Summary
Enteroider fremstår som en ny modell for å studere vevsfysiologi og patofysiologi, medisinutvikling og regenerativ medisin. Her beskriver vi et bovint primærcelle 2D enteroid-avledet kultursystem som tillater samkultur med relevante vevscelletyper. Denne modellen gir en translasjonsfordel for gastrointestinal forskningsmodellering.
Abstract
Organoide cellekultursystemer kan rekapitulere kompleksiteten observert i vev, noe som gjør dem nyttige for å studere vertspatogeninteraksjoner, evaluere legemiddeleffektivitet og toksisitet og vevsbioengineering. Imidlertid kan anvendelse av disse modellene av de beskrevne årsakene være begrenset på grunn av den tredimensjonale (3D) naturen til disse modellene. For eksempel er bruk av 3D enteroidkultursystemer for å studere fordøyelsessykdommer utfordrende på grunn av utilgjengeligheten av tarmlumen og dets utskillede stoffer. Faktisk krever stimulering av 3D-organoider med patogener enten luminal mikroinjeksjon, mekanisk forstyrrelse av 3D-strukturen eller generering av apikale enteroider. Videre kan disse organoidene ikke dyrkes sammen med immun- og stromale celler, noe som begrenser grundig mekanistisk analyse i patofysiologisk dynamikk. For å omgå dette optimaliserte vi et bovint primærcelle todimensjonalt (2D) enteroid-avledet monolagskultursystem, noe som muliggjorde samkultur med andre relevante celletyper. Ilealkrypter isolert fra friske voksne storfe ble dyrket for å generere 3D-organoider som ble kryopreservert for fremtidig bruk. Et 2D-monolag ble opprettet ved hjelp av gjenopplivede 3D-enteroider som ble passasjert og forstyrret for å gi enkeltceller, som ble frøet på kjellermembranekstraktbelagte transbrønncellekulturinnsatser, og derved eksponerte deres apikale overflate. Intestinal monolagspolaritet, cellulær differensiering og barrierefunksjon ble karakterisert ved hjelp av immunfluorescensmikroskopi og måling av transepitelial elektrisk motstand. Stimulering av monolagets apikale overflate avslørte monolagets forventede funksjonalitet, som demonstrert ved cytokinsekresjon fra både apikale og basale rom. Den beskrevne 2D enteroid-avledede monolagsmodellen har stort løfte om å undersøke vertspatogeninteraksjoner og tarmfysiologi, medisinutvikling og regenerativ medisin.
Introduction
Dyremodeller i forskning spiller en avgjørende rolle i å øke vår forståelse av sykdomspatofysiologi og dynamikken i vertsimmunresponsen under infeksjon og støtter utviklingen av nye forebyggende og terapeutiske strategier 1,2,3,4. Disse modellene støtter forskning, oppdagelse og fremskritt hos dyr og er nøkkelen til fremdriften av menneskers helseforskning. I flere tiår har gnagermodeller støttet fremskritt innen immunmekanismer og grunnleggende biologisk forskning for menneskelige sykdommer 3,5,6,7. Mens gnagermodeller er kritiske i screening og tidlig utviklingsforskning, tilbyr store dyremodeller en mer relevant sammenligning ved forskning på menneskelige sykdommer i både tidlige oppdagelses- og senere utviklingsstudier, inkludert terapeutisk effekt og sikkerhetstesting 1,3,4,5. Husdyr gir klare fordeler sammenlignet med gnagermodeller for mer effektiv oversettelse for menneskelige applikasjoner for noen sykdommer, inkludert kryptosporidiose, salmonellose, tuberkulose, respiratorisk syncytialvirus og brucellose 1,7,8. Faktisk utvikler disse sykdommene og andre spontant hos storfe, som deler flere analoge sykdomspatogeneser og immunprosesser til mennesker, og som en utavlet befolkning etterligner storfe den genetiske og miljømessige heterogeniteten som påvirker menneskelige immunresponser 5,8,9,10 . Fordelene med storfemodeller for forskning på smittsomme sykdommer kan maksimeres ved først å bruke et sofistikert kultursystem og deretter implementere in vivo-studier trinnvis. Den første bruken av et svært komplekst storfe-avledet kultursystem kan redusere antall levende dyreforsøk betydelig, samtidig som sjansene for vellykket translasjons- og anvendt forskning forbedres. Dyrkningsmodeller bør rekapitulere sykdomsprosessene på organnivå for optimal prediktiv validitet, og beholde det opprinnelige vevsmikromiljøet romlig og funksjonelt.
Den mukosale immunresponsen er et mangesidig system som består av en svært effektiv barriere dannet av gastrointestinale enterocytter og forskjellige populasjoner av immunceller som ligger under slimhinneoverflaten11. Dette svært komplekse systemet er kritisk under infeksjon for å opprettholde GI-homeostase og initiere immunforsvar mot enteriske patogener11. Kommunikasjon mellom enterocytter og underliggende medfødte immunceller initierer utviklingen av beskyttende immunresponser mot patogene mikroorganismer. Som sådan er kultursystemer som er komparative i deres kompleksitetsnivå nødvendige for en optimal undersøkelse av vert-enteriske patogeninteraksjoner og er svært effektive for å forstå enterisk fysiologi og narkotikaforskning og utvikling12,13. Organoider er et robust dyrkningssystem som ligner arkitekturen og funksjonen til opprinnelsesvevet14,15. Multicellulariteten til disse modellene tillater undersøkelse av rollen til forskjellige cellepopulasjoner og de cellulære interaksjonene som er involvert i enterisk helse og sykdom12,14. Imidlertid er human-avledede organoidmodeller i forskning for tiden begrenset av vanskeligheten med å oppnå tilstrekkelig mengde og konsistent kvalitet på humane tarmepitelceller og begrenset celle levedyktighet i kultur. Immortaliserte cellelinjer kan brukes til å oppnå høye utbytter av homologe kulturer i disse modellene konsekvent; Imidlertid mangler transformerte celler iboende mangfoldet og funksjonell kompleksitet av ikke-transformerte epitelceller16,17. Fordelene ved å bruke kulturer avledet fra storfevev som en modell for å undersøke gastrointestinale sykdommer og fysiologi inkluderer den enkle som vevsprøver kan oppnås konsekvent fra friske givere, forbedret celle levedyktighet, og større cellulær mangfold oppnåelig bare med ikke-immortalized vev. Komparativ vevstranskriptomikk og karakterisering av intestinale organoider avslører likheter i konserverte ortologe gener og cellulære potensialer mellom mennesker og storfe18. Derfor kan et bovint organoidavledet kultursystem være fordelaktig ved undersøkelse av humane tarmsykdommer, med funn som lett kan oversettes til humanmedisin.
Protokollen beskrevet her beskriver en effektiv plattform for å evaluere vertsresponser på enteriske patogener eller forbindelser og tarmfysiologi ved bruk av et bovint enteroid-avledet 2D primært cellekultursystem. I motsetning til 3D-organoider, tillater 2D-kultursystemer generert på transbrønninnsatser en dobbel kultur av tarmceller med immun- eller stromale celler, noe som tillater studier i vevsnivådynamikken. Med applikasjoner innen biomedisinsk forskning, farmasøytisk utvikling og effekttesting, kan denne fysiologisk relevante modellen være til nytte for helsen og fremgangen til både storfe og mennesker.
Protocol
Alle protokollene ble utført i samsvar med institusjonelle og nasjonale retningslinjer og forskrifter for dyrevelferd.
1. Forberedelse av reagens
MERK: Stamtemperaturen og den endelige konsentrasjonen av reagensene som ble brukt i denne studien er angitt i tabell 1.
- Forbered prøveinnsamlingsbuffer: Bland 1 l iskald fosfatbufret saltvann (PBS) som inneholder penicillin (100 U / ml), streptomycin (100 μg / ml), gentamicin (25 μg / ml) og caspofungin (2,5 μg / ml). Oppbevar lageroppløsning ved 4 °C.
- Forbered dissosiasjonsreagens #1: Bland 18,55 ml prøveoppsamlingsbuffer (som beskrevet i trinn 1.1), 1,422 ml etylendiamintetraeddiksyre (EDTA, 0,422 M/pH 7,4), 20 μL 1 M 1,4-dithreitol (DTT) løsning, 4 μL Y-27632-løsning (5000x/50 mM). Oppbevar oppløsningen ved 4 °C.
- Forbered dissosiasjonsreagens #2: Bland 18,57 ml oppsamlingsbuffer (som beskrevet i trinn 1.1), 1,422 ml EDTA (0,422 M/pH 7,4), 4 μL Y-27632-løsning (5000x/50 mM). Oppbevar oppløsningen ved 37 °C.
- Forbered enteroid vekstmedielager: Bland 9,875 ml organoid vekstmedium pluss tilskudd, 100 μL penicillin (100 U / ml), streptomycin (100 μg / ml), 5 μl gentamicin (25 μg / ml) og 20 μl caspofungin (2,5 μg / ml). Oppbevar oppløsningen ved 4 °C.
- Forbered enteroid differensieringsmedielager: Bland 10 ml organoid differensieringsmedium pluss supplement, 100 μL penicillin (100 U / ml), streptomycin (100 μg / ml), 5 μL gentamicin (25 μg / ml) og 20 mikrol caspofungin (2,5 μg / ml). Oppbevares ved -20 °C.
- Forbered vaskemedier: Bland 48,45 ml DMEM / F-12 1,1 medium (med L-glutamin, uten HEPES), 1 ml B-27-tilskudd uten vitamin A (50x lager), 500 μL penicillin (100 U / ml), streptomycin (100 μg / ml), 25 μl gentamicin (50 mg / ml stam) og 25 μl caspofungin (5 mg / ml lager). Oppbevar oppløsningen ved 4 °C.
- Forbered beleggbuffer: Bland 25 ml DMEM: F12 komplette medier uten hemmere og 25 mg bovint serumalbumin (BSA). Oppbevar oppløsningen ved 4 °C.
2. Isolering av tarmkrypter fra hele vev (figur 1)
MERK: Bovine små intestinale enteroider ble generert fra ilealvev hentet fra friske voksne Holstein-styrer (>2 år) fra et lokalt biffbehandlingsanlegg. En donor ble brukt til denne serien av eksperimenter.
- Fremstilling av tarmvevsprøver
- Plasser de høstede ~ 10 tommers (25 cm) tarmvevsprøvene i ~ 400 ml iskald oppsamlingsbuffer (PBS + antibiotika / antimykotika) og på is for transport til laboratoriet.
- Bruk kirurgisk saks (f.eks. Mayo saks) og tang (f.eks. Adson tang), fjern overflødig fett og mesenteri fra tarmvevsprøven.
- Klipp vevet i to like store stykker.
- Åpne vevet i lengderetningen med kirurgisk saks og skyll vevet i steril PBS.
- Fjern forsiktig slimlaget i tarmprøven ved hjelp av siden av et sterilt glassmikroskopglass og skyll vevet med fersk PBS.
MERK: Dette trinnet bidrar til å fjerne villi og bidrar til å øke renheten til krypfraksjonene i påfølgende trinn. - For hvert 5-tommers (13 cm) stykke, kutt vevet i to 2,5 tommer (6,5 cm) og kutt deretter hvert stykke i 4 omtrent like små biter for å lette vevsdissosiasjon.
- Dissosiasjon av tarmvev
- Forbered et 20 ml volum av vevets dissosiasjonsreagens #1 i et sterilt 50 ml konisk rør og deponer de små vevsprøvene i det koniske røret til volumforskyvningen beveger menisken fra 20 ml-merket til 35 ml-merket på det koniske røret.
- Gjenta trinnet ovenfor for de resterende bitene av tynntarmsvevsprøven.
- Forsegl de koniske rørene med parafilm og rist det koniske røret manuelt 10 ganger.
MERK: Gjennom hele protokollen skal manuell risting gjøres på en bevisst, men skånsom måte. - Plasser de koniske rørene horisontalt på is i en beholder på en orbital risteplattform.
- Rist de koniske rørene på is i beholderen i 30 minutter ved 80 omdreininger per minutt (rpm). Hvert 10. minutt rister du det koniske røret manuelt.
- Klargjør et 20 ml volum av forvarmet (37 °C) vevsdissosiasjonsreagens #2 (formulert som ovenfor, men uten DTT) i et 50 ml konisk rør. Deponer vevsprøvene fra de koniske rørene som inneholder dissosiasjonsreagenset #1 i de koniske rørene som inneholder dissosiasjonsreagenset #2.
- Forsegl de koniske rørene med parafilm og rist de koniske rørene manuelt 10 ganger.
- Plasser de koniske rørene i et forvarmet (37 °C) ristende vannbad, vippet i ca. 60 °C vinkel, og rist ved 150 o / min i 10 minutter, med manuell risting etter 5 minutter og igjen etter totalt 10 min inkubasjon.
- Isolering av kryptfragmenter
- Merk 10 sterile koniske rør #1 - #10. Tilsett 20 ml steril iskald PBS til hvert merket konisk rør.
- Overfør vevsbitene fra de koniske rørene som inneholder dissosiasjonsreagenset #2 til et nytt sterilt 50 ml konisk rør som inneholder iskald PBS #1.
- Rist de koniske rørene manuelt 10 ganger.
- Forsegl de koniske rørene med parafilm og legg dem horisontalt på is. Rist koniske rør på en orbital shaker i 10 minutter ved 80 o / min. Etter 10 min, rist manuelt konisk rør #1 10 ganger. Dette regnes som Vask #1.
- Overfør forsiktig vevsprøver med et par kirurgiske tang til konisk rør #2.
- Gjenta trinn 2.3.2 - 2.3.4, dette regnes som vask #2.
- Gjenta vask til vask #10.
- Supernatantene fra hver vask inneholder kryptene som skal brukes til enteroidgenerering. Oppbevar tubene med supernatantene ved 4 °C til alle 10 vaskene er fullført.
- Etterat vask nummer 10 er fullført og vevsdelen kassert, sentrifugerer du supernatantene til koniske rør #6-#10 ved 400 x g i 2 minutter ved 4 °C for å pelletere de isolerte kryptene.
MERK: Vask 6-10 inneholder de reneste fraksjonene av intakte krypter med begrenset rusk og enkeltceller. Som sådan anbefales det at bare disse fraksjonene brukes til enteroidgenerering, og de tidligere vaskene (# 2 - # 5) kastes) - Kast supernatanten og tilsett 4 ml frisk, iskald PBS til krypter uten å resuspendere (dette bidrar til å holde fragmentene intakte til mikroskopi).
- Vurder renheten til de dissosierte kryptene for hvert koniske rør #6- #10 ved mikroskopi.
- Tilsett 50 μL PBS til en plate med 384 brønner.
- Legg til 10 μL kryptoppheng til PBS og bruk en 40x forstørrelse objektivlinse for å bestemme kryptens renhet, integritet og antall.
MERK: Å tegne et kryss på bunnen av platen gjør tellingen enklere.
3. Ex vivo generering og passasje av storfe ileal enteroider (figur 2)
MERK: Kryptene fra de koniske rørene med de mest rene, intakte tarmkryptene vil bli brukt til nedstrømsanalyser. For alle trinn som involverer krypter og enteroider, må pipettespisser, celleskrapere og rør forhåndsbelegges med beleggbufferen, og bobler bør unngås for å forhindre tap av krypter. Med mindre annet er oppgitt, bør en 1000 μL pipetspiss brukes for å forhindre oppbryting av kryptfragmenter.
- Genererer enteroider fra kryptfragmenter
- Kombiner de reneste kryptfraksjonene (vanligvis #6- #10) til ett konisk rør.
- Sentrifuger det kjegleformede røret som inneholder kryptene ved 400 x g i 2 minutter ved 4 °C.
- Kast supernatanten ved å aspirere den med en pipette og resuspender kryptpelleten i Wash Media.
- Sentrifuge som i trinn 3.1.2. Dekanter supernatanten og tilsett 2 ml vaskemedier til kryptpelleten.
- Tell antall krypter som beskrevet i trinn 2.3.11.1.
- Sentrifuge som i trinn 3.1.2 for å pelletere kryptene, kaste supernatant og resuspendere i iskald 100% redusert vekstfaktor kjellermembran ekstracellulær matrise (BME) for å oppnå en konsentrasjon på ca. 400 krypter / 100 μL.
MERK: Det er viktig å tine BME riktig ved 4 °C ettersom temperaturendringer endrer konsistensen. BME kan forhindres i å størkne for tidlig ved hjelp av en kjøleblokk og forkjølte pipetspisser.- Ved hjelp av en annen kjellermembranmatriseformulering kan det kreve fortynning av BME når du lager kupler. Se produsentens instruksjoner som er spesifikke for BME som brukes.
- Pipett opp og ned for å suspendere kryptene i BME grundig.
- Lag krypt-BME-kupler ved sakte å pipetere 50 μL krypt-BME-suspensjon på en 6-brønns vevskulturplate på en oppvarmingsplate satt til 37 ° C med opptil 8 kupler / brønn.
MERK: 6-brønnsplaten må forvarmes i en inkubator ved 37 ° C over natten før plettering av kupler. - Hold 6-brønnsplaten på oppvarmingsplaten i 1 min før du forsiktig flytter platen til en 37 ° C, 5% CO2 -inkubator.
- Etter 2 minutter, snu 6-brønnsplaten slik at lokket vender ned og rug i ytterligere 30 minutter for å la kuplene polymerisere.
- Etter 30 minutter, tilsett forsiktig 3 ml romtemperatur (RT) Enteroid Growth Media supplert med 10 μM SB202190, 0,5 μM LY2157299 og 10 μM Y-27632 til brønnene som inneholder kupler.
- Inkuber ved 37 °C, 5 % CO2.
- Fjern media og erstatt med friske enteroid vekstmedier supplert med hemmere hver 2-3 dager.
- Passasje av enteroider
- Etter 7-10 dager, sørg for at kryptene har dannet 3D-enteroider med mange spirende strukturer, som i figur 2E, og er klare til å bli passert.
- Kast mediet fra brønnene som inneholder kupler.
- For hver 4 kupler per brønn, tilsett 1 ml iskald ikke-enzymatisk celledissosiasjonsløsning supplert med 10 μM Y-27632 til hver brønnholdig kupler.
- Bruk en forhåndsbelagt celleskraper, løsne kuppelen forsiktig fra vevskulturplaten.
- Samle enteroider i et 15 ml konisk rør og triturere ved å pipettere opp og ned 10 ganger.
- Inkuber det koniske røret som inneholder de fragmenterte enteroidene ved RT på en orbital shaker ved 80 o / min i 10 minutter.
- Tilsett 10 ml iskalde vaskemedier med 10 μM Y -27632 til enteroidene.
- Sentrifuge det koniske røret ved 300 x g i 5 minutter ved RT.
- Kast supernatanten og oppløs pelleten i 10 ml ferske vaskemedier og overfør til en ny 15 ml konisk tube.
- Sentrifuge det koniske røret ved 300 x g i 5 minutter ved RT.
- Kast supernatanten og resuspender pelleten i 1 ml enteroid vekstmedium i 1,5 ml mikrosentrifugerør.
- Sentrifuger mikrosentrifugerøret ved 300 x g i 5 minutter ved RT og kast supernatanten.
- Resuspender enteroidpelleten i iskald 100% BME og følg trinn 3.1.6-3.1.13.
- Repassage enteroids hver 7. Ekspansjonstider kan variere på grunn av tetthet, levedyktighet og omfang av spirende. Flere spirende strukturer som skaper store enteroidstrukturer er en indikasjon på enteroidene som trenger å bli passert.
- Kryopreservering av enteroider
- For kryopreservering, Sørg for at enteroidene passeres ikke mer enn fem ganger i kultur.
MERK: Dette er ikke testet eksperimentelt og er basert på forfatternes observasjon at senere passasjer har redusert levedyktigheten og gir variable resultater. - For å høste enteroidene, bruk dissosiasjonsbufferen som beskrevet i trinn 3.2.2-3.2.9.
MERK: Dissosiere enteroidene mekanisk ved hjelp av en 5 ml pipette. - Tell antall enteroidfragmenter som beskrevet i trinn 2.3.11.1.
- Sentrifuge det koniske røret ved 300 x g i 5 minutter ved RT.
- Kast supernatanten og resuspender enteroidfragmentene i kryopreserveringsmedier supplert med 10 μM Y-27632 for å oppnå en konsentrasjon på ~2000 enteroidfragmenter/ml og aliquot 1 ml i forhåndsmerkede kryovialer.
- Plasser kryovialene i en kontrollert frysebeholder og oppbevar ved -80 °C over natten.
- Overfør kryovialene til flytende nitrogen i dampfase for langtidslagring.
- For kryopreservering, Sørg for at enteroidene passeres ikke mer enn fem ganger i kultur.
- Gjenoppliving av tarmkryptfragmenter
- Plasser en 6-brønnsplate over natten inne i inkubatoren.
- Forbelegg et 5 ml rør med 5 ml beleggmedier.
- Fjern kryovialene fra lagring av flytende nitrogen.
- Umiddelbart, når den er tint, overfør krypter fra kryovialen til det forhåndsbelagte 5 ml røret. Skyll ut cryovial med Wash Media og legg til 5 ml røret. Unngå bobler.
- Få volumet opp til 5 ml med vaskemedier og sentrifuge ved 400 x g i 5 minutter ved 4 °C.
- Under sentrifugeringen, forhåndsbelegg et 1,5 ml rør med beleggmedier.
- Etter sentrifugering, hell av supernatanten, resuspender pelleten i mediet som er igjen i røret, og overfør til det forhåndsbelagte 1,5 ml røret. Vask 5 ml slangen med vaskemedier og overfør den til et 1,5 ml rør. Sentrifuge ved 400 x g i 5 minutter ved 4 °C.
- Få volumet opp til 1,5 ml med Enteroid Growth Media.
- Sentrifuge som ovenfor (trinn 3.4.7), og forsiktig aspirere.
- Ta BME fra 4 °C og legg på is/isblokk.
- Resuspender enteroidpelleten i iskald 100% BME og følg trinn 3.1.6- 3.1.12.
- Bytt media hver 2-3 dag.
4. Generering og vurdering av 2D monolayers fra 3D enteroider
MERK: Som ovenfor, for alle trinn som involverer krypter og enteroider, bør pipettespisser, celleskrapere og rør forhåndsbelegges med beleggbufferen, og bobler bør unngås for å forhindre tap av krypter.
- Fremstilling av transbrønninnsatser for 2D monolagsdannelse
- Plasser innsatser i en 24-brønns vevskulturadapterplate og belegg den apikale siden av 1 μm PET 24-brønns cellekulturinnsatser med 100 μL 1:15 fortynning av BME i Enteroid Growth Media. Belegg alltid en ekstra innsats som skal brukes som en kontroll når du tar barriereintegritetsmålinger.
- Plasser den belagte innsatsen i en 24-brønns vevskulturadapterplate i inkubatoren.
MERK: En spesifikk adapter eller ledsager vevskulturplate må brukes med transwellinnsatsene. - Inkuber kulturinnsatsene ved 37 °C, 5%CO2 i 1 time for å tillate polymerisering.
MERK: BME-belagte transbrønner kan forsegles med parafilm og oppbevares ved 4 °C i opptil 1 uke hvis de ikke brukes umiddelbart. - På slutten av inkubasjonen, aspirer 3D enteroid kultur medium.
- Dissosiasjon av 3D-enteroider
- Generer 2D-enteroidmonolag fra kryopreserverte enteroidfragmenter som ble gjenopplivet, belagt og dyrket som beskrevet ovenfor i avsnitt 3.1 for å danne 3D-enteroider. Passasje de tinte enteroidene minst to ganger, med den siste passasjen dyrket i minst 5 dager før behandling for å generere 2D monolagskulturer.
- Høst enteroidene ved å tilsette iskalde vaskemedier supplert med 10 μM Y-27632 til enteroidkupler (bruk ca. 1 ml dissosiasjonsbuffer for 4 kupler)
- Løsne kuplene med en celleskrape og samle dem inn i et 15 ml konisk rør.
- Triturere 30 ganger ved hjelp av en 1 ml pipettespiss for å generere enteroidfragmenter.
- Triturer 40 ganger med en 200 μL pipettespiss for ytterligere å bryte opp enteroidfragmentene.
- Få volumet på det 15 ml koniske røret med enteroidfragmenter til 10 ml med iskalde vaskemedier.
- Sentrifuge det koniske røret ved 300 x g i 5 minutter ved RT.
- Aspirer supernatanten, inkludert BME-laget, pass på at du ikke forstyrrer enteroidpelleten.
MERK: BME-laget vil vises som et uklart gelatinøst lag like over pelleten. - For hver 4 kupler, resuspender pelleten i 1 ml forvarmet TrypLE ekspressenzym supplert med 10 μM Y-27632.
- Tilsett enteroid-TrypLE-blandingen til en 24-brønnsplate og inkuber ved 37 ° C, 5% CO2 i 10 minutter.
- Etter 10 minutter, pipet enteroid-TrypLE-blandingen 40 ganger ved hjelp av en 1 ml pipette for å fragmentere enteroidene ytterligere.
- Deretter fragmenteres pipetten 40 ganger med en 200 μL pipette for å bryte fragmentene i enkeltceller.
- Bruk en 3 ml eller 5 ml sprøyte med en steril 22-G kanyle på, aspirer og dispenser cellesuspensjonen 4 ganger for å oppnå encellesuspensjon.
- Overvåk celledissosiasjon ved mikroskopi som beskrevet i trinn 2.3.11.1, inntil 80% av enteroidene er brutt ned i enkeltceller.
- Samle cellesuspensjon i et 15 ml konisk rør og slukk enzymatisk reaksjon ved å tilsette 4x volum Wash Media supplert med 10% FBS.
- Filtrer enteroidene gjennom en forhåndsbelagt 40 μm cellesil to ganger i et 50 ml konisk rør.
- Pellet enkeltcellene ved å sentrifugere det koniske røret ved 300 x g i 5 minutter.
- 2D monolagssåing på transwellinnsatser.
- Dekanter supernatanten og resuspender pelleten i et lite volum (~600 μL) organoid vekstmedium supplert med 20 % føtal bovint serum (FBS) ved RT.
- Bestem enteroid celletetthet og levedyktighet ved hjelp av Trypan Blue fargestoff ekskluderingsmetode, hemacytometer eller automatisert celleteller. En gjennomsnittlig levedyktighet på 75% forventes.
- Fjern forsiktig overflødig beleggløsning påført i trinn 1.3 fra cellekulturinnsatsen like før såing av cellene.
- Frø enkeltcellene ved 1 x 105 celler i et volum på 200 μL per innsats på den apikale overflaten av en forhåndsbelagt cellekulturinnsats.
- Tilsett 700 μL komplette medier supplert med 20% FBS til den basolaterale siden av cellekulturinnsatsen.
- Manøvrer platen 10 ganger i form av tallet 8 for å la cellene spre seg jevnt over innsatsen.
- Hold tallerkenen på tallerkenen varmere i 10 min i biosikkerhetsskapet.
- Inkuber platen ved 37 °C og 5 % CO2.
- Etter 48 timer, erstatt media på apikale og basale rom med fersk Enteroid Growth Media supplert med 20% FBS og hemmere.
- På den tredje dagen, fjern mediet fra de apikale og basolaterale rommene, vask forsiktig innsatsen med 1x PBS, og erstatt den med enteroid differensieringsmedium kun supplert med hemmere.
- Bytt media i begge rom hver 2-3 dag.
- Kvantitativ måling av epitelbarriereintegritet og monolagskonfluens
MERK: Barriereintegritet kan vurderes ved å bruke et epithelial voltohmmeter for å måle transepitelial elektrisk motstand (TEER).- Fjern transwellkulturplaten fra inkubatoren og la den balansere ved RT i noen minutter i biosikkerhetsskapet.
- Forsikre deg om at STX2-elektrodene er forhåndskondisjonert og voltohmmeter kalibrert til 1000Ω i henhold til produsentens instruksjoner.
- Sett sondens lange pinne inn i det basolaterale rommet og den korte enden inn i det apikale rommet i transwell epitelcellekulturen. Pass på at du ikke forstyrrer monolaget eller skader innsatsen.
- Når den er stabil, registrer 3 TEER-målinger per transbrønninnsats, inkludert innsatsen uten celler. Ta et gjennomsnitt av målene for hvert innlegg.
- Beregn den korrigerte TEER-verdien ved å trekke gjennomsnittsmålingen av den tomme brønnen fra gjennomsnittsmålingene av eksperimentelle brønner og deretter multiplisere den med overflaten av innsatsen for å bestemme motstanden til epitelbarrieren (TEER [Ω.cm2] = [Rcell layer - Rblank] × Area).
Representative Results
Det første trinnet i å generere 2D enteroid-avledede monolayers er å forberede delen av tarmvev høstet (figur 1A) for vevsdissosiasjon. Dette gjøres ved å fjerne det vedlagte fettet og mesenteriet fra vevet (figur 1B), etterfulgt av å kutte vevet i lengderetningen for å eksponere lumenoverflaten slik at slimlaget i tarmen kan fjernes ved forsiktig skraping ved hjelp av et glassglass. Den høstede tarmseksjonen kuttes deretter i gradvis mindre vevsseksjoner (figur 1C) for å øke den enkle dissosiasjonen. Krypter dissosieres deretter fra det underliggende submukosale vevet ved hjelp av en serie vasker bestående av kelerende buffere (figur 1D, E) og PBS. De isolerte tarmkryptene (figur 1F) blir deretter innebygd i kjellermembranmatrikskupler (figur 2A) og dyrket i flere dager for å generere 3D-enteroider. Fra en 10-tommers seksjon av bovin ileum kan omtrent 900 000 krypter isoleres og brukes til enteroiddannelse. Etter bare noen timer i kulturen begynner de belagte kryptene å bli lengre og utvikle seg til enterosfærer (figur 2B). Etter 2 dager kan et veldefinert lumen observeres (figur 2C), med spirende strukturer notert så tidlig som dag 4 i kultur (figur 2D). Ved dag 7 har modne enteroider utviklet seg (figur 2E). Immunfluorescensfargingen av 7 dager gammel 3D-enteroid demonstrerer tilstedeværelsen av forskjellige cellelinjer. Konfokalmikroskopi av enteroider viser lokalisering av DAPI nukleær flekk, E-cadherinprotein ved adherens-overgangen, Chromogranin-A (Chr-A)-farging som viser tilstedeværelse av enteroendokrine celler, lysozym (LYZ) som viser Paneth-celler, og cytokeratin-18 (CK-18) som representerer enterocyttceller i figur 3. Etter 7-10 dager i kultur, bør enteroidene passeres for å tillate ytterligere ekspansjon og forhindre overbefolkning. Den optimale tiden for å passere enteroider ble bestemt til å være 7-10 dager etter første primære kryptisolasjon og er i siste instans avhengig av helse og vekstrate av enteroider i kultur. Den optimale såtettheten for å oppnå ønsket enteroid morfologi og levedyktighet, som vist i figur 2E, er 400 krypter per kuppel. Enteroider kan lett kryopreserveres, og de tinte enteroidfragmentene gjenopprettes fullstendig for eksperimentell bruk etter to passasjer etter tining. Spesielt anbefales minst to passasjer av den primære kryptkulturen før kryopreservering.
For å produsere et 2D enteroid-avledet monolag, høstes 3D-enteroidene og over en rekke trinn tritureres mekanisk i nærvær av en dissosiasjonsløsning (figur 4A) i enkeltceller. Disse enkeltcellene kan deretter sås på en transbrønninnsats som er forhåndsbelagt med en kjellermembranmatrisekulturmedieløsning. I gjennomsnitt kan fire transbrønner sås fra fire 3D enteroide kupler. Antallet 3D-enteroider som behandles er dermed avhengig av antall transbrønner som trengs for eksperimentet. Plettering av enkeltceller ved en såtetthet på 1 x 105 og dyrking av dem i nærvær av 20% FBS (figur 4B-D) kan generere et konfluent monolag på mindre enn 1 uke. Den progressive sammenløpet av 2D-monolaget i kultur kan overvåkes over tid ved hjelp av lysmikroskopi (figur 4E,F). Målinger av transepitelial elektrisk motstand (TEER) kan bekrefte konfluens og karakterisere epitelbarrierens integritet over tid og som respons på eksperimentell stimulering (figur 5A). I gjennomsnitt, etter syv dager i kultur, vil et omtrent 100% konfluent monolag ha en tilsvarende TEER-verdi på ~ 1500 Ω ·cm 2. En longitudinell vurdering av 2D enteroid monolayer TEER-verdier viser en jevn økning i TEER-verdier over syv dager, og når en maksimal gjennomsnittsverdi på 1546 Ω · cm2 før den synker med den laveste verdien på 11,5 Ω · cm2 oppnådd på dag tolv (figur 5B). Immunfluorescerende merking av differensierte monolayers indikerer at intakte, organiserte, polariserte tarmepitelplater dannes ved hjelp av denne protokollen (figur 6). Konfokal mikroskopi av det fargede 2D-monolaget demonstrerer lokalisering av DAPI kjernefysisk flekk, E-cadherin og F-aktinfarging (figur 6A-D). Fluorescensmikroskopi av 2D monolaget viser kjennetegn ved differensierte tarmepitelceller med kromogranin-A (Chr-A)-farging som viser tilstedeværelse av enteroendokrine celler, lysozym (LYZ) som viser panethceller og cytokeratin-18 (CK-18) som indikerer enterocyttcellelinjer (figur 6E-L). Z-stack-modellering viser forventet polarisering av 2D monolagskulturen med karakteristisk avsetning av F-aktin som finnes i mikrovilli som dekker det apikale aspektet av de differensierte enterocytter og E-cadherin, et protein som ligger ved adherenskryssene mellom epitelceller (figur 6M).
Monolagets funksjonalitet kan vurderes ved apikal stimulering med forskjellige komponenter, inkludert Toll-lignende reseptor (TLR) ligander eller patogener, etterfulgt av cytokinkvantifisering av cellekulturer supernatanter høstet fra apikale og basale rom. Faktisk, når det apikale aspektet av monolaget stimuleres i 24 timer med TLR 1/2-agonisten Pam3csk4 på dag 4 av kulturen, observeres økt cytokinproduksjon i begge rom sammenlignet med de ubehandlede monolagene (figur 7A,B).
Figur 1: Isolasjon av tarmkrypten fra friskt voksent storfe. Bilder som illustrerer vevsprosessering av (A) helvoksent ileum fra storfe, (B) avfettet ileum, (C) ileum snittet i 2,5-tommers (6,3 cm) biter i PBS på is, (D) ilealvevssnitt i dissosiasjonsbuffer #1 ved 4 °C og (E) i dissosiasjonsbuffer 2 i et ristende vannbad ved 37 °C, og (F) isolerte ilealkryptfragmenter. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Bovin primær 3D ileal enteroid utvikling i kjellermembranmatrise. Representative bilder av (A) 3D enteroid kupler opprettet i en 6-brønns vevskulturplate og (B-E) 3D enteroid utvikling fra dagene 0, 2, 4 og 7 i kultur. Skala bar = 50 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3 Tredimensjonale tarmenteroider viser farging av epitelcellelinje. Representative bilder av 3D-enteroider etter 7 dager i kultur demonstrerer tilstedeværelsen av nukleær flekk, F-aktin, cytokeratin-18 (CK-18), Chromogranin-A (Chr-A), Ecadherin (E-cad), Lysozym (Lyz) og overlegg av bilder (Merge). Skala bar 50 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Etablering av 2D enteroid-derivert monolag fra ileal enteroider. Representative bilder av (A) 3D enteroidfragmenter i dissosiasjonsløsning som forberedelse til monolagssåing, enkeltceller belagt på en transbrønninnsats med en såtetthet på 1 x 105 avbildet på dag 0 ved bruk av (B) lys, (C) fasekontrast og (D) lysfeltmikroskopi og monolagsutvikling på transbrønninnlegg avbildet på dag fem ved bruk av (E) fasekontrast og (F) lysfeltmikroskopi. 40x forstørrelse og skala bar = 50 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Transepitelial elektrisk motstand (TEER) målinger av 2D enteroid-avledet monolag på transwellinnsatser. (A) Skjematisk diagram over hvordan TEER-målinger av 2D intestinal epitelcelle (IEC) monolag oppnås ved bruk av STX2 spisepinneelektroder av et voltohmmeter, (B) Langsgående overvåking av 2D monolayer TEER-målinger over 12 dager i cellekultur. Hvert datapunkt representerer en gjennomsnittlig TEER-verdi og standard gjennomsnittsfeil (SEM) hentet fra to tekniske replikater. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Differensierte 2D enteroid-avledede monolayers på transwellinnsatser utvikler seg til polariserte tarmepitelark. (A-M) Representative immunfluorescerende bilder av et 2D enteroid-avledet monolag på transbrønninnsats etter 5 dager i kultur som viser (A) kjernen (blå), (B) E-cadherin (rød), (C) F-aktin (grønn) og (D) overlegg av de 3 bildene (fusjon), (E,I) Kjerneflekk, (F) Chromogranin-A, (J) Cytokeratin-18, (G,K) Lysozym og (H,L) Sammenslåing av bilder. (M) Z-stack-modellering som viser fordelingen av de samme epitelcellemarkørproteinene i 2D-monolagsarket. Bilder ble hentet fra 2 biologiske replikater. Skala bar = 50 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7: Bovine primære 2D enteroid-avledede monolayers på transwell innsatser er funksjonelt aktive. Apikal og basal cellekultur supernatant cytokinsekresjon av (A) IL-1α og (B) IL-8 ved 2D monolayers på transwellinnlegg etter 5 dager i kultur som var ubehandlet eller stimulert med Pam3csk4 i 24 timer. Data er representative for gjennomsnittlige cytokinnivåer og SEM fra monolayers avledet fra frosne lagre av krypter fra ett dyr og tre uavhengige eksperimenter. Cytokiner ble kvantifisert ved hjelp av den perlebaserte multipleksanalysen (Table of Materials) i henhold til produsentens instruksjoner og analysert på en kompakt multipleksingsenhet (Table of Materials) og immunoassay curve fitting software (Table of Materials). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tabell 1: Stam- og sluttkonsentrasjoner av reagensene. Klikk her for å laste ned tabellen.
Discussion
Protokollen som presenteres her beskriver en fysiologisk relevant modell for undersøkelse av tarmfysiologi og tarmsykdommer. Flere forskningsgrupper har beskrevet genereringen av bovine enteroidkulturer, inkludert 2D monolayers 16,19,20,21,22,23,24. Selv om monolagsgenerering ikke er åpenlyst teknisk utfordrende, er flere minutters trinn avgjørende for å utvikle vellykkede kulturer konsekvent. Som sådan kan reproduserbarheten av 2D-monolayers ved hjelp av de kort beskrevne metodene i den publiserte litteraturen være utfordrende for en forsker nybegynner innen organoider å gjennomføre. Protokollen beskrevet her er tilpasset fra disse protokollene og de som er publisert i andre arter, og gir en trinnvis veiledning til monolagsgenerering på transwellinnsatser som er svært reproduserbare.
Protokollen som er skissert her, kan enkelt endres for å passe til de spesifikke målene for eksperimentell design eller tilgjengeligheten av reagenser. Faktisk, etter denne protokollen, kan vellykkede kulturer oppnås ved å så monolayers ved en lavere celletetthet (f.eks. 2,5 x 104) eller i fravær av FBS, som beskrevet av andre publikasjoner24. Endring av disse parametrene kan imidlertid kreve en økt kultur for å etablere et konfluent monolag. Som sådan, hvis andre faktorer som er integrert i studiedesignet, inkludert samkultur med immunceller, dikterer et bestemt tidsforløp for forsøket, kan såtettheten endres etter behov. Mens andre kjellermembranformuleringer kan erstattes i stedet for den som brukes i denne protokollen for å generere 3D-enteroider og 2D-monolag, vil disse kreve litt optimalisering for å bestemme det optimale kjellermembran-til-media-forholdet.
Anvendelsen av transwellinnsatser i den beskrevne metodikken har mange fordeler i forhold til monolagsvekst på konvensjonell plastvare og 3D enteroidkulturer. Sammenlignet med standard vevskulturplater, fremmer bruk av transbrønner for monolagskulturer cellulær differensiering og organisering på en måte som beholder likhet med tarmkrypter14,25. Tarmepitelbarrieren er viktig for å forhindre overføring av toksiner og mikroorganismer inn i kroppen, samtidig som næringsopptaket forenkles. Som sådan er det viktig å forstå hvordan tarmens barriereintegritet fungerer hos sunn og endres under tarmforstyrrelser eller som respons på forbindelser. I motsetning til 3D-enteroidkulturer er objektiv vurdering av tarmbarriereintegritet mulig når man kombinerer monolayers på transwells og måling av TEER, som demonstrert her14,25. Generering av 2D-monolag på transbrønner tillater også dobbeltkultur med relevante celletyper som immun- eller stromale celler. Dette gjør det mulig å karakterisere kritisk viktig krysstale mellom tarmceller og celler i vevsmikromiljøet, noe som ikke kan oppnås med 3D-kulturer. Eksponering av monolagets apikale overflate tillater ikke bare eksperimentell eksponering for patogener og forbindelser og innsamling av luminale produkter, men gir også studier i andre aspekter av tarmfysiologi og sykdom, inkludert undersøkelse av intestinal mikrobiota og molekylær absorpsjon eller transportfysiologi13. Uavhengig kontroll over apikale og basale tarmoverflater er en klar fordel i forhold til 3D-enteroidmodeller.
Gjennom flere prøveeksperimenter identifiserte vi viktige trinn som bidro til protokollens suksess. Mens hele tarmvevsprøver kan kjøles ned over natten og behandles dagen etter, må vevsdissosiasjon og isolering av kryptfragmenttrinn utføres raskt for å forhindre oppløsning av de isolerte kryptfraksjonene. Etter å ha fullført PBS-vaskene, kan sentrifugering av kryptene i Wash Media bidra til å forhindre sammenbrudd i krypten, som beskrevet i trinn 2.3.10. Når du passerer enteroidene eller høster dem for monolagsdannelse, er det viktig å skille enteroidene fra BME-kuplene. Vaskemediet må være iskaldt for å hjelpe til med å løse opp BME. I motsetning til dette kan bruk av forvarmet TrypLE og filtrering av cellesuspensjonen to ganger bidra til å danne enkeltcellene som trengs for monolagsgenerering. Til slutt kan manuell manøvrering av platen i form av tallet 8 bidra til jevnt å spre enkeltcellene over transwellinnsatsen.
En viktig begrensning av denne protokollen er at 2D-monolagene ble produsert fra enteroide stammer generert fra en moden Holstein-styrer (>2 år). Den modne mage-tarmkanalen i kalver kan nødvendiggjøre mindre endringer i den beskrevne protokollen for å gi optimale resultater. Rasespesifikke forskjeller i tarmfysiologien til storferaser er beskrevet i litteraturen26. Selv om det er ukjent om disse forskjellene kan påvirke enteroid og påfølgende monolayer-generering, mistenker vi at eventuelle forskjeller bare vil resultere i mindre endringer i protokollen vår. I tillegg har 2D-kulturmodellen noen iboende ulemper. Sammenlignet med 3D-enteroidmodeller kan 2D-kulturer mangle noen aspekter av tarmvevsarkitekturen og cellulært mangfold og skape begrensninger og utfordringer knyttet til utbredelsen av 2D-kultur13. Likevel viser studier at noen monolayers kan etterligne forventet kryptorganisasjon27, og noen av disse begrensningene kan til og med overvinnes ved å etablere 2D-kulturer med et luft-væske-grensesnitt. Likevel bør begrensningene i denne modellen vurderes fullt ut for å avgjøre om dens anvendelse er egnet for det eksperimentelle spørsmålet som stilles.
Denne protokollen beskriver et optimalisert kultursystem som modellerer bovint mage-tarmkanalen ved hjelp av enteroider avledet fra bovin ileum for å danne monolayers på transwellinnsatser. Med et bredt spekter av applikasjoner fra forskning på smittsomme sykdommer til narkotikaforskning og regenerativ medisin, kan dette kultursystemet med høy gjennomstrømning føre til enestående utvikling av forebyggende og terapeutiske strategier som kan være gjensidig fordelaktige for dyr og menneskers helse.
Disclosures
Forfatterne erklærer at forskningen ble utført i fravær av kommersielle eller økonomiske forhold som kan tolkes som en potensiell interessekonflikt.
Acknowledgments
Vi anerkjenner bruken av Cellular and Molecular Core Facility ved Midwestern University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 mL pipette tip | MidSci | PR-200RK-S | |
| 1 µm PET 24-well cell culture inserts | Corning | 353104 | |
| 1000 mL pipette tip | MidSci | PR-1250RK-S | |
| 22 G needle | Becton, Dickinson and Company | 305156 | |
| 24-well culture vessel | Corning | 353504 | |
| 40 μm cell strainer | Corning | 431750 | |
| 50 mL centrifuge tube | Fisher scientific | 14-955-240 | |
| 5-mL pipet tip | Fisher scientific | 30075307 | |
| 5 mL syringe | Becton, Dickinson and Company | 309647 | |
| 5 mL tube | Eppendorf | 30119401 | |
| Anti-Cytokeratin -18 (C-04) | Abcam | AB668-1001 | |
| B-27 supplement without vitamin A | Gibco | 12-587-010 | |
| Belysa software | Luminex | 40-122 | Immunoassay curve fitting software |
| Bovine serum albumin (BSA) | Fisher bioreagents | BP9704-100 | |
| Caspofungin acetate | Selleckchem | S3073 | |
| Cell lifter | Fisher Scientific | 08-100-241 | |
| Chromogranin-A (E-5) | Santa Cruz Biotechnology | SC-271738 | |
| Coverslips | Fisher scientific | 12-540-C | |
| Cryovials | Neptune scientific | 3471.X | |
| Cultrex Ultimatrix RGF BME | R&D Systems | BME001-05 | |
| DAPI | MilliporeSigma | D9542-5MG | |
| Dissecting scissors | VWR | 82027-588 | |
| Dithiothreitol (DTT) solution | Thermo Scientific | FERR0861 | |
| DMEM/ F-12 1.1 medium (with L-glutamine, without HEPES) | Cytiva | SH30271.01 | |
| E-cadherin | Cell Signaling Technology | #3195 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Fisher Scientific | BP2482500 | |
| FBS | Corning | MT35070CV | |
| Gentamicin | Gibco | 15710064 | |
| Glass microscope slide | Fisher scientific | 12-550-07 | |
| Goat anti-mouse Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11001 | |
| Goat anti-mouse Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A21235 | |
| Goat anti-rabbit Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A21428 | |
| Hemacytometer | Bio-Rad | 1450015 | |
| IntestiCult organoid Differentiation medium (Human) | StemCell Technologies | 100-0214 | |
| IntestiCult organoid growth medium (Human) | StemCell Technologies | 0-6010 | |
| Keyence BZ-X700 | Keyence | BZ-X700 | |
| LY2157299 (Galunisertib) | Selleckchem | S2230 | |
| MAGPIX system | Luminex | Magpix system | Compact multiplexing unit |
| Microscope | Keyence | BZ-X700 | |
| MILLIPLEX Bovine Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel | MilliporeSigma | BCYT1-33K | Bead-based multiplex assay |
| Mr. Frosty container | Nalgene | 5100-0001 | |
| Non-Enzymatic Cell Dissociation Solution | ATCC | 30-2103 | |
| NutriFreeze D10 Cryopreservation Media | Biological Industries | 05-713-1B | |
| Orbital shaking platform | Thermo Fisher | 88880021 | |
| Pam3Csk4 | invivogen | tlrl-pms | |
| Parafilm sealing film | dot scientific inc. | #HS234526C | |
| Paraformaldehyde 16% solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Phalloidin-FITC | R&D Systems | 5782/12U | |
| Phosphate buffered saline | Fisher Scientific | BP399-20 | |
| Prolong Glass Antifade | Invitrogen | P36982 | |
| Rabbit anti-human Lyzozyme (EC3.2.1.17) | Agilent technologies | A009902-2 | |
| SB202190 (FHPI) | Selleckchem | S1077 | |
| Shaking water bath | Thermo Fisher | MaxQ 7000 | |
| Sodium Azide | VWR | BDH7465-2 | |
| Streptomycin | Teknova | S6525 | |
| Trypan Blue dye | Gibco | 15250-061 | |
| TrypLE express enzyme | Life technologies | 12604013 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337 | |
| Voltohmmeter | MilliporeSigma | Millicell ERS-2 | |
| Y-27632 | Selleckchem | S1049 |
References
- Gerdts, V., et al. Large animal models for vaccine development and testing. ILAR Journal. 56 (1), 53-62 (2015).
- Reza Khorramizadeh, M., Saadat, F. Animal models for human disease. Animal Biotechnology. Chapter 8, Academic Press. 153-171 (2020).
- Meyerholz, D. K., Beck, A. P., Singh, B. Innovative use of animal models to advance scientific research. Cell and Tissue Research. 380 (2), 205-206 (2020).
- Hamernik, D. L. Farm animals are important biomedical models. Animal Frontiers. 9 (3), (2019).
- Ribitsch, I., et al. Large animal models in regenerative medicine and tissue engineering: To do or not to do. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 972 (2020).
- Wagar, L. E., DiFazio, R. M., Davis, M. M. Advanced model systems and tools for basic and translational human immunology. Genome Medicine. 10 (1), 73 (2018).
- Ziegler, A., Gonzalez, L., Blikslager, A. Large animal models: The key to translational discovery in digestive disease research. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 2 (6), 716-724 (2016).
- Roth, J. A., Tuggle, C. K.
- Schultz, R. D., Dunne, H. W., Heist, C. E.
- Potter, A. A., et al. Large animal models for vaccine development and testing. ILAR Journal. 56 (1), 53-62 (2015).
- Ahluwalia, B., Magnusson, M. K., Öhman, L. Mucosal immune system of the gastrointestinal tract: maintaining balance between the good and the bad. Scandinavian Journal of Gastroenterology. 52 (11), 1185-1193 (2017).
- Roodsant, T., et al. A human 2D primary organoid-derived epithelial monolayer model to Study host-pathogen interaction in the small intestine. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 272 (2020).
- Liu, Y., Chen, Y. G. 2D- and 3D-based intestinal stem cell cultures for personalized medicine. Cells. 7 (12), 225 (2018).
- Duque-Correa, M. A., Maizels, R. M., Grencis, R. K., Berriman, M. Organoids - New models for host-helminth interactions. Trends in Parasitology. 36 (2), 170-181 (2020).
- Kar, S. K., et al. Organoids: a promising new in vitro platform in livestock and veterinary research. Veterinary Research. 52 (1), 43 (2021).
- Hamilton, C. A., et al. Development of in vitro enteroids derived from bovine small intestinal crypts. Veterinary Research. 49 (1), 54 (2018).
- Beaumont, M., et al.
- Lee, B. R., et al. Robust three-dimensional (3D) expansion of bovine intestinal organoids: An in vitro model as a potential alternative to an in vivo system. Animals (Basel). 11 (7), 2115 (2021).
- Töpfer, E., et al. Bovine colon organoids: From 3D bioprinting to cryopreserved multi-well screening platforms. Toxicology in Vitro. 61, 104606 (2019).
- Powell, R. H., Behnke, M. S. WRN conditioned media is sufficient for in vitro propagation of intestinal organoids from large farm and small companion animals. Biology Open. 6 (5), 698-705 (2017).
- Derricott, H., et al. Developing a 3D intestinal epithelium model for livestock species. Cell and Tissue Research. 375 (2), 409-424 (2019).
- Rusu, D., Loret, S., Peulen, O., Mainil, J., Dandrifosse, G. Immunochemical, biomolecular and biochemical characterization of bovine epithelial intestinal primocultures. BMC Cell Biology. 6, 42 (2005).
- Dibb-Fuller, M. P., Best, A., Stagg, D. A., Cooley, W. A., Woodward, M. J. An in-vitro model for studying the interaction of Escherichia coli O157:H7 and other enteropathogens with bovine primary cell cultures. Journal of Medical Microbiology. 50 (9), 759-769 (2001).
- Sutton, K. M., Orr, B., Hope, J., Jensen, S. R., Vervelde, L. Establishment of bovine 3D enteroid-derived 2D monolayers. Veterinary Research. 53 (1), 15 (2022).
- Barrila, J., et al. Modeling host-pathogen interactions in the context of the microenvironment: Three-dimensional cell culture comes of age. Infection and Immunity. 86 (11), e00282-e00318 (2018).
- Carvalho, P. H. V., Pinto, A. C. J., Millen, D. D., Felix, T. L. Effect of cattle breed and basal diet on digestibility, rumen bacterial communities, and eating and rumination activity. Journal of Animal Science. 98 (5), skaa114 (2020).
- Thorne, C. A., et al. Enteroid monolayers reveal an autonomous WNT and BMP circuit controlling intestinal epithelial growth and organization. Developmental Cell. 44 (5), 624-633 (2018).
