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Immunology and Infection

ट्रांसलेशनल बायोमेडिकल रिसर्च में अनुप्रयोगों के लिए एक गोजातीय प्राथमिक एंटॉइड-व्युत्पन्न द्वि-आयामी मोनोलेयर संस्कृति प्रणाली का निर्माण

Published: April 5, 2024 doi: 10.3791/65901
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Farm Animal Medicine, College of Veterinary Medicine, Midwestern University

Summary

एंटरोइड्स ऊतक शरीर क्रिया विज्ञान और पैथोफिज़ियोलॉजी, दवा विकास और पुनर्योजी चिकित्सा के अध्ययन के लिए एक उपन्यास मॉडल के रूप में उभर रहे हैं। यहां, हम एक गोजातीय प्राथमिक सेल 2 डी एंटरॉइड-व्युत्पन्न संस्कृति प्रणाली का वर्णन करते हैं जो प्रासंगिक ऊतक कोशिका प्रकारों के साथ सह-संस्कृति की अनुमति देता है। यह मॉडल गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल अनुसंधान मॉडलिंग के लिए एक अनुवाद संबंधी लाभ प्रदान करता है।

Abstract

ऑर्गेनॉइड सेल कल्चर सिस्टम ऊतकों में देखी गई जटिलता को पुन: प्राप्त कर सकते हैं, जिससे उन्हें मेजबान-रोगज़नक़ इंटरैक्शन का अध्ययन करने, दवा प्रभावकारिता और विषाक्तता का मूल्यांकन करने और ऊतक बायोइंजीनियरिंग में उपयोगी बना दिया जा सकता है। हालांकि, वर्णित कारणों के लिए इन मॉडलों को लागू करना इन मॉडलों की त्रि-आयामी (3 डी) प्रकृति के कारण सीमित हो सकता है। उदाहरण के लिए, पाचन रोगों का अध्ययन करने के लिए 3 डी एंटॉइड कल्चर सिस्टम का उपयोग आंतों के लुमेन और इसके स्रावित पदार्थों की दुर्गमता के कारण चुनौतीपूर्ण है। दरअसल, रोगजनकों के साथ 3 डी ऑर्गेनोइड की उत्तेजना के लिए या तो ल्यूमिनल माइक्रोइंजेक्शन, 3 डी संरचना के यांत्रिक व्यवधान, या एपिकल-आउट एंटॉइड की पीढ़ी की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, इन ऑर्गेनोइड को प्रतिरक्षा और स्ट्रोमल कोशिकाओं के साथ सह-सुसंस्कृत नहीं किया जा सकता है, जो पैथोफिजियोलॉजिकल डायनेमिक्स में गहन यंत्रवत विश्लेषण को सीमित करता है। इसे दरकिनार करने के लिए, हमने एक गोजातीय प्राथमिक सेल द्वि-आयामी (2 डी) एंटॉइड-व्युत्पन्न मोनोलेयर संस्कृति प्रणाली को अनुकूलित किया, जिससे अन्य प्रासंगिक सेल प्रकारों के साथ सह-संस्कृति की अनुमति मिली। स्वस्थ वयस्क मवेशियों से अलग किए गए इलियल क्रिप्ट को 3 डी ऑर्गेनोइड उत्पन्न करने के लिए सुसंस्कृत किया गया था जो भविष्य में उपयोग के लिए क्रायोप्रिजर्व थे। पुनर्जीवित 3 डी एंटॉइड्स का उपयोग करके एक 2 डी मोनोलेयर बनाया गया था जो एकल कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए पारित और बाधित किया गया था, जो तहखाने झिल्ली निकालने-लेपित ट्रांसवेल सेल कल्चर आवेषण पर वरीयता प्राप्त थे, जिससे उनकी शिखर सतह उजागर हुई। आंतों की मोनोलेयर ध्रुवीयता, सेलुलर भेदभाव, और बाधा समारोह को इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके और ट्रांसपीथेलियल विद्युत प्रतिरोध को मापने की विशेषता थी। मोनोलेयर की एपिकल सतह की उत्तेजना ने मोनोलेयर की अपेक्षित कार्यक्षमता का खुलासा किया, जैसा कि एपिकल और बेसल दोनों डिब्बों से साइटोकिन स्राव द्वारा प्रदर्शित किया गया है। वर्णित 2 डी एंटॉइड-व्युत्पन्न मोनोलेयर मॉडल मेजबान-रोगज़नक़ इंटरैक्शन और आंतों के शरीर विज्ञान, दवा विकास और पुनर्योजी चिकित्सा की जांच में बहुत अच्छा वादा करता है।

Introduction

अनुसंधान में पशु मॉडल रोग पैथोफिज़ियोलॉजी और संक्रमण के दौरान मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया की गतिशीलता की हमारी समझ को बढ़ाने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं और उपन्यास निवारक और चिकित्सीय रणनीतियों 1,2,3,4के विकास का समर्थन करते हैं। ये मॉडल जानवरों में अनुसंधान खोज और उन्नति का समर्थन करते हैं और मानव स्वास्थ्य अनुसंधान की प्रगति के लिए महत्वपूर्ण हैं। दशकों से, कृंतक मॉडल ने प्रतिरक्षा तंत्र और मानव रोगों 3,5,6,7 के लिए मौलिक जीव विज्ञान अनुसंधान में प्रगति को रेखांकित किया है। जबकि कृंतक मॉडल स्क्रीनिंग और प्रारंभिक विकास अनुसंधान में महत्वपूर्ण हैं, बड़े पशु मॉडल चिकित्सीय प्रभावकारिता और सुरक्षा परीक्षण 1,3,4,5 सहित प्रारंभिक खोज और बाद के विकास अध्ययनों दोनों में मानव रोगों के शोध में अधिक प्रासंगिक तुलना प्रदान करते हैं। पशुधन क्रिप्टोस्पोरिडिओसिस, साल्मोनेलोसिस, तपेदिक, श्वसन सिंकिटियल वायरस औरब्रुसेलोसिस 1,7,8 सहित कुछ बीमारियों के लिए मानव अनुप्रयोगों के लिए अधिक कुशल अनुवाद के लिए कृंतक मॉडल की तुलना में स्पष्ट लाभ प्रदान करता है। दरअसल, ये रोग और अन्य मवेशियों में अनायास विकसित होते हैं, जो मनुष्यों के लिए कई समान रोग रोगजनन और प्रतिरक्षा प्रक्रियाओं को साझा करते हैं, और एक बहिष्कृत आबादी के रूप में, मवेशी मानव प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को प्रभावित करने वाली आनुवंशिक और पर्यावरणीय विविधता की नकल करते हैं 5,8,9,10 . संक्रामक रोग अनुसंधान के लिए गोजातीय मॉडल के लाभों को पहले एक परिष्कृत संस्कृति प्रणाली को नियोजित करके और फिर विवो अध्ययन में चरणबद्ध तरीके से लागू करके अधिकतम किया जा सकता है। एक अत्यधिक जटिल गोजातीय व्युत्पन्न संस्कृति प्रणाली का प्रारंभिक उपयोग सफल अनुवाद और अनुप्रयुक्त अनुसंधान की संभावना में सुधार करते हुए जीवित पशु अध्ययन की संख्या को काफी कम कर सकता है। संस्कृति मॉडल को इष्टतम भविष्य कहनेवाला वैधता के लिए एक अंग स्तर पर रोग प्रक्रियाओं को पुन: व्यवस्थित करना चाहिए, देशी ऊतक माइक्रोएन्वायरमेंट को स्थानिक और कार्यात्मक रूप से बनाए रखना चाहिए।

म्यूकोसल प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया एक बहुआयामी प्रणाली है जिसमें गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल एंटरोसाइट्स और म्यूकोसल सतह11के नीचे स्थित प्रतिरक्षा कोशिकाओं की विविध आबादी द्वारा गठित एक अत्यधिक कुशल बाधा शामिल है। जीआई होमियोस्टेसिस को बनाए रखने और एंटरिक रोगजनकोंके खिलाफ प्रतिरक्षा सुरक्षा शुरू करने में संक्रमण के दौरान यह अत्यधिक जटिल प्रणाली महत्वपूर्ण है। एंटरोसाइट्स और अंतर्निहित जन्मजात प्रतिरक्षा कोशिकाओं के बीच संचार रोगजनक सूक्ष्मजीवों के खिलाफ सुरक्षात्मक प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं के विकास की शुरुआत करता है। जैसे, संस्कृति प्रणालियों है कि जटिलता के अपने स्तर में तुलनात्मक हैं मेजबान आंत्र रोगज़नक़ बातचीत में एक इष्टतम जांच के लिए आवश्यक हैं और आंत्र शरीर क्रिया विज्ञान और दवा की खोज और विकास12,13 को समझने में अत्यधिक प्रभावी हैं. ऑर्गेनोइड एक मजबूत संस्कृति प्रणाली है जो मूल14,15 के ऊतक की वास्तुकला और कार्य जैसा दिखता है। इन मॉडलों की बहुकोशिकीयता विविध सेल आबादी की भूमिका और आंत्र स्वास्थ्य और रोग12,14 में शामिल सेलुलर बातचीत में जांच की अनुमति देता है. हालांकि, अनुसंधान में मानव-व्युत्पन्न ऑर्गेनॉइड मॉडल वर्तमान में मानव आंतों के उपकला कोशिकाओं की पर्याप्त मात्रा और लगातार गुणवत्ता और संस्कृति में सीमित सेल व्यवहार्यता प्राप्त करने की कठिनाई से सीमित हैं। अमर सेल लाइनों का उपयोग लगातार इन मॉडलों में समरूप संस्कृतियों की उच्च पैदावार प्राप्त करने के लिए किया जा सकता है; हालांकि, रूपांतरित कोशिकाओं स्वाभाविक रूप से विविधता और गैर तब्दील उपकला कोशिकाओं16,17 की कार्यात्मक जटिलता की कमी. गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल रोगों और शरीर विज्ञान की जांच के लिए एक मॉडल के रूप में गोजातीय ऊतक से प्राप्त संस्कृतियों का उपयोग करने के फायदों में आसानी शामिल है जिसके साथ ऊतक के नमूने लगातार स्वस्थ दाताओं से प्राप्त किए जा सकते हैं, बेहतर सेल व्यवहार्यता, और अधिक सेलुलर विविधता केवल गैर-अमर ऊतक के साथ प्राप्त की जा सकती है। तुलनात्मक ऊतक ट्रांसक्रिप्टोमिक्स और आंतों के ऑर्गेनोइड के लक्षण वर्णन संरक्षित ऑर्थोलॉगस जीन और मनुष्यों और मवेशियों के बीच सेलुलर क्षमता में समानताएं प्रकट करते हैं18. इसलिए, एक गोजातीय ऑर्गेनोइड-व्युत्पन्न संस्कृति प्रणाली मानव आंतों के रोगों की जांच में फायदेमंद हो सकती है, जिसके निष्कर्ष आसानी से मानव चिकित्सा के लिए अनुवाद योग्य हैं।

यहां वर्णित प्रोटोकॉल एक गोजातीय एंटॉइड-व्युत्पन्न 2 डी प्राथमिक सेल संस्कृति प्रणाली का उपयोग करके एंटरिक रोगजनकों या यौगिकों और आंतों के शरीर विज्ञान के लिए मेजबान प्रतिक्रियाओं का मूल्यांकन करने के लिए एक प्रभावी मंच का विवरण देता है। 3 डी ऑर्गेनोइड के विपरीत, ट्रांसवेल आवेषण पर उत्पन्न 2 डी संस्कृति प्रणाली प्रतिरक्षा या स्ट्रोमल कोशिकाओं के साथ आंतों की कोशिकाओं की दोहरी संस्कृति की अनुमति देती है, जिससे ऊतक-स्तर की गतिशीलता में अध्ययन की अनुमति मिलती है। जैव चिकित्सा अनुसंधान, दवा विकास और प्रभावकारिता परीक्षण में अनुप्रयोगों के साथ, यह शारीरिक रूप से प्रासंगिक मॉडल मवेशियों और लोगों दोनों के स्वास्थ्य और उन्नति को समान रूप से लाभान्वित कर सकता है।

Protocol

सभी प्रोटोकॉल पशु कल्याण के लिए संस्थागत और राष्ट्रीय दिशानिर्देशों और नियमों के अनुपालन में किए गए थे।

1. अभिकर्मक तैयारी

नोट: इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले अभिकर्मकों के स्टॉक और अंतिम सांद्रता तालिका 1में सूचीबद्ध हैं।

  1. नमूना संग्रह बफर तैयार करें: 1 एल बर्फ-ठंडा फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) जिसमें पेनिसिलिन (100 यू / एमएल), स्ट्रेप्टोमाइसिन (100 माइक्रोग्राम / एमएल), जेंटामाइसिन (25 माइक्रोग्राम / एमएल), और कैस्पोफंगिन (2.5 माइक्रोग्राम / एमएल) शामिल हैं। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टॉक समाधान स्टोर करें।
  2. पृथक्करण अभिकर्मक # 1 तैयार करें: नमूना संग्रह बफर के 18.55 एमएल मिलाएं (जैसा कि चरण 1.1 में वर्णित है), एथिलीनडायमिनेटेट्राएसेटिक एसिड (ईडीटीए, 0.422 एम / पीएच 7.4) के 1.422 एमएल, 1 एम 1,4-डाइथियोथ्रेइटोल (डीटीटी) समाधान के 20 माइक्रोन, वाई -27632 समाधान (5000x/50 मिमी) के 4 माइक्रोन। समाधान को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  3. पृथक्करण अभिकर्मक #2 तैयार करें: संग्रह बफर के 18.57 एमएल मिलाएं (जैसा कि चरण 1.1 में वर्णित है), ईडीटीए के 1.422 एमएल (0.422 एम / पीएच 7.4), वाई -27632 समाधान के 4 माइक्रोन (5000x/50 मिमी)। समाधान को 37 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  4. एंटरॉइड ग्रोथ मीडिया स्टॉक तैयार करें: ऑर्गेनॉइड ग्रोथ मीडियम प्लस सप्लीमेंट का 9.875 एमएल, पेनिसिलिन का 100 माइक्रोन (100 यू/एमएल), स्ट्रेप्टोमाइसिन (100 माइक्रोग्राम/एमएल), जेंटामाइसिन का 5 डिग्री एल (25 माइक्रोग्राम/एमएल), और कैस्पोफंगिन का 20 डिग्री एल (2.5 माइक्रोग्राम/एमएल) मिलाएं। समाधान को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  5. एंटरॉइड भेदभाव मीडिया स्टॉक तैयार करें: ऑर्गेनॉइड भेदभाव माध्यम प्लस पूरक के 10 एमएल, पेनिसिलिन के 100 माइक्रोन (100 यू / एमएल), स्ट्रेप्टोमाइसिन (100 माइक्रोन / एमएल), जेंटामाइसिन के 5 माइक्रोन (25 माइक्रोन / एमएल), और कैस्पोफंगिन के 20 माइक्रोन (2.5 माइक्रोन / एमएल) मिलाएं। -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर समाधान।
  6. वॉश मीडिया तैयार करें: डीएमईएम/एफ-12 1.1 मध्यम (एल-ग्लूटामाइन के साथ, एचईपीईएस के बिना), विटामिन ए (50x स्टॉक) के बिना बी-27 पूरक के 1 एमएल, पेनिसिलिन के 500 माइक्रोन (100 यू/एमएल), स्ट्रेप्टोमाइसिन (100 माइक्रोग्राम/एमएल), जेंटामाइसिन के 25 माइक्रोन (50 मिलीग्राम/एमएल स्टॉक), और कैस्पोफंगिन के 25 माइक्रोन (5 मिलीग्राम/एमएल स्टॉक) मिलाएं। समाधान को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  7. कोटिंग बफर तैयार करें: डीएमईएम के 25 एमएल मिलाएं: अवरोधकों के बिना एफ 12 पूर्ण मीडिया और 25 मिलीग्राम गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन (बीएसए)। समाधान को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

2. पूरे ऊतक से आंतों के क्रिप्ट का अलगाव (चित्र 1)

नोट: गोजातीय छोटे आंतों के एंटॉइड एक स्थानीय बीफ़ प्रसंस्करण संयंत्र से स्वस्थ वयस्क होल्स्टीन स्टीयर (>2 वर्ष की आयु) से प्राप्त इलियल ऊतक से उत्पन्न हुए थे। प्रयोगों की इस श्रृंखला के लिए एक दाता का उपयोग किया गया था।

  1. आंतों के ऊतकों के नमूनों की तैयारी
    1. कटे हुए ~ 10 इंच (25 सेमी) आंतों के ऊतकों के नमूनों को ~ 400 एमएल बर्फ-ठंडे संग्रह बफर (पीबीएस + एंटीबायोटिक्स/एंटीमायोटिक्स) में और प्रयोगशाला में परिवहन के लिए बर्फ पर रखें।
    2. सर्जिकल कैंची (जैसे, मेयो कैंची) और संदंश (जैसे, adson संदंश) का उपयोग करके, आंतों के ऊतकों के नमूने से अतिरिक्त वसा और मेसेंटरी को हटा दें।
    3. ऊतक को दो बराबर टुकड़ों में काटें।
    4. सर्जिकल कैंची के साथ ऊतक अनुदैर्ध्य खोलें और बाँझ पीबीएस में ऊतक कुल्ला.
    5. धीरे एक बाँझ ग्लास खुर्दबीन स्लाइड के पक्ष का उपयोग आंतों के नमूने के बलगम परत को हटाने और ताजा पीबीएस के साथ ऊतक कुल्ला.
      नोट: यह कदम विली को हटाने में मदद करता है और बाद के चरणों में क्रिप्ट अंशों की शुद्धता बढ़ाने में मदद करता है।
    6. प्रत्येक 5-इंच (13 सेमी) टुकड़े के लिए, ऊतक को दो 2.5 इंच (6.5 सेमी) में काट लें और फिर ऊतक पृथक्करण की सुविधा के लिए प्रत्येक टुकड़े को लगभग 4 बराबर छोटे टुकड़ों में काट लें।
  2. आंतों के ऊतकों का पृथक्करण
    1. एक बाँझ 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में ऊतक पृथक्करण अभिकर्मक #1 की 20 एमएल मात्रा तैयार करें और शंक्वाकार ट्यूब में छोटे ऊतक के नमूनों को जमा करें जब तक कि वॉल्यूम विस्थापन मेनिस्कस को 20 एमएल चिह्न से शंक्वाकार ट्यूब पर 35 एमएल के निशान तक नहीं ले जाता है।
    2. शेष छोटी आंत ऊतक नमूना टुकड़े के लिए ऊपर कदम दोहराएँ.
    3. पैराफिल्म के साथ शंक्वाकार ट्यूबों को सील करें और शंक्वाकार ट्यूब को 10 बार मैन्युअल रूप से हिलाएं।
      नोट: प्रोटोकॉल के दौरान, मैनुअल मिलाते हुए एक जानबूझकर लेकिन कोमल तरीके से किया जाना चाहिए.
    4. शंक्वाकार ट्यूबों को क्षैतिज रूप से बर्फ पर एक कंटेनर में एक कक्षीय मिलाते हुए मंच पर रखें।
    5. कंटेनर में बर्फ पर शंक्वाकार ट्यूबों को 80 क्रांतियों प्रति मिनट (आरपीएम) पर 30 मिनट के लिए हिलाएं। हर 10 मिनट, मैन्युअल रूप से शंक्वाकार ट्यूब हिला.
    6. 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में पूर्व-गर्म (37 डिग्री सेल्सियस) ऊतक पृथक्करण अभिकर्मक #2 (ऊपर के रूप में तैयार किया गया, लेकिन डीटीटी के बिना) की 20 एमएल मात्रा तैयार करें। पृथक्करण अभिकर्मक #1 युक्त शंक्वाकार ट्यूबों से ऊतक के नमूने जमा करें जिसमें पृथक्करण अभिकर्मक #2 होता है।
    7. पैराफिल्म के साथ शंक्वाकार ट्यूबों को सील करें और शंक्वाकार ट्यूबों को 10 बार मैन्युअल रूप से हिलाएं।
    8. शंक्वाकार ट्यूबों को पूर्व-गर्म (37 डिग्री सेल्सियस) मिलाते हुए पानी के स्नान में रखें, लगभग 60 डिग्री सेल्सियस कोण पर झुका हुआ है, और 10 मिनट के लिए 150 आरपीएम पर हिलाएं, 5 मिनट के बाद मैनुअल झटकों के साथ और फिर कुल 10 मिनट इनक्यूबेशन के बाद।
  3. क्रिप्ट टुकड़ों का अलगाव
    1. लेबल 10 बाँझ शंक्वाकार ट्यूब #1 - #10. प्रत्येक लेबल शंक्वाकार ट्यूब के लिए बाँझ बर्फ ठंड पीबीएस के 20 एमएल जोड़ें.
    2. शंक्वाकार ट्यूबों से ऊतक के टुकड़ों को हदबंदी अभिकर्मक #2 को एक नए बाँझ 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में बर्फ-ठंडा पीबीएस #1 युक्त स्थानांतरित करें।
    3. मैन्युअल रूप से शंक्वाकार ट्यूबों को 10 बार हिलाएं।
    4. पैराफिल्म के साथ शंक्वाकार ट्यूबों को सील करें और उन्हें बर्फ पर क्षैतिज रूप से रखें। 80 आरपीएम पर 10 मिनट के लिए एक कक्षीय प्रकार के बरतन पर शंक्वाकार ट्यूबों हिला. 10 मिनट के बाद, मैन्युअल रूप से शंक्वाकार ट्यूब #1 10 बार हिला. इसे वॉश # 1 माना जाता है।
    5. धीरे शंक्वाकार ट्यूब #2 करने के लिए शल्य चिकित्सा संदंश की एक जोड़ी का उपयोग ऊतक नमूने हस्तांतरण.
    6. 2.3.2 - 2.3.4 कदम दोहराएँ, यह धो # 2 माना जाता है.
    7. # 10 धोने तक धोने दोहराएं।
    8. प्रत्येक धोने से supernatants में क्रिप्ट होते हैं जिनका उपयोग एंटरॉइड पीढ़ी के लिए किया जाएगा। 4 डिग्री सेल्सियस पर सतह पर सतह पर सवार ट्यूबों रखें जब तक सभी 10 washes पूरा कर रहे हैं.
    9. 10वें धोने के बाद पूरा हो गया है और ऊतक अनुभाग त्याग दिया है, अलग क्रिप्ट गोली करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए 400 x ग्राम पर शंक्वाकार ट्यूबों # 6- # 10 के सतह पर तैरनेवाला अपकेंद्रित्र.
      नोट: वॉश 6-10 में सीमित मलबे और एकल कोशिकाओं के साथ बरकरार क्रिप्ट के सबसे साफ अंश होते हैं। जैसे, यह अनुशंसा की जाती है कि केवल इन अंशों का उपयोग एंटॉइड पीढ़ी के लिए किया जाता है, और पहले के वॉश (# 2- # 5) को छोड़ दिया जाता है)
    10. सतह पर तैरनेवाला त्यागें और बिना निलंबित किए क्रिप्ट में ताजा, बर्फ-ठंडा पीबीएस के 4 एमएल जोड़ें (यह माइक्रोस्कोपी तक टुकड़ों को बरकरार रखने में मदद करता है)।
    11. माइक्रोस्कोपी द्वारा प्रत्येक शंक्वाकार ट्यूबों # 6- # 10 के लिए अलग क्रिप्ट की शुद्धता का आकलन करें।
      1. एक 384 अच्छी तरह से थाली के लिए पीबीएस के 50 माइक्रोन जोड़ें.
      2. पीबीएस में क्रिप्ट निलंबन के 10 माइक्रोन जोड़ें और क्रिप्ट शुद्धता, अखंडता और गिनती निर्धारित करने के लिए 40x आवर्धन उद्देश्य लेंस का उपयोग करें।
        नोट: प्लेट के तल पर एक क्रॉस खींचना अच्छी तरह से गिनती आसान बनाता है।

3. पूर्व विवो पीढ़ी और गोजातीय इलियल एंटॉइड्स का मार्ग(चित्र 2)

नोट: सबसे शुद्ध, बरकरार आंतों के क्रिप्ट के साथ शंक्वाकार ट्यूबों से क्रिप्ट का उपयोग डाउनस्ट्रीम परख के लिए किया जाएगा। सभी चरणों के लिए जिसमें क्रिप्ट और एंटॉइड्स, पिपेट टिप्स, सेल स्क्रैपर्स और ट्यूब शामिल हैं, कोटिंग बफर के साथ पूर्व-लेपित होना चाहिए, और क्रिप्ट के नुकसान को रोकने के लिए बुलबुले से बचा जाना चाहिए। जब तक अन्यथा न कहा गया हो, क्रिप्ट टुकड़ों को तोड़ने से रोकने के लिए 1000 माइक्रोन पिपेट टिप का उपयोग किया जाना चाहिए।

  1. क्रिप्ट टुकड़ों से एंटॉइड उत्पन्न करना
    1. शुद्धतम क्रिप्ट अंशों (आमतौर पर #6-#10) को एक शंक्वाकार ट्यूब में मिलाएं।
    2. शंक्वाकार ट्यूब को 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिन के लिए 400 x ग्राम पर क्रिप्ट युक्त अपकेंद्रित्र।
    3. यह एक विंदुक के साथ aspirating द्वारा सतह पर तैरनेवाला त्यागें और वॉश मीडिया में क्रिप्ट गोली resuspension.
    4. चरण 3.1.2 के रूप में अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला छानना और क्रिप्ट गोली के लिए वॉश मीडिया के 2 एमएल जोड़ें.
    5. चरण 2.3.11.1 में वर्णित के रूप में क्रिप्ट की संख्या की गणना करें।
    6. चरण 3.1.2 के रूप में सेंट्रीफ्यूज क्रिप्ट को गोली देने के लिए, सतह पर तैरनेवाला त्यागें, और लगभग 400 क्रिप्ट / 100 माइक्रोन की एकाग्रता प्राप्त करने के लिए बर्फ-ठंडे 100% कम विकास कारक तहखाने झिल्ली बाह्य मैट्रिक्स (बीएमई) में फिर से निलंबित करें।
      नोट: बीएमई को 4 डिग्री सेल्सियस पर ठीक से पिघलाना महत्वपूर्ण है क्योंकि तापमान में परिवर्तन इसकी स्थिरता को बदल देता है। बीएमई को कूलिंग ब्लॉक और प्री-चिल्ड पिपेट टिप्स का उपयोग करके समय से पहले जमने से रोका जा सकता है।
      1. एक और तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स सूत्रीकरण का उपयोग गुंबद बनाते समय बीएमई के कमजोर पड़ने की आवश्यकता हो सकती है। उपयोग किए जा रहे बीएमई के लिए विशिष्ट निर्माता निर्देशों का संदर्भ लें।
    7. बीएमई में क्रिप्ट को अच्छी तरह से निलंबित करने के लिए ऊपर और नीचे पाइप।
    8. 8 गुंबदों / अच्छी तरह से 37 डिग्री सेल्सियस पर सेट वार्मिंग प्लेट पर 6-अच्छी तरह से टिशू कल्चर प्लेट पर क्रिप्ट-बीएमई निलंबन के 50 माइक्रोन को धीरे-धीरे पाइप करके क्रिप्ट-बीएमई गुंबद बनाएं।
      नोट: 6 अच्छी तरह से थाली गुंबदों की चढ़ाना से पहले रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर एक इनक्यूबेटर में पूर्व गर्म किया जाना चाहिए.
    9. ध्यान से एक 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 इनक्यूबेटर के लिए थाली ले जाने से पहले 1 मिनट के लिए वार्मिंग प्लेट पर 6 अच्छी तरह से थाली रखें.
    10. 2 मिनट के बाद, 6 अच्छी तरह से थाली फ्लिप तो ढक्कन नीचे का सामना करना पड़ रहा है और गुंबदों polymerize करने के लिए अनुमति देने के लिए एक अतिरिक्त 30 मिनट के लिए सेते हैं.
    11. 30 मिनट के बाद, ध्यान से गुंबदों युक्त कुओं के लिए 10 माइक्रोन SB202190, 0.5 माइक्रोन LY2157299, और 10 माइक्रोन वाई -27632 के साथ पूरक कमरे के तापमान (आरटी) एंटॉइड ग्रोथ मीडिया के 3 एमएल जोड़ें।
    12. 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 पर सेते हैं।
    13. मीडिया निकालें और हर 2-3 दिनों में अवरोधकों के साथ पूरक ताजा एंटॉइड ग्रोथ मीडिया के साथ बदलें।
  2. एंटॉइड का पासिंग
    1. 7-10 दिनों के बाद, सुनिश्चित करें कि क्रिप्ट ने कई नवोदित संरचनाओं के साथ 3 डी एंटॉइड का गठन किया है, जैसा कि चित्र 2E में है, और पारित होने के लिए तैयार हैं।
    2. गुंबदों वाले कुओं से मीडिया को त्यागें।
    3. प्रति कुएं प्रत्येक 4 गुंबदों के लिए, प्रत्येक अच्छी तरह से युक्त गुंबदों के लिए 10 माइक्रोन वाई -27632 के साथ पूरक बर्फ-ठंडा गैर-एंजाइमैटिक सेल पृथक्करण समाधान के 1 एमएल जोड़ें।
    4. एक पूर्व लेपित सेल खुरचनी का प्रयोग, धीरे ऊतक संस्कृति प्लेट से गुंबद अलग.
    5. एक 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में enteroids लीजिए और ऊपर और नीचे 10 बार pipetting द्वारा triturate.
    6. 10 मिनट के लिए 80 आरपीएम पर एक कक्षीय प्रकार के बरतन पर आरटी पर खंडित enteroids युक्त शंक्वाकार ट्यूब सेते हैं.
    7. एंटॉइड में 10 माइक्रोन वाई -27632 के साथ बर्फ-ठंडा वॉश मीडिया के 10 एमएल जोड़ें।
    8. आरटी पर 5 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर शंक्वाकार ट्यूब अपकेंद्रित्र.
    9. सतह पर तैरनेवाला त्यागें और ताजा वॉश मीडिया के 10 एमएल में गोली को फिर से निलंबित करें और एक नई 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    10. आरटी पर 5 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर शंक्वाकार ट्यूब अपकेंद्रित्र.
    11. सतह पर तैरनेवाला त्यागें और 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में एंटरॉइड ग्रोथ मीडिया के 1 एमएल में गोली को फिर से निलंबित करें।
    12. आरटी पर 5 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब को सेंट्रीफ्यूज करें और सतह पर तैरनेवाला को त्याग दें।
    13. बर्फ-ठंडे 100% बीएमई में एंटरॉइड गोली को फिर से निलंबित करें और चरणों का पालन करें 3.1.6-3.1.13.
    14. हर 7 दिनों में एंटॉइड को फिर से पारित करें। नवोदित घनत्व, व्यवहार्यता और सीमा के कारण विस्तार का समय भिन्न हो सकता है। बड़ी एंटॉइड संरचनाएं बनाने वाली कई नवोदित संरचनाएं एंटॉइड के संकेत हैं जिन्हें पारित करने की आवश्यकता है।
  3. एंटॉइड्स का क्रायोप्रिजर्वेशन
    1. क्रायोप्रिजर्वेशन के लिए, सुनिश्चित करें कि एंटॉइड संस्कृति में पांच बार से अधिक पारित नहीं होते हैं।
      नोट: यह प्रयोगात्मक रूप से परीक्षण नहीं किया गया है और लेखकों के अवलोकन पर आधारित है कि बाद के मार्ग ने व्यवहार्यता को कम कर दिया है और परिवर्तनशील परिणाम प्राप्त किए हैं।
    2. एंटॉइड की कटाई के लिए, चरण 3.2.2-3.2.9 में वर्णित पृथक्करण बफर का उपयोग करें।
      नोट: यंत्रवत् एक 5 एमएल pipet का उपयोग कर enteroids अलग करना.
    3. चरण 2.3.11.1 में वर्णित एंटॉइड टुकड़ों की संख्या की गणना करें।
    4. आरटी पर 5 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर शंक्वाकार ट्यूब अपकेंद्रित्र.
    5. सतह पर तैरनेवाला त्यागें और पूर्व लेबल क्रायोवियल्स में ~ 2000 enteroid टुकड़े/एमएल और विभाज्य 1 एमएल की एकाग्रता प्राप्त करने के लिए 10 माइक्रोन Y-27632 के साथ पूरक क्रायोप्रेज़र्वेशन मीडिया में enteroid टुकड़े resuspended है.
    6. क्रायोवियल्स को एक नियंत्रित फ्रीजिंग कंटेनर में रखें और रात भर -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    7. क्रायोवियल्स को दीर्घकालिक भंडारण के लिए वाष्प-चरण तरल नाइट्रोजन में स्थानांतरित करें।
  4. आंतों के क्रिप्ट टुकड़ों का पुनर्जीवन
    1. इनक्यूबेटर के अंदर रात भर एक 6 अच्छी तरह से थाली रखें.
    2. कोटिंग मीडिया के 5 एमएल के साथ 5 एमएल ट्यूब को प्री-कोट।
    3. तरल नाइट्रोजन भंडारण से क्रायोवियल्स निकालें।
    4. तुरंत, एक बार पिघलने के बाद, क्रायोवियल से प्री-लेपित 5 एमएल ट्यूब में क्रिप्ट स्थानांतरित करें। वॉश मीडिया के साथ क्रायोवियल को कुल्ला और 5 एमएल ट्यूब में जोड़ें। बुलबुले से बचें।
    5. वॉश मीडिया के साथ वॉल्यूम को 5 एमएल तक लाएं और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए 400 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र करें।
    6. सेंट्रीफ्यूजेशन के दौरान, कोटिंग मीडिया के साथ एक 1.5 एमएल ट्यूब को प्री-कोट करें।
    7. सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, सतह पर तैरनेवाला डालना, ट्यूब में शेष मीडिया में गोली को फिर से निलंबित करना, और पूर्व-लेपित 1.5 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करना। वॉश मीडिया के साथ 5 एमएल ट्यूब धो लें और इसे 1.5 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए 400 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र।
    8. एंटरॉइड ग्रोथ मीडिया के साथ वॉल्यूम को 1.5 एमएल तक लाएं।
    9. ऊपर के रूप में अपकेंद्रित्र (चरण 3.4.7), और ध्यान से महाप्राण।
    10. बीएमई को 4 डिग्री सेल्सियस से लें और बर्फ/बर्फ ब्लॉक पर रखें।
    11. आइस-कोल्ड 100% बीएमई में एंटरॉइड गोली को फिर से निलंबित करें और चरणों 3.1.6- 3.1.12 का पालन करें।
    12. हर 2-3 दिनों में मीडिया बदलें।

4. 3D एंटॉइड से 2D मोनोलेयर का निर्माण और मूल्यांकन

नोट: ऊपर के रूप में, सभी चरणों के लिए जिसमें क्रिप्ट और एंटॉइड्स, पिपेट टिप्स, सेल स्क्रैपर्स और ट्यूबों को कोटिंग बफर के साथ पूर्व-लेपित किया जाना चाहिए, और क्रिप्ट के नुकसान को रोकने के लिए बुलबुले से बचा जाना चाहिए।

  1. 2 डी मोनोलेयर गठन के लिए ट्रांसवेल आवेषण की तैयारी
    1. एक 24 अच्छी तरह से टिशू कल्चर एडाप्टर प्लेट में आवेषण रखें और एंटरॉइड ग्रोथ मीडिया में बीएमई के 1:15 कमजोर पड़ने के 100 माइक्रोन के साथ 1 माइक्रोन पीईटी 24-अच्छी तरह से सेल संस्कृति आवेषण के शिखर पक्ष को पूर्व-कोट करें। हमेशा एक अतिरिक्त डालने है कि एक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जाएगा जब बाधा अखंडता माप ले.
    2. इनक्यूबेटर में एक 24 अच्छी तरह से टिशू कल्चर एडाप्टर प्लेट में लेपित डालने रखें.
      नोट: ट्रांसवेल आवेषण के साथ एक विशिष्ट एडाप्टर या साथी टिशू कल्चर प्लेट का उपयोग किया जाना चाहिए।
    3. पोलीमराइजेशन की अनुमति देने के लिए 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 पर संस्कृति आवेषण को इनक्यूबेट करें।
      नोट: बीएमई-लेपित ट्रांसवेल्स को पैराफिल्म के साथ सील किया जा सकता है और तुरंत उपयोग नहीं किए जाने पर 1 सप्ताह तक 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
    4. इनक्यूबेशन के अंत में, 3 डी enteroid संस्कृति माध्यम महाप्राण.
  2. 3 डी एंटॉइड का पृथक्करण
    1. क्रायोप्रेज़र्व्ड एंटॉइड टुकड़ों से 2 डी एंटॉइड मोनोलेयर उत्पन्न करें जिन्हें 3 डी एंटॉइड बनाने के लिए धारा 3.1 में ऊपर वर्णित पुनर्जीवित, चढ़ाया और सुसंस्कृत किया गया था। पिघले हुए एंटॉइड्स को कम से कम दो बार पास करें, अंतिम मार्ग 2 डी मोनोलेयर संस्कृतियों को उत्पन्न करने के लिए प्रसंस्करण से पहले कम से कम 5 दिनों के लिए सुसंस्कृत किया गया है।
    2. एंटरॉइड गुंबदों के लिए 10 माइक्रोन वाई -27632 के साथ पूरक बर्फ-ठंडा वॉश मीडिया जोड़कर एंटॉइड की कटाई करें (4 गुंबदों के लिए लगभग 1 एमएल पृथक्करण बफर का उपयोग करें)
    3. एक सेल खुरचनी के साथ गुंबदों को अलग करें और उन्हें 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में इकट्ठा करें।
    4. enteroid टुकड़े उत्पन्न करने के लिए एक 1 एमएल विंदुक टिप का उपयोग कर 30 बार triturate.
    5. एंटरॉइड टुकड़ों को और तोड़ने के लिए 200 माइक्रोन पिपेट टिप के साथ 40 बार ट्राइट्यूरेट करें।
    6. बर्फ ठंडा वॉश मीडिया के साथ 10 एमएल करने के लिए enteroid टुकड़े के साथ 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब की मात्रा लाओ.
    7. आरटी पर 5 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर शंक्वाकार ट्यूब अपकेंद्रित्र.
    8. बीएमई परत सहित सतह पर तैरनेवाला एस्पिरेट, ध्यान रखें कि एंटॉइड गोली को परेशान न करें।
      नोट: बीएमई परत गोली के ठीक ऊपर एक बादल जिलेटिनस परत के रूप में दिखाई देगी।
    9. प्रत्येक 4 गुंबदों के लिए, Y-27632 के 10 माइक्रोन के साथ पूरक पूर्व-गर्म TrypLE एक्सप्रेस एंजाइम के 1 एमएल में गोली को फिर से निलंबित करें।
    10. एक 24 अच्छी तरह से थाली के लिए enteroid-TrypLE मिश्रण जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं, 10 मिनट के लिए 5% सीओ2 .
    11. 10 मिनट के बाद, एंटॉइड को आगे टुकड़े करने के लिए 1 एमएल विंदुक का उपयोग करके 40 बार एंटरॉइड-ट्रिपल मिश्रण को पाइप करें।
    12. फिर, एकल कोशिकाओं में टुकड़ों को तोड़ने के लिए 200 माइक्रोन पिपेट के साथ 40 बार पिपेट टुकड़े करता है।
    13. एक बाँझ 22-जी सुई संलग्न के साथ एक 3 एमएल या 5 एमएल सिरिंज का उपयोग करना, महाप्राण और एकल सेल निलंबन को प्राप्त करने के लिए 4 बार सेल निलंबन बांटना।
    14. माइक्रोस्कोपी द्वारा सेल पृथक्करण की निगरानी करें जैसा कि चरण 2.3.11.1 में वर्णित है, जब तक कि 80% एंटॉइड एकल कोशिकाओं में टूट नहीं जाते।
    15. एक 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में सेल निलंबन लीजिए और 10% FBS के साथ पूरक वॉश मीडिया की 4x मात्रा जोड़कर एंजाइमी प्रतिक्रिया बुझाना.
    16. एक पूर्व लेपित 40 माइक्रोन सेल झरनी के माध्यम से दो बार एक 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में enteroids फ़िल्टर.
    17. 5 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर शंक्वाकार ट्यूब अपकेंद्रित्र द्वारा एकल कोशिकाओं गोली.
  3. ट्रांसवेल आवेषण पर 2 डी मोनोलेयर सीडिंग।
    1. सतह पर तैरनेवाला छानना और आरटी पर 20% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) के साथ पूरक organoid विकास मीडिया की एक छोटी मात्रा (~ 600 μL) में गोली resuspend.
    2. Trypan ब्लू डाई बहिष्करण विधि, hemacytometer, या स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग कर enteroid सेल घनत्व और व्यवहार्यता का निर्धारण. 75% की औसत व्यवहार्यता अपेक्षित है।
    3. ध्यान से अतिरिक्त कोटिंग समाधान सेल संस्कृति डालने से कदम 1.3 में लागू बस कोशिकाओं बोने से पहले हटा दें.
    4. एक पूर्व लेपित सेल संस्कृति डालने के शिखर सतह पर डालने के लिए 200 माइक्रोन प्रति डालने की मात्रा में 1 एक्स 105 कोशिकाओं पर एकल कोशिकाओं बीज.
    5. सेल संस्कृति डालने के basolateral पक्ष के लिए 20% FBS के साथ पूरक पूरा मीडिया के 700 माइक्रोन जोड़ें.
    6. कोशिकाओं डालने पर समान रूप से फैल करने के लिए अनुमति देने के लिए संख्या 8 के आकार में 10 बार थाली पैंतरेबाज़ी.
    7. जैव सुरक्षा कैबिनेट में 10 मिनट के लिए प्लेट गर्म पर थाली रखें.
    8. प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर इनक्यूबेट करें।
    9. 48 घंटे के बाद, 20% एफबीएस और अवरोधकों के साथ पूरक ताजा एंटरॉइड ग्रोथ मीडिया के साथ एपिकल और बेसल डिब्बों पर मीडिया को बदलें।
    10. तीसरे दिन, एपिकल और बेसोलेटरल डिब्बों से मीडिया को हटा दें, ध्यान से 1x पीबीएस के साथ डालने को धो लें, और इसे केवल अवरोधकों के साथ पूरक एंटरॉइड भेदभाव मीडिया के साथ बदलें।
    11. हर 2-3 दिनों में दोनों डिब्बों में मीडिया बदलें।
  4. उपकला बाधा अखंडता और मोनोलेयर संगम का मात्रात्मक माप
    नोट: ट्रान्सपीथेलियल विद्युत प्रतिरोध (टीईईआर) को मापने के लिए उपकला वोल्टोहममीटर का उपयोग करके बैरियर अखंडता का आकलन किया जा सकता है।
    1. इनक्यूबेटर से ट्रांसवेल संस्कृति प्लेट निकालें और यह जैव सुरक्षा कैबिनेट में कुछ मिनट के लिए आरटी पर संतुलित करने के लिए अनुमति देते हैं.
    2. सुनिश्चित करें कि STX2 इलेक्ट्रोड को पूर्व-वातानुकूलित किया गया है और वोल्टोहैमीटर को निर्माता के निर्देशों के अनुसार 1000Ω तक कैलिब्रेट किया गया है।
    3. जांच की लंबी छड़ी को बेसोलेटरल डिब्बे में और छोटे छोर को ट्रांसवेल एपिथेलियल सेल कल्चर के एपिकल डिब्बे में डालें। ध्यान रखें कि मोनोलेयर को बाधित न करें या इंसर्ट को नुकसान न पहुंचाएं।
    4. एक बार स्थिर, कोशिकाओं के बिना डालने सहित, ट्रांसवेल डालने प्रति 3 टीईईआर माप रिकॉर्ड करें। प्रत्येक डालने के लिए माप का एक औसत ले लो.
    5. प्रयोगात्मक कुओं के औसत माप से रिक्त अच्छी तरह से के औसत माप घटाकर और फिर उपकला बाधा (TEER [Ω.cm2] = [Rcell परत - Rblank] × क्षेत्र) के प्रतिरोध को निर्धारित करने के लिए डालने की सतह क्षेत्र से गुणा करके सही TEER मूल्य की गणना करें।

Representative Results

2 डी enteroid व्युत्पन्न monolayers उत्पन्न करने में पहला कदम ऊतक पृथक्करण के लिए काटा आंतों के ऊतकों (चित्रा 1 ए) के अनुभाग तैयार करने के लिए है. यह संलग्न वसा और ऊतक (चित्रा 1 बी) से मेसेंटरी को हटाने के द्वारा किया जाता है, इसके बाद ऊतक को अनुदैर्ध्य रूप से काटने के बाद लुमेन सतह को बेनकाब करने के लिए ताकि आंत की बलगम परत को ग्लास स्लाइड का उपयोग करके कोमल स्क्रैपिंग द्वारा हटाया जा सके। कटाई आंतों अनुभाग तो उत्तरोत्तर छोटे ऊतक वर्गों (चित्रा 1C) हदबंदी की आसानी बढ़ाने के लिए में कटौती की है. क्रिप्ट तो अंतर्निहित उप mucosal ऊतक से अलग कर रहे हैं केलेशन बफ़र्स (चित्रा 1 डी, ई) और पीबीएस से मिलकर washes की एक श्रृंखला का उपयोग कर. पृथक आंतों के क्रिप्ट (चित्रा 1 एफ) तो तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स गुंबदों (चित्रा 2 ए) में एम्बेडेड हैं और 3 डी एंटॉइड उत्पन्न करने के लिए कई दिनों के लिए सुसंस्कृत हैं। गोजातीय इलियम के 10 इंच के खंड से, लगभग 900,000 क्रिप्ट को अलग किया जा सकता है और एंटरॉइड गठन के लिए उपयोग किया जा सकता है। संस्कृति में बस कुछ ही घंटों के बाद, मढ़वाया तह और enterospheres(चित्रा 2B) में विकसित करने के लिए शुरू. 2 दिनों के बाद, एक अच्छी तरह से परिभाषित लुमेन देखा जा सकता है (चित्रा 2 सी), नवोदित संरचनाओं के साथ संस्कृति में दिन 4 के रूप में जल्दी उल्लेख किया गया है (चित्रा 2 डी)। 7 दिन तक, परिपक्व एंटॉइड विकसित हो गए हैं(चित्र 2ई)। 7-दिन पुराने 3 डी एंटॉइड का इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला हो जाना विभिन्न सेल वंशों की उपस्थिति को प्रदर्शित करता है। एंटॉइड्स की कन्फोकल माइक्रोस्कोपी डीएपीआई परमाणु दाग के स्थानीयकरण को प्रदर्शित करती है, ई-कैडरिन प्रोटीन एडेरेंस जंक्शन पर, क्रोमोग्रानिन-ए (सीआर-ए) एंटरोएंडोक्राइन कोशिकाओं की उपस्थिति दिखाते हुए, लाइसोजाइम (एलवाईजेड) पनेथ कोशिकाओं का प्रदर्शन करता है, और साइटोकैटिन -18 (सीके -18) चित्रा 3 में एंटरोसाइट कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करता है। संस्कृति में 7-10 दिनों के बाद, एंटॉइड को आगे विस्तार की अनुमति देने और भीड़भाड़ को रोकने के लिए पारित किया जाना चाहिए। एंटॉइड पारित करने का इष्टतम समय प्रारंभिक प्राथमिक क्रिप्ट अलगाव के 7-10 दिनों के बाद निर्धारित किया गया था और अंततः संस्कृति में एंटॉइड के स्वास्थ्य और विकास दर पर निर्भर है। वांछित एंटॉइड आकृति विज्ञान और व्यवहार्यता प्राप्त करने के लिए इष्टतम सीडिंग घनत्व, जैसा कि चित्र 2E में दर्शाया गया है, प्रति गुंबद 400 क्रिप्ट है। एंटरोइड्स को आसानी से क्रायोप्रेज़र्व्ड किया जा सकता है, और पिघले हुए एंटॉइड टुकड़े दो मार्ग के बाद प्रयोगात्मक उपयोग के लिए पूरी तरह से ठीक हो जाते हैं। विशेष रूप से, क्रायोप्रिजर्वेशन से पहले प्राथमिक क्रिप्ट संस्कृति के कम से कम दो अंशों की सिफारिश की जाती है।

एक 2 डी enteroid व्युत्पन्न monolayer का उत्पादन करने के लिए, 3 डी enteroids काटा जाता है और चरणों की एक श्रृंखला पर, यंत्रवत् एकल कोशिकाओं में एक पृथक्करण समाधान (चित्रा 4 ए) की उपस्थिति में triturated हैं. इन एकल कोशिकाओं को तब एक ट्रांसवेल डालने पर वरीयता दी जा सकती है जिसे तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स-संस्कृति मीडिया समाधान के साथ पूर्व-लेपित किया गया है। औसतन, चार ट्रांसवेल को चार 3 डी एंटॉइड गुंबदों से बोया जा सकता है। संसाधित 3 डी एंटॉइड की संख्या इस प्रकार प्रयोग के लिए आवश्यक ट्रांसवेल की संख्या पर निर्भर करती है। 1 x 10-5 के बीजारोपण घनत्व पर एकल कोशिकाओं को चढ़ाना और शुरू में 20% एफबीएस(चित्रा 4बी-डी)की उपस्थिति में उन्हें संवर्धन करना 1 सप्ताह से भी कम समय में एक संगम मोनोलेयर उत्पन्न कर सकता है। संस्कृति में 2 डी मोनोलेयर के प्रगतिशील संगम को प्रकाश माइक्रोस्कोपी(चित्रा 4ई,एफ)का उपयोग करके समय के साथ निगरानी की जा सकती है। ट्रांसपीथेलियल विद्युत प्रतिरोध (टीईईआर) माप संगम की पुष्टि कर सकते हैं और समय के साथ और प्रयोगात्मक उत्तेजना (चित्रा 5ए)के जवाब में उपकला बाधा अखंडता की विशेषता कर सकते हैं। औसतन, संस्कृति में सात दिनों के बाद, लगभग 100% संगम मोनोलेयर में ~ 1500 Ω· सेमी2 का एक समान TEER मान होगा। 2 डी एंटरॉइड मोनोलेयर टीईईआर मूल्यों का एक अनुदैर्ध्य मूल्यांकन सात दिनों में टीईईआर मूल्यों में लगातार वृद्धि दर्शाता है, जो 1546 Ω· सेमी2 के अधिकतम औसत मूल्य तक पहुंचने से पहले 11.5 Ω· सेमी 2 दिन बारह (चित्रा 5बी) पर प्राप्त 11.5 · सेमी2 के न्यूनतम मूल्य तक पहुंचता है। विभेदित मोनोलेयर्स के इम्यूनोफ्लोरोसेंट लेबलिंग इंगित करता है कि अक्षुण्ण, संगठित, ध्रुवीकृत आंतों के उपकला शीट इस प्रोटोकॉल (चित्रा 6) का उपयोग करके बनते हैं। सना हुआ 2 डी मोनोलेयर की कन्फोकल माइक्रोस्कोपी डीएपीआई परमाणु दाग, ई-कैडरिन, और एफ-एक्टिन धुंधला (चित्रा 6 ए-डी) के स्थानीयकरण को प्रदर्शित करती है। 2 डी मोनोलेयर की प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी क्रोमोग्रानिन-ए (Chr-A) धुंधला के साथ विभेदित आंतों के उपकला कोशिकाओं की पहचान दिखाती है, जो एंटरोएंडोक्राइन कोशिकाओं, लाइसोजाइम (LYZ) को पनेथ कोशिकाओं का प्रदर्शन करती है, और साइटोकैटिन -18 (सीके -18) एंटरोसाइट सेल वंशावली(चित्रा 6E-L) का संकेत देती है। जेड-स्टैक मॉडलिंग एफ-एक्टिन की विशेषता के साथ 2 डी मोनोलेयर संस्कृति के अपेक्षित ध्रुवीकरण को दर्शाता है जो माइक्रोविली में विभेदित एंटरोसाइट्स और ई-कैडरिन के एपिकल पहलू को कवर करता है, जो उपकला कोशिकाओं (चित्रा 6एम) के बीच अंतराल वाले पालन जंक्शनों पर स्थित प्रोटीन है।

मोनोलेयर की कार्यक्षमता का मूल्यांकन विभिन्न घटकों के साथ एपिक उत्तेजना द्वारा किया जा सकता है, जिसमें टोल-जैसे रिसेप्टर (टीएलआर) लिगैंड या रोगजनकों शामिल हैं, इसके बाद एपिकल और बेसल डिब्बों से काटे गए सेल कल्चर सुपरनेटेंट के साइटोकिन मात्रा का ठहराव किया जाता है। दरअसल, जब मोनोलेयर के शिखर पहलू को संस्कृति के दिन 4 पर टीएलआर 1/2 एगोनिस्ट पाम 3 सीएसके4 के साथ 24 घंटे के लिए उत्तेजित किया जाता है, तो अनुपचारित मोनोलेयर(चित्रा 7ए,बी)की तुलना में दोनों डिब्बों में साइटोकिन उत्पादन में वृद्धि देखी जाती है।

Figure 1
चित्रा 1: स्वस्थ वयस्क मवेशियों से गोजातीय आंतों क्रिप्ट अलगाव। छवियाँ (ए) पूरे वयस्क मवेशी इलियम, (बी) defatted ileum, (सी) बर्फ पर पीबीएस में 2.5 इंच (6.3 सेमी) टुकड़े में खंडित ileum, (डी) हदबंदी बफर # 1 में 4 डिग्री सेल्सियस पर ileal ऊतक अनुभागों, और (ई) 37 डिग्री सेल्सियस पर एक मिलाते हुए पानी के स्नान में पृथक्करण बफर 2 में, और (एफ) अलग ileal क्रिप्ट टुकड़े की ऊतक प्रसंस्करण. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स में गोजातीय प्राथमिक 3 डी इलियल एंटॉइड विकास। (ए) 3 डी एंटॉइड गुंबदों की प्रतिनिधि छवियां 6-अच्छी तरह से टिशू कल्चर प्लेट और (बीई) 3 डी एंटरॉइड विकास में 0, 2, 4 और 7 दिनों से संस्कृति में बनाई गई हैं। स्केल बार = 50 माइक्रोन. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: तीन आयामी आंतों enteroids उपकला सेल वंश धुंधला दिखा. संस्कृति में 7 दिनों के बाद 3 डी एंटॉइड की प्रतिनिधि छवियां परमाणु दाग, एफ-एक्टिन, साइटोकैटिन -18 (सीके -18), क्रोमोग्रानिन-ए (Chr-A), एकाडरिन (ई-कैड), लाइसोजाइम (लाइज़) और छवियों के ओवरले (मर्ज) की उपस्थिति प्रदर्शित करती हैं। स्केल बार 50 माइक्रोन। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: इलियल एंटॉइड से 2 डी एंटॉइड-व्युत्पन्न मोनोलेयर की स्थापना। मोनोलेयर सीडिंग की तैयारी में पृथक्करण समाधान में (ए) 3 डी एंटरॉइड टुकड़ों की प्रतिनिधि छवियां, 1 x 10के सीडिंग घनत्व पर ट्रांसवेल डालने पर चढ़ाया गया एकल कोशिकाएं (बी) प्रकाश, (सी) चरण विपरीत, और (डी) उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोपी, और ट्रांसवेल आवेषण पर मोनोलेयर विकास (ई) चरण विपरीत और (एफ) का उपयोग करके दिन पांच पर imaged) उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोपी। 40x आवर्धन और स्केल बार = 50 माइक्रोन। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: ट्रांसवेल आवेषण पर 2 डी एंटॉइड-व्युत्पन्न मोनोलेयर के ट्रांसपीथेलियल विद्युत प्रतिरोध (टीईईआर) माप। (ए) वोल्टोहैमीटर के एसटीएक्स 2 चॉपस्टिक इलेक्ट्रोड का उपयोग करके 2 डी आंतों के उपकला सेल (आईईसी) मोनोलेयर के टीईईआर माप कैसे प्राप्त किए जाते हैं, इसका योजनाबद्ध आरेख, (बी) सेल संस्कृति में 12 दिनों में 2 डी मोनोलेयर टीईईआर माप की अनुदैर्ध्य निगरानी। प्रत्येक डेटा बिंदु एक औसत टीईईआर मूल्य और दो तकनीकी प्रतिकृतियों से प्राप्त माध्य (एसईएम) की मानक त्रुटि का प्रतिनिधित्व करता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: ट्रांसवेल आवेषण पर विभेदित 2 डी एंटॉइड-व्युत्पन्न मोनोलेयर ध्रुवीकृत आंतों के उपकला शीट में विकसित होते हैं। (एएम) संस्कृति में 5 दिनों के बाद ट्रांसवेल डालने पर 2 डी एंटॉइड-व्युत्पन्न मोनोलेयर की प्रतिनिधि इम्यूनोफ्लोरोसेंट छवियां (ए) नाभिक (नीला), (बी) ई-कैडरिन (लाल), (सी) एफ-एक्टिन (हरा) और (डी) 3 छवियों के ओवरले (मर्ज), (ई, आई) परमाणु दाग, (एफ) क्रोमोग्रानिन-ए, (जे) साइटोकैटिन -18, (जी, के) लाइसोजाइम, और (एच, एल) छवियों का विलय। (एम) जेड-स्टैक मॉडलिंग 2 डी मोनोलेयर शीट के समान उपकला सेल मार्कर प्रोटीन के वितरण को दर्शाता है। चित्र 2 जैविक प्रतिकृतियों से प्राप्त किए गए थे। स्केल बार = 50 माइक्रोन. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 7
चित्रा 7: ट्रांसवेल आवेषण पर गोजातीय प्राथमिक 2 डी एंटॉइड-व्युत्पन्न मोनोलेयर कार्यात्मक रूप से सक्रिय हैं। (ए) आईएल-1α, और (बी) आईएल -8 द्वारा 2 डी मोनोलेयर्स द्वारा संस्कृति में 5 दिनों के बाद ट्रांसवेल आवेषण पर एपिकल और बेसल सेल कल्चर सुपरनेटेंट साइटोकिन स्राव जो अनुपचारित या 24 घंटे के लिए पाम 3 सीएसके 4 के साथ उत्तेजित थे। डेटा औसत साइटोकिन स्तर के प्रतिनिधि हैं और एक जानवर और तीन स्वतंत्र प्रयोगों से क्रिप्ट के जमे हुए स्टॉक से प्राप्त मोनोलेयर से एसईएम हैं। साइटोकिन्स को निर्माता के निर्देशों के अनुसार मनका-आधारित मल्टीप्लेक्स परख (सामग्री की तालिका) का उपयोग करके मात्रा निर्धारित की गई थी और एक कॉम्पैक्ट मल्टीप्लेक्सिंग यूनिट (सामग्री की तालिका) और इम्यूनोसे वक्र फिटिंग सॉफ्टवेयर (सामग्री की तालिका) पर विश्लेषण किया गया था। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

तालिका 1: स्टॉक और अभिकर्मकों की अंतिम सांद्रता। कृपया तालिका डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल आंतों शरीर क्रिया विज्ञान और आंत्र विकारों की जांच के लिए एक शारीरिक रूप से प्रासंगिक मॉडल का वर्णन करता है. कई शोध समूहों ने गोजातीय एंटॉइड संस्कृतियों की पीढ़ी का वर्णन किया है, जिसमें 2 डी मोनोलेयर 16,19,20,21,22,23,24 शामिल हैं। जबकि मोनोलेयर पीढ़ी तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण नहीं है, लगातार सफल संस्कृतियों को विकसित करने में कई-मिनट के कदम महत्वपूर्ण हैं। जैसे, प्रकाशित साहित्य में संक्षेप में वर्णित विधियों का उपयोग करके 2 डी मोनोलेयर्स की प्रजनन क्षमता एक शोधकर्ता नौसिखिए के लिए ऑर्गेनोइड के क्षेत्र में चुनौतीपूर्ण हो सकती है। यहां वर्णित प्रोटोकॉल इन प्रोटोकॉल और अन्य प्रजातियों में प्रकाशित लोगों से अनुकूलित है, जो ट्रांसवेल आवेषण पर मोनोलेयर पीढ़ी के लिए चरण-दर-चरण मार्गदर्शिका प्रदान करता है जो अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है।

इस के साथ साथ उल्लिखित प्रोटोकॉल आसानी से प्रयोगात्मक डिजाइन या अभिकर्मकों की उपलब्धता के विशिष्ट लक्ष्यों फिट करने के लिए संशोधित किया जा सकता है. दरअसल, इस प्रोटोकॉल के बाद, सफल संस्कृतियों एक कम सेल घनत्व (जैसे, 2.5 एक्स 104) या एफबीएस की अनुपस्थिति में, अन्य प्रकाशनों24 द्वारा वर्णित के रूप में एक कम सेल घनत्व पर monolayers बोने द्वारा प्राप्त किया जा सकता है. हालांकि, इन मापदंडों को बदलने के लिए एक संगम मोनोलेयर स्थापित करने के लिए एक बढ़ी हुई संस्कृति की आवश्यकता हो सकती है। जैसे, यदि प्रतिरक्षा कोशिकाओं के साथ सह-संस्कृति सहित अध्ययन डिजाइन के अभिन्न अंग अन्य कारक, प्रयोग के लिए एक विशिष्ट समय पाठ्यक्रम निर्धारित करते हैं, तो बीजारोपण घनत्व को आवश्यकतानुसार बदला जा सकता है। जबकि अन्य तहखाने झिल्ली योगों 3 डी enteroids और 2 डी monolayers उत्पन्न करने के लिए इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया एक के स्थान पर प्रतिस्थापित किया जा सकता है, इन इष्टतम तहखाने झिल्ली से मीडिया अनुपात निर्धारित करने के लिए कुछ अनुकूलन की आवश्यकता होगी.

वर्णित पद्धति में ट्रांसवेल आवेषण के आवेदन में पारंपरिक प्लास्टिकवेयर और 3 डी एंटॉइड संस्कृतियों पर मोनोलेयर विकास पर कई लाभ हैं। मानक टिशू कल्चर प्लेटों की तुलना में, मोनोलेयर संस्कृतियों के लिए ट्रांसवेल्स का उपयोग सेलुलर भेदभाव और संगठन को एक तरह से बढ़ावा देता है जो आंतों के क्रिप्ट14,25 के लिए समानता को बरकरार रखता है। आंतों के उपकला अवरोध शरीर में विषाक्त पदार्थों और सूक्ष्मजीवों के स्थानांतरण को रोकने में महत्वपूर्ण है, साथ ही साथ पोषक तत्वों के अवशोषण की सुविधा प्रदान करते हैं। जैसे, यह समझना महत्वपूर्ण है कि आंत की बाधा अखंडता स्वस्थ में कैसे कार्य करती है और आंतों के विकारों के दौरान या यौगिकों के जवाब में बदल जाती है। 3 डी enteroid संस्कृतियों के विपरीत, आंतों बाधा अखंडता का उद्देश्य मूल्यांकन संभव है जब transwells पर monolayers के संयोजन और TEER मापने, के रूप में यहाँ 14,25 में प्रदर्शन किया. ट्रांसवेल्स पर 2 डी मोनोलेयर उत्पन्न करना भी प्रतिरक्षा या स्ट्रोमल कोशिकाओं जैसे प्रासंगिक सेल प्रकारों के साथ दोहरी संस्कृति की अनुमति देता है। यह आंतों की कोशिकाओं और ऊतक माइक्रोएन्वायरमेंट की कोशिकाओं के बीच गंभीर रूप से महत्वपूर्ण क्रॉसस्टॉक को चिह्नित करने की अनुमति देता है, जिसे 3 डी संस्कृतियों के साथ प्राप्त नहीं किया जा सकता है। मोनोलेयर की शिखर सतह का एक्सपोजर न केवल रोगजनकों और यौगिकों और ल्यूमिनल उत्पादों के संग्रह के लिए प्रयोगात्मक जोखिम की अनुमति देता है, बल्कि आंतों के शरीर विज्ञान और रोग के अन्य पहलुओं में अध्ययन भी करता है, जिसमें आंतों के माइक्रोबायोटा और आणविक अवशोषण या परिवहन शरीर विज्ञान13 की जांच शामिल है। एपिकल और बेसल आंतों की सतहों पर स्वतंत्र नियंत्रण 3 डी एंटरॉइड मॉडल पर एक अलग लाभ है।

कई परीक्षण प्रयोगों के माध्यम से, हमने प्रोटोकॉल की सफलता में योगदान देने वाले प्रमुख चरणों की पहचान की। जबकि पूरे आंतों के ऊतकों के नमूनों को रात भर प्रशीतित किया जा सकता है और अगले दिन संसाधित किया जा सकता है, ऊतक पृथक्करण और क्रिप्ट टुकड़ा चरणों के अलगाव को पृथक क्रिप्ट अंशों के विघटन को रोकने के लिए तुरंत किया जाना चाहिए। पीबीएस वॉश को पूरा करने के बाद, वॉश मीडिया में क्रिप्ट को सेंट्रीफ्यूज करने से क्रिप्ट ब्रेकडाउन को रोकने में मदद मिल सकती है, जैसा कि चरण 2.3.10 में विस्तृत है। एंटॉइड्स को पास करते समय या मोनोलेयर गठन के लिए उनकी कटाई करते समय, बीएमई गुंबदों से एंटॉइड को अलग करना आवश्यक है। बीएमई को भंग करने में सहायता के लिए वॉश मीडिया बर्फ के ठंडे होना चाहिए। इसके विपरीत, पूर्व-गर्म TrypLE का उपयोग करना और सेल निलंबन को दो बार फ़िल्टर करना मोनोलेयर पीढ़ी के लिए आवश्यक एकल कोशिकाओं को बनाने में मदद कर सकता है। अंत में, मैन्युअल रूप से संख्या 8 के आकार में प्लेट पैंतरेबाज़ी समान रूप से ट्रांसवेल डालने पर एकल कोशिकाओं को फैलाने में मदद कर सकते हैं.

इस प्रोटोकॉल की एक महत्वपूर्ण सीमा यह है कि 2 डी मोनोलेयर्स एक परिपक्व होल्स्टीन स्टीयर (>2 वर्ष की आयु) से उत्पन्न एंटॉइड स्टॉक से उत्पादित किए गए थे। बछड़ों में परिपक्व जठरांत्र संबंधी मार्ग इष्टतम परिणाम उपज के लिए वर्णित प्रोटोकॉल के लिए मामूली संशोधनों की आवश्यकता हो सकती है. मवेशियों की नस्लों की आंतों के शरीर क्रिया विज्ञान में नस्ल-विशिष्ट अंतर साहित्य26 में वर्णित किया गया है। हालांकि यह अज्ञात है कि क्या ये अंतर एंटॉइड और बाद में मोनोलेयर पीढ़ी को प्रभावित कर सकते हैं, हमें संदेह है कि किसी भी अंतर के परिणामस्वरूप हमारे प्रोटोकॉल में केवल मामूली बदलाव होंगे। इसके अतिरिक्त, 2D संस्कृति मॉडल के कुछ अंतर्निहित नुकसान हैं। 3 डी enteroid मॉडल की तुलना में, 2 डी संस्कृतियों आंतों के ऊतकों वास्तुकला और सेलुलर विविधता के कुछ पहलुओं की कमी हो सकती है और प्रतिबंध और चुनौतियों 2 डी संस्कृति13 के प्रसार के साथ जुड़े पैदा कर सकते हैं. फिर भी, अध्ययनों से पता चलता है कि कुछ मोनोलेयर अपेक्षित क्रिप्ट संगठन27 का अनुकरण कर सकते हैं, और इनमें से कुछ सीमाओं को वायु-तरल इंटरफ़ेस के साथ 2 डी संस्कृतियों की स्थापना करके भी दूर किया जा सकता है। फिर भी, इस मॉडल की सीमाओं को यह निर्धारित करने के लिए पूरी तरह से विचार किया जाना चाहिए कि इसका आवेदन प्रयोगात्मक प्रश्न के लिए उपयुक्त है या नहीं।

यह प्रोटोकॉल एक अनुकूलित संस्कृति प्रणाली का वर्णन करता है जो गोजातीय इलियम से प्राप्त एंटॉइड का उपयोग करके गोजातीय जठरांत्र संबंधी मार्ग को मॉडल करता है ताकि ट्रांसवेल आवेषण पर मोनोलेयर बनाया जा सके। संक्रामक रोग अनुसंधान से लेकर दवा की खोज और पुनर्योजी चिकित्सा तक अनुप्रयोगों की एक विस्तृत श्रृंखला के साथ, यह उच्च-थ्रूपुट संस्कृति प्रणाली निवारक और चिकित्सीय रणनीतियों के अभूतपूर्व विकास को जन्म दे सकती है जो पशु और मानव स्वास्थ्य के लिए पारस्परिक रूप से फायदेमंद हो सकती हैं।

Disclosures

लेखकों ने घोषणा की कि अनुसंधान किसी भी वाणिज्यिक या वित्तीय संबंधों की अनुपस्थिति में आयोजित किया गया था जिसे संभावित हितों के टकराव के रूप में माना जा सकता है।

Acknowledgments

हम मिडवेस्टर्न यूनिवर्सिटी में सेलुलर और आणविक कोर सुविधा के उपयोग को स्वीकार करते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 mL pipette tip  MidSci PR-200RK-S
1 µm PET 24-well cell culture inserts  Corning 353104
1000 mL pipette tip  MidSci PR-1250RK-S
22 G needle Becton, Dickinson and Company 305156
24-well culture vessel  Corning 353504
40 μm cell strainer  Corning 431750
50 mL centrifuge tube  Fisher scientific 14-955-240
5-mL pipet tip Fisher scientific 30075307
5 mL syringe Becton, Dickinson and Company 309647
5 mL tube Eppendorf 30119401
Anti-Cytokeratin -18 (C-04) Abcam AB668-1001
B-27 supplement without vitamin A  Gibco 12-587-010
Belysa software Luminex 40-122 Immunoassay curve fitting software 
Bovine serum albumin (BSA) Fisher bioreagents BP9704-100
Caspofungin acetate Selleckchem S3073
Cell lifter Fisher Scientific 08-100-241
Chromogranin-A (E-5) Santa Cruz Biotechnology SC-271738
Coverslips Fisher scientific 12-540-C
Cryovials Neptune scientific 3471.X
Cultrex Ultimatrix RGF BME  R&D Systems BME001-05
DAPI MilliporeSigma D9542-5MG
Dissecting scissors  VWR 82027-588
Dithiothreitol (DTT) solution Thermo Scientific FERR0861
DMEM/ F-12 1.1 medium (with L-glutamine, without HEPES) Cytiva SH30271.01
E-cadherin  Cell Signaling Technology #3195
Ethylenediaminetetraacetic acid Fisher Scientific BP2482500
FBS Corning MT35070CV
Gentamicin Gibco 15710064
Glass microscope slide  Fisher scientific 12-550-07
Goat anti-mouse Alexa Fluor 488 Invitrogen A11001
Goat anti-mouse Alexa Fluor 647 Invitrogen A21235
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 555  Invitrogen A21428
Hemacytometer Bio-Rad 1450015
IntestiCult organoid Differentiation medium (Human) StemCell Technologies 100-0214
IntestiCult organoid growth medium (Human) StemCell Technologies 0-6010
Keyence BZ-X700  Keyence BZ-X700
LY2157299 (Galunisertib) Selleckchem S2230
MAGPIX system Luminex Magpix system Compact multiplexing unit
Microscope Keyence BZ-X700 
MILLIPLEX Bovine Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel MilliporeSigma BCYT1-33K Bead-based multiplex assay 
Mr. Frosty container  Nalgene 5100-0001
Non-Enzymatic Cell Dissociation Solution  ATCC 30-2103
NutriFreeze D10 Cryopreservation Media  Biological Industries 05-713-1B
Orbital shaking platform Thermo Fisher 88880021
Pam3Csk4 invivogen tlrl-pms
Parafilm sealing film dot scientific inc. #HS234526C
Paraformaldehyde 16% solution Electron Microscopy Sciences 15710
Phalloidin-FITC  R&D Systems 5782/12U
Phosphate buffered saline Fisher Scientific BP399-20
Prolong Glass Antifade Invitrogen P36982
Rabbit anti-human Lyzozyme (EC3.2.1.17) Agilent technologies A009902-2
SB202190 (FHPI) Selleckchem S1077
Shaking water bath Thermo Fisher MaxQ 7000
Sodium Azide VWR BDH7465-2
Streptomycin Teknova S6525
Trypan Blue dye  Gibco 15250-061
TrypLE express enzyme  Life technologies 12604013
Tween 20 Fisher Scientific BP337
Voltohmmeter  MilliporeSigma Millicell ERS-2 
Y-27632  Selleckchem S1049

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References

  1. Gerdts, V., et al. Large animal models for vaccine development and testing. ILAR Journal. 56 (1), 53-62 (2015).
  2. Reza Khorramizadeh, M., Saadat, F. Animal models for human disease. Animal Biotechnology. Chapter 8, Academic Press. 153-171 (2020).
  3. Meyerholz, D. K., Beck, A. P., Singh, B. Innovative use of animal models to advance scientific research. Cell and Tissue Research. 380 (2), 205-206 (2020).
  4. Hamernik, D. L. Farm animals are important biomedical models. Animal Frontiers. 9 (3), (2019).
  5. Ribitsch, I., et al. Large animal models in regenerative medicine and tissue engineering: To do or not to do. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 972 (2020).
  6. Wagar, L. E., DiFazio, R. M., Davis, M. M. Advanced model systems and tools for basic and translational human immunology. Genome Medicine. 10 (1), 73 (2018).
  7. Ziegler, A., Gonzalez, L., Blikslager, A. Large animal models: The key to translational discovery in digestive disease research. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 2 (6), 716-724 (2016).
  8. Roth, J. A., Tuggle, C. K. Livestock models in translational medicine. ILAR Journal. 56 (1), 1-6 (2015).
  9. Schultz, R. D., Dunne, H. W., Heist, C. E. Ontogeny of the bovine immune response. Infection and Immunity. 7 (6), 981-991 (1973).
  10. Potter, A. A., et al. Large animal models for vaccine development and testing. ILAR Journal. 56 (1), 53-62 (2015).
  11. Ahluwalia, B., Magnusson, M. K., Öhman, L. Mucosal immune system of the gastrointestinal tract: maintaining balance between the good and the bad. Scandinavian Journal of Gastroenterology. 52 (11), 1185-1193 (2017).
  12. Roodsant, T., et al. A human 2D primary organoid-derived epithelial monolayer model to Study host-pathogen interaction in the small intestine. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 272 (2020).
  13. Liu, Y., Chen, Y. G. 2D- and 3D-based intestinal stem cell cultures for personalized medicine. Cells. 7 (12), 225 (2018).
  14. Duque-Correa, M. A., Maizels, R. M., Grencis, R. K., Berriman, M. Organoids - New models for host-helminth interactions. Trends in Parasitology. 36 (2), 170-181 (2020).
  15. Kar, S. K., et al. Organoids: a promising new in vitro platform in livestock and veterinary research. Veterinary Research. 52 (1), 43 (2021).
  16. Hamilton, C. A., et al. Development of in vitro enteroids derived from bovine small intestinal crypts. Veterinary Research. 49 (1), 54 (2018).
  17. Beaumont, M., et al. Intestinal organoids in farm animals. Veterinary Research. 52 (1), 33 (2021).
  18. Lee, B. R., et al. Robust three-dimensional (3D) expansion of bovine intestinal organoids: An in vitro model as a potential alternative to an in vivo system. Animals (Basel). 11 (7), 2115 (2021).
  19. Töpfer, E., et al. Bovine colon organoids: From 3D bioprinting to cryopreserved multi-well screening platforms. Toxicology in Vitro. 61, 104606 (2019).
  20. Powell, R. H., Behnke, M. S. WRN conditioned media is sufficient for in vitro propagation of intestinal organoids from large farm and small companion animals. Biology Open. 6 (5), 698-705 (2017).
  21. Derricott, H., et al. Developing a 3D intestinal epithelium model for livestock species. Cell and Tissue Research. 375 (2), 409-424 (2019).
  22. Rusu, D., Loret, S., Peulen, O., Mainil, J., Dandrifosse, G. Immunochemical, biomolecular and biochemical characterization of bovine epithelial intestinal primocultures. BMC Cell Biology. 6, 42 (2005).
  23. Dibb-Fuller, M. P., Best, A., Stagg, D. A., Cooley, W. A., Woodward, M. J. An in-vitro model for studying the interaction of Escherichia coli O157:H7 and other enteropathogens with bovine primary cell cultures. Journal of Medical Microbiology. 50 (9), 759-769 (2001).
  24. Sutton, K. M., Orr, B., Hope, J., Jensen, S. R., Vervelde, L. Establishment of bovine 3D enteroid-derived 2D monolayers. Veterinary Research. 53 (1), 15 (2022).
  25. Barrila, J., et al. Modeling host-pathogen interactions in the context of the microenvironment: Three-dimensional cell culture comes of age. Infection and Immunity. 86 (11), e00282-e00318 (2018).
  26. Carvalho, P. H. V., Pinto, A. C. J., Millen, D. D., Felix, T. L. Effect of cattle breed and basal diet on digestibility, rumen bacterial communities, and eating and rumination activity. Journal of Animal Science. 98 (5), skaa114 (2020).
  27. Thorne, C. A., et al. Enteroid monolayers reveal an autonomous WNT and BMP circuit controlling intestinal epithelial growth and organization. Developmental Cell. 44 (5), 624-633 (2018).

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ट्रांसलेशनल बायोमेडिकल रिसर्च में अनुप्रयोगों के लिए एक गोजातीय प्राथमिक एंटॉइड-व्युत्पन्न द्वि-आयामी मोनोलेयर संस्कृति प्रणाली का निर्माण
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Molehin, D., Guinan, J., Lopez, B.… More

Molehin, D., Guinan, J., Lopez, B. Generation of a Bovine Primary Enteroid-Derived Two-Dimensional Monolayer Culture System for Applications in Translational Biomedical Research. J. Vis. Exp. (206), e65901, doi:10.3791/65901 (2024).

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