Summary
Hittills har det inte uppfyllts något behov av protokoll för samtidig isolering av alla celltyper som är bosatta i centrala nervsystemet från samma mus. Protokollet visar en procedur som är tillämplig på naiva och experimentella autoimmuna encefalomyelitmöss för att undersöka komplexa cellulära nätverk under neuroinflammation och samtidigt minska det nödvändiga antalet möss.
Abstract
Experimentell autoimmun encefalomyelit (EAE) är den vanligaste murina modellen för multipel skleros (MS) och används ofta för att ytterligare belysa den fortfarande okända etiologin för MS i syfte att utveckla nya behandlingsstrategier. Myelinoligodendrocytglykoproteinpeptid 35-55 (MOG35-55) EAE-modellen reproducerar ett självbegränsande monofasiskt sjukdomsförlopp med stigande förlamning inom 10 dagar efter immunisering. Mössen undersöks dagligen med hjälp av ett kliniskt poängsystem. MS drivs av olika patomekanismer med ett specifikt tidsmönster, varför undersökningen av vilken roll celltyper som är bosatta i centrala nervsystemet (CNS) spelar under sjukdomsprogression är av stort intresse. Det unika med detta protokoll är den samtidiga isoleringen av alla huvudsakliga CNS-residenta celltyper (mikroglia, oligodendrocyter, astrocyter och neuroner) som är tillämpliga på vuxna EAE och friska möss. Dissociationen av hjärnan och ryggmärgen från vuxna möss följs av magnetaktiverad cellsortering (MACS) för att isolera mikroglia, oligodendrocyter, astrocyter och neuroner. Flödescytometri användes för att utföra kvalitetsanalyser av de renade encellssuspensionerna som bekräftade viabilitet efter cellisolering och indikerade renheten för varje celltyp på cirka 90 %. Sammanfattningsvis erbjuder detta protokoll ett exakt och omfattande sätt att analysera komplexa cellulära nätverk i friska och EAE-möss. Dessutom kan antalet möss minskas avsevärt eftersom alla fyra celltyperna isoleras från samma möss.
Introduction
Multipel skleros (MS) är en kronisk inflammatorisk autoimmun sjukdom i centrala nervsystemet (CNS) som kännetecknas av demyelinisering, axonal skada, glios och neurodegeneration. Trots många forskningsmetoder inom detta område är patofysiologin vid MS fortfarande inte helt klarlagd 1,2,3,4. Den vanligaste djurmodellen för att undersöka MS är myelinoligodendrocytglykoproteinpeptid 35-55 (MOG35-55)-inducerad experimentell autoimmun encefalomyelit (EAE) som delar många av dess kliniska och patofysiologiska egenskaper 5,6,7,8,9 . Den är baserad på immunsystemets svar mot CNS-specifika antigener som leder till inflammation, demyelinisering och neuroaxonal degeneration. Experimentell autoimmun encefalomyelit (EAE) är en lämplig modell för undersökning av neuroinflammatoriska vägar och signalkaskader som finns vid MS.
Nuvarande behandlingsalternativ för MS är endast delvis effektiva och fokuserar främst på den initiala inflammatoriska fasen av sjukdomen. Den neurodegenerativa komponenten av MS verkar dock vara den största utmaningen för långsiktiga terapeutiska metoder. Därför krävs reproducerbara och exakta cellisoleringsprotokoll för att undersöka molekylära och cellulära mekanismer i autoimmuna sjukdomar på ett heltäckande sätt. Även om det finns vissa protokoll för isolering av en enda celltyp 10,11,12,13,14,15, finns det ett otillfredsställt behov av samtidig isolering av flera CNS-residenta cellpopulationer samtidigt. Tidigare protokoll för isolering av CNS-residenta celler brister i att bevara cellulär funktionalitet och renhet, vilket resulterar i samodling med närliggande celler 16,17,18 eller olämplighet för komplexa analyser av intracellulära nätverk ex vivo19,20,21,22.
Syftet med detta protokoll var att etablera en reproducerbar och heltäckande metod för samtidig isolering av rena, livsdugliga encellssuspensioner av alla de viktigaste CNS-residenta celltyperna som är tillämpliga på vuxna friska möss och EAE-möss. De olika celltyperna isolerades med hjälp av magnetaktiverad cellsortering (MACS)23. Cellseparationen kan åstadkommas antingen genom positiv selektion, dvs magnetisk märkning av celltypsspecifika ytmarkörer, eller genom negativ selektion via biotinylering och utarmning av alla oönskade celler. Flödescytometri tillämpades för att säkerställa en renhet på över 90 % och en viabilitet på minst 80 % av de isolerade encellssuspensionerna.
Sammanfattningsvis var huvudmålet att etablera ett protokoll för samtidig isolering av alla huvudcelltyper som är bosatta i CNS som ett mångsidigt verktyg för undersökning av neuroinflammatoriska vägar som erbjuder en omfattande och exakt analys av komplexa cellulära nätverk och biokemiska signalkaskader i friska möss och EAE-möss.
Protocol
Alla EAE-experiment inducerades på C57BL/6J-möss vid 10-12 veckors ålder och godkändes av lokala myndigheter (Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz Nordrhein-Westfalen). Överensstämmelsen med den tyska och EU:s djurskyddslagstiftning säkerställdes också vid alla tidpunkter för försöken. Alla möss hölls i individuellt ventilerade burar och djurstallar.
OBS: Följande reagensvolymer avser en vuxen murin hjärna och ryggmärg, som i det följande kallas CNS-cellssuspension och väger cirka 20 mg till 500 mg. Om dissociation av mer än en CNS-cellsuspension planeras måste alla reagensvolymer och reagensmaterial skalas upp i enlighet med detta. Det rekommenderas att förvara Dulbeccos fosfatbuffrade saltlösning (D-PBS; 1x) med kalcium och magnesium, kompletterat med 1 g/L glukos och 36 mg/L natriumpyruvat) kontinuerligt på is under hela experimentet. Om cellodling planeras i efterhand, utför alla steg under sterila förhållanden med hjälp av huvor. Annars behöver inget av följande protokollavsnitt utföras under huven. Förvara buffertarna på is. Använd endast förkylda lösningar och undvik virvlar under hela experimentet. Se bild 1 för övergripande arbetsflöde.
Figur 1: Arbetsflöde för samtidig isolering av oligodendrocyter, mikroglia, astrocyter och neuroner i naiva möss och EAE-möss. De första stegen i arbetsflödet är desamma för både naiva möss och EAE-möss. Om man vill arbeta med ett EAE-replikat måste EAE-induktion utföras i förväg (1). I korthet börjar protokollet med dissektion (2) och dissociation (3) av murin hjärna och ryggmärg följt av avlägsnande av skräp (4) och röda blodkroppar (5). Därefter delas den resulterande renade CNS-cellsuspensionen i två fraktioner för samtidig isolering av oligodendrocyter och mikroglia via MACS (6). Mikroglia detekteras via anti-CD11b-mikropärlor medan oligodendrocyter isoleras med hjälp av anti-O4-mikropärlor (positiva selektioner). Från det negativa flödet av oligodendrocyterna (8) isoleras astrocyter via anti-ACSA-2-mikropärlor (positiv selektion) och neuroner genom biotinmärkning och utarmning av alla icke-neuronala celler (negativ selektion). Hos EAE-möss följs isoleringen av CD11b+-celler av fluorescensaktiverad cellsortering av CD45intCD11b-höga celler för att eliminera andra CD11b+-immunceller som makrofager, dendritiska celler, monocyter, granulocyter och naturliga mördarceller som är kända för att delta i neuroinflammationsprocesser under EAE-kursen (7)27,28,48. Efter isoleringen av de olika CNS-residenta celltyperna kan renhetsanalyser utföras (9). Förkortningar: Abs = antikroppar; ACSA-2 = astrocytcellyteantigen-2, CD11b = cyklinberoende kinas 11B; CD45 = tyrosinproteinfosfatas C, av receptortyp, CNS = centrala nervsystemet; EAE = experimentell autoimmun encefalomyelit; MACS = magnetiskt aktiverad cellsortering; O4 = oligodendrocytmarkör O4. Denna siffra har ändrats från49. Klicka här för att se en större version av denna figur.
1. Induktion av aktiv EAE
- Beredning av reagenser
- För cellseparation: Bered PB-bufferten och förvara den vid 2-8 °C i högst 1 vecka. För att bereda stamlösningen, tillsätt 475 ml 1x PBS utan tillsatser (pH 7,2) + 25 ml 0,5 % bovint serumalbumin (BSA). Använd en spädning på 1:20 beredd i BSA.
- För flödescytometri och fluorescensaktiverad cellsortering (FACS): Bered FACS-bufferten, PBS med 2 % fetalt kalvserum (FCS) och 2 mM EDTA och förvara den vid 2-8 °C. För att förbereda, tillsätt 500 ml 1x PBS utan tillskott och 10 ml FCS + 2 ml EDTA (från 0,5 M EDTA-lager)
- Utför immunisering enligt protokollet från Bittner et al. 5. I korthet, inducera EAE genom subkutan injektion av en emulsion innehållande 200 μg MOG35-55 peptid och 200 μL komplett Freuds adjuvans inklusive 200 μg Mycobacterium tuberculosis.
- Bedöva musen med 2% isofluran genom att använda en anestesikammare med en isofluranförångare. Använd veterinärsalva på djurets ögon för att förhindra torrhet under narkos.
- Efter 2 timmar injiceras en intraperitoneal injektion av 100 ng kikhostetoxin (PTx) upplöst i 100 μL 1x PBS enligt protokollet från Huntemann et al.24. Upprepa PTx-injektionen dag 2 efter immunisering.
VARNING: Observera varje djur tills det har återfått tillräckligt med medvetande för att bibehålla sternal liggande. Möss som har genomgått injektionsprocedurerna returneras inte till de andra mössens sällskap förrän de har återhämtat sig helt. För Mycobacterium tuberculosis och PTx: Undvik inandning, förtäring och kontakt med hud och ögon. Mycobacterium tuberculosis är en aktivator av det medfödda immunförsvaret. PTx har många biologiska effekter. - Övervaka EAE-progressionen dagligen, utförd av två blindade utredare som övervakar vikten och undersöker mössen kliniskt.
- För detta ändamål användes följande poängsystem var grad 0 - inga kliniska tecken på EAE, grad 1 - partiell svanspares, grad 2 - fullständig svanspares, grad 3 - måttlig svaghet i bakbenen, grad 4 - fullständig svaghet i bakbenen och ataktisk gång, grad 5 - mild parapares, grad 6 - parapares, grad 7 - paraplegi, grad 8 - tetrapares, grad 9 - quadriplegi, och grad 10-död.
- Använd följande exklusionskriterier för ytterligare deltagande i experimentets kliniska poäng > 7 eller en viktminskning som överstiger 20 % av den ursprungliga kroppsvikten.
- För dissektion av hjärnan och ryggmärgen, avliva EAE-möss på dag 16 efter EAE-induktion som representerar sjukdomsmaximum.
2. Förberedelse av CNS-vävnad (Varaktighet: cirka 10 minuter per möss)
- Efter att ha offrat möss med koldioxid, börja med transkardiell perfusion av varje mus med 20 ml 1x PBS. Upprepa perfusionen igen med 20 ml 1x PBS.
- Placera musen i ryggläge och fixera lemmarna med kanyler. Applicera 75 % etanol på djurets främre kropp. Ytterligare sterilitetsåtgärder är inte nödvändiga vid den tidpunkten.
- Öppna buken och bröstkorgen genom att göra ett längsgående snitt genom huden och fascian med hjälp av en sax.
- Skär revbenen i sidled och vik upp bröstkorgen för att få fri tillgång till hjärtat. Fäst bröstkorgen vikt uppåt med kanyler.
- Öppna höger förmak med en sax. Applicera 20 ml 1x PBS i vänster kammare med en kanyl för att spola ut blodet genom det snittade högra förmaket.
- Exponera skallen genom att skära huden ovanpå murinhuvudet via en längsgående sektion och flytta huden runt huvudet med hjälp av en pincett. Snitta skallen med hjälp av en sax längs sagittalsuturen.
- Sätt in spetsen på en pincett längs snittlinjen för att öppna kalotten. Ta bort resterande delar av kalotten med en pincett så att hjärnan är helt exponerad.
- Ta försiktigt bort hjärnan och placera den i en mushjärnmatris. Skär hjärnan i 1 mm tjocka sagittala skivor med hjälp av ett rakblad.
- Klipp kotpelaren med hjälp av en sax strax ovanför höftbenskammen så att sprutan kan föras in i ryggmärgskanalen.
OBS: Det enklaste sättet att ta bort ryggmärgen är att spola ut den ur ryggmärgskanalen med PBS. Annars måste kotbågarna öppnas individuellt med en sax och sedan kan ryggmärgen tas bort. - Spola ut ryggmärgen ur ryggmärgskanalen från kaudalen till kraniet med hjälp av en 20 ml spruta med en 20 G nål som innehåller 1x PBS. Skär ryggmärgen i 0,5 cm långa segment med hjälp av en skalpell.
- Förvara varje CNS-cellsuspension bestående av hjärna och motsvarande ryggmärg i en separat petriskål per mus fylld med cirka 3 ml kall D-PBS. Förvara disken på is tills den bearbetas.
3. Dissociation av CNS-vävnad (Varaktighet: cirka 1-1,5 timmar beroende på antalet CNS-cellsuspensioner)
OBS: Nervvävnad från vuxna möss dissocieras genom att kombinera mekanisk dissociation med enzymatisk nedbrytning av den extracellulära matrisen. Därmed kvarstår den strukturella integriteten och cellsuspensionen kan användas för ytterligare cellisoleringsprocedurer.
- Bered lämplig volym enzymblandning 1 bestående av 50 μl enzym P och 1 900 μl buffert Z per CNS-cellsuspension. Båda reagenserna tillhör det vuxna hjärnans dissociationssats.
- Bered lämplig volym enzymblandning 2 bestående av 10 μl enzym A och 20 μl buffert Y per CNS-cellsuspension. Båda reagenserna tillhör det vuxna hjärnans dissociationssats.
- Överför 1 950 μl enzymblandning 1 till C-röret och tillsätt därefter vävnadsdelarna från en CNS-cellsuspension. Använd ett C-rör per mus.
- Tillsätt 30 μl enzymblandning 2 till varje C-rör. Stäng C-rören ordentligt och fäst dem upp och ner på hylsan på celldissociatorn med värmare.
- Kör lämpligt program med namnet 37C_ABDK_01 (tar 30 min). Observera åtminstone de första 5 minuterna av programmet för att säkerställa att alla rör roterar med samma hastighet. Det är möjligt att det uppstår fel under körningen. Gå sedan vidare till steg 6.
- Under de sista 2 minuterna av programmet, placera en 70 μm sil på ett 50 ml rör för varje dissocierad CNS-cellsuspension. Förfukta dessa silar med 2 ml D-PBS.
- Efter avslutat program, fäst C-rören från dissociatorn och placera dem i en centrifug. Centrifugera proverna vid 300 g och 4 °C i 1 minut för att samla upp provet i botten av röret.
- Återsuspendera sample och applicera den på den förfuktade silen. Tillsätt 10 ml kall D-PBS till det tomma C-röret och stäng det. Skaka den försiktigt och applicera suspensionen på motsvarande sil.
- Kassera silarna och stäng 50 ml-rören. Centrifugera cellsuspensionen igen vid 300 × g och 4 °C i 10 minuter. Efteråt aspirerar du hela supernatanten mycket försiktigt.
4. Borttagning av skräp (Varaktighet: Cirka 1,5-2 timmar beroende på antalet CNS-cellsuspensioner)
OBS: Vävnadsdissociation leder ofta till myelin- och cellskräp som kan försämra nedströmsanalysen. Genom att tillsätta en lösning för borttagning av skräp kan detta skräp effektivt avlägsnas från CNS-cellsuspensionen.
- Återsuspendera cellpelleten försiktigt med 3 100 μL D-PBS för varje CNS-cellsuspension. Virvla inte.
- Om du arbetar med mer än en CNS-cellsuspension, slå samman högst två CNS-cellsuspensioner som härrör från ett tillstånd eller en experimentgrupp i ett 15 ml rör.
- Tillsätt 900 μl av skräpborttagningslösningen från dissociationssatsen för vuxna hjärnor till en CNS-cellsuspension eller 1 800 μl skräpborttagningslösning till två poolade CNS-cellsuspensioner.
- Vänd upp och ner på röret och blanda suspensionen. Överlägg den sedan mycket försiktigt med 4 ml kall D-PBS. En tydlig gradient ska vara synlig (Figur 2A).
- Centrifugera rören i 10 minuter vid 3000 x g och 4 °C med full acceleration och utan broms.
- Om separationen sker som avsett bildas tre faser (figur 2C). Aspirera de två översta faserna helt (Figur 2C-1,2) och kassera dem. Det är viktigt att inga myelinrester lämnas kvar (Figur 2E).
OBS: Om gradienten inte fungerade och cellerna behövs brådskande, sug inte av de två översta faserna. Fyll istället upp 15 ml-röret med kall D-PBS upp till 15 ml och invertera flera gånger. Centrifugera igen vid 1000 x g i 10 minuter vid 4 °C med full acceleration och utan broms. Sug av supernatanten och upprepa steg 4.1-4.4. - Fyll upp röret med kall D-PBS upp till 14 ml och stäng det. Vänd röret kraftfullt på arbetsbänken tills cellpelleten lossnar från botten av röret. Virvla inte.
- Centrifugera provet igen vid 1000 x g och 4 °C i 10 minuter. Ställ in full acceleration och full broms. Aspirera supernatanten försiktigt och fullständigt.
Bild 2: Att göra och inte göra under borttagning av skräp. (A) Positivt exempel för gradienten efter överlagring med 4 ml PBS. Den övre fasen, som består av 4 ml PBS, skiljer sig tydligt från den nedre fasen, som består av CNS-cellsuspensionen med lösningen för avlägsnande av skräp. (B) Negativt exempel för gradienten efter överlagring med 4 ml PBS. Gradienten saknar en tydlig separation mellan PBS och cellsuspensionen nedanför. En bit av PBS diffunderas in i cellsuspensionen. C) Positivt exempel för gradienten efter centrifugering. Tre separata faser kan lätt urskiljas. Inga myelinrester är synliga i den övre (1) eller nedre fasen (3) av gradienten. Den mellersta fasen innehåller allt myelin (2). Cellpelleten är synlig i botten av 15 ml-röret. (D) Negativt exempel för gradienten efter centrifugering. Det finns ingen exakt separation mellan de tre faserna möjlig. Vissa myelinrester är synliga i den övre (1) och nedre fasen (3) av gradienten. (E) Positivt exempel för gradienten efter aspirering av de två översta faserna. Det resulterande provet innehåller endast cellpelleten och en klar supernatant ovan. Inga myelinrester lämnas kvar. (F) Negativt exempel för gradienten efter aspirering av de två översta faserna. Provet innehåller fortfarande en del myelinrester (svart pil). Förkortningar: CNS = centrala nervsystemet; PBS = fosfatbuffrad koksaltlösning Klicka här för att se en större version av denna figur.
5. Avlägsnande av röda blodkroppar (Varaktighet: Cirka 1 timme beroende på antalet CNS-cellsuspensioner)
OBS: Detta steg förhindrar senare kontaminering av röda blodkroppar och säkerställer en optimal lys av erytrocyter med minimal effekt på de andra celltyperna som isolerats från CNS-vävnaden. Följande volymer är indicerade för cellsuspensioner från 100 mg till 1 g neuronal vävnad motsvarande två vuxna mösshjärnor och ryggmärg. Om du arbetar med mer än två CNS-cellsuspensioner, skala upp alla reagenser och totala volymer i enlighet med detta.
- Börja med beredningen av lösning för avlägsnande av röda blodkroppar (RBCRS): per två poolade CNS-cellssuspensioner. Späd 100 μl stamlösning för avlägsnande av röda blodkroppar (10 gånger) från dissociationssatsen för vuxna i 900 μl ddH2O för att uppnå en slutlig spädning på 1:10.
- Förvara RBCRS vid 2–8 °C fram till användning. Släng oanvända rester i slutet av dagen.
- Återsuspendera cellpelleten med upp till två CNS-cellsuspensioner i 1 ml av RBCRS. Undvik vortexing. Inkubera lösningen i 10 minuter vid 4 °C.
- Tillsätt 10 ml kall PB-buffert till två poolade cellsuspensioner. Centrifugera provet vid 300 × g och 4 °C i 10 minuter och aspirera supernatanten helt efteråt.
- Återsuspendera varje cellpellet från en CNS-cellsuspension i 80 μL PB-buffert genom att pipettera långsamt upp och ner. Använd därför 160 μL för att återsuspendera cellpellets som härrör från två CNS-cellsuspensioner.
- När du arbetar med flera CNS-cellsuspensioner från samma experimentella tillstånd, slå samman alla dessa cellsuspensioner.
- Bestäm celltalet, t.ex. med hjälp av en förbättrad räknekammare. Cellsuspensionerna späddes vanligen 1:50 i PB-buffert, följt av ytterligare spädning 1:10 i 0,4 % trypanblå lösning.
6. Protokoll för magnetiska pärlor i naiva möss och EAE-möss (Varaktighet: Cirka 1 timme)
- Märk de olika CNS-celltyperna magnetiskt med mikrokulor som är specifika för deras ytantigen. Placera sedan cellsuspensionen i kolumnen och separera magnetiskt märkta celler som finns kvar i kolumnen och omärkta celler som körs igenom.
- Efter att ha tagit bort kolonnen från magnetfältet, spola ut magnetiskt märkta celler från kolonnen i ett rör som den positivt valda cellfraktionen.
OBS: Volymerna för den magnetiska märkningsprocessen beräknas för upp till 1 x 107 totala celler. Om fler celler erhålls, skala upp alla reagens- och totalvolymer i enlighet med detta. Det rekommenderas att arbeta snabbt och endast använda förkylda lösningar för att förhindra täckning av antikroppar på cellytan och icke-specifik cellmärkning samt för att säkerställa en hög livskraft hos de isolerade cellpopulationerna. Det är också viktigt att utföra tvättstegen så snart kolonnbehållaren är tom genom att tillsätta PB-bufferten så att kolonnerna inte torkar ut. - Dela den renade outspädda CNS-cellsuspensionen i två fraktioner för följande isoleringar av mikroglia och oligodendrocyter. Förhållandet mellan de båda fraktionerna beror på det önskade cellantalet för varje celltyp.
Anmärkning: Ytterligare detaljer (inkubationstid, detaljerade protokollsteg, volymer, reagenser och cellräkningsmetod) anges i tabell 1.
Tabell 1: Arbetsflöde för samtidig magnetisk märkning och isolering av oligodendrocyter och mikroglia från naiva möss och EAE-möss. Båda celltyperna isoleras via ett positivt urval. Steg som visas på samma rad anges som att de ska utföras på en gång. Förkortningar: CD11b = cyklinberoende kinas 11B; EAE = experimentell autoimmun encefalomyelit; FcR = Fc-receptorliknande protein, O4 = oligodendrocytmarkör O4. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
7. Protokolländring: ytterligare sortering för isolering av mikroglia i EAE-möss (Varaktighet: Cirka 1,5-2 timmar)
OBS: När man arbetar med EAE-möss är det nödvändigt att komplettera det MACS-baserade cellisoleringsprotokollet med FACS för att avlägsna andra CD11b+ -cellpopulationer än mikroglia (t.ex. monocyter, makrofager, naturliga mördarceller, granulocyter eller dendritiska celler) från CD11b+ -cellfraktionen. Annars kan det här steget ignoreras.
- Förbered färgningsmasterblandningen som innehåller 1x PBS kompletterad med CD11b FITC (klon M1/70, 1:50) och CD45 APC/Cy7 (klon 30-F11, 1:200). Använd 100 μL av färgningsmasterblandningen per 5 x 106 celler. Blanda alla antikroppar före användning.
- Centrifugera mikrogliacellsuspensionen vid 300 × g och 4 °C i 10 minuter och aspirera supernatanten försiktigt.
- Återsuspendera cellpelleten med 100 μL av den beredda färgningsmasterblandningen per 5 x 106 celler. Inkubera i 15 minuter i mörker vid rumstemperatur (RT).
- Stoppa reaktionen genom att tillsätta 500 μl PBS och centrifugera provet igen vid 300 × g och 4 °C i 10 minuter.
- Aspirera supernatanten försiktigt och återsuspendera cellpelleten med 1x PBS kompletterat med 10 μg/ml DNAse för att nå en slutlig koncentration på 1 x 107 celler per ml. Förvara cellerna vid 4 °C tills sorteringen startar.
- Applicera cellsuspensionen på en 100 μm sil placerad på ett nytt FACS-rör omedelbart innan du börjar sortera.
- Ställ in flödeshastigheten på 1000 händelser per sekund och använd 100 μm-munstycket. Sortera den önskade cellpopulationen av CD45intCD11bhöga celler i ett nytt 15 ml rör preparerat med 1x PBS vid RT.
8. Beredning av negativt genomflöde av oligodendrocyter för isolering av neuroner och astrocyter (Varaktighet: Cirka 1 timme)
OBS: Det negativa genomflödet av oligodendrocyter från steg 6 samlas in för ytterligare isolering av neuroner och astrocyter. För detta ändamål delas cellsuspensionen i två delar. På grund av den tidigare isoleringen av oligodendrocyter från CNS-cellsuspensionen minimeras kontaminering av O4+ -celler som annars skulle observeras.
- Centrifugera det negativa genomflödet av oligodendrocyterna vid 300 × g och 4 °C i 10 minuter och aspirera supernatanten försiktigt.
- Återsuspendera cellpelleten i 80 μl PB-buffert per poolad CNS-cellsuspension som tidigare använts för isolering av den oligodendrocytpositiva fraktionen.
- Räkna cellerna. Utför räkningen av celler som antas vara O4- med hjälp av en förbättrad räknekammare efter utspädning av cellsuspensionen 1:50 i PB-buffert följt av ytterligare 1:10 utspädning i 0,4 % trypanblått.
- Dela upp den renade outspädda cellsuspensionen i två fraktioner för följande samtidiga isolering av nervceller och astrocyter. Förhållandet mellan båda fraktionerna beror på den föredragna mängden av varje celltyp.
OBS: Ytterligare detaljer (inkubationstid, detaljerade protokollsteg, volymer, reagenser och cellräkningsmetod) anges i tabell 2.
Tabell 2: Arbetsflöde för samtidig magnetisk märkning och isolering av neuroner och astrocyter från naiva möss och EAE-möss. Båda celltyperna är isolerade från det negativa genomflödet av oligodendrocyter. Astrocyter separeras som en positiv selektion via anti-ACSA-2 mikropärlor medan neuroner renas via biotinylering och utarmning av alla icke-neuronala celler som en negativ selektion. Steg som visas på samma rad anges som att de ska utföras på en gång. Förkortningar: Anti-ACSA-2 = astrocytcellyteantigen-2; EAE = experimentell autoimmun encefalomyelit; FcR = Fc-receptorliknande protein, MACS = magnetiskt aktiverad cellsortering. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
9. Renhetsanalyser av isolerade CNS-residenta celltyper (Tidsåtgång: Cirka 2 timmar)
OBS: Att utföra flödescytometri av alla fyra isolerade CNS-residenta cellpopulationer rekommenderas för att mäta och jämföra deras renhet och viabilitet. Därför är det nödvändigt att färga alla celltyper med en antikropp märkt med fluorofor. Färgning av levande/döda celler implementeras med hjälp av ett fixerbart livskraftsfärgämne (1:10 000).
- Renhetspanel - extracellulärt färgningsprotokoll
- Använd 1 x 105 celler upplösta i 50 μL PBS per färgning.
- Bered färgningsmasterblandningen upplöst i PBS med 2 % FCS/2 mM EDTA bestående av följande fluorokromkonjugerade monoklonala antikroppar riktade mot celltypsspecifika ytmarkörer: CD11b FITC (klon 1/70, 1:100)25,26,27,28, Biotin-PE (klon Bio3-18E7, 1:200)29,30,31,32, ACSA-2 PE-Vio615 (klon REA-969, 1:200)33,34,35, O4 APC (klon REA-576, 1:400) och CD45 BV510 (klon 30-F11, 1:150)36,37. Tillsätt 1 μg anti-CD16/32 per 1 x 106 celler för att blockera Fc-receptorn3 8,39. Vrunt alla antikroppar före användning.
- Centrifugera cellsuspensionen i 5 minuter vid 540 x g och 4 °C och aspirera supernatanten försiktigt.
- Återsuspendera cellpelleten i 100 μl av respektive masterblandning och inkubera provet i 15 minuter vid RT i mörker.
- Tvätta cellerna med 500 μl 1x PBS med 2 % FCS/2 mM EDTA och centrifugera provet i 5 minuter vid 540 x g och 4 °C.
- Aspirera supernatanten och återsuspendera cellpelleten med 70 μL 1x PBS med 2 % FCS/2 mM EDTA.
- Virvla provet för att dissociera cellpelleten helt. Därefter är provet klart för flödescytometrianalys.
- Renhetspanel - intracellulärt färgningsprotokoll med NeuN
- Använd 1 x 105 celler i varje cellpopulation för intracellulär färgning av NeuN som är en neuronspecifik kärnmarkör 40,41. Detta är ytterligare ett sätt att färga livskraftiga neuroner.
- Överför 1 x 105 celler av varje cellpopulation till ett FACS-rör. Tillsätt 1 ml PBS med 2 % FCS/2 mM EDTA per rör. Centrifugera rören vid 540 g och 4 °C i 5 min.
- Under tiden bereds masterblandningen upplöst i PBS med 2 % FCS/2 mM EDTA bestående av följande fluorokromkonjugerade monoklonala antikroppar riktade mot celltypsspecifika ytmarkörer: CD11b FITC (klon M1/70, 1:100)25,26,27,28, Biotin-PE (klon Bio3-18E7, 1:200)29,30,31,32, ACSA-2 PE-Vio615 (klon REA-969, 1:200)33,34,35 och CD45 BV510 (klon 30-F11, 1:150)36,37.
- Aspirera supernatanten och återsuspendera cellerna i 100 μl av den beredda masterblandningen och inkubera provet i 10 minuter vid RT i mörker.
- Tvätta cellerna med 100 μL PBS med 2 % FCS/2 mM EDTA och centrifugera dem igen vid 540 x g och 4 °C i 5 minuter.
- Bered under tiden 200 μl av fixerings-/permeabiliseringslösningen: Tillsätt 50 μl av det koncentrerade stamlagret av fixerings-/permeabiliseringskoncentrat till 150 μL fixerings-/permeabiliseringsspädningsmedel för att uppnå en slutlig spädning på 1:4.
- Aspirera supernatanten och återsuspendera cellerna i 100 μl 1x fixerings-/permeabiliseringslösning. Inkubera provet i 30 minuter vid 4 °C.
- Under tiden bereds 1 ml 1x permeabiliserings-/tvättbuffert genom att 100 μL permeabiliseringsbuffertmaterial tillsätts till 900 μL ddH2O för att uppnå en slutlig utspädning på 1:10.
- Tvätta cellerna 1x med 100 μl 1x permeabiliserings-/tvättbuffert och centrifugera provet vid 540 x g och 4 °C i 5 min.
- Under tiden bereds en annan masterblandning i 1x permeabilisering/tvättbuffert bestående endast av NeuN (NeuN AF647, klon EPR12763, 1:200) och 1 μg anti-CD16/32 per 106 celler för att blockera Fc-receptorn.
- Aspirera supernatanten. Återsuspendera de fixerade och permeabiliserade cellerna i 50 μl av den andra masterblandningen och inkubera i 30 minuter vid 4 °C.
- Tvätta provet med 100 μl 1x permeabiliserings-/tvättbuffert och centrifugera vid 540 x g och 4 °C i 5 min.
- Kassera supernatanten och återsuspendera cellpelleten i 70 μl PBS med 2 % FCS/2 mM EDTA. Därefter är provet klart för flödescytometrisk analys.
- Efter att ha ställt in panelen på flödescytometern, skaffa celler för renhetsanalys med hjälp av en programvara för flödescytometrianalys.
10. Statistisk analys
- Utföra statistiska analyser och designa grafer med ett grafiskt analysprogram. Data presenteras som medelvärde ± SEM.
Representative Results
Det nuvarande protokollet erbjuder möjligheten att samtidigt isolera alla viktiga CNS-residenta celler, dvs mikroglia, oligodendrocyter, astrocyter och neuroner från ett enda CNS-replikat. Detta är viktigt för att minska antalet möss som behövs för den här typen av experiment och för att säkerställa jämförbarheten av molekylära och biokemiska analyser på cellnivå. Om de enskilda celltyperna isoleras från olika CNS-replikat kan cellulära interaktioner inte kartläggas sanningsenligt och potentiella tekniska avvikelser under isoleringsprocesserna kan snedvrida ytterligare nedströmsanalyser. Dessutom skulle molekylära och biokemiska fynd från varje celltyp inte vara jämförbara med varandra eftersom de inte härrör från samma EAE-sammanhang. Ett befintligt MACS-protokoll med hjälp av ett kommersiellt system/kit anpassades för att möjliggöra samtidig isolering av de ovan nämnda celltyperna.
Isoleringen av mikroglia utfördes med hjälp av anti-CD11b-mikropärlor, oligodendrocyter isolerades via anti-O4-mikropärlor (tabell 1) och anti-ACSA-2-mikropärlor användes för att isolera astrocyter (tabell 2). Däremot representerar isoleringen av neuroner en negativ selektion och åstadkoms genom biotinylering och magnetisk märkning av alla icke-neuronala celler (tabell 2). Alla icke-neuronala celler (t.ex. oligodendrocyter, mikroglia, astrocyter, endotelceller och fibroblaster) utom blodceller kan märkas magnetiskt med hjälp av en biotinkonjugerad antikropp, specifikt riktad mot ett ytantigen som uttrycks på dessa icke-neuronala celler (tabell 2). Genom utarmning av dessa magnetiskt märkta icke-neuronala celler kan mycket rena och livskraftiga neuronala cellpopulationer genereras 30,42,43.
Två nya flödescytometripaneler för renhetsanalyser av de genererade encellssuspensionerna designades. Här användes celltypsspecifika yt- och kärnmarkörer i kombination med diskriminering mellan levande och döda celler.
Det resulterande cellutbytet per mus och celltyp (Figur 3A) analyserades och ledde till ett genomsnitt på 8. 4 x 105 ± 3 x 104 mikroglia, 3,23 x 106 ± 1 x 105 oligodendrocyter, 8,6 x 105 ± 2 x 104 astrocyter och 4,5 x 105 ± 1 x 104 neuroner per naiv mus.
I samband med syftet att undersöka sjukdomsmodeller för neuroinflammation tillämpades protokollet även på en musmodell av EAE. Mössen avlivades på dag 16 efter EAE-induktion, vilket motsvarar sjukdomsmaximum. I denna EAE-inställning isolerades cirka 2,9 x 106 ± 6,7 x 105 oligodendrocyter, 5,2 x 105 ± 9 x 104 astrocyter och 4,4 x 105 ± 4 x 104 neuroner. Utbytet av mikrogliaceller minskade till cirka 1,7 x 105 ± 4 x 104 mikroglia per EAE-mus på grund av den extra cellsorteringen efter MACS-stegen (Figur 3A).
Efter isolering visade fenotypiska karakteriseringar av de olika cellpopulationerna via flödescytometri att livskraftiga encellssuspensioner med en renhet på cirka 90 % för alla huvudcelltyper som är bosatta i CNS (Figur 3B) kunde uppnås. Microglia var inhägnade som CD45intCD11bhigh enligt definitionen i litteraturen 44,45,46,47.
I EAE var mikroglia tvungna att sorteras från alla CD11b+-celler för att skilja dem från andra CD11b+-immunceller som monocyter, neutrofiler, naturliga mördarceller, granulocyter och makrofager som immigrerar in i CNS under neuroinflammation 27,28,48. Därför sorterades mikroglia som CD45intCD11high cells från CD11b+ cellsuspensionen. Hela sorteringsstrategin för mikroglia visas i figur 4. Hos naiva möss utgjorde mikrogliapopulationen 91,16 % av alla levande enskilda celler (96 % av den totala CD11b+-populationen) (Figur 4A). Hos EAE-möss utgjorde mikrogliapopulationen 46,85 % av alla levande enskilda celler (55 % av den totala CD11b+-populationen) (Figur 4B). Även om både MACS- och FACS-procedurer applicerar mekanisk stress på de enskilda cellerna, var 75,41 % ± 8,63 % av de sorterade renade mikroglia livskraftiga (Figur 3B).
Astrocyter och nervceller som isolerades direkt från den initiala CNS-cellsuspensionen uppvisade relevant kontaminering med oligodendrocyter, vilket ledde till antagandet att samtidig isolering av nervceller och astrocyter från det negativa flödet av oligodendrocyter kunde förhindra denna kontamination. Flödescytometrianalyser bekräftade att astrocyter isolerade från det negativa genomflödet av oligodendrocyter hade en renhet på 89,23 % ± 2,78 % och visade en viabilitet på 80,56 % ± 1,41 %. I likhet med dessa resultat var renheten hos de neuroner som isolerats från O4-cellfraktionen 81,25 % ± 3,31 % och viabiliteten var 83,90 % ± 2,61 % (figur 3B). Dessa fynd bekräftar också att samtidig isolering av dessa två celltyper först efter isolering av oligodendrocyter inte har någon inverkan på mängden livskraftiga funktionella celler.
Resultaten avseende viabiliteten och renheten hos de isolerade encelliga suspensionerna var mycket likartade hos EAE-möss jämfört med de som erhölls hos naiva möss, vilket bekräftar att detta protokoll är lämpligt för friska möss såväl som i samband med EAE (Figur 3B).
Figur 3: Cellutbyten och flödescytometribaserad validering av isolerade CNS-residenta celler. (A) Cellavkastning per mus och celltyp efter isolering av CNS-residenta celler i naiva möss och EAE-möss. Stapeldiagram visualiserar mängden cellutbyte per mus och celltyp efter implementeringen av det presenterade protokollet. Fem biologiska replikat bearbetades för resultaten i naiva möss, och fyra biologiska replikat analyserades i EAE-möss. Respektive medel ± SEM avbildas. B) Motsvarande renhets- och viabilitetsanalyser av de renade cellfraktionerna. Stapeldiagram visar viabiliteten och renheten hos de resulterande encellssuspensionerna baserat på deras uttryck av celltypsspecifika markörer. NeuN användes som en celltypsspecifik kärnmarkör för nervceller. Fem biologiska replikat förvärvades och jämfördes för varje celltyp för både friska möss och EAE-möss. Respektive medel ± SEM anges. Förkortningar: Anti-ACSA-2 = astrocytcellyteantigen-2; CD11b = cyklinberoende kinas 11B; CD45 = tyrosinproteinfosfatas C, av receptortyp, CNS = centrala nervsystemet; EAE = experimentell autoimmun encefalomyelit; MACS = magnetiskt aktiverad cellsortering; NeuN = RNA-bindande protein fox-1 homolog 3; O4 = oligodendrocytmarkör O4, SEM = medelvärdets medelfel. Denna siffra har ändrats från49. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Regleringsstrategi för cellsortering av mikroglia efter isolering av CD11b+-celler. (A) Gating strategi hos naiva och (B) EAE-möss. Den övre raden i varje panel visar punktdiagram före sortering och den nedre raden efter sortering. Efter selektion av levande (SSC-A / FSC-A) och enstaka celler (FCS-H / FSC-W) sorterades populationen av CD45intCD11b+ -celler som mikrogliapopulation. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Discussion
Hittills har metoder för att kartlägga CNS-residenta celler ex vivo genom att kombinera masspektrometri och RNA-sekvensering erbjudit en mycket exakt cellulär profilering inom hälsa och sjukdom, men kräver ambitiös teknisk kunskap och expertis inom detta område50,51. Dessutom tillåter de inte funktionella analyser och är mycket dyra. Utöver det ger mikrofluidiska brain-on-a-chip-system en snabb och prisvärd screening för sjukdomsmekanismer och testning av nya terapeutiska metoder med begränsning av celltillväxt och migration 52,53,54,55. CNS-organoider kan också utgöra ett likvärdigt alternativ i framtiden för undersökning av cellulär modellering, intercellulära kopplingar och interaktioner under sjukdomsförlopp 56,57,58,59. Fluorescens- och magnetaktiverad cellsortering är dock för närvarande de mest effektiva metoderna för att generera rena och livskraftiga encellssuspensioner ex vivo 35,60,61. Även om andra etablerade tillverkningsprotokoll för isolering av CNS-residenta celltyper är likartade när det gäller de enskilda stegen i den magnetiska isoleringen och den tidigare celldissociationen, är de avsedda att utföras separat för varje celltyp. I det nuvarande protokollet integreras däremot olika isoleringsmetoder för varje celltyp med CNS-hemvist i ett logiskt sammanhang så att de kan utföras samtidigt på en gång och från en enda CNS-cellsuspension (tabell 1, tabell 2). Således möjliggör det multi-omics-analyser från en enda CNS-cellsuspension och, så småningom, utforskning av komplexa neuronala nätverk. Även om det inte är ett måste att poola flera vävnader från flera djur för att utföra detta protokoll, säkerställer denna poolning ett tillräckligt antal isolerade celler för vidare nedströmsanalys. Användningen av olika möss för isolering av de enskilda celltyperna skulle utesluta möjligheten att analysera potentiella cellulära interaktioner. Genom att kombinera individuella isoleringsmetoder för de olika CNS-celltyperna, som alla följer en tidigare CNS-dissociation, sparar man dessutom materialkostnader genom att använda en dissocierad CNS-cellsuspension för alla följande magnetiska isoleringssteg. Dessutom minimeras en potentiell teknisk bias som orsakas av användningen av olika möss.
En begränsning i protokollet kan vara den nästan uteslutande användningen av C57BL/6J-möss av honkön. EAE-immuniseringsprotokollet har utformats och etablerats för honmöss, så detta cellisoleringsprotokoll implementerades även på honmöss av typen C57BL/6J. Ändå användes även naiva hanmöss under utvecklingen av detta protokoll, utan att känna igen någon effekt på det resulterande cellantalet eller renheten. En annan restriktion påverkar den magnetiska cellisoleringen av neuroner eftersom det inte finns några specifika mikrokulor för isolering av neuroner i form av ett positivt urval. Det antogs att en ren encellssuspension kunde erhållas genom biotinmärkning och utarmning av alla icke-neuronala celler (tabell 2). Detta antagande verifierades genom användningen av NeuN som en specifik nukleär markör för neuroner, integrerad i den nämnda flödescytometrins renhetspanel. En annan begränsning gäller isoleringen av mikroglia hos EAE-möss. Här minskar den resulterande cellavkastningen jämfört med de andra celltyperna på grund av det extra sorteringssteget efter MACS-protokollet. Dessutom kan man hävda att sortering ökar den mekaniska spänningen i mikroglia jämfört med de andra cellpopulationerna. Individuella sorteringsstrategier kan leda till olika mängder cellutbyte. Om det isolerade cellantalet är mindre än förväntat eller önskvärt rekommenderar vi att du justerar grindinställningen och/eller förbättrar diskrimineringen mellan levande och döda.
Ett kritiskt steg i protokollet är avlägsnandet av skräp. Gradienten måste skiktas mycket långsamt och försiktigt för att skapa de tre önskade separata faserna (figur 2A). Endast om myelinet och andra rester av skräp i de två översta faserna avlägsnas helt (figur 2E) kan rena encellssuspensioner genereras och ytterligare kontaminering minskas. Om de resulterande cellsuspensionerna saknar renhet, är detta förmodligen den del av protokollet som bör förbättras först efter försäkran om korrekt användning av alla mikropärlor.
Att få höga nivåer i renhet och livskraft kan vara utmanande i denna typ av experiment. Några rekommendationer för felsökning är:
-Arbete under sterila förhållanden är obligatoriskt för att förhindra kontaminering av de olika mikrokulorna och möjliggöra upprepad användning, särskilt för efterföljande odling.
-Märkning av varje rör för att förhindra förväxlingar rekommenderas starkt.
-Undvik användning av okylda reagenser/buffertar. Förvara alla cellsuspensioner på is under hela experimentet för att säkerställa hög livskraft.
-Håll tiden mellan de olika arbetsmomenten så kort som möjligt. Det finns ingen specifik del i protokollet där det rekommenderas att pausa experimentet.
-Det är högst relevant att hålla sig till de angivna inkubationstiderna.
Sammanfattningsvis erbjuder detta nuvarande protokoll för samtidig isolering av alla huvudcelltyper som är bosatta i CNS från ett CNS-replikat möjligheten att analysera komplexa neuronala nätverk och neuroinflammatoriska vägar ex vivo från en CNS-cellsuspension. Således kan CNS-residenta celler undersökas under olika stadier av sjukdomsförlopp, t.ex. under neuroinflammation, neurodegeneration och/eller remission i EAE. Dessutom kan cell-cellinteraktioner och biokemiska vägar studeras på individnivå och variabiliteten inom experimentella grupper kan minskas. Det finns också möjlighet att odla fraktioner av de isolerade CNS-cellerna i monokulturer för ytterligare funktionella analyser och validering. Sammantaget erbjuder detta protokoll betydande framsteg som potentiellt påverkar prekliniska och kliniska forskningsmetoder.
Disclosures
Samtliga författare uppger att de inte har några intressekonflikter.
Acknowledgments
Figurerna skapades med hjälp av Adobe Illustrator (version 2023) och Servier Medical Art (https://smart.servier.com). Antonia Henes fick stöd av Jürgen Manchot Stiftung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 70 μm cell strainers | Corning, MA, USA | 352350 | CNS tissue dissociation |
| ACSA-2 Antibody, anti-mouse, PE-Vio 615 (clone REA-969) | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany | 130-116-244 | Flow cytometry, store at 4 °C |
| Adult Brain Dissociation Kit, mouse, and rat | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany | 130-107-677 | Tissue dissociation,contains debris and red blood cell removal solutions; prepare aliquots of enzyme A and P upon arrival and store them at -20 °C; store the remaining kit at 4 °C |
| Anti-ACSA-2 MicroBead Kit, mouse | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany | 130-097-678 | MACS of astrocytes, store at 4 °C |
| Anti-mouse CD16/32 antibody | BioLegend, London, UK | 101301 | Flow cytometry, store at 4 °C |
| Anti-O4 MicroBeads, human, mouse, rat | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany | 130-094-543 | MACS of oligodendrocytes, store at 4 °C |
| AstroMACS Separation buffer | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany | 130-091-221 | MACS of astrocytes, store at 4 °C |
| Biotin Antibody, PE (clone Bio3-18E7) | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany | 130-113-853 | Flow cytometry, store at 4 °C |
| BRAND Neubauer counting chamber | Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA | 10195580 | Cell counting |
| Brilliant Violet 510 anti-mouse CD45 Antibody (clone 30-F11) | BioLegend, London, UK | 103137 | Flow cytometry, store at 4 °C |
| CD11b MicroBeads, human, mouse | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany | 130-049-601 | MACS of microglia, store at 4 °C |
| DNAse I, recombinant, Rnase-free | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | 4716728001 | Flow cytometry, store at -20° C |
| D-PBS with Calcium, Magnesium, Glucose, Pyruvat | Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA | 14287080 | Buffer, store at 4 °C |
| D-PBS, without calcium, without magnesium | Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA | 14190250 | Buffer, store at 4 °C |
| eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 780 | Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA | 65-0865-14 | Flow cytometry, store at 4 °C |
| eBioscience Foxp3/Transcription factor staining buffer set | Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA | 00-5523-00 | Flow cytometry, store at 4°C |
| Falcon (15 mL) | Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA | 11507411 | Cell tube |
| Falcon (50 mL) | Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA | 10788561 | Cell tube |
| Falcon Round-Bottom Polystyrene Test Tubes with Cell Strainer Snap Cap, 5 mL | Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA | 08-771-23 | Flow cytometry |
| FcR Blocking Reagent, mouse | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany | 130-092-575 | MACS of oligodendrocytes, store at 4 °C |
| Female C57BL/6J mice | Charles River Laboratories, Sulzfeld, Germany | Active EAE induction | |
| Fetal calf serum (FCS) | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | F2442-50ML | Flow cytometry, store at -5 to -20 °C |
| FITC Rat Anti-CD 11b (clone M1/70) | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | 553310 | Flow cytometry, store at 4 °C |
| Freund’s Complete adjuvant | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | AR001 | Active EAE induction, store at 4 °C |
| GentleMACS C Tubes | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany | 130-093-237 | CNS tissue dissociation |
| GentleMACS Octo Dissociator with Heaters | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany | 130-096-427 | CNS tissue dissociation |
| Graphpad Prism 8.4.3 | Graphpad by Dotmatics | Graphical Analysis | |
| Isoflurane | AbbVie, North Chicago, IL, USA | Active EAE induction, store at 4 °C | |
| Kaluza Analysis Software V2.1.1 | Beckman Coulter, Indianapolis, IN, USA | Flow cytometry analysis | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany | 130-042-401 | MACS |
| MACS BSA Stock Solution | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany | 130-091-376 | PB-buffer |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany | 130-042-303 | MACS |
| MOG35–55 peptide | Charité, Berlin, Germany; alternatives: Genosphere Biotechnologies (Paris, France) or sb-Peptide (Saint Egrève, France) | Active EAE induction, store at -20 °C | |
| Mycobacterium tuberculosis strain H37 Ra | Becton, Dickinson and Company (BD),Franklin Lakes, NJ, USA | Active EAE induction, store at 4 °C | |
| Neuron Isolation Kit, mouse | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany | 130-115-390 | MACS of neurons, store at 4 °C |
| O4 Antibody, anti-human/mouse/rat, APC, (clone REA-576) | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany | 130-119-897 | Flow cytometry, store at 4 °C |
| Pertussis toxin in glycerol | Hooke Laboratories Inc., Lawrence, MA, USA | BT-0105 | Active EAE induction; store at -20 °C |
| pluriStrainer Mini 100 μm | pluriSelect Life Science UG, Leipzig, Sachsen, Germany | 43-10100-40 | Flow cytometry |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany | 130-090-976 | MACS |
| Recombinant Alexa Fluor 647 Anti-NeuN antibody (clone EPR12763) | Abcam, Cambridge, UK | EPR12763 | Flow cytometry, store at -20 °C |
| Stainless Steel Brain Matrices, 1 mm | Ted Pella, Redding, CA, USA | 15067 | CNS tissue dissection |
| Trypan blue solution, 0.4% | Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA | 15250061 | Cell counting |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA | 15575020 | Flow cytometry, store at room temperature |
References
- Trapp, B. D., Nave, K. A. Multiple Sclerosis: An Immune or Neurodegenerative Disorder. Annu Rev Neurosci. 31 (1), 247-269 (2008).
- Stys, P. K., Zamponi, G. W., van Minnen, J., Geurts, J. J. Will the real multiple sclerosis please stand up. Nat Rev Neurosci. 13 (7), 507-514 (2012).
- Korn, T.
- Ward, M., Goldman, M. D. Epidemiology and Pathophysiology of Multiple Sclerosis. CONTINUUM. 28 (4), 988-1005 (2022).
- Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein (MOG35-55) Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 Mice. J Vis Exp. (86), 51275 (2014).
- Bittner, S., et al. The TASK1 channel inhibitor A293 shows efficacy in a mouse model of multiple sclerosis. Exp Neurol. 238 (2), 149-155 (2012).
- Göbel, K., et al. Plasma kallikrein modulates immune cell trafficking during neuroinflammation via PAR2 and bradykinin release. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (1), 271-276 (2019).
- Ballerini, C.
- Birmpili, D., Charmarke Askar, I., Bigaut, K., Bagnard, D. The Translatability of Multiple Sclerosis Animal Models for Biomarkers Discovery and Their Clinical Use. Int J Mol Sci. 23 (19), 11532 (2022).
- Tsatas, O., Ghasemlou, N. Isolation and RNA purification of macrophages/microglia from the adult mouse spinal cord. J Immunol Methods. 477, 112678 (2020).
- Calvo, B., Rubio, F., Fernández, M., Tranque, P. Dissociation of neonatal and adult mice brain for simultaneous analysis of microglia, astrocytes and infiltrating lymphocytes by flow cytometry. IBRO Rep. 8, 36-47 (2020).
- Diaz-Amarilla, P., et al. Isolation and characterization of neurotoxic astrocytes derived from adult triple transgenic Alzheimer's disease mice. Neurochem Int. 159, 105403 (2022).
- Galatro, T. F., Vainchtein, I. D., Brouwer, N., Boddeke, E. W. G. M., Eggen, B. J. L. Isolation of Microglia and Immune Infiltrates from Mouse and Primate Central Nervous System. Methods Mol Biol. 1559, 333-342 (2017).
- Altendorfer, B., et al. Transcriptomic Profiling Identifies CD8+ T Cells in the Brain of Aged and Alzheimer's Disease Transgenic Mice as Tissue-Resident Memory T Cells. J Immunol. 209 (7), 1272-1285 (2022).
- Lanfranco, M. F., Sepulveda, J., Kopetsky, G., Rebeck, G. W. Expression and secretion of apoE isoforms in astrocytes and microglia during inflammation. Glia. 69 (6), 1478-1493 (2021).
- Swire, M., Ffrench-Constant, C.
- Park, J., Koito, H., Li, J., Han, A. Microfluidic compartmentalized co-culture platform for CNS axon myelination research. Biomed Microdevices. 11 (6), 1145-1153 (2009).
- Facci, L., Barbierato, M., Skaper, S. D. Astrocyte/Microglia Cocultures as a Model to Study Neuroinflammation. Methods Mol Biol. 1727, 127-137 (2018).
- Speicher, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G., Pawlowski, M. Generating microglia from human pluripotent stem cells: novel in vitro models for the study of neurodegeneration. Mol Neurodegener. 14 (1), 46 (2019).
- Homayouni Moghadam, F., et al. Isolation and Culture of Embryonic Mouse Neural Stem Cells. J Vis Exp. (141), 58874 (2018).
- Santos, R., et al. Differentiation of Inflammation-Responsive Astrocytes from Glial Progenitors Generated from Human Induced Pluripotent Stem Cells. Stem Cell Reports. 8 (6), 1757-1769 (2017).
- Tcw, J., et al. An Efficient Platform for Astrocyte Differentiation from Human Induced Pluripotent Stem Cells. Stem Cell Reports. 9 (2), 600-614 (2017).
- Miltenyi, S., Müller, W., Weichel, W., Radbruch, A. High gradient magnetic cell separation with MACS. Cytometry. 11 (2), 231-238 (1990).
- Huntemann, N., et al. An optimized and validated protocol for inducing chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in C57BL/6J mice. J Neurosci Methods. 367, 109443 (2022).
- Martin, E., El-Behi, M., Fontaine, B., Delarasse, C. Analysis of Microglia and Monocyte-derived Macrophages from the Central Nervous System by Flow Cytometry. J Vis Exp. (124), 55781 (2017).
- Sarkar, S., et al. Rapid and Refined CD11b Magnetic Isolation of Primary Microglia with Enhanced Purity and Versatility. J Vis Exp. (122), 55364 (2017).
- Rodríguez Murúa, S., Farez, M. F., Quintana, F. J. The Immune Response in Multiple Sclerosis. Annu Rev Pathol. 17, 121-139 (2021).
- Engelhardt, B., Ransohoff, R. M. Capture, crawl, cross: the T cell code to breach the blood-brain barriers. Trends Immunol. 33 (12), 579-589 (2012).
- Elia, G. Biotinylation reagents for the study of cell surface proteins. Proteomics. 8 (19), 4012-4024 (2008).
- Berl, S., et al. Enrichment and isolation of neurons from adult mouse brain for ex vivo analysis. J Neurosci Methods. 283, 15-22 (2017).
- Turvy, D. N., Blum, J. S. Biotin Labeling and Quantitation of Cell-Surface Proteins. Curr Protoc Immunol. 18 (7), (2001).
- Mao, S. Y.
- Kantzer, C. G., et al. Anti-ACSA-2 defines a novel monoclonal antibody for prospective isolation of living neonatal and adult astrocytes. Glia. 65 (6), 990-1004 (2017).
- Batiuk, M. Y., et al. An immunoaffinity-based method for isolating ultrapure adult astrocytes based on ATP1B2 targeting by the ACSA-2 antibody. J Biol Chem. 292 (21), 8874-8891 (2017).
- Pan, J., Wan, J. Methodological comparison of FACS and MACS isolation of enriched microglia and astrocytes from mouse brain. J Immunol Methods. 486, 112834 (2020).
- Donovan, J. A., Koretzky, G. A.
- Hathcock, K. S., Hirano, H., Hodes, R. J. CD45 expression by murine B cells and T cells: Alteration of CD45 isoforms in subpopulations of activated B cells. Immunol Res. 12 (1), 21-36 (1993).
- Balogh, P., Tew, J. G., Szakal, A. K. Simultaneous blockade of Fc? receptors and indirect labeling of mouse lymphocytes by the selective detection of allotype-restricted epitopes on the kappa chain of rat monoclonal antibodies. Cytometry. 47 (2), 107-110 (2002).
- Becerril-García, M. A., et al. Langerhans Cells From Mice at Birth Express Endocytic- and Pattern Recognition-Receptors, Migrate to Draining Lymph Nodes Ferrying Antigen and Activate Neonatal T Cells in vivo. Front Immunol. 11, 744 (2020).
- Dent, M. A., Segura-Anaya, E., Alva-Medina, J., Aranda-Anzaldo, A. NeuN/Fox-3 is an intrinsic component of the neuronal nuclear matrix. FEBS Lett. 584 (13), 2767-2771 (2010).
- Duan, W., et al. Novel Insights into NeuN: from Neuronal Marker to Splicing Regulator. Mol Neurobiol. 53 (3), 1637-1647 (2016).
- Monteiro, R., Sivasubramanian, M. K., Balasubramanian, P., Subramanian, M. Obesity-Induced Sympathoexcitation is Associated with Glial Senescence in the Brainstem. FASEB J. 34 (S1), 1-1 (2020).
- Li, S., Chang, L., Teissie, J. Electroporation protocols: mircroorganism, mammalian system, and nanodevice. , Humana Press, New York. (2020).
- Kettenmann, H., Hanisch, U. K., Noda, M., Verkhratsky, A.
- Haage, V., et al. Comprehensive gene expression meta-analysis identifies signature genes that distinguish microglia from peripheral monocytes/macrophages in health and glioma. Acta Neuropathol Commun. 7 (1), 20 (2019).
- Kosior, N., Petkau, T. L., Connolly, C., Lu, G., Leavitt, B. R. Isolating cells from adult murine brain for validation of cell-type specific cre-mediated deletion. J Neurosci Methods. 328, 108422 (2019).
- Jurga, A. M., Paleczna, M., Kuter, K. Z. Overview of General and Discriminating Markers of Differential Microglia Phenotypes. Front Cell Neurosci. 14, 198 (2020).
- Man, S., Ubogu, E. E., Ransohoff, R. M. Inflammatory Cell Migration into the Central Nervous System: A Few New Twists on an Old Tale. Brain Pathol. 17 (2), 243-250 (2007).
- Schroeter, C. B., et al. One Brain-All Cells: A Comprehensive Protocol to Isolate All Principal CNS-Resident Cell Types from Brain and Spinal Cord of Adult Healthy and EAE Mice. Cells. 10 (3), 651 (2021).
- Sankowski, R., et al. Mapping microglia states in the human brain through the integration of high-dimensional techniques. Nate Neurosci. 22 (12), 2098-2110 (2019).
- Brennan, F. H., et al. Microglia coordinate cellular interactions during spinal cord repair in mice. Nat Commun. 13 (1), 4096 (2022).
- Enright, H. A., et al. Functional and transcriptional characterization of complex neuronal co-cultures. Sci Rep. 10 (1), 11007 (2020).
- Mofazzal Jahromi, M. A., et al. Microfluidic Brain-on-a-Chip: Perspectives for Mimicking Neural System Disorders. Mol Neurobiol. 56 (12), 8489-8512 (2019).
- Chin, E., Goh, E.
- Miccoli, B., Braeken, D., Li, Y. E. Brain-on-a-chip Devices for Drug Screening and Disease Modeling Applications. Curr Pharm Des. 24 (45), 5419-5436 (2019).
- Giandomenico, S. L., et al. Cerebral organoids at the air-liquid interface generate diverse nerve tracts with functional output. Nat Neurosci. 22 (4), 669-679 (2019).
- Pellegrini, L., et al. Human CNS barrier-forming organoids with cerebrospinal fluid production. Science. 369 (6500), eaaz5626 (2020).
- Chhibber, T., et al. CNS organoids: an innovative tool for neurological disease modeling and drug neurotoxicity screening. Drug Discov Today. 25 (2), 456-465 (2020).
- Tang, X. Y., et al. Human organoids in basic research and clinical applications. Signal Transduct TargetTher. 7 (1), 168 (2022).
- Sutermaster, B. A., Darling, E. M. Considerations for high-yield, high-throughput cell enrichment: fluorescence versus magnetic sorting. Sci Rep. 9 (1), 227 (2019).
- Doughty, D., et al. Development of a novel purification protocol to isolate and identify brain microglia. Exp Biol Med. 247 (16), 1433-1446 (2022).
