Summary
Enteroider fremstår som en ny model til undersøgelse af vævsfysiologi og patofysiologi, lægemiddeludvikling og regenerativ medicin. Her beskriver vi et bovin primærcelle 2D enteroidafledt kultursystem, der tillader samdyrkning med relevante vævscelletyper. Denne model giver en translationel fordel for gastrointestinal forskningsmodellering.
Abstract
Organoide cellekultursystemer kan rekapitulere kompleksiteten observeret i væv, hvilket gør dem nyttige til at studere værtspatogeninteraktioner, evaluere lægemiddeleffektivitet og toksicitet og vævsbioteknologi. Anvendelse af disse modeller af de beskrevne årsager kan dog være begrænset på grund af disse modellers tredimensionelle (3D) karakter. For eksempel er det udfordrende at bruge 3D enteroidkultursystemer til at studere fordøjelsessygdomme på grund af utilgængeligheden af tarmlumen og dets udskillede stoffer. Faktisk kræver stimulering af 3D-organoider med patogener enten luminal mikroinjektion, mekanisk forstyrrelse af 3D-strukturen eller generering af apikale enteroider. Desuden kan disse organoider ikke dyrkes sammen med immun- og stromale celler, hvilket begrænser dybtgående mekanistisk analyse af patofysiologisk dynamik. For at omgå dette optimerede vi et bovin primærcelle todimensionelt (2D) enteroidafledt monolagskultursystem, der tillader samdyrkning med andre relevante celletyper. Ileal krypter isoleret fra raske voksne kvæg blev dyrket for at generere 3D organoider, der blev kryopræserveret til fremtidig brug. Et 2D-monolag blev skabt ved hjælp af genoplivede 3D-enteroider, der blev passeret og forstyrret for at give enkeltceller, som blev podet på kældermembranekstraktbelagte transwellcellekulturindsatser og derved udsatte deres apikale overflade. Den intestinale monolagspolaritet, cellulære differentiering og barrierefunktion blev karakteriseret ved anvendelse af immunofluorescensmikroskopi og måling af transepitelial elektrisk modstand. Stimulering af monolagets apikale overflade afslørede monolagets forventede funktionalitet, som demonstreret ved cytokinsekretion fra både apikale og basale rum. Den beskrevne 2D enteroidafledte monolagsmodel har et stort løfte om at undersøge værtspatogeninteraktioner og tarmfysiologi, lægemiddeludvikling og regenerativ medicin.
Introduction
Dyremodeller i forskning spiller en afgørende rolle i at øge vores forståelse af sygdomspatofysiologi og dynamikken i værtsimmunresponset under infektion og understøtter udviklingen af nye forebyggende og terapeutiske strategier 1,2,3,4. Disse modeller understøtter forskning, opdagelse og fremskridt inden for dyr og er nøglen til fremskridt inden for forskning i menneskers sundhed. I årtier har gnavermodeller understøttet fremskridt inden for immunmekanismer og grundlæggende biologisk forskning for menneskelige sygdomme 3,5,6,7. Mens gnavermodeller er kritiske i screening og tidlig udviklingsforskning, tilbyder store dyremodeller en mere relevant sammenligning i forskning i menneskelige sygdomme i både tidlige opdagelser og senere udviklingsundersøgelser, herunder terapeutisk effekt og sikkerhedstest 1,3,4,5. Husdyr giver klare fordele sammenlignet med gnavermodeller for mere effektiv oversættelse til humane applikationer til nogle sygdomme, herunder kryptosporidiose, salmonellose, tuberkulose, respiratorisk syncytialvirus og brucellose 1,7,8. Faktisk udvikler disse sygdomme og andre spontant hos kvæg, som deler flere analoge sygdomspatogenese og immunprocesser med mennesker, og som en udavlet befolkning efterligner kvæg den genetiske og miljømæssige heterogenitet, der påvirker humane immunresponser 5,8,9,10 . Fordelene ved kvægmodeller til forskning i infektionssygdomme kan maksimeres ved først at anvende et sofistikeret kultursystem og derefter implementere in vivo-undersøgelser trinvist. Den første anvendelse af et meget komplekst dyrkningssystem afledt af kvæg kan reducere antallet af dyreforsøg betydeligt og samtidig forbedre chancerne for vellykket translationel og anvendt forskning. Dyrkningsmodeller bør rekapitulere sygdomsprocesserne på organniveau for optimal prædiktiv validitet, idet det oprindelige vævsmikromiljø bevares rumligt og funktionelt.
Det slimhindeimmunrespons er et mangefacetteret system, der består af en yderst effektiv barriere dannet af gastrointestinale enterocytter og forskellige populationer af immunceller placeret under slimhindeoverfladen11. Dette meget komplekse system er kritisk under infektion for at opretholde GI-homeostase og initiere immunforsvar mod enteriske patogener11. Kommunikation mellem enterocytter og underliggende medfødte immunceller initierer udviklingen af beskyttende immunresponser mod patogene mikroorganismer. Som sådan er dyrkningssystemer, der er komparative i deres kompleksitetsniveau, nødvendige for en optimal undersøgelse af vært-enteriske patogeninteraktioner og er yderst effektive til forståelse af enterisk fysiologi og lægemiddelopdagelse og -udvikling12,13. Organoider er et robust kultursystem, der ligner arkitekturen og funktionen af oprindelsesvævet14,15. Multicellulariteten af disse modeller tillader undersøgelse af forskellige cellepopulationers rolle og de cellulære interaktioner, der er involveret i enterisk sundhed og sygdom12,14. Imidlertid er humanafledte organoidmodeller i forskning i øjeblikket begrænset af vanskeligheden ved at opnå en tilstrækkelig mængde og ensartet kvalitet af humane tarmepitelceller og begrænset cellelevedygtighed i kultur. Udødeliggjorte cellelinjer kan bruges til konsekvent at opnå høje udbytter af homologe kulturer i disse modeller; Imidlertid mangler transformerede celler i sagens natur mangfoldigheden og den funktionelle kompleksitet af ikke-transformerede epitelceller 16,17. Fordelene ved at bruge kulturer afledt af kvægvæv som model til undersøgelse af gastrointestinale sygdomme og fysiologi omfatter den lethed, hvormed vævsprøver konsekvent kan opnås fra raske donorer, forbedret cellelevedygtighed og større cellulær mangfoldighed, der kun kan opnås med ikke-udødeliggjort væv. Sammenlignende vævstranskriptomik og karakterisering af tarmorganoider afslører ligheder i bevarede ortologe gener og cellulære potentialer mellem mennesker og kvæg18. Derfor kan et dyrkningssystem afledt af kvægorganoider være et fordelagtigt til undersøgelse af tarmsygdomme hos mennesker, hvor resultaterne let kan overføres til humanmedicin.
Protokollen beskrevet heri beskriver en effektiv platform til evaluering af værtsresponser på enteriske patogener eller forbindelser og tarmfysiologi ved hjælp af et bovin enteroidafledt 2D primærcellekultursystem. I modsætning til 3D-organoider tillader 2D-kultursystemer genereret på transwellindsatser en dobbelt kultur af tarmceller med immun- eller stromale celler, hvilket muliggør undersøgelse af vævsniveaudynamikken. Med anvendelser inden for biomedicinsk forskning, farmaceutisk udvikling og effektivitetstest kan denne fysiologisk relevante model gavne både kvægs og menneskers sundhed og fremskridt.
Protocol
Alle protokoller blev udført i overensstemmelse med institutionelle og nationale retningslinjer og regler for dyrevelfærd.
1. Fremstilling af reagens
BEMÆRK: Stammen og de endelige koncentrationer af de reagenser, der blev anvendt i denne undersøgelse, er anført i tabel 1.
- Forbered prøveopsamlingsbuffer: Bland 1 liter iskold fosfatbufret saltvand (PBS) indeholdende penicillin (100 E / ml), streptomycin (100 μg / ml), gentamicin (25 μg / ml) og caspofungin (2,5 μg / ml). Opbevar stamopløsning ved 4 °C.
- Forbered dissociationsreagens #1: Bland 18,55 ml prøveopsamlingsbuffer (som beskrevet i trin 1.1), 1,422 ml ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA, 0,422 M/pH 7,4), 20 μL 1 M 1,4-Dithiothreitol (DTT) opløsning, 4 μL Y-27632-opløsning (5000x/50 mM). Opløsningen opbevares ved 4 °C.
- Forbered dissociationsreagens #2: Bland 18,57 ml opsamlingsbuffer (som beskrevet i trin 1.1), 1,422 ml EDTA (0,422 M/pH 7,4), 4 μL Y-27632-opløsning (5000x/50 mM). Opbevar opløsningen ved 37 °C.
- Forbered enteroid vækstmediebestand: Bland 9,875 ml organoid vækstmedium plus supplement, 100 μL penicillin (100 U / ml), streptomycin (100 μg / ml), 5 μL gentamicin (25 μg / ml) og 20 μL caspofungin (2,5 μg / ml). Opløsningen opbevares ved 4 °C.
- Forbered enteroid differentieringsmedielager: Bland 10 ml organoiddifferentieringsmedium plus supplement, 100 μL penicillin (100 E / ml), streptomycin (100 μg / ml), 5 μL gentamicin (25 μg / ml) og 20 μL caspofungin (2,5 μg / ml). Opbevar opløsningen ved -20 °C.
- Forbered vaskemedier: Bland 48,45 ml DMEM / F-12 1,1 medium (med L-glutamin, uden HEPES), 1 ml B-27 supplement uden vitamin A (50x lager), 500 μL penicillin (100 U / ml), streptomycin (100 μg / ml), 25 μL gentamicin (50 mg / ml lager) og 25 μL caspofungin (5 mg / ml lager). Opløsningen opbevares ved 4 °C.
- Forbered belægningsbuffer: Bland 25 ml DMEM: F12 komplette medier uden inhibitorer og 25 mg bovin serumalbumin (BSA). Opløsningen opbevares ved 4 °C.
2. Isolering af tarmkrypter fra helvæv (figur 1)
BEMÆRK: Kvæg små tarm enteroider blev genereret fra ilealvæv opnået fra raske voksne Holstein stude (>2 år) fra et lokalt oksekødsforarbejdningsanlæg. En donor blev brugt til denne række eksperimenter.
- Forberedelse af tarmvævsprøver
- Placer de høstede ~ 10 tommer (25 cm) tarmvævsprøver i ~ 400 ml iskold opsamlingsbuffer (PBS + antibiotika / antimykotika) og på is til transport til laboratoriet.
- Brug kirurgisk saks (f.eks. Mayo saks) og tang (fx adson tang), fjern overskydende fedt og mesenteri fra tarmvævsprøven.
- Skær vævet i to lige store stykker.
- Åbn vævet i længderetningen med kirurgisk saks og skyl vævet i steril PBS.
- Fjern forsigtigt slimlaget i tarmprøven ved hjælp af siden af et sterilt glasmikroskopglas og skyl vævet med frisk PBS.
BEMÆRK: Dette trin hjælper med at fjerne villi og hjælper med at øge renheden af kryptfraktionerne i efterfølgende trin. - For hvert 5-tommer (13 cm) stykke skal du skære vævet i to 2,5 tommer (6,5 cm) og derefter skære hvert stykke i 4 omtrent lige små stykker for at lette vævsdissociation.
- Dissociation af tarmvæv
- Forbered et 20 ml volumen af vævsdissociationsreagenset #1 i et sterilt 50 ml konisk rør og deponer de små vævsprøver i det koniske rør, indtil volumenforskydningen flytter menisken fra 20 ml mærket til 35 ml mærket på det koniske rør.
- Gentag ovenstående trin for de resterende tyndtarmsvævsprøvestykker.
- Forsegl de koniske rør med parafilm og ryst det koniske rør manuelt 10 gange.
BEMÆRK: I hele protokollen skal manuel omrystning udføres på en bevidst, men skånsom måde. - Placer de koniske rør vandret på is i en beholder på en orbital rysteplatform.
- Ryst de koniske rør på is i beholderen i 30 minutter ved 80 omdrejninger i minuttet (o / min). Hvert 10. minut rystes det koniske rør manuelt.
- Der fremstilles et 20 ml volumen forvarmet (37 °C) vævsdissociationsreagens #2 (formuleret som ovenfor, men uden DTT) i et 50 ml konisk rør. Vævsprøverne fra de koniske rør indeholdende dissociationsreagenset #1 deponeres i de koniske rør, der indeholder dissociationsreagenset #2.
- Forsegl de koniske rør med parafilm og ryst de koniske rør manuelt 10 gange.
- De koniske rør anbringes i et forvarmet (37 °C) rystevandbad, der vippes i en vinkel på ca. 60 °C, og omrystes ved 150 rpm i 10 minutter med manuel omrystning efter 5 minutter og igen efter den totale inkubation på 10 minutter.
- Isolering af kryptfragmenter
- Etiket 10 sterile koniske rør #1 - #10. Tilsæt 20 ml steril iskold PBS til hvert mærket konisk rør.
- Vævsstykkerne overføres fra de koniske rør, der indeholder dissociationsreagenset #2, til et nyt sterilt 50 ml konisk rør indeholdende iskold PBS #1.
- Ryst de koniske rør manuelt 10 gange.
- Forsegl de koniske rør med parafilm og læg dem vandret på is. Ryst koniske rør på en orbitalryster i 10 minutter ved 80 o / min. Efter 10 minutter rystes konisk rør #1 manuelt 10 gange. Dette betragtes som vask # 1.
- Overfør forsigtigt vævsprøver ved hjælp af et par kirurgiske tang til konisk rør # 2.
- Gentag trin 2.3.2 - 2.3.4, dette betragtes som vask #2.
- Gentag vasken indtil vask #10.
- Supernatanterne fra hver vask indeholder de krypter, der vil blive brugt til enteroiddannelse. Opbevar glassene med supernatanterne ved 4 °C, indtil alle 10 vaske er færdige.
- Når den 10. vask er afsluttet, og vævssektionen er kasseret, centrifugeres supernatanterne i koniske rør #6-#10 ved 400 x g i 2 minutter ved 4 °C for at pelletere de isolerede krypter.
BEMÆRK: Vask 6-10 indeholder de reneste fraktioner af intakte krypter med begrænset snavs og enkeltceller. Som sådan anbefales det, at kun disse fraktioner anvendes til enteroidgenerering, og de tidligere vaske (#2-#5) kasseres) - Supernatanten kasseres, og der tilsættes 4 ml frisk, iskold PBS til krypterne uden at opslæmme dem igen (dette hjælper med at holde fragmenterne intakte indtil mikroskopi).
- Vurder renheden af de dissocierede krypter for hvert konisk rør # 6-# 10 ved mikroskopi.
- Der tilsættes 50 μL PBS til en plade med 384 brønde.
- Tilføj 10 μL kryptsuspension til PBS, og brug en 40x forstørrelsesobjektivlinse til at bestemme kryptens renhed, integritet og antal.
BEMÆRK: Tegning af et kryds på bunden af pladen gør tællingen lettere.
3. Ex vivo-generering og passage af bovin ileal enteroider (figur 2)
BEMÆRK: Krypterne fra de koniske rør med de mest rene, intakte tarmkrypter vil blive brugt til nedstrøms assays. For alle trin, der involverer krypter og enteroider, skal pipettespidser, celleskrabere og rør være forbelagt med belægningsbufferen, og bobler bør undgås for at forhindre tab af krypter. Medmindre andet er angivet, skal der anvendes en 1000 μL pipetspids for at forhindre nedbrydning af kryptfragmenter.
- Generering af enteroider fra kryptfragmenter
- Kombiner de reneste kryptfraktioner (normalt #6-#10) i et konisk rør.
- Det koniske rør indeholdende krypterne centrifugeres ved 400 x g i 2 minutter ved 4 °C.
- Supernatanten kasseres ved at opsuge den med en pipette og opslæmme kryptpillen i vaskemediet.
- Der centrifugeres som i trin 3.1.2. Supernatanten dekanteres, og der tilsættes 2 ml vaskemedier til kryptpelletsen.
- Tæl antallet af krypter som beskrevet i trin 2.3.11.1.
- Der centrifugeres som i trin 3.1.2 for at pelletere krypterne, supernatanten kasseres, og opslæmningen resuspenderes i iskold 100 % ekstracellulær matrix med reduceret vækstfaktor i kældermembranen (BME) for at opnå en koncentration på ca. 400 krypter/100 μl.
BEMÆRK: Det er vigtigt at optø BME korrekt ved 4 °C, da ændringer i temperaturen ændrer dens konsistens. BME kan forhindres i at størkne for tidligt ved hjælp af en køleblok og forkølede pipetspidser.- Brug af en anden kældermembranmatrixformulering kan kræve fortynding af BME, når der oprettes kupler. Se fabrikantens anvisninger, der er specifikke for den BME, der anvendes.
- Pipet op og ned for grundigt at suspendere krypterne i BME.
- Der fremstilles krypt-BME-kupler ved langsomt at pipettere 50 μL krypt-BME-suspension på en 6-brønds vævskulturplade på en opvarmningsplade indstillet til 37 °C med op til 8 kupler/brønd.
BEMÆRK: 6-brøndpladen skal forvarmes i en inkubator ved 37 °C natten over inden plettering af kupler. - Opbevar 6-brøndspladen på varmepladen i 1 minut, før pladen forsigtigt flyttes til en 37 °C, 5% CO2 -inkubator.
- Efter 2 minutter vendes 6-brøndspladen, så låget vender nedad, og inkuberes i yderligere 30 minutter for at lade kuplerne polymerisere.
- Efter 30 minutter tilsættes forsigtigt 3 ml enteroid vækstmedie ved stuetemperatur (RT) suppleret med 10 μM SB202190, 0,5 μM LY2157299 og 10 μM Y-27632 til hullerne, der indeholder kupler.
- Der inkuberes ved 37 °C, 5 % CO2.
- Fjern medier og erstat med friske Enteroid Growth media suppleret med hæmmere hver 2-3 dage.
- Passaging af enteroider
- Efter 7-10 dage skal du sikre dig, at krypterne har dannet 3D-enteroider med mange spirende strukturer, som i figur 2E, og er klar til at blive passeret.
- Kassér medierne fra brøndene, der indeholder kupler.
- For hver 4 kupler pr. brønd tilsættes 1 ml iskold ikke-enzymatisk celledissociationsopløsning suppleret med 10 μM Y-27632 til hver brønd, der indeholder kupler.
- Brug en forbelagt celleskraber til forsigtigt at løsne kuplen fra vævskulturpladen.
- Opsaml enteroider i et 15 ml konisk rør og triturer ved pipettering op og ned 10 gange.
- Det koniske rør indeholdende de fragmenterede enteroider ved RT inkuberes på en orbitalryster ved 80 omdr./min. i 10 minutter.
- Tilsæt 10 ml iskold vaskemedie med 10 μM Y -27632 til enteroiderne.
- Det koniske rør centrifugeres ved 300 x g i 5 minutter ved RT.
- Supernatanten kasseres, pelletsen resuspenderes i 10 ml frisk vaskemedie og overføres til et nyt konisk rør på 15 ml.
- Det koniske rør centrifugeres ved 300 x g i 5 minutter ved RT.
- Supernatanten kasseres, og pelletpen resuspenderes i 1 ml enteroid vækstmedie i 1,5 ml mikrocentrifugeglas.
- Mikrocentrifugeglasset centrifugeres ved 300 x g i 5 minutter ved RT, og supernatanten kasseres.
- Enteroidpellet resuspenderes i iskold 100 % BME, og trin 3.1.6-3.1.13 følges.
- Repassage enteroider hver 7. dag. Udvidelsestider kan variere på grund af tætheden, levedygtigheden og omfanget af spirende. Flere spirende strukturer, der skaber store enteroidstrukturer, er tegn på, at enteroiderne skal passeres.
- Kryopræservering af enteroider
- Til kryopræservering skal du sørge for, at enteroiderne ikke passeres mere end fem gange i kultur.
BEMÆRK: Dette er ikke blevet testet eksperimentelt og er baseret på forfatternes observation af, at senere passager har reduceret levedygtighed og giver variable resultater. - Til høst af enteroiderne anvendes dissociationsbufferen som beskrevet i trin 3.2.2-3.2.9.
BEMÆRK: Enteroiderne adskilles mekanisk ved hjælp af en 5 ml pipet. - Antallet af enteroidfragmenter som beskrevet i trin 2.3.11.1 tælles.
- Det koniske rør centrifugeres ved 300 x g i 5 minutter ved RT.
- Supernatanten kasseres, og enteroidfragmenterne resuspenderes i kryopræserveringsmedier suppleret med 10 μM Y-27632 for at opnå en koncentration på ~2000 enteroidfragmenter/ml og alikvote 1 ml i præmærkede kryoialer.
- Kryoialerne anbringes i en kontrolleret frysebeholder og opbevares ved -80 °C natten over.
- Overfør kryoialerne til flydende nitrogen med dampfase til langtidsopbevaring.
- Til kryopræservering skal du sørge for, at enteroiderne ikke passeres mere end fem gange i kultur.
- Genoplivning af intestinale krypter, fragmenter
- Placer en 6- brøndplade natten over inde i inkubatoren.
- Fortræk et 5 ml rør med 5 ml belægningsmedier.
- Fjern cryovialerne fra opbevaring af flydende nitrogen.
- Når de er optøet, overføres krypter straks fra kryovialrøret til det forbelagte 5 ml rør. Skyl cryovialen ud med vaskemediet og tilsæt til 5 ml røret. Undgå bobler.
- Volumen bringes op til 5 ml med vaskemedie og centrifugeres ved 400 x g i 5 minutter ved 4 °C.
- Under centrifugeringen skal du forbelægge et 1,5 ml rør med belægningsmedier.
- Efter centrifugering hældes supernatanten af, pelletsen resuspenderes i det substrat, der er tilbage i glasset, og overføres til det forcoatede 1,5 ml glas. Vask 5 ml røret med vaskemediet og overfør det til et 1,5 ml rør. Der centrifugeres ved 400 x g i 5 minutter ved 4 °C.
- Bring lydstyrken op til 1,5 ml med Enteroid Growth Media.
- Der centrifugeres som ovenfor (trin 3.4.7), og der suges forsigtigt.
- Tag BME fra 4 °C og læg det på is/isblok.
- Enteroidpellet resuspenderes i iskold 100% BME, og trin 3.1.6-3.1.12 følges.
- Skift mediet hver 2-3 dage.
4. Generering og vurdering af 2D-monolag fra 3D-enteroider
BEMÆRK: Som ovenfor skal pipettespidser, celleskrabere og rør for alle trin, der involverer krypter og enteroider, forbelægges med belægningsbufferen, og bobler bør undgås for at forhindre tab af krypter.
- Fremstilling af transwellskær til 2D monolagsdannelse
- Anbring indsatser i en 24-brønds vævskulturadapterplade, og fortræk den apikale side af 1 μm PET 24-brønds cellekulturindsatser med 100 μL 1:15 fortynding af BME i enteroidvækstmedier. Overtræk altid et ekstra skær, der skal bruges som kontrol, når du foretager målinger af barriereintegritet.
- Anbring den coatede indsats i en 24-brønds vævskulturadapterplade i inkubatoren.
BEMÆRK: Der skal anvendes en specifik adapter eller ledsagende vævskulturplade sammen med transwellindsatserne. - Kulturindsatserne inkuberes ved 37 °C, 5% CO2 i 1 time for at tillade polymerisation.
BEMÆRK: BME-belagte transwells kan forsegles med parafilm og opbevares ved 4 °C i op til 1 uge, hvis de ikke anvendes straks. - Ved afslutningen af inkubationen aspireres 3D enteroidkulturmediet.
- Dissociation af 3D-enteroider
- Der genereres 2D-enteroidmonolag fra kryopræserverede enteroidfragmenter, der blev genoplivet, belagt og dyrket som beskrevet ovenfor i pkt. 3.1 til dannelse af 3D-enteroider. Passage de optøede enteroider mindst to gange, med den sidste passage dyrket i mindst 5 dage før behandling for at generere 2D monolagskulturer.
- Høst enteroiderne ved at tilføje iskold vaskemedie suppleret med 10 μM Y-27632 til enteroidkupler (brug ca. 1 ml dissociationsbuffer til 4 kupler)
- Fjern kuplerne med en celleskraber og saml dem i et 15 ml konisk rør.
- Triturere 30 gange ved hjælp af en 1 ml pipettespids til at generere enteroidfragmenter.
- Triturere 40 gange med en 200 μL pipettespids for yderligere at nedbryde enteroidfragmenterne.
- Bring volumenet af det 15 ml koniske rør med enteroidfragmenter til 10 ml med iskolde vaskemedier.
- Det koniske rør centrifugeres ved 300 x g i 5 minutter ved RT.
- Supernatanten, herunder BME-laget, suges til sig, idet det sikres, at enteroidpillen ikke forstyrres.
BEMÆRK: BME-laget vises som et uklart gelatinøst lag lige over pelleten. - For hver 4 kupler resuspenderes pelleten i 1 ml forvarmet TrypLE express-enzym suppleret med 10 μM Y-27632.
- Der tilsættes enteroid-TrypLE-blanding til en plade med 24 huller og inkuberes ved 37 °C, 5% CO2 i 10 minutter.
- Efter 10 minutter pipetteres enteroid-TrypLE-blandingen 40 gange ved hjælp af en 1 ml pipette for yderligere at fragmentere enteroiderne.
- Derefter fragmenteres pipet 40 gange med en 200 μL pipette for at bryde fragmenterne i enkeltceller.
- Brug en 3 ml eller 5 ml sprøjte med en steril 22-G kanyle påsat, aspirer og dispenser cellesuspensionen 4 gange for at opnå enkeltcellesuspension.
- Celledissociation overvåges ved mikroskopi som beskrevet i trin 2.3.11.1, indtil 80 % af enteroiderne er opdelt i enkeltceller.
- Opsaml cellesuspension i et 15 ml konisk rør og sluk enzymatisk reaktion ved at tilføje 4x volumen vaskemedier suppleret med 10% FBS.
- Enteroiderne filtreres gennem en forbelagt 40 μm cellesil to gange i et 50 ml konisk rør.
- Pellet enkeltcellerne ved at centrifugere det koniske rør ved 300 x g i 5 min.
- 2D monolagssåning på transwellskær.
- Supernatanten dekanteres, og pelletpen resuspenderes i et lille volumen (~600 μL) organoid vækstmedie suppleret med 20% føtalt bovint serum (FBS) ved RT.
- Bestem enteroid celletæthed og levedygtighed ved hjælp af Trypan Blue farvestofudelukkelsesmetode, hæmacytometer eller automatiseret celletæller. Der forventes en gennemsnitlig levedygtighed på 75%.
- Fjern forsigtigt den overskydende belægningsopløsning, der blev anvendt i trin 1.3, fra cellekulturindsatsen lige før såning af cellerne.
- De enkelte celler udskilles ved 1 x 105 celler i et volumen på 200 μL pr. indsats på den apikale overflade af en præcoated cellekulturindsats.
- Der tilsættes 700 μL komplette medier suppleret med 20% FBS til den basolaterale side af cellekulturindsatsen.
- Manøvrer pladen 10 gange i form af tallet 8 for at lade cellerne sprede sig jævnt over indsatsen.
- Hold pladen på tallerkenen varmere i 10 minutter i biosikkerhedsskabet.
- Pladen inkuberes ved 37 °C og 5 % CO2.
- Efter 48 timer udskiftes medier på apikale og basale rum med friske Enteroid Growth Media suppleret med 20% FBS og hæmmere.
- På den tredje dag fjernes mediet fra de apikale og basolaterale rum, vaskes forsigtigt med 1x PBS og udskiftes med Enteroid Differentieringsmedier kun suppleret med inhibitorer.
- Skift mediet i begge rum hver 2-3 dage.
- Kvantitativ måling af epitelbarriereintegritet og monolagssammenløb
BEMÆRK: Barriereintegritet kan vurderes ved hjælp af et epitelvoltohmmeter til måling af transepitelial elektrisk modstand (TEER).- Fjern transwellkulturpladen fra inkubatoren, og lad den ekvilibrere ved RT i et par minutter i biosikkerhedsskabet.
- Sørg for, at STX2-elektroderne er forkonditioneret og voltohmmeter kalibreret til 1000Ω i henhold til producentens anvisninger.
- Indsæt sondens lange pind i det basolaterale rum og den korte ende i det apikale rum i transwellepitelcellekulturen. Pas på ikke at forstyrre monolaget eller beskadige indsatsen.
- Når det er stabilt, registreres 3 TEER-målinger pr. transwell-indsats, inklusive indsatsen uden celler. Tag et gennemsnit af målene for hvert skær.
- Den korrigerede TEER-værdi beregnes ved at trække den gennemsnitlige måling af blindprøvebrønden fra de gennemsnitlige målinger af forsøgshullerne og derefter multiplicere den med insertets overfladeareal for at bestemme epitelbarrierens modstand (TEER [Ω.cm2] = [Rcelllag - Rblank] × Area).
Representative Results
Det første trin i generering af 2D enteroidafledte monolag er at forberede sektionen af tarmvæv høstet (figur 1A) til vævsdissociation. Dette gøres ved at fjerne det vedhæftede fedt og mesenteriet fra vævet (figur 1B), efterfulgt af at skære vævet i længderetningen for at udsætte lumenoverfladen, så tarmens slimlag kan fjernes ved forsigtig skrabning ved hjælp af et glasglas. Den høstede tarmsektion skæres derefter i gradvist mindre vævssektioner (figur 1C) for at øge den lette dissociation. Krypter adskilles derefter fra det underliggende submukosale væv ved hjælp af en række vaske bestående af chelationsbuffere (figur 1D, E) og PBS. De isolerede tarmkrypter (figur 1F) indlejres derefter i kældermembranmatrixkupler (figur 2A) og dyrkes i flere dage for at generere 3D-enteroider. Fra en 10-tommer sektion af bovin ileum kan ca. 900.000 krypter isoleres og anvendes til enteroiddannelse. Efter blot et par timer i kultur begynder de belagte krypter at forlænge sig og udvikle sig til enterosfærer (figur 2B). Efter 2 dage kan der observeres et veldefineret lumen (figur 2C), med spirende strukturer noteret så tidligt som dag 4 i kultur (figur 2D). På dag 7 har modne enteroider udviklet sig (figur 2E). Immunofluorescensfarvningen af 7 dage gammel 3D-enteroid demonstrerer tilstedeværelsen af forskellige cellelinjer. Konfokalmikroskopi af enteroider demonstrerer lokalisering af DAPI-nuklear plet, E-cadherinprotein ved adhærenskrydset, Chromogranin-A (Chr-A) farvning, der viser tilstedeværelsen af enteroendokrine celler, Lysozym (LYZ), der viser Paneth-celler, og Cytokeratin-18 (CK-18), der repræsenterer enterocytceller i figur 3. Efter 7-10 dage i kultur skal enteroiderne passeres for at muliggøre yderligere ekspansion og forhindre overfyldning. Den optimale tid til passage af enteroider blev bestemt til at være 7-10 dage efter indledende primær kryptisolering og er i sidste ende afhængig af enteroidernes sundhed og væksthastighed i kultur. Den optimale såtæthed for at opnå den ønskede enteroidmorfologi og levedygtighed, som afbildet i figur 2E, er 400 krypter pr. Kuppel. Enteroider kan let kryopræserveres, og de optøede enteroidfragmenter genoprettes fuldt ud til eksperimentel brug efter to passager efter optøning. Især anbefales mindst to passager af den primære kryptkultur før kryopræservering.
For at producere et 2D-enteroidafledt monolag høstes 3D-enteroiderne og tritureres mekanisk i nærvær af en dissociationsopløsning (figur 4A) i enkeltceller. Disse enkeltceller kan derefter podes på en transwell-indsats, der er forbelagt med en kældermembranmatrix-kulturmedieopløsning. I gennemsnit kan fire transwells podes fra fire 3D enteroidkupler. Antallet af behandlede 3D-enteroider afhænger således af antallet af transwells, der er nødvendige for eksperimentet. Plating af enkeltceller med en såtæthed på 1 x 105 og oprindeligt dyrkning af dem i nærværelse af 20% FBS (figur 4B-D) kan generere et sammenflydende monolag på mindre end 1 uge. Den progressive sammenløb af 2D-monolaget i kultur kan overvåges over tid ved hjælp af lysmikroskopi (figur 4E, F). Målinger af transepitelial elektrisk modstand (TEER) kan bekræfte sammenløbet og karakterisere epitelbarrierens integritet over tid og som reaktion på eksperimentel stimulering (figur 5A). I gennemsnit vil et ca. 100% sammenflydende monolag efter syv dage i kultur have en tilsvarende TEER-værdi på ~ 1500 Ω ·cm 2. En langsgående vurdering af 2D enteroid monolayer TEER-værdier viser en støt stigning i TEER-værdier over syv dage og når en maksimal gennemsnitsværdi på 1546 Ω·cm2, før den falder med den laveste værdi på 11,5 Ω·cm2 opnået på dag tolv (figur 5B). Immunofluorescerende mærkning af differentierede monolag indikerer, at intakte, organiserede, polariserede intestinale epitelplader dannes under anvendelse af denne protokol (figur 6). Konfokalmikroskopi af det farvede 2D-monolag demonstrerer lokalisering af DAPI-nuklear plet, E-cadherin og F-actinfarvning (figur 6A-D). Fluorescensmikroskopi af 2D-monolaget viser kendetegn ved differentierede intestinale epitelceller med kromogranin-A (Chr-A) farvning, der viser tilstedeværelsen af enteroendokrine celler, lysozym (LYZ), der viser Paneth-celler, og cytokeratin-18 (CK-18), der indikerer enterocytcellelinjer (figur 6E-L). Z-stack-modellering viser den forventede polarisering af 2D-monolagskulturen med karakteristisk aflejring af F-actin, der findes i mikrovilli, der dækker det apikale aspekt af de differentierede enterocytter og E-cadherin, et protein placeret ved adhærenskrydsene mellem epitelceller (figur 6M).
Monolagets funktionalitet kan vurderes ved apikal stimulering med forskellige komponenter, herunder Toll-like receptor (TLR) ligander eller patogener, efterfulgt af cytokinkvantificering af cellekultursupernatanter høstet fra det apikale og basale rum. Når det apikale aspekt af monolaget stimuleres i 24 timer med TLR 1/2-agonisten Pam3csk4 på dag 4 af kulturen, observeres øget cytokinproduktion i begge rum sammenlignet med de ubehandlede monolag (figur 7A, B).
Figur 1: Kvægs tarmkryptisolering fra raske voksne kvæg. Billeder, der illustrerer vævsbehandlingen af (A) hele voksne kvæg ileum, (B) affedtet ileum, (C) ileum snittet i 2,5 tommer (6,3 cm) stykker i PBS på is, (D) ilealvævssektioner i dissociationsbuffer #1 ved 4 °C og (E) i dissociationsbuffer 2 i et rystende vandbad ved 37 °C og (F) isolerede ilealkryptfragmenter. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Bovin primær 3D ileal enteroid udvikling i kældermembranmatrix. Repræsentative billeder af (A) 3D enteroide kupler skabt i en 6-brønds vævskulturplade og (B-E) 3D enteroidudvikling fra dag 0, 2, 4 og 7 i kultur. Skalabjælke = 50 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Tredimensionelle intestinale enteroider viser farvning af epitelcelleafstamning. Repræsentative billeder af 3D-enteroider efter 7 dage i kultur viser tilstedeværelsen af nuklear plet, F-actin, cytokeratin-18 (CK-18), Chromogranin-A (Chr-A), Ecadherin (E-cad), Lysozym (Lyz) og overlay af billeder (Merge). Skalabjælke 50 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Etablering af 2D enteroidafledt monolag fra ileale enteroider. Repræsentative billeder af (A) 3D-enteroidfragmenter i dissociationsopløsning som forberedelse til enkeltlagssåning, enkeltceller belagt på en transwellindsats med en såtæthed på 1 x 105 afbildet på dag 0 ved hjælp af (B) lys, (C) fasekontrast og (D) lysfeltmikroskopi og monolagsudvikling på transwellindsatser afbildet på dag fem ved hjælp af (E) fasekontrast og (F) lysfeltmikroskopi. 40x forstørrelse og skalabjælke = 50 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Målinger af transepitelial elektrisk modstand (TEER) af det 2D enteroidafledte monolag på transwellskær. A) Skematisk diagram over, hvordan TEER-målinger af monolaget 2D-tarmepitelceller (IEC) opnås ved hjælp af STX2-spisepindeelektroderne i et voltohmmeter. (B) Longitudinel overvågning af 2D monolayer TEER målinger over 12 dage i cellekultur. Hvert datapunkt repræsenterer en gennemsnitlig TEER-værdi og standardfejl for middelværdi (SEM) opnået fra to tekniske replikater. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Differentierede 2D enteroidafledte monolag på transwellindsatser udvikler sig til polariserede tarmepitelplader. (A-M) Repræsentative immunfluorescerende billeder af et 2D enteroidafledt monolag på transwellindsats efter 5 dage i kultur, der viser (A) kernen (blå), (B) E-cadherin (rød), (C) F-actin (grøn) og (D) overlay af de 3 billeder (fusionere), (E, I) kerneplet, (F) kromogranin-A, (J) cytokeratin-18, (G, K) lysozym og (H, L) fusionere af billeder. (M) Z-stack-modellering, der viser fordelingen af de samme epitelcellemarkørproteiner i 2D-monolagsarket. Billeder blev opnået fra 2 biologiske replikater. Skalabjælke = 50 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 7: Bovin primære 2D enteroidafledte monolag på transwellindsatser er funktionelt aktive. Apikal og basalcellekultur supernatant cytokinsekretion af (A) IL-1α og (B) IL-8 ved 2D monolag på transwellindsatser efter 5 dage i kultur, der var ubehandlet eller stimuleret med Pam3csk4 i 24 timer. Data er repræsentative for gennemsnitlige cytokinniveauer og SEM fra monolag afledt af frosne lagre af krypter fra et dyr og tre uafhængige forsøg. Cytokiner blev kvantificeret ved hjælp af det perlebaserede multiplex-assay (materialetabel) i henhold til producentens instruktioner og analyseret på en kompakt multiplexingenhed (materialetabel) og immunoassaykurvetilpasningssoftware (materialetabel). Klik her for at se en større version af denne figur.
Tabel 1: Reagensernes stamme og endelige koncentrationer. Klik her for at downloade tabellen.
Discussion
Protokollen præsenteret her beskriver en fysiologisk relevant model til undersøgelse af tarmfysiologi og enteriske lidelser. Flere forskergrupper har beskrevet dannelsen af kvægenteroidkulturer, herunder 2D-monolag 16,19,20,21,22,23,24. Mens generering af monolag ikke er åbenlyst teknisk udfordrende, er flere minutters trin afgørende for at udvikle succesrige kulturer konsekvent. Som sådan kan reproducerbarheden af 2D-monolag ved hjælp af de kort beskrevne metoder i den offentliggjorte litteratur være udfordrende for en forsker, der er nybegynder inden for organoider, at foretage. Den protokol, der er beskrevet heri, er tilpasset fra disse protokoller og dem, der er offentliggjort i andre arter, og giver en trinvis vejledning til generering af monolag på transwellskær, der er meget reproducerbar.
Den protokol, der er skitseret heri, kan let ændres, så den passer til de specifikke mål for det eksperimentelle design eller tilgængeligheden af reagenser. Efter denne protokol kan vellykkede kulturer opnås ved såning af monolag ved en lavere celletæthed (f.eks. 2,5 x 104) eller i fravær af FBS, som beskrevet i andre publikationer24. Ændring af disse parametre kan dog kræve en øget kultur for at etablere et sammenflydende monolag. Som sådan, hvis andre faktorer, der er integreret i undersøgelsesdesignet, herunder co-kultur med immunceller, dikterer et bestemt tidsforløb for eksperimentet, kan såtætheden ændres efter behov. Mens andre kældermembranformuleringer kan erstattes i stedet for den, der anvendes i denne protokol til at generere 3D-enteroider og 2D-monolag, vil disse kræve en vis optimering for at bestemme det optimale kældermembran-til-medie-forhold.
Anvendelsen af transwellindsatser i den beskrevne metode har mange fordele i forhold til monolagsvækst på konventionelle plastvarer og 3D-enteroidkulturer. Sammenlignet med standard vævskulturplader fremmer brug af transwells til enkeltlagskulturer cellulær differentiering og organisering på en måde, der bevarer lighed med tarmkrypter14,25. Den intestinale epitelbarriere er afgørende for at forhindre translokation af toksiner og mikroorganismer i kroppen, samtidig med at næringsstofabsorptionen lettes. Som sådan er det afgørende at forstå, hvordan tarmens barriereintegritet fungerer sundt og ændres under tarmlidelser eller som reaktion på forbindelser. I modsætning til 3D enteroidkulturer er objektiv vurdering af tarmbarriereintegritet mulig ved kombination af monolag på transwells og måling af TEER, som demonstreret heri14,25. Generering af 2D-monolag på transwells tillader også dobbeltkultur med relevante celletyper såsom immun- eller stromale celler. Dette gør det muligt at karakterisere kritisk vigtig krydstale mellem tarmceller og celler i vævsmikromiljøet, hvilket ikke kan opnås med 3D-kulturer. Eksponering af monolagets apikale overflade muliggør ikke blot eksperimentel eksponering for patogener og forbindelser og indsamling af luminale produkter, men giver også mulighed for undersøgelser af andre aspekter af tarmfysiologi og -sygdomme, herunder undersøgelse af tarmmikrobiota og molekylær absorption eller transportfysiologi13. Uafhængig kontrol over de apikale og basale tarmoverflader er en klar fordel i forhold til 3D enteroidmodeller.
Gennem flere forsøgseksperimenter identificerede vi vigtige trin, der bidrog til protokollens succes. Mens prøver af heltarmsvæv kan nedkøles natten over og behandles den følgende dag, skal vævsdissociationen og isoleringen af kryptfragmenttrin udføres straks for at forhindre opløsning af de isolerede kryptfraktioner. Når PBS-vaskerne er afsluttet, kan centrifugering af krypterne i vaskemedier hjælpe med at forhindre kryptnedbrud, som beskrevet i trin 2.3.10. Når man passerer enteroiderne eller høster dem til enkeltlagsdannelse, er det vigtigt at adskille enteroiderne fra BME-kuplerne. Vaskemediet skal være iskoldt for at hjælpe med at opløse BME. I modsætning, ved hjælp af forvarmet TrypLE og filtrering af cellesuspensionen to gange kan hjælpe med at danne de enkelte celler, der er nødvendige for monolagsgenerering. Endelig kan manuel manøvrering af pladen i form af tallet 8 hjælpe med at sprede de enkelte celler jævnt over transwellindsatsen.
En vigtig begrænsning ved denne protokol er, at 2D-monolagene blev fremstillet af enteroidstammer genereret fra en moden Holstein-stud (>2 år). Den modne mave-tarmkanal hos kalve kan nødvendiggøre mindre ændringer af den beskrevne protokol for at give optimale resultater. Racespecifikke forskelle i tarmfysiologien hos kvægracer er beskrevet i litteraturen26. Selvom det er ukendt, om disse forskelle kan påvirke enteroid og efterfølgende monolagsgenerering, formoder vi, at eventuelle forskelle kun vil resultere i mindre ændringer i vores protokol. Derudover har 2D-kulturmodellen nogle iboende ulemper. Sammenlignet med 3D-enteroidmodeller kan 2D-kulturer mangle nogle aspekter af tarmvævsarkitekturen og cellulær mangfoldighed og skabe begrænsninger og udfordringer forbundet med udbredelsen af 2D-kultur13. Alligevel viser undersøgelser, at nogle monolag kan efterligne forventet kryptorganisation27, og nogle af disse begrænsninger kan endda overvindes ved at etablere 2D-kulturer med en luft-væske-grænseflade. Ikke desto mindre bør begrænsningerne i denne model overvejes fuldt ud for at afgøre, om dens anvendelse er egnet til det eksperimentelle spørgsmål, der stilles.
Denne protokol beskriver et optimeret dyrkningssystem, der modellerer mavetarmkanalen hos kvæg ved hjælp af enteroider afledt af bovin ileum til dannelse af monolag på transwellindsatser. Med en bred vifte af anvendelser fra forskning i infektionssygdomme til lægemiddelopdagelse og regenerativ medicin kan dette dyrkningssystem med høj kapacitet føre til en hidtil uset udvikling af forebyggende og terapeutiske strategier, der kan være gensidigt gavnlige for dyrs og menneskers sundhed.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at forskningen blev udført i mangel af kommercielle eller finansielle forbindelser, der kunne fortolkes som en potentiel interessekonflikt.
Acknowledgments
Vi anerkender brugen af Cellular and Molecular Core Facility ved Midwestern University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 mL pipette tip | MidSci | PR-200RK-S | |
| 1 µm PET 24-well cell culture inserts | Corning | 353104 | |
| 1000 mL pipette tip | MidSci | PR-1250RK-S | |
| 22 G needle | Becton, Dickinson and Company | 305156 | |
| 24-well culture vessel | Corning | 353504 | |
| 40 μm cell strainer | Corning | 431750 | |
| 50 mL centrifuge tube | Fisher scientific | 14-955-240 | |
| 5-mL pipet tip | Fisher scientific | 30075307 | |
| 5 mL syringe | Becton, Dickinson and Company | 309647 | |
| 5 mL tube | Eppendorf | 30119401 | |
| Anti-Cytokeratin -18 (C-04) | Abcam | AB668-1001 | |
| B-27 supplement without vitamin A | Gibco | 12-587-010 | |
| Belysa software | Luminex | 40-122 | Immunoassay curve fitting software |
| Bovine serum albumin (BSA) | Fisher bioreagents | BP9704-100 | |
| Caspofungin acetate | Selleckchem | S3073 | |
| Cell lifter | Fisher Scientific | 08-100-241 | |
| Chromogranin-A (E-5) | Santa Cruz Biotechnology | SC-271738 | |
| Coverslips | Fisher scientific | 12-540-C | |
| Cryovials | Neptune scientific | 3471.X | |
| Cultrex Ultimatrix RGF BME | R&D Systems | BME001-05 | |
| DAPI | MilliporeSigma | D9542-5MG | |
| Dissecting scissors | VWR | 82027-588 | |
| Dithiothreitol (DTT) solution | Thermo Scientific | FERR0861 | |
| DMEM/ F-12 1.1 medium (with L-glutamine, without HEPES) | Cytiva | SH30271.01 | |
| E-cadherin | Cell Signaling Technology | #3195 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Fisher Scientific | BP2482500 | |
| FBS | Corning | MT35070CV | |
| Gentamicin | Gibco | 15710064 | |
| Glass microscope slide | Fisher scientific | 12-550-07 | |
| Goat anti-mouse Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11001 | |
| Goat anti-mouse Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A21235 | |
| Goat anti-rabbit Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A21428 | |
| Hemacytometer | Bio-Rad | 1450015 | |
| IntestiCult organoid Differentiation medium (Human) | StemCell Technologies | 100-0214 | |
| IntestiCult organoid growth medium (Human) | StemCell Technologies | 0-6010 | |
| Keyence BZ-X700 | Keyence | BZ-X700 | |
| LY2157299 (Galunisertib) | Selleckchem | S2230 | |
| MAGPIX system | Luminex | Magpix system | Compact multiplexing unit |
| Microscope | Keyence | BZ-X700 | |
| MILLIPLEX Bovine Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel | MilliporeSigma | BCYT1-33K | Bead-based multiplex assay |
| Mr. Frosty container | Nalgene | 5100-0001 | |
| Non-Enzymatic Cell Dissociation Solution | ATCC | 30-2103 | |
| NutriFreeze D10 Cryopreservation Media | Biological Industries | 05-713-1B | |
| Orbital shaking platform | Thermo Fisher | 88880021 | |
| Pam3Csk4 | invivogen | tlrl-pms | |
| Parafilm sealing film | dot scientific inc. | #HS234526C | |
| Paraformaldehyde 16% solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Phalloidin-FITC | R&D Systems | 5782/12U | |
| Phosphate buffered saline | Fisher Scientific | BP399-20 | |
| Prolong Glass Antifade | Invitrogen | P36982 | |
| Rabbit anti-human Lyzozyme (EC3.2.1.17) | Agilent technologies | A009902-2 | |
| SB202190 (FHPI) | Selleckchem | S1077 | |
| Shaking water bath | Thermo Fisher | MaxQ 7000 | |
| Sodium Azide | VWR | BDH7465-2 | |
| Streptomycin | Teknova | S6525 | |
| Trypan Blue dye | Gibco | 15250-061 | |
| TrypLE express enzyme | Life technologies | 12604013 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337 | |
| Voltohmmeter | MilliporeSigma | Millicell ERS-2 | |
| Y-27632 | Selleckchem | S1049 |
References
- Gerdts, V., et al. Large animal models for vaccine development and testing. ILAR Journal. 56 (1), 53-62 (2015).
- Reza Khorramizadeh, M., Saadat, F. Animal models for human disease. Animal Biotechnology. Chapter 8, Academic Press. 153-171 (2020).
- Meyerholz, D. K., Beck, A. P., Singh, B. Innovative use of animal models to advance scientific research. Cell and Tissue Research. 380 (2), 205-206 (2020).
- Hamernik, D. L. Farm animals are important biomedical models. Animal Frontiers. 9 (3), (2019).
- Ribitsch, I., et al. Large animal models in regenerative medicine and tissue engineering: To do or not to do. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 972 (2020).
- Wagar, L. E., DiFazio, R. M., Davis, M. M. Advanced model systems and tools for basic and translational human immunology. Genome Medicine. 10 (1), 73 (2018).
- Ziegler, A., Gonzalez, L., Blikslager, A. Large animal models: The key to translational discovery in digestive disease research. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 2 (6), 716-724 (2016).
- Roth, J. A., Tuggle, C. K.
- Schultz, R. D., Dunne, H. W., Heist, C. E.
- Potter, A. A., et al. Large animal models for vaccine development and testing. ILAR Journal. 56 (1), 53-62 (2015).
- Ahluwalia, B., Magnusson, M. K., Öhman, L. Mucosal immune system of the gastrointestinal tract: maintaining balance between the good and the bad. Scandinavian Journal of Gastroenterology. 52 (11), 1185-1193 (2017).
- Roodsant, T., et al. A human 2D primary organoid-derived epithelial monolayer model to Study host-pathogen interaction in the small intestine. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 272 (2020).
- Liu, Y., Chen, Y. G. 2D- and 3D-based intestinal stem cell cultures for personalized medicine. Cells. 7 (12), 225 (2018).
- Duque-Correa, M. A., Maizels, R. M., Grencis, R. K., Berriman, M. Organoids - New models for host-helminth interactions. Trends in Parasitology. 36 (2), 170-181 (2020).
- Kar, S. K., et al. Organoids: a promising new in vitro platform in livestock and veterinary research. Veterinary Research. 52 (1), 43 (2021).
- Hamilton, C. A., et al. Development of in vitro enteroids derived from bovine small intestinal crypts. Veterinary Research. 49 (1), 54 (2018).
- Beaumont, M., et al.
- Lee, B. R., et al. Robust three-dimensional (3D) expansion of bovine intestinal organoids: An in vitro model as a potential alternative to an in vivo system. Animals (Basel). 11 (7), 2115 (2021).
- Töpfer, E., et al. Bovine colon organoids: From 3D bioprinting to cryopreserved multi-well screening platforms. Toxicology in Vitro. 61, 104606 (2019).
- Powell, R. H., Behnke, M. S. WRN conditioned media is sufficient for in vitro propagation of intestinal organoids from large farm and small companion animals. Biology Open. 6 (5), 698-705 (2017).
- Derricott, H., et al. Developing a 3D intestinal epithelium model for livestock species. Cell and Tissue Research. 375 (2), 409-424 (2019).
- Rusu, D., Loret, S., Peulen, O., Mainil, J., Dandrifosse, G. Immunochemical, biomolecular and biochemical characterization of bovine epithelial intestinal primocultures. BMC Cell Biology. 6, 42 (2005).
- Dibb-Fuller, M. P., Best, A., Stagg, D. A., Cooley, W. A., Woodward, M. J. An in-vitro model for studying the interaction of Escherichia coli O157:H7 and other enteropathogens with bovine primary cell cultures. Journal of Medical Microbiology. 50 (9), 759-769 (2001).
- Sutton, K. M., Orr, B., Hope, J., Jensen, S. R., Vervelde, L. Establishment of bovine 3D enteroid-derived 2D monolayers. Veterinary Research. 53 (1), 15 (2022).
- Barrila, J., et al. Modeling host-pathogen interactions in the context of the microenvironment: Three-dimensional cell culture comes of age. Infection and Immunity. 86 (11), e00282-e00318 (2018).
- Carvalho, P. H. V., Pinto, A. C. J., Millen, D. D., Felix, T. L. Effect of cattle breed and basal diet on digestibility, rumen bacterial communities, and eating and rumination activity. Journal of Animal Science. 98 (5), skaa114 (2020).
- Thorne, C. A., et al. Enteroid monolayers reveal an autonomous WNT and BMP circuit controlling intestinal epithelial growth and organization. Developmental Cell. 44 (5), 624-633 (2018).
