Summary
Enteroider håller på att växa fram som en ny modell för att studera vävnadsfysiologi och patofysiologi, läkemedelsutveckling och regenerativ medicin. Här beskriver vi ett bovint primärt cellodlingssystem med 2D-enteroid-härledda celler som möjliggör samodling med relevanta vävnadscelltyper. Denna modell erbjuder en translationell fördel för modellering av gastrointestinal forskning.
Abstract
Organoida cellodlingssystem kan rekapitulera den komplexitet som observerats i vävnader, vilket gör dem användbara för att studera värd-patogeninteraktioner, utvärdera läkemedelseffektivitet och toxicitet och vävnadsbioteknik. Tillämpningen av dessa modeller av de beskrivna skälen kan dock vara begränsad på grund av modellernas tredimensionella (3D) karaktär. Till exempel är det utmanande att använda 3D-enteroidodlingssystem för att studera matsmältningssjukdomar på grund av otillgängligheten av tarmlumen och dess utsöndrade ämnen. Faktum är att stimulering av 3D-organoider med patogener kräver antingen luminal mikroinjektion, mekanisk störning av 3D-strukturen eller generering av apikala enteroider. Dessutom kan dessa organoider inte samodlas med immun- och stromaceller, vilket begränsar djupgående mekanistisk analys av patofysiologisk dynamik. För att kringgå detta optimerade vi ett tvådimensionellt (2D) enteroid-härlett monolagerodlingssystem för nötkreatur i primärcellen, vilket möjliggjorde samodling med andra relevanta celltyper. Ileala kryptor isolerade från friska vuxna nötkreatur odlades för att generera 3D-organoider som kryokonserverades för framtida bruk. Ett 2D-monolager skapades med hjälp av återupplivade 3D-enteroider som passerade och stördes för att ge enstaka celler, som såddes på basalmembranextraktbelagda transwell-cellodlingsinsatser, och därigenom exponerade deras apikala yta. Tarmens monolagerpolaritet, cellulära differentiering och barriärfunktion karakteriserades med hjälp av immunofluorescensmikroskopi och mätning av transepitelial elektrisk resistans. Stimulering av monolagrets apikala yta avslöjade monolagrets förväntade funktionalitet, vilket demonstrerades genom cytokinsekretion från både apikala och basala kompartment. Den beskrivna 2D-enteroid-härledda monolagermodellen är mycket lovande när det gäller att undersöka värd-patogeninteraktioner och tarmfysiologi, läkemedelsutveckling och regenerativ medicin.
Introduction
Djurmodeller i forskning spelar en avgörande roll för att öka vår förståelse av sjukdomars patofysiologi och dynamiken i värdens immunsvar under infektion och stöder utvecklingen av nya förebyggande och terapeutiska strategier 1,2,3,4. Dessa modeller stöder forskning, upptäckt och framsteg på djur och är nyckeln till framsteg inom forskning om människors hälsa. I årtionden har gnagarmodeller legat till grund för framsteg inom immunmekanismer och grundläggande biologisk forskning för mänskliga sjukdomar 3,5,6,7. Medan gnagarmodeller är avgörande vid screening och tidig utvecklingsforskning, erbjuder stordjursmodeller en mer relevant jämförelse vid forskning om mänskliga sjukdomar i både tidiga upptäckts- och senare utvecklingsstudier, inklusive terapeutisk effektivitet och säkerhetstestning 1,3,4,5. Boskap erbjuder tydliga fördelar jämfört med gnagarmodeller för effektivare översättning för humana tillämpningar för vissa sjukdomar, inklusive kryptosporidios, salmonellos, tuberkulos, respiratoriskt syncytialvirus och brucellos 1,7,8. Faktum är att dessa och andra sjukdomar utvecklas spontant hos nötkreatur, som delar flera liknande sjukdomspatogenes och immunprocesser som människor, och som en utavlad population efterliknar nötkreatur den genetiska och miljömässiga heterogenitet som påverkar människans immunsvar 5,8,9,10 . Nyttan av nötkreatursmodeller för forskning om infektionssjukdomar kan maximeras genom att först använda ett sofistikerat odlingssystem och sedan genomföra in vivo-studier stegvis. Den initiala användningen av ett mycket komplext odlingssystem från nötkreatur kan avsevärt minska antalet studier på levande djur och samtidigt förbättra chanserna för framgångsrik translationell och tillämpad forskning. Odlingsmodeller bör rekapitulera sjukdomsprocesserna på organnivå för optimal prediktiv validitet, med bibehållen naturlig vävnadsmikromiljö rumsligt och funktionellt.
Slemhinnans immunsvar är ett mångfacetterat system som består av en mycket effektiv barriär som bildas av gastrointestinala enterocyter och olika populationer av immunceller som ligger under slemhinnans yta11. Detta mycket komplexa system är avgörande under infektion för att upprätthålla GI-homeostas och initiera immunförsvar mot enteriska patogener11. Kommunikation mellan enterocyter och underliggande medfödda immunceller initierar utvecklingen av skyddande immunsvar mot patogena mikroorganismer. Som sådana är odlingssystem som är jämförande i sin komplexitetsnivå nödvändiga för en optimal undersökning av värd-enteriska patogeninteraktioner och är mycket effektiva för att förstå enterisk fysiologi och läkemedelsupptäckt och utveckling12,13. Organoider är ett robust odlingssystem som liknar arkitekturen och funktionen hos ursprungsvävnaden14,15. Flercelligheten hos dessa modeller gör det möjligt att undersöka rollen hos olika cellpopulationer och de cellulära interaktioner som är involverade i enterisk hälsa och sjukdom12,14. Organoidmodeller som härrör från människor i forskning begränsas dock för närvarande av svårigheten att erhålla en tillräcklig kvantitet och jämn kvalitet på humana tarmepitelceller och begränsad cellviabilitet i odling. Odödliga cellinjer kan användas för att konsekvent erhålla höga utbyten av homologa kulturer i dessa modeller; Transformerade celler saknar dock i sig mångfalden och den funktionella komplexiteten hos icke-transformerade epitelceller16,17. Fördelarna med att använda kulturer som härrör från nötkreatursvävnad som en modell för att undersöka gastrointestinala sjukdomar och fysiologi inkluderar den lätthet med vilken vävnadsprover konsekvent kan erhållas från friska donatorer, förbättrad cellviabilitet och större cellulär mångfald som endast kan uppnås med icke-odödlig vävnad. Jämförande vävnadstranskriptomik och karakterisering av tarmorganoider avslöjar likheter i bevarade ortologa gener och cellulära potentialer mellan människor och nötkreatur18. Därför kan ett odlingssystem som härrör från nötkreatur vara fördelaktigt vid undersökning av tarmsjukdomar hos människor, med fynd som lätt kan överföras till humanmedicin.
Protokollet som beskrivs här beskriver en effektiv plattform för att utvärdera värdsvar på enteriska patogener eller föreningar och tarmfysiologi med hjälp av ett bovint enteroid-härlett 2D-primärt cellodlingssystem. Till skillnad från 3D-organoider tillåter 2D-odlingssystem som genereras på transwell-insatser en dubbel odling av tarmceller med immun- eller stromaceller, vilket möjliggör studier av dynamiken på vävnadsnivå. Med tillämpningar inom biomedicinsk forskning, läkemedelsutveckling och effektivitetstestning kan denna fysiologiskt relevanta modell gynna hälsan och utvecklingen av både nötkreatur och människor.
Protocol
Alla protokoll utfördes i enlighet med institutionella och nationella riktlinjer och föreskrifter för djurskydd.
1. Beredning av reagens
OBS: Stam- och slutkoncentrationerna av de reagenser som används i denna studie listas i tabell 1.
- Förbered provtagningsbuffert: Blanda 1 L iskall fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) som innehåller penicillin (100 E/ml), streptomycin (100 μg/ml), gentamicin (25 μg/ml) och kaspofungin (2,5 μg/ml). Förvara stamlösningen vid 4 °C.
- Förbered dissociationsreagens #1: Blanda 18.55 ml provtagningsbuffert (enligt beskrivningen i steg 1.1), 1.422 ml etylendiamintetraättiksyra (EDTA, 0.422 M/pH 7.4), 20 μL 1 M 1,4-ditiotreitol (DTT) lösning, 4 μL Y-27632 lösning (5000x/50 mM). Förvara lösningen vid 4 °C.
- Förbered dissociationsreagens #2: Blanda 18.57 ml uppsamlingsbuffert (enligt beskrivningen i steg 1.1), 1.422 ml EDTA (0.422 M/pH 7.4), 4 μL Y-27632-lösning (5000x/50 mM). Förvara lösningen vid 37 °C.
- Förbered enteroida tillväxtmedier: Blanda 9,875 ml organoid tillväxtmedium plus tillskott, 100 μL penicillin (100 E/ml), streptomycin (100 μg/ml), 5 μL gentamicin (25 μg/ml) och 20 μL kaspofungin (2,5 μg/ml). Förvara lösningen vid 4 °C.
- Förbered enteroiddifferentieringsmediet: Blanda 10 ml organoiddifferentieringsmedium plus tillskott, 100 μl penicillin (100 E/ml), streptomycin (100 μg/ml), 5 μl gentamicin (25 μg/ml) och 20 μl kaspofungin (2,5 μg/ml). Lösningen förvaras vid -20 °C.
- Förbered tvättmedel: Blanda 48,45 ml DMEM/F-12 1,1 medium (med L-glutamin, utan HEPES), 1 ml B-27-tillskott utan vitamin A (50 x buljong), 500 μL penicillin (100 E/ml), streptomycin (100 μg/ml), 25 μL gentamicin (50 mg/ml stam) och 25 μL kaspofungin (5 mg/ml stam). Förvara lösningen vid 4 °C.
- Förbered beläggningsbuffert: Blanda 25 ml DMEM: F12 komplett media utan inhibitorer och 25 mg bovint serumalbumin (BSA). Förvara lösningen vid 4 °C.
2. Isolering av tarmkryptor från hel vävnad (figur 1)
OBS: Enteroider från tunntarm hos nötkreatur genererades från ileusvävnad från friska vuxna Holsteinstutar (>2 år) från en lokal nötköttsanläggning. En donator användes för denna serie av experiment.
- Beredning av vävnadsprover från tarmen
- Placera de skördade ~10 tum (25 cm) tarmvävnadsproverna i ~400 ml iskall uppsamlingsbuffert (PBS+ antibiotika/antimykotika) och på is för transport till laboratoriet.
- Använd en kirurgisk sax (t.ex. majonnässax) och pincett (t.ex. asonpincett) för att ta bort överflödigt fett och tarmkäxet från tarmvävnadsprovet.
- Skär vävnaden i två lika stora bitar.
- Öppna vävnaden i längdriktningen med en kirurgisk sax och skölj vävnaden i steril PBS.
- Ta försiktigt bort slemskiktet i tarmprovet med hjälp av sidan av ett sterilt glasmikroskopglas och skölj vävnaden med färsk PBS.
OBS: Detta steg hjälper till att ta bort villi och hjälper till att öka renheten hos kryptfraktionerna i efterföljande steg. - För varje 5-tums (13 cm) bit, skär vävnaden i två 2.5 tum (6.5 cm) och skär sedan varje bit i 4 ungefär lika små bitar för att underlätta vävnadsdissociation.
- Dissociation av tarmvävnad
- Förbered en 20 ml volym av vävnadsdissociationsreagens #1 i ett sterilt 50 ml koniskt rör och deponera de små vävnadsproverna i det koniska röret tills volymförskjutningen flyttar menisken från 20 ml-märket till 35 ml-märket på det koniska röret.
- Upprepa ovanstående steg för de återstående tunntarmsvävnadsprovbitarna.
- Försegla de koniska rören med parafilm och skaka det koniska röret manuellt 10 gånger.
OBS: Under hela protokollet bör manuell skakning göras på ett avsiktligt men skonsamt sätt. - Placera de koniska rören horisontellt på is i en behållare på en orbital skakplattform.
- Skaka de koniska rören på is i behållaren i 30 minuter med 80 varv per minut (rpm). Var 10:e minut, skaka det koniska röret manuellt.
- Bered en 20 ml volym förvärmt (37 °C) vävnadsdissociationsreagens #2 (formulerat enligt ovan, men utan DTT) i ett 50 ml koniskt rör. Sätt in vävnadsproverna från de koniska rören som innehåller dissociationsreagens #1 i de koniska rören som innehåller dissociationsreagens #2.
- Försegla de koniska rören med parafilm och skaka de koniska rören manuellt 10 gånger.
- Placera de koniska rören i ett förvärmt (37 °C) skakvattenbad, lutat i cirka 60 °C vinkel, och skaka med 150 varv per minut i 10 minuter, med manuell skakning efter 5 minuter och igen efter totalt 10 minuters inkubation.
- Isolering av kryptfragment
- Etikett 10 sterila koniska rör #1 - #10. Tillsätt 20 ml steril iskall PBS till varje märkt koniskt rör.
- Överför vävnadsbitarna från de koniska rören som innehåller dissociationsreagenset #2 till ett nytt sterilt 50 ml koniskt rör som innehåller iskall PBS #1.
- Skaka de koniska rören manuellt 10 gånger.
- Försegla de koniska rören med parafilm och placera dem horisontellt på is. Skaka koniska rör på en orbital shaker i 10 minuter vid 80 rpm. Efter 10 min, skaka koniskt rör #1 manuellt 10 gånger. Detta anses vara tvätt #1.
- Överför försiktigt vävnadsprover med hjälp av en kirurgisk pincett till koniskt rör #2.
- Upprepa steg 2.3.2 - 2.3.4, detta anses vara tvätt #2.
- Upprepa tvättarna tills tvätt #10.
- Supernatanterna från varje tvätt innehåller de kryptor som kommer att användas för enteroidgenerering. Förvara tuberna med supernatanterna vid 4 °C tills alla 10 tvättar är klara.
- Efter att den 10:e tvätten är klar och vävnadssnittet kasserats, centrifugera supernatanterna i koniska rör #6-#10 vid 400 x g i 2 minuter vid 4 °C för att pelletera de isolerade kryptorna.
OBS: Tvätt 6-10 innehåller de renaste fraktionerna av intakta kryptor med begränsat skräp och enstaka celler. Som sådan rekommenderas det att endast dessa fraktioner används för enteroidgenerering, och de tidigare tvättarna (#2-#5) kasseras) - Kassera supernatanten och tillsätt 4 ml färsk, iskall PBS till kryptor utan att suspendera igen (detta hjälper till att hålla fragmenten intakta fram till mikroskopi).
- Bedöm renheten hos de dissocierade kryptorna för varje koniskt rör #6-#10 med mikroskopi.
- Tillsätt 50 μl PBS till en platta med 384 brunnar.
- Tillsätt 10 μL kryptsuspension till PBS och använd en objektivlins med 40x förstoring för att bestämma kryptans renhet, integritet och antal.
OBS: Att rita ett kryss på botten av plåtbrunnen gör räkningen lättare.
3. Ex vivo-generering och passage av bovina ileala enteroider (figur 2)
OBS: Kryptorna från de koniska rören med de renaste, intakta tarmkryptorna kommer att användas för nedströmsanalyser. För alla steg som involverar kryptor och enteroider måste pipettspetsar, cellskrapor och rör förbeläggas med beläggningsbufferten, och bubblor bör undvikas för att förhindra förlust av kryptor. Om inget annat anges bör en 1000 μL pipettspets användas för att förhindra att kryptfragment bryts upp.
- Generera enteroider från kryptfragment
- Kombinera de renaste kryptfraktionerna (vanligtvis #6-#10) i ett koniskt rör.
- Centrifugera det koniska röret med kryptorna vid 400 x g i 2 minuter vid 4 °C.
- Kasta supernatanten genom att aspirera den med en pipett och återsuspendera kryptpelleten i Wash Media.
- Centrifugera enligt punkt 3.1.2. Dekantera supernatanten och tillsätt 2 ml tvättmedia till kryptpelletsen.
- Räkna antalet kryptor enligt beskrivningen i steg 2.3.11.1.
- Centrifugera som i steg 3.1.2 för att pelletera kryptorna, kassera supernatant och återsuspendera i iskall 100 % reducerad tillväxtfaktor basalmembran extracellulär matris (BME) för att uppnå en koncentration på cirka 400 kryptor/100 μL.
OBS: det är viktigt att tina BME ordentligt vid 4 °C eftersom temperaturförändringar förändrar dess konsistens. BME kan förhindras från att stelna i förtid med hjälp av ett kylblock och förkylda pipettspetsar.- Att använda en annan basalmembranmatrisformulering kan kräva utspädning av BME vid skapande av kupoler. Se tillverkarens instruktioner som är specifika för den BME som används.
- Pipett upp och ner för att noggrant suspendera kryptorna i BME.
- Gör crypt-BME-kupoler genom att långsamt pipettera 50 μL crypt-BME-suspension på en 6-håls vävnadsodlingsplatta på en värmeplatta inställd på 37 °C med upp till 8 kupoler/brunn.
OBS: 6-hålsplattan måste förvärmas i en inkubator vid 37 °C över natten före plätering av kupoler. - Håll 6-hålsplattan på värmeplattan i 1 minut innan du försiktigt flyttar plattan till en 37 °C, 5 % CO2 inkubator.
- Efter 2 minuter vänder du plattan med 6 brunnar så att locket är vänt nedåt och inkuberar i ytterligare 30 minuter så att kupolerna kan polymeriseras.
- Efter 30 minuter tillsätts försiktigt 3 ml rumstempererat (RT) enteroidtillväxtmedium kompletterat med 10 μM SB202190, 0,5 μM LY2157299 och 10 μM Y-27632 till brunnarna som innehåller kupoler.
- Inkubera vid 37 °C, 5 % CO2
- Ta bort media och ersätt med nytt enteroidtillväxtmedium kompletterat med inhibitorer var 2-3:e dag.
- Passaging av enteroider
- Efter 7-10 dagar, se till att kryptorna har bildat 3D-enteroider med många spirande strukturer, som i figur 2E, och är redo att passeras.
- Kassera media från brunnarna som innehåller kupoler.
- För varje 4 kupoler per brunn, tillsätt 1 ml iskall icke-enzymatisk celldissociationslösning kompletterad med 10 μM Y-27632 till varje brunn som innehåller kupoler.
- Använd en förbelagd cellskrapa och lossa försiktigt kupolen från vävnadsodlingsplattan.
- Samla enteroider i ett 15 ml koniskt rör och triturera genom att pipettera upp och ner 10 gånger.
- Inkubera det koniska röret som innehåller de fragmenterade enteroiderna vid RT på en orbitalskaker vid 80 rpm i 10 minuter.
- Tillsätt 10 ml iskallt tvättmedium med 10 μM Y -27632 till enteroiderna.
- Centrifugera det koniska röret vid 300 x g i 5 minuter vid RT.
- Kassera supernatanten och återsuspendera pelleten i 10 ml färskt tvättmedium och överför till ett nytt 15 ml koniskt rör.
- Centrifugera det koniska röret vid 300 x g i 5 minuter vid RT.
- Kassera supernatanten och återsuspendera pelleten i 1 ml enteroidtillväxtmedia i 1,5 ml mikrocentrifugrör.
- Centrifugera mikrocentrifugröret vid 300 x g i 5 minuter vid RT och kassera supernatanten.
- Återsuspendera enteroidpelleten i iskall 100 % BME och följ steg 3.1.6-3.1.13.
- Återpassage enteroider var 7:e dag. Expansionstiderna kan variera beroende på knoppningens densitet, livskraft och omfattning. Flera spirande strukturer som skapar stora enteroidstrukturer är en indikation på att enteroiderna behöver passeras.
- Kryokonservering av enteroider
- För kryokonservering, se till att enteroiderna inte passerar mer än fem gånger i kulturen.
OBS: Detta har inte testats experimentellt och är baserat på författarnas observation att senare passager har minskat livskraften och ger varierande resultat. - För att skörda enteroiderna, använd dissociationsbufferten enligt beskrivningen i steg 3.2.2-3.2.9.
OBS: Dissociera enteroiderna mekaniskt med en 5 ml pipett. - Räkna antalet enteroidfragment enligt beskrivningen i steg 2.3.11.1.
- Centrifugera det koniska röret vid 300 x g i 5 minuter vid RT.
- Kassera supernatanten och återsuspendera enteroidfragmenten i kryokonserveringsmedier kompletterade med 10 μM Y-27632 för att uppnå en koncentration på ~2000 enteroidfragment/ml och alikvot 1 ml i förmärkta kryovialer.
- Placera kryovialerna i en kontrollerad frysbehållare och förvara vid -80 °C över natten.
- Överför kryovialerna till flytande kväve i ångfas för långtidsförvaring.
- För kryokonservering, se till att enteroiderna inte passerar mer än fem gånger i kulturen.
- Återupplivning av fragment av tarmkryptor
- Placera en 6-hålsplatta över natten inuti inkubatorn.
- Förbestryk ett 5 ml rör med 5 ml beläggningsmedia.
- Ta bort kryovialerna från förvaringen av flytande kväve.
- Omedelbart, när det har tinats, överför kryptor från kryovialen till det förbelagda 5 ml röret. Skölj ur kryovialen med tvättmedia och tillsätt i 5 ml röret. Undvik bubblor.
- Höj volymen till 5 ml med tvättmedia och centrifugera vid 400 x g i 5 minuter vid 4 °C.
- Under centrifugeringen, förbelägg ett 1.5 ml rör med beläggningsmedia.
- Efter centrifugering, häll av supernatanten, återsuspendera pelleten i mediet som finns kvar i röret och överför till det förbelagda 1.5 ml röret. Tvätta 5 ml röret med tvättmedia och överför det till ett 1.5 ml rör. Centrifugera vid 400 x g i 5 minuter vid 4 °C.
- Höj volymen till 1,5 ml med enteroidtillväxtmedia.
- Centrifugera enligt ovan (steg 3.4.7) och sug försiktigt.
- Ta BME från 4 °C och lägg på is/isblock.
- Återsuspendera enteroidpelleten i iskall 100 % BME och följ steg 3.1.6-3.1.12.
- Byt media var 2-3:e dag.
4. Generering och bedömning av 2D-monolager från 3D-enteroider
OBS: Som ovan, för alla steg som involverar kryptor och enteroider, bör pipettspetsar, cellskrapor och rör förbeläggas med beläggningsbufferten, och bubblor bör undvikas för att förhindra förlust av kryptor.
- Förberedelse av transwell-insatser för 2D-monolagerbildning
- Placera insatserna i en 24-brunnars vävnadsodlingsadapterplatta och förbelägg den apikala sidan av 1 μm PET 24-håls cellodlingsinsatser med 100 μL 1:15 utspädning av BME i enteroidtillväxtmedia. Belägg alltid en extra insats som kommer att användas som en kontroll när du gör mätningar av barriärintegritet.
- Placera den belagda insatsen i en adapterplatta för 24-håls vävnadskultur i inkubatorn.
OBS: En specifik adapter eller odlingsplatta för medföljande vävnad måste användas med transwell-insatserna. - Inkubera kulturinsatserna vid 37 °C, 5 % CO2 i 1 timme för att möjliggöra polymerisation.
OBS: BME-belagda transbrunnar kan förseglas med parafilm och förvaras vid 4 °C i upp till 1 vecka om de inte används omedelbart. - I slutet av inkubationen aspirerar du 3D-enteroidodlingsmediet.
- Dissociation av 3D-enteroider
- Generera 2D-enteroidmonolager från kryokonserverade enteroidfragment som återupplivats, pläterats och odlats enligt beskrivningen ovan i avsnitt 3.1 för att bilda 3D-enteroider. Passera de tinade enteroiderna minst två gånger, med den sista passagen odlad i minst 5 dagar före bearbetning för att generera 2D-monolagerkulturer.
- Skörda enteroiderna genom att tillsätta iskallt tvättmedium kompletterat med 10 μM Y-27632 till enteroidkupoler (använd cirka 1 ml dissociationsbuffert för 4 kupoler)
- Lossa kupolerna med en cellskrapa och samla upp dem i ett 15 ml koniskt rör.
- Triturera 30 gånger med en 1 ml pipettspets för att generera enteroidfragment.
- Triturera 40 gånger med en 200 μL pipettspets för att ytterligare bryta upp enteroidfragmenten.
- Höj volymen på det 15 ml koniska röret med enteroidfragment till 10 ml med iskallt tvättmedium.
- Centrifugera det koniska röret vid 300 x g i 5 minuter vid RT.
- Aspirera supernatanten, inklusive BME-skiktet, och var noga med att inte störa enteroidpelleten.
OBS: BME-skiktet kommer att visas som ett grumligt gelatinöst lager precis ovanför pelleten. - För var 4:e kupoler, återsuspendera pelleten i 1 ml förvärmt TrypLE-uttrycksenzym kompletterat med 10 μM Y-27632.
- Tillsätt enteroid-trypLE-blandningen till en 24-hålsplatta och inkubera vid 37 °C, 5 % CO2 i 10 minuter.
- Efter 10 minuter pipetterar du enteroid-trypLE-blandningen 40 gånger med en 1 ml pipett för att ytterligare fragmentera enteroiderna.
- Därefter fragmenteras pipetten 40 gånger med en 200 μL pipett för att bryta sönder fragmenten till enskilda celler.
- Använd en 3 ml eller 5 ml spruta med en steril 22-G nål fastsatt, aspirera och dispensera cellsuspensionen 4 gånger för att uppnå encellssuspension.
- Övervaka celldissociationen med mikroskopi enligt beskrivningen i steg 2.3.11.1 tills 80 % av enteroiderna har brutits ned till enstaka celler.
- Samla cellsuspensionen i ett 15 ml koniskt rör och släck den enzymatiska reaktionen genom att tillsätta 4x volymen tvättmedia kompletterat med 10 % FBS.
- Filtrera enteroiderna genom en förbelagd 40 μm cellsil två gånger i ett 50 ml koniskt rör.
- Pelletera de enskilda cellerna genom att centrifugera det koniska röret med 300 x g i 5 minuter.
- 2D-sådd i flera lager på transwell-skär.
- Dekantera supernatanten och återsuspendera pelleten i en liten volym (~600 μL) organoida tillväxtmedier kompletterat med 20 % fetalt bovint serum (FBS) vid RT.
- Bestäm enteroidcelldensitet och viabilitet med hjälp av Trypan Blue-färgämnesuteslutningsmetoden, hemacytometern eller automatiserad cellräknare. En genomsnittlig lönsamhet på 75 % förväntas.
- Ta försiktigt bort överflödig beläggningslösning som applicerades i steg 1.3 från cellodlingsinsatsen strax före sådd av cellerna.
- Frö de enskilda cellerna vid 1 x 105 celler i en volym av 200 μL per insats på den apikala ytan av en förbelagd cellodlingsinsats.
- Tillsätt 700 μL komplett substrat kompletterat med 20 % FBS till den basolaterala sidan av cellodlingsinsatsen.
- Manövrera plattan 10 gånger i form av siffran 8 så att cellerna kan spridas jämnt över insatsen.
- Förvara tallriken på tallriken varmare i 10 min i biosäkerhetsskåpet.
- Inkubera plattan vid 37 °C och 5 % CO2 %.
- Efter 48 timmar byts media på de apikala och basala kompartmenten ut mot färska enteroida tillväxtmedier kompletterade med 20 % FBS och hämmare.
- På den tredje dagen, ta bort mediet från de apikala och basolaterala facken, tvätta försiktigt insatsen med 1x PBS och ersätt den med enteroiddifferentieringsmedia kompletterat med endast inhibitorer.
- Byt material i båda facken var 2-3:e dag.
- Kvantitativ mätning av epitelbarriärintegritet och sammanflöde i flera lager
OBS: Barriärintegriteten kan bedömas genom att använda en epitelvoltohmmeter för att mäta transepitelial elektrisk resistans (TEER).- Ta bort transwell-odlingsplattan från inkubatorn och låt den komma i jämvikt vid RT i några minuter i biosäkerhetsskåpet.
- Se till att STX2-elektroderna har förkonditionerats och voltohmmetern kalibrerats till 1000Ω enligt tillverkarens instruktioner.
- Sätt in sondens långa pinne i det basolaterala facket och den korta änden i det apikala facket i transwell-epitelcellkulturen. Var försiktig så att du inte stör monolagret eller skadar insatsen.
- När den är stabil, registrera 3 TEER-mätningar per transbrunnsinsats, inklusive insatsen utan celler. Ta ett genomsnitt av måtten för varje insats.
- Beräkna det korrigerade TEER-värdet genom att subtrahera medelvärdet av blindbrunnen från medelvärdet av försöksbrunnarna och sedan multiplicera det med insatsens yta för att bestämma epitelbarriärens resistans (TEER [Ω.cm2] = [Rcell layer - Rblank] × Area).
Representative Results
Det första steget i att generera 2D-enteroid-härledda monolager är att förbereda den del av tarmvävnaden som skördas (Figur 1A) för vävnadsdissociation. Detta görs genom att avlägsna det bifogade fettet och tarmkäxet från vävnaden (Figur 1B), följt av att skära vävnaden i längdriktningen för att exponera lumenytan så att tarmens slemskikt kan avlägsnas genom försiktig skrapning med hjälp av en glasskiva. Den skördade tarmdelen skärs sedan i gradvis mindre vävnadssnitt (Figur 1C) för att underlätta dissociationen. Kryptor separeras sedan från den underliggande subslemhinnevävnaden med hjälp av en serie tvättar bestående av kelatbuffertar (Figur 1D,E) och PBS. De isolerade tarmkryptorna (Figur 1F) bäddas sedan in i basalmembranmatriskupoler (Figur 2A) och odlas i flera dagar för att generera 3D-enteroider. Från en 10-tums sektion av bovint ileum kan cirka 900 000 kryptor isoleras och användas för enteroidbildning. Efter bara några timmar i odling börjar de pläterade kryptorna att förlängas och utvecklas till enterosfärer (Figur 2B). Efter 2 dagar kan en väldefinierad lumen observeras (Figur 2C), med spirande strukturer noterade så tidigt som dag 4 i odlingen (Figur 2D). Vid dag 7 har mogna enteroider utvecklats (Figur 2E). Immunofluorescensfärgningen av 7 dagar gammal 3D-enteroid visar närvaron av olika cellinjer. Konfokalmikroskopi av enteroider visar lokalisering av DAPI-kärnfärgning, E-cadherin-protein vid adherens-korsningen, kromogranin-A (Chr-A) färgning som visar närvaron av enteroendokrina celler, Lysozym (LYZ) som visar Paneth-celler och Cytokeratin-18 (CK-18) som representerar enterocytceller i figur 3. Efter 7-10 dagar i odling bör enteroiderna passera för att möjliggöra ytterligare expansion och förhindra överbeläggning. Den optimala tiden för passage av enteroider bestämdes till 7-10 dagar efter initial primär kryptisolering och är i slutändan beroende av enteroidernas hälsa och tillväxthastighet i odling. Den optimala såddtätheten för att uppnå önskad enteroidmorfologi och livskraft, som visas i figur 2E, är 400 kryptor per kupol. Enteroider kan lätt kryokonserveras, och de tinade enteroidfragmenten återhämtar sig helt för experimentell användning efter två passager efter upptining. Noterbart är att minst två passager av den primära kryptkulturen rekommenderas före kryokonservering.
För att producera ett 2D-enteroid-härlett monolager skördas 3D-enteroiderna och tritureras mekaniskt i närvaro av en dissociationslösning (figur 4A) i en serie steg till enskilda celler. Dessa enskilda celler kan sedan sås på en transwell-insats som har förbelagts med en basalmembranmatrisodlingsmedialösning. I genomsnitt kan fyra transbrunnar sås från fyra 3D-enteroidkupoler. Antalet 3D-enteroider som bearbetas är alltså beroende av antalet transbrunnar som behövs för experimentet. Plätering av enstaka celler med en såddtäthet på 1 x 105 och initialt odling av dem i närvaro av 20 % FBS (Figur 4B-D) kan generera ett sammanflytande monolager på mindre än 1 vecka. Det progressiva sammanflödet av 2D-monoskiktet i odling kan övervakas över tid med hjälp av ljusmikroskopi (figur 4E,F). Mätningar av transepitelial elektrisk resistans (TEER) kan bekräfta sammanflödet och karakterisera epitelbarriärens integritet över tid och som svar på experimentell stimulering (figur 5A). I genomsnitt, efter sju dagar i odling, kommer ett ungefär 100 % sammanflytande monolager att ha ett motsvarande TEER-värde på ~1500 Ω·cm2. En longitudinell bedömning av 2D-enteroid monolagers TEER-värden visar en stadig ökning av TEER-värdena under sju dagar, med ett maximalt medelvärde på 1546 Ω · cm2 innan det sjunker med det lägsta värdet på 11,5 Ω · cm2 som erhölls på dag tolv (figur 5B). Immunofluorescensmärkning av differentierade monolager indikerar att intakta, organiserade, polariserade tarmepitelskikt bildas med hjälp av detta protokoll (Figur 6). Konfokalmikroskopi av det färgade 2D-monolagret visar lokalisering av DAPI-kärnfärgning, E-cadherin och F-aktinfärgning (Figur 6A-D). Fluorescensmikroskopi av 2D-monolagret visar kännetecken för differentierade tarmepitelceller med kromogranin-A (Chr-A) färgning som visar närvaron av enteroendokrina celler, Lysozym (LYZ) som visar Paneth-celler och Cytokeratin-18 (CK-18) som indikerar enterocytcellinjer (Figur 6E-L). Z-stackmodellering visar den förväntade polarisationen av 2D-monolagerkulturen med karakteristisk avsättning av F-aktin som finns i mikrovilli som täcker den apikala aspekten av de differentierade enterocyterna och E-cadherin, ett protein som är beläget vid adherens-korsningarna mellan epitelceller (Figur 6M).
Monolagrets funktionalitet kan bedömas genom apikal stimulering med olika komponenter, inklusive Toll-like receptor (TLR) ligander eller patogener, följt av cytokinkvantifiering av cellkulturer, supernatanter skördade från apikala och basala kompartment. Faktum är att när den apikala aspekten av monolagret stimuleras i 24 timmar med TLR 1/2-agonisten Pam3csk4 på dag 4 av odlingen, observeras ökad cytokinproduktion i båda facken jämfört med de obehandlade monolagren (Figur 7A,B).
Figur 1: Isolering av tarmkryptor från friska vuxna nötkreatur. Bilder som illustrerar vävnadsbearbetningen av (A) hela vuxna nötkreaturs ileum, (B) avfettad ileum, (C) ileum snittad i 2,5-tums (6,3 cm) bitar i PBS på is, (D) ileala vävnadssnitt i dissociationsbuffert #1 vid 4 °C, och (E) i dissociationsbuffert 2 i ett skakande vattenbad vid 37 °C, och (F) isolerade ileala kryptfragment. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Bovin primär 3D-utveckling av ileal enteroid i basalmembranmatris. Representativa bilder av (A) 3D-enteroidkupoler skapade i en 6-brunns vävnadsodlingsplatta och (B-E) 3D-enteroidutveckling från dag 0, 2, 4 och 7 i odling. Skalstapel = 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Tredimensionella tarmenteroider visar epitelcellslinjefärgning. Representativa bilder av 3D-enteroider efter 7 dagar i odling visar närvaron av kärnfärgning, F-aktin, cytokeratin-18 (CK-18), kromogranin-A (Chr-A), Ecadherin (E-cad), Lysozym (Lyz) och överlagring av bilder (Merge). Skalstreck 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Etablering av 2D-enteroid-härlett monolager från ileala enteroider. Representativa bilder av (A) 3D-enteroidfragment i dissociationslösning som förberedelse för enskiktssådd, enstaka celler pläterade på en transwell-insats med en sådddensitet på 1 x 105 avbildade på dag 0 med (B) ljus, (C) faskontrast och (D) ljusfältsmikroskopi, och monolagerutveckling på transwell-insatser avbildade på dag fem med (E) faskontrast och (F) ljusfältsmikroskopi. 40x förstoring och skalstreck = 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Mätningar av transepitelial elektrisk resistans (TEER) av det 2D-enteroid-härledda monolagret på transwell-insatser. A) Schematisk bild av hur TEER-mätningar av 2D-intestinala epitelceller (IEC) erhålls med hjälp av STX2-ätpinneelektroderna i en voltohmmeter. B) Longitudinell övervakning av 2D-monolager-TEER-mätningar under 12 dagar i cellodling. Varje datapunkt representerar ett genomsnittligt TEER-värde och ett medelvärde (SEM) som erhållits från två tekniska replikat. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6: Differentierade 2D-enteroid-härledda monolager på transwell-insatser utvecklas till polariserade tarmepitelark. (A-M) Representativa immunofluorescerande bilder av ett 2D-enteroid-härlett monolager på transwell-insats efter 5 dagar i odling som visar (A) kärnan (blå), (B) E-cadherin (röd), (C) F-aktin (grön) och (D) överlagring av de 3 bilderna (sammanslagning), (E,I) kärnfärgning, (F) kromogranin-A, (J) cytokeratin-18, (G,K) lysozym och (H,L) sammanslagning av bilder. (M) Z-stackmodellering som visar fördelningen av samma epitelcellmarkörproteiner i 2D-monolagerarket. Bilder erhölls från 2 biologiska replikat. Skalstapel = 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 7: Bovina primära 2D-enteroid-härledda monolager på transwell-insatser är funktionellt aktiva. apikal och basal cellodling supernatantcytokinsekretion av (A) IL-1α och (B) IL-8 genom 2D monolager på transwell-insatser efter 5 dagar i odling som var obehandlade eller stimulerade med Pam3csk4 i 24 timmar. Data är representativa för genomsnittliga cytokinnivåer och SEM från monolager som härrör från frysta lager av kryptor från ett djur och tre oberoende experiment. Cytokiner kvantifierades med hjälp av den pärlbaserade multiplexanalysen (Table of Materials) enligt tillverkarens instruktioner och analyserades på en kompakt multiplexeringsenhet (Table of Materials) och immunoassay curve fitting software (Table of Materials). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Tabell 1: Stam och slutliga koncentrationer av reagenserna. Klicka här för att ladda ner tabellen.
Discussion
Protokollet som presenteras här beskriver en fysiologiskt relevant modell för att undersöka tarmfysiologi och enteriska sjukdomar. Flera forskargrupper har beskrivit uppkomsten av enteroidkulturer hos nötkreatur, bland annat 2D-monolager 16,19,20,21,22,23,24. Även om generering av flera lager inte är uppenbart tekniskt utmanande, är flera minuters steg avgörande för att utveckla framgångsrika kulturer konsekvent. Som sådan kan reproducerbarheten av 2D-monolager med hjälp av de kortfattat beskrivna metoderna i den publicerade litteraturen vara utmanande för en forskare som är nybörjare inom området organoider att genomföra. Protokollet som beskrivs här är anpassat från dessa protokoll och de som publicerats i andra arter, vilket ger en steg-för-steg-guide för generering av monolager på transwell-insatser som är mycket reproducerbar.
Protokollet som beskrivs här kan enkelt modifieras för att passa de specifika målen för den experimentella designen eller tillgången på reagenser. Enligt detta protokoll kan framgångsrika odlingar uppnås genom sådd av monolager med lägre celltäthet (t.ex. 2,5 x 104) eller i frånvaro av FBS, vilket beskrivs i andra publikationer24. Att ändra dessa parametrar kan dock kräva en ökad kultur för att upprätta ett sammanflytande monolager. Om andra faktorer som är integrerade i studiedesignen, inklusive samodling med immunceller, dikterar ett specifikt tidsförlopp för experimentet, kan såddtätheten ändras efter behov. Medan andra basalmembranformuleringar kan ersättas i stället för den som används i detta protokoll för att generera 3D-enteroider och 2D-monolager, kommer dessa att kräva viss optimering för att bestämma det optimala förhållandet mellan basalmembran och media.
Tillämpningen av transwell-insatser i den beskrivna metodiken har många fördelar jämfört med enskiktstillväxt på konventionella plast- och 3D-enteroidkulturer. Jämfört med vanliga vävnadsodlingsplattor främjar användning av transbrunnar för monolagerkulturer cellulär differentiering och organisation på ett sätt som behåller likheten med tarmkryptor14,25. Tarmepitelbarriären är avgörande för att förhindra translokation av gifter och mikroorganismer i kroppen samtidigt som den underlättar näringsupptaget. Som sådan är det viktigt att förstå hur tarmens barriärintegritet fungerar hos friska och förändras under tarmstörningar eller som svar på föreningar. Till skillnad från 3D-enteroidkulturer är objektiv bedömning av tarmbarriärens integritet möjlig när man kombinerar monolager på transbrunnar och mäter TEER, vilket visas här i14,25. Generering av 2D-monolager på transbrunnar möjliggör också dubbelodling med relevanta celltyper som immun- eller stromaceller. Detta gör det möjligt att karakterisera kritiskt viktig överhörning mellan tarmceller och celler i vävnadens mikromiljö, vilket inte kan uppnås med 3D-kulturer. Exponering av monoskiktets apikala yta möjliggör inte bara experimentell exponering för patogener och föreningar och insamling av luminalprodukter, utan möjliggör också studier av andra aspekter av tarmfysiologi och sjukdomar, inklusive undersökning av tarmmikrobiota och molekylär absorptions- eller transportfysiologi13. Oberoende kontroll över de apikala och basala tarmytorna är en klar fördel jämfört med 3D-enteroidmodeller.
Genom flera försöksexperiment identifierade vi viktiga steg som bidrog till protokollets framgång. Medan vävnadsprover från hela tarmen kan kylas över natten och behandlas följande dag, måste vävnadsdissociationen och isoleringen av kryptfragmentstegen utföras omedelbart för att förhindra sönderfall av de isolerade kryptfraktionerna. Efter att ha slutfört PBS-tvättarna kan centrifugering av kryptorna i tvättmedia hjälpa till att förhindra krypthaveri, som beskrivs i steg 2.3.10. När du passerar enteroiderna eller skördar dem för monolagerbildning är det viktigt att separera enteroiderna från BME-kupolerna. Tvättmediet måste vara iskallt för att hjälpa till att lösa upp BME. Däremot kan användning av förvärmd trypLE och filtrering av cellsuspensionen två gånger hjälpa till att bilda de enskilda celler som behövs för monolagergenerering. Slutligen kan manuell manövrering av plattan i form av siffran 8 hjälpa till att jämnt fördela de enskilda cellerna över transbrunnsinsatsen.
En viktig begränsning i detta protokoll är att 2D-monolagren producerades från enteroidstammar som genererats från en mogen Holstein-stut (>2 år gammal). Den mognande mag-tarmkanalen hos kalvar kan kräva mindre modifieringar av det beskrivna protokollet för att ge optimala resultat. Rasspecifika skillnader i tarmfysiologin hos nötkreatursraser har beskrivits i litteraturen26. Även om det är okänt om dessa skillnader kan påverka enteroid och efterföljande generering av monolager, misstänker vi att eventuella skillnader endast skulle resultera i mindre ändringar i vårt protokoll. Dessutom har 2D-kulturmodellen vissa inneboende nackdelar. Jämfört med 3D-enteroidmodeller kan 2D-kulturer sakna vissa aspekter av tarmvävnadsarkitekturen och cellulär mångfald och skapa begränsningar och utmaningar i samband med förökningen av 2D-kultur13. Ändå visar studier att vissa monolager kan efterlikna förväntad kryptoorganisation27, och vissa av dessa begränsningar kan till och med övervinnas genom att etablera 2D-kulturer med ett luft-vätskegränssnitt. Icke desto mindre bör begränsningarna i denna modell beaktas fullt ut för att avgöra om dess tillämpning är lämplig för den experimentella fråga som ställs.
Detta protokoll beskriver ett optimerat odlingssystem som modellerar den bovina mag-tarmkanalen med hjälp av enteroider som härrör från bovint ileum för att bilda monolager på transwell-insatser. Med ett brett spektrum av tillämpningar, från forskning om infektionssjukdomar till läkemedelsupptäckt och regenerativ medicin, kan detta odlingssystem med hög kapacitet leda till en aldrig tidigare skådad utveckling av förebyggande och terapeutiska strategier som kan vara ömsesidigt fördelaktiga för djurs och människors hälsa.
Disclosures
Författarna förklarar att forskningen genomfördes i avsaknad av kommersiella eller finansiella relationer som skulle kunna tolkas som en potentiell intressekonflikt.
Acknowledgments
Vi erkänner användningen av Cellular and Molecular Core Facility vid Midwestern University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 mL pipette tip | MidSci | PR-200RK-S | |
| 1 µm PET 24-well cell culture inserts | Corning | 353104 | |
| 1000 mL pipette tip | MidSci | PR-1250RK-S | |
| 22 G needle | Becton, Dickinson and Company | 305156 | |
| 24-well culture vessel | Corning | 353504 | |
| 40 μm cell strainer | Corning | 431750 | |
| 50 mL centrifuge tube | Fisher scientific | 14-955-240 | |
| 5-mL pipet tip | Fisher scientific | 30075307 | |
| 5 mL syringe | Becton, Dickinson and Company | 309647 | |
| 5 mL tube | Eppendorf | 30119401 | |
| Anti-Cytokeratin -18 (C-04) | Abcam | AB668-1001 | |
| B-27 supplement without vitamin A | Gibco | 12-587-010 | |
| Belysa software | Luminex | 40-122 | Immunoassay curve fitting software |
| Bovine serum albumin (BSA) | Fisher bioreagents | BP9704-100 | |
| Caspofungin acetate | Selleckchem | S3073 | |
| Cell lifter | Fisher Scientific | 08-100-241 | |
| Chromogranin-A (E-5) | Santa Cruz Biotechnology | SC-271738 | |
| Coverslips | Fisher scientific | 12-540-C | |
| Cryovials | Neptune scientific | 3471.X | |
| Cultrex Ultimatrix RGF BME | R&D Systems | BME001-05 | |
| DAPI | MilliporeSigma | D9542-5MG | |
| Dissecting scissors | VWR | 82027-588 | |
| Dithiothreitol (DTT) solution | Thermo Scientific | FERR0861 | |
| DMEM/ F-12 1.1 medium (with L-glutamine, without HEPES) | Cytiva | SH30271.01 | |
| E-cadherin | Cell Signaling Technology | #3195 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Fisher Scientific | BP2482500 | |
| FBS | Corning | MT35070CV | |
| Gentamicin | Gibco | 15710064 | |
| Glass microscope slide | Fisher scientific | 12-550-07 | |
| Goat anti-mouse Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11001 | |
| Goat anti-mouse Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A21235 | |
| Goat anti-rabbit Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A21428 | |
| Hemacytometer | Bio-Rad | 1450015 | |
| IntestiCult organoid Differentiation medium (Human) | StemCell Technologies | 100-0214 | |
| IntestiCult organoid growth medium (Human) | StemCell Technologies | 0-6010 | |
| Keyence BZ-X700 | Keyence | BZ-X700 | |
| LY2157299 (Galunisertib) | Selleckchem | S2230 | |
| MAGPIX system | Luminex | Magpix system | Compact multiplexing unit |
| Microscope | Keyence | BZ-X700 | |
| MILLIPLEX Bovine Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel | MilliporeSigma | BCYT1-33K | Bead-based multiplex assay |
| Mr. Frosty container | Nalgene | 5100-0001 | |
| Non-Enzymatic Cell Dissociation Solution | ATCC | 30-2103 | |
| NutriFreeze D10 Cryopreservation Media | Biological Industries | 05-713-1B | |
| Orbital shaking platform | Thermo Fisher | 88880021 | |
| Pam3Csk4 | invivogen | tlrl-pms | |
| Parafilm sealing film | dot scientific inc. | #HS234526C | |
| Paraformaldehyde 16% solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Phalloidin-FITC | R&D Systems | 5782/12U | |
| Phosphate buffered saline | Fisher Scientific | BP399-20 | |
| Prolong Glass Antifade | Invitrogen | P36982 | |
| Rabbit anti-human Lyzozyme (EC3.2.1.17) | Agilent technologies | A009902-2 | |
| SB202190 (FHPI) | Selleckchem | S1077 | |
| Shaking water bath | Thermo Fisher | MaxQ 7000 | |
| Sodium Azide | VWR | BDH7465-2 | |
| Streptomycin | Teknova | S6525 | |
| Trypan Blue dye | Gibco | 15250-061 | |
| TrypLE express enzyme | Life technologies | 12604013 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337 | |
| Voltohmmeter | MilliporeSigma | Millicell ERS-2 | |
| Y-27632 | Selleckchem | S1049 |
References
- Gerdts, V., et al. Large animal models for vaccine development and testing. ILAR Journal. 56 (1), 53-62 (2015).
- Reza Khorramizadeh, M., Saadat, F. Animal models for human disease. Animal Biotechnology. Chapter 8, Academic Press. 153-171 (2020).
- Meyerholz, D. K., Beck, A. P., Singh, B. Innovative use of animal models to advance scientific research. Cell and Tissue Research. 380 (2), 205-206 (2020).
- Hamernik, D. L. Farm animals are important biomedical models. Animal Frontiers. 9 (3), (2019).
- Ribitsch, I., et al. Large animal models in regenerative medicine and tissue engineering: To do or not to do. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 972 (2020).
- Wagar, L. E., DiFazio, R. M., Davis, M. M. Advanced model systems and tools for basic and translational human immunology. Genome Medicine. 10 (1), 73 (2018).
- Ziegler, A., Gonzalez, L., Blikslager, A. Large animal models: The key to translational discovery in digestive disease research. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 2 (6), 716-724 (2016).
- Roth, J. A., Tuggle, C. K.
- Schultz, R. D., Dunne, H. W., Heist, C. E.
- Potter, A. A., et al. Large animal models for vaccine development and testing. ILAR Journal. 56 (1), 53-62 (2015).
- Ahluwalia, B., Magnusson, M. K., Öhman, L. Mucosal immune system of the gastrointestinal tract: maintaining balance between the good and the bad. Scandinavian Journal of Gastroenterology. 52 (11), 1185-1193 (2017).
- Roodsant, T., et al. A human 2D primary organoid-derived epithelial monolayer model to Study host-pathogen interaction in the small intestine. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 272 (2020).
- Liu, Y., Chen, Y. G. 2D- and 3D-based intestinal stem cell cultures for personalized medicine. Cells. 7 (12), 225 (2018).
- Duque-Correa, M. A., Maizels, R. M., Grencis, R. K., Berriman, M. Organoids - New models for host-helminth interactions. Trends in Parasitology. 36 (2), 170-181 (2020).
- Kar, S. K., et al. Organoids: a promising new in vitro platform in livestock and veterinary research. Veterinary Research. 52 (1), 43 (2021).
- Hamilton, C. A., et al. Development of in vitro enteroids derived from bovine small intestinal crypts. Veterinary Research. 49 (1), 54 (2018).
- Beaumont, M., et al.
- Lee, B. R., et al. Robust three-dimensional (3D) expansion of bovine intestinal organoids: An in vitro model as a potential alternative to an in vivo system. Animals (Basel). 11 (7), 2115 (2021).
- Töpfer, E., et al. Bovine colon organoids: From 3D bioprinting to cryopreserved multi-well screening platforms. Toxicology in Vitro. 61, 104606 (2019).
- Powell, R. H., Behnke, M. S. WRN conditioned media is sufficient for in vitro propagation of intestinal organoids from large farm and small companion animals. Biology Open. 6 (5), 698-705 (2017).
- Derricott, H., et al. Developing a 3D intestinal epithelium model for livestock species. Cell and Tissue Research. 375 (2), 409-424 (2019).
- Rusu, D., Loret, S., Peulen, O., Mainil, J., Dandrifosse, G. Immunochemical, biomolecular and biochemical characterization of bovine epithelial intestinal primocultures. BMC Cell Biology. 6, 42 (2005).
- Dibb-Fuller, M. P., Best, A., Stagg, D. A., Cooley, W. A., Woodward, M. J. An in-vitro model for studying the interaction of Escherichia coli O157:H7 and other enteropathogens with bovine primary cell cultures. Journal of Medical Microbiology. 50 (9), 759-769 (2001).
- Sutton, K. M., Orr, B., Hope, J., Jensen, S. R., Vervelde, L. Establishment of bovine 3D enteroid-derived 2D monolayers. Veterinary Research. 53 (1), 15 (2022).
- Barrila, J., et al. Modeling host-pathogen interactions in the context of the microenvironment: Three-dimensional cell culture comes of age. Infection and Immunity. 86 (11), e00282-e00318 (2018).
- Carvalho, P. H. V., Pinto, A. C. J., Millen, D. D., Felix, T. L. Effect of cattle breed and basal diet on digestibility, rumen bacterial communities, and eating and rumination activity. Journal of Animal Science. 98 (5), skaa114 (2020).
- Thorne, C. A., et al. Enteroid monolayers reveal an autonomous WNT and BMP circuit controlling intestinal epithelial growth and organization. Developmental Cell. 44 (5), 624-633 (2018).
