinate cellular interactions during spinal cord repair in mice. Nat Commun. 13 (1), 4096 (2022).
  52. Enright, H. A., et al. Functional and transcriptional characterization of complex neuronal co-cultures. Sci Rep. 10 (1), 11007 (2020).
  53. Mofazzal Jahromi, M. A., et al. Microfluidic Brain-on-a-Chip: Perspectives for Mimicking Neural System Disorders. Mol Neurobiol. 56 (12), 8489-8512 (2019).
  54. Chin, E., Goh, E. Blood-brain barrier on a chip. Methods Cell Biol. 146, 159-182 (2018).
  55. Miccoli, B., Braeken, D., Li, Y. E. Brain-on-a-chip Devices for Drug Screening and Disease Modeling Applications. Curr Pharm Des. 24 (45), 5419-5436 (2019).
  56. Giandomenico, S. L., et al. Cerebral organoids at the air-liquid interface generate diverse nerve tracts with functional output. Nat Neurosci. 22 (4), 669-679 (2019).
  57. Pellegrini, L., et al. Human CNS barrier-forming organoids with cerebrospinal fluid production. Science. 369 (6500), eaaz5626 (2020).
  58. Chhibber, T., et al. CNS organoids: an innovative tool for neurological disease modeling and drug neurotoxicity screening. Drug Discov Today. 25 (2), 456-465 (2020).
  59. Tang, X. Y., et al. Human organoids in basic research and clinical applications. Signal Transduct TargetTher. 7 (1), 168 (2022).
  60. Sutermaster, B. A., Darling, E. M. Considerations for high-yield, high-throughput cell enrichment: fluorescence versus magnetic sorting. Sci Rep. 9 (1), 227 (2019).
  61. Doughty, D., et al. Development of a novel purification protocol to isolate and identify brain microglia. Exp Biol Med. 247 (16), 1433-1446 (2022).

Tags

Nevrovitenskap utgave 200 voksne autoimmune encefalomyelittmus EAE-modell multippel sklerose MS-etiologi behandlingsstrategier MOG35-55 EAE-modell stigende lammelse klinisk skåringssystem patomekanismer CNS-residente celletyper mikroglia oligodendrocytter astrocytter nevroner hjerne- og ryggmargsdissosiasjon magnetisk aktivert cellesortering (MACS) flowcytometrianalyse enkeltcellesuspensjoner
Samtidig isolering av hovedcelletyper i sentralnervesystemet fra voksne autoimmune encefalopatimus
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Schroeter, C. B., Henes, A.,… More

Schroeter, C. B., Henes, A., Vogelsang, A., Herrmann, A. M., Lichtenberg, S., Cengiz, D., Dobelmann, V., Huntemann, N., Nelke, C., Eichler, S., Albrecht, P., Meuth, S. G., Ruck, T. Simultaneous Isolation of Principal Central Nervous System-Resident Cell Types from Adult Autoimmune Encephalomyelitis Mice. J. Vis. Exp. (200), e65735, doi:10.3791/65735 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter