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JoVE Journal Cancer Research
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Cancer Research

डिम्बग्रंथि के कैंसर पेरिटोनियल मेटास्टेसिस का एक पूर्व विवो मॉडल मानव ओमेंटम का उपयोग कर

Published: January 26, 2024 doi: 10.3791/66031
Automatic Translation
1, 2, 2, 1, 2, 2
1Department of Gynecologic Oncology, Karmanos Cancer Institute, 2C.S. Mott Center for Human Growth and Development, Department of Obstetrics and Gynecology, Wayne State University School of Medicine

Summary

यह प्रोटोकॉल कैंसर सेल-ओमेंटम इंटरैक्शन के त्रि-आयामी (3 डी) पूर्व विवो मॉडल की स्थापना का वर्णन करता है। मॉडल वसा आला के भीतर प्रो-ट्यूमर तंत्र को स्पष्ट करने और उपन्यास उपचारों के परीक्षण के लिए एक मंच प्रदान करता है।

Abstract

डिम्बग्रंथि का कैंसर सबसे घातक स्त्री रोग संबंधी दुर्दमता है। ओमेंटम मेटास्टैटिक डिम्बग्रंथि के कैंसर कोशिकाओं के साथ-साथ प्रतिरक्षा मॉड्यूलेटरी संकेतों को एक सहायक माइक्रोएन्वायरमेंट प्रदान करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है जो ट्यूमर सहिष्णुता की अनुमति देता है। हालांकि, हमारे पास सीमित मॉडल हैं जो डिम्बग्रंथि के कैंसर कोशिकाओं और वसा युक्त ऊतकों के बीच बातचीत की बारीकी से नकल करते हैं। सेलुलर और आणविक तंत्र को और समझने के लिए जिसके द्वारा ओमेंटम एक प्रो-ट्यूमरल माइक्रोएन्वायरमेंट प्रदान करता है, हमने कैंसर सेल-ओमेंटम इंटरैक्शन का एक अनूठा 3 डी पूर्व विवो मॉडल विकसित किया है। मानव ओमेंटम का उपयोग करके, हम इस वसा युक्त माइक्रोएन्वायरमेंट के भीतर डिम्बग्रंथि के कैंसर कोशिकाओं को विकसित करने में सक्षम हैं और ट्यूमर के विकास और प्रतिरक्षा विनियमन के लिए जिम्मेदार कारकों की निगरानी करते हैं। इस वसा समृद्ध ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट के अध्ययन के लिए एक मंच प्रदान करने के अलावा, मॉडल इस जगह में मेटास्टैटिक कैंसर कोशिकाओं को लक्षित करने के लिए उपन्यास चिकित्सीय दृष्टिकोण के विकास और मूल्यांकन के लिए एक उत्कृष्ट मंच प्रदान करता है। प्रस्तावित मॉडल उत्पन्न करना आसान है, सस्ता है, और अनुवाद संबंधी जांच के लिए लागू है।

Introduction

डिम्बग्रंथि का कैंसर दुनिया भर में सबसे घातक स्त्री रोग संबंधी दुर्दमता है1. इस कैंसर के विकास का आजीवन जोखिम 70 में लगभग 1 है, 63 वर्ष की आयु में निदान की औसत आयु2 है। प्राथमिक डिम्बग्रंथि विकृतियों को हिस्टोलॉजिकल रूप से उपकला या गैर-उपकला के रूप में वर्गीकृत किया जाता है। उपकला डिम्बग्रंथि के कैंसर (ईओसी) 90% से अधिक ट्यूमर का प्रतिनिधित्व करते हैं, और सबसे आम उपप्रकार उच्च ग्रेड सीरस कार्सिनोमा (एचजीएससी) है, जो लगभग 70% -80% ईओसी के लिए जिम्मेदार है। वर्तमान में, बीमारी का जल्दी पता लगाने के लिए कोई प्रभावी स्क्रीनिंग विधियां नहीं हैं। इसलिए अधिकांश रोगियों का निदान एक उन्नत चरण (यानी, फेडरेशन इंटरनेशनेल डी गायनेकोलॉजी एट डी'ऑब्स्टेट्रिक [एफआईजीओ] चरण III या IV) में कैंसर के पेरिटोनियल गुहा2 में फैलने के बाद किया जाता है।

मानक फ्रंटलाइन उपचार सभी दृश्यमान मैक्रोस्कोपिक रोग को दूर करने के लिए साइटोरेडक्टिव सर्जरी है, इसके बाद किसी भी अवशिष्ट सूक्ष्म रोग को नष्ट करने के लिए सहायक प्लैटिनम-आधारित कीमोथेरेपी है। जबकि पिछले दो दशकों में डिम्बग्रंथि के कैंसर के उपचार में कई प्रगति हुई है, उन्नत बीमारी वाले लगभग 70% रोगी उपचार के 3 वर्षों के भीतर पुनरुत्थान करेंगे3. इन रोगियों के समग्र खराब पूर्वानुमान को देखते हुए, ईओसी में चल रहे और भविष्य के अनुवाद संबंधी अनुसंधान प्रयासों का उद्देश्य प्रारंभिक पहचान के लिए बायोमार्कर की पहचान करना, मेटास्टेसिस को रोकना, प्रतिरोध से बचने के लिए वर्तमान उपचारों में सुधार करना और नए व्यक्तिगत कैंसर उपचार विकसित करना है।

पेरिटोनियल गुहा और इसके संबंधित कीमोरेसिस्टेंस के भीतर सामान्यीकृत मेटास्टेसिस डिम्बग्रंथि के कैंसर 4,5 के रोगियों के उपचार के सुधार के लिए प्रमुख सीमाओं में से दो हैं। ओमेंटम, एक फैटी एप्रन जैसी संरचना जो आंतों के ऊपर पेट से नीचे लटकती है, डिम्बग्रंथि के कैंसर मेटास्टेसिस 6,7 का एक मुख्य स्थल है। एक शारीरिक बाधा के रूप में अपने कार्य के अलावा, ओमेंटम को पुनर्योजी और एंजियोजेनिक क्षमताओं के लिए दिखाया गया है और प्रतिरक्षा गतिविधियों के अधिकारी हैं, जो एक साथ संवहनीकरण को बढ़ावा देते हैं, घाव भरने में तेजी लाते हैं, और संक्रमण को सीमित करते हैं8. इसमें स्टेम कोशिकाओं की एक उच्च सांद्रता होती है जो विभिन्न सेल प्रकारों में अंतर कर सकती है और क्षतिग्रस्त ऊतकों की मरम्मत में मदद कर सकती है। ओमेंटम चोट या संक्रमण के जवाब में सूजन हो सकता है, जो चोट9 की साइट पर प्रतिरक्षा कोशिकाओं के प्रवास को ट्रिगर करता है। ये प्रतिरक्षा कोशिकाएं विकास कारकों और अन्य अणुओं को छोड़ती हैं जो क्षतिग्रस्त ऊतक की मरम्मत और पुनर्जनन को बढ़ावा देने में मदद करती हैं। प्रतिरक्षा कोशिकाएं, जैसे मैक्रोफेज, लिम्फोसाइट्स और प्लाज्मा कोशिकाएं, ओमेंटम में स्थानीयकृत संरचनाएं हैं जिन्हें "दूधिया धब्बे" के रूप में जाना जाता है, जो रोगजनकों का पता लगाने और हमला करने और पेरिटोनियल प्रतिरक्षा को विनियमित करने के लिए जिम्मेदार हैं। ओमेंटम को प्रतिरक्षा सहिष्णुता10 को प्रेरित करने में एक भूमिका निभाने के लिए भी दिखाया गया है, जो प्रतिरक्षा प्रणाली की क्षमता है कि वह स्व-प्रतिजनों को सहन करे और स्वस्थ ऊतकों पर हमला न करे। हालांकि, एक ही प्रतिरक्षा से संबंधित गतिविधियों भी रोग प्रतिक्रियाओं में शामिल हैं, इस तरह के अंडाशय ट्यूमर की वृद्धि, मेटास्टेसिस, और प्रतिरक्षा निगरानी 9,11 के पलायन. हमारी प्रयोगशाला और अन्य लोगों के पिछले अध्ययनों ने एंटी-ट्यूमरल प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं के निषेध में और कीमोरेसिस्टेंस12,13,14के अधिग्रहण में वसा माइक्रोएन्वायरमेंट की एक अनूठी और सक्रिय भूमिका का प्रदर्शन किया है। दुर्भाग्य से, हमारे पास सेलुलर और आणविक तंत्र पर सीमित जानकारी है जिसके द्वारा ओमेंटम एक प्रो-ट्यूमरल माइक्रोएन्वायरमेंट प्रदान करता है।

कैंसर कोशिकाओं और ओमेंटम के बीच बातचीत को बेहतर ढंग से समझने के लिए, मानव डिम्बग्रंथि के कैंसर कोशिकाओं और रोगी-व्युत्पन्न ओमेंटम एक्सप्लांट्स से युक्त एक 3 डी संस्कृति प्रणाली विकसित की गई थी। यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल पेरिटोनियल कार्सिनोमैटोसिस के एक उपन्यास पूर्व विवो मॉडल का प्रतिनिधित्व करता है. यह मॉडल इस वसा युक्त ऊतक में डिम्बग्रंथि के कैंसर ट्यूमरजेनेसिस की प्राकृतिक प्रगति की नकल करता है। प्रस्तावित मॉडल डिम्बग्रंथि के कैंसर अनुसंधान में अनुवाद संबंधी जांच के लिए आसान, सस्ती और संभावित रूप से लागू होता है।

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Protocol

निम्नलिखित अनुसंधान प्रोटोकॉल की समीक्षा की गई और वेन स्टेट यूनिवर्सिटी संस्थागत समीक्षा बोर्ड (आईआरबी) द्वारा अनुमोदित किया गया। सर्जरी से पहले सभी रोगियों से सूचित सहमति प्राप्त की गई थी। चित्रा 1 इस प्रोटोकॉल में तीन सामान्य चरणों को दिखाता है।

1. मानव omentum ऊतक की तैयारी

  1. ओमेंटम कल्चर मीडिया (डीएमईएम/एफ 12 + 10% भ्रूण गोजातीय सीरम + 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन) तैयार करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। इस मीडिया के विभाज्य 30-40 एमएल को बाँझ 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब या सर्जिकल नमूना कंटेनर में विभाजित करें।
  2. ओमेंटल बायोप्सी या ओमेंटेक्टॉमी सर्जरी से सर्जिकल नमूने प्राप्त करें। ऑपरेटिंग कमरे में हटाने के तुरंत बाद ओमेंटम संस्कृति मीडिया में बाँझ नमूना विसर्जित करें। यदि वर्कफ़्लो इसकी अनुमति नहीं देता है, तो जितनी जल्दी हो सके ओमेंटम कल्चर मीडिया में नमूना रखें। इसे बर्फ पर रखकर नमूना स्थानांतरित करें और प्रसंस्करण तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    नोट: हटाए गए ओमेंटम नमूने का आकार काम करने योग्य ऊतक की मात्रा निर्धारित करेगा।
  3. एक लामिना का प्रवाह हुड का उपयोग कर संग्रह के 1-2 घंटे के भीतर ओमेंटम नमूना प्रक्रिया. सुनिश्चित करें कि सभी सामग्री और उपकरण बाँझ या निष्फल हैं।
  4. संग्रह कंटेनर से ओमेंटम निकालें और इसे 100 मिमी संस्कृति पकवान में स्थानांतरित करें। नमूना को 1x फॉस्फेट-बफर खारा (1x पीबीएस) में विसर्जित करें और किसी भी रक्त के थक्के या मलबे को हटाने के लिए नमूने को धीरे से धो लें।
  5. ऊतक को टुकड़ों में काटें (0.5 सेमी x 0.5 सेमी या 100-200 मिलीग्राम; चित्र 2A) या तो छोटे सर्जिकल कैंची या 10-15 मिमी स्केलपेल का उपयोग करना। ऊतक में हेरफेर करने और ओमेंटम को कुचलने से बचने में मदद करने के लिए छोटे सर्जिकल संदंश का उपयोग करें। यदि ओमेंटम नमूने को शल्य चिकित्सा से हटाने के लिए एक ऊर्जा उपकरण का उपयोग किया गया था, तो सीलबंद किनारे पर विकृत ऊतक का उपयोग करने से बचें।
  6. कट ओमेंटम के प्रत्येक टुकड़े को 24-वेल कल्चर प्लेट के अलग-अलग कुओं में रखें और कुओं को ओमेंटम कल्चर मीडिया के 500 माइक्रोन के साथ भरें या एक वॉल्यूम के साथ जो ओमेंटम पीस को अच्छी तरह से फर्श (चित्रा 2बी) से ऊपर तैरने की अनुमति दिए बिना ओमेंटम को कवर करने के लिए पर्याप्त है।
  7. इंजेक्शन के लिए तैयार होने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर ताजा संस्कृति मीडिया में ओमेंटम टुकड़े स्टोर करें।

2. डिम्बग्रंथि के कैंसर कोशिकाओं की तैयारी

  1. संस्कृति मानव डिम्बग्रंथि के कैंसर कोशिकाओं में एक 75 सेमी 2 संस्कृति फ्लास्क 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर कम से कम 75% संगम करने के लिए ओमेंटम संग्रह के दिन तक.
    नोट: यह प्रोटोकॉल mCherry-positive OCSC1-F2 मानव डिम्बग्रंथि के कैंसर कोशिकाओं का उपयोग करता है जो पहले 15,16,17,18 वर्णित थे। यह एक प्रतिदीप्ति संकेत के साथ टैग किसी भी कैंसर सेल लाइन के लिए संशोधित किया जा सकता है.
  2. ओमेंटम नमूना के संग्रह के तुरंत बाद एक लामिना का प्रवाह हुड के अंदर कोशिकाओं को तैयार करें। सुनिश्चित करें कि सभी सामग्री और उपकरण बाँझ या निष्फल हैं।
  3. संस्कृति फ्लास्क के लिए बाँझ 1x पीबीएस के 10 एमएल जोड़ें और धीरे फ्लास्क कमाल से कोशिकाओं को धो लें. 1x पीबीएस निकालें और फिर 0.05% ट्रिप्सिन-ईडीटीए के 3 एमएल जोड़ें।
  4. धीरे सभी कोशिकाओं कोट करने के लिए संस्कृति फ्लास्क रॉक, और फिर कोई अधिक से अधिक 5 मिनट के लिए एक इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2) में फ्लास्क जगह. कोशिकाओं को पूरी तरह से अलग करने के लिए संस्कृति फ्लास्क टैप करें, और फिर ओमेंटम कल्चर मीडिया के 3 एमएल जोड़कर ट्रिप्सिन को बेअसर करें।
  5. पिपेट द्वारा सेल निलंबन मिलाएं, और फिर निलंबन को 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें। 24 डिग्री सेल्सियस पर 1,200 x ग्राम पर 5 मिनट के लिए निलंबन अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला निकालें और ताजा omentum संस्कृति मीडिया के 6 एमएल में सेल गोली resuspend.
  6. एक hemacytometer का उपयोग कोशिकाओं की गिनती. सेल निलंबन को कम से कम 100,000 कोशिकाओं प्रति 100-200 माइक्रोन निलंबन तक पतला करें। यह ओमेंटम के प्रत्येक कटे हुए टुकड़े में इंजेक्शन की मात्रा है।
  7. सेल मार्ग जारी रखने के लिए एक नई संस्कृति फ्लास्क में कोशिकाओं की एक उचित संख्या स्थानांतरण.

3. डिम्बग्रंथि के कैंसर कोशिकाओं का इंजेक्शन

  1. सेल निलंबन को आकर्षित करने के लिए 1 एमएल सिरिंज का उपयोग करें, फिर 26-जी सुई संलग्न करें। सुई का उपयोग सेल निलंबन आकर्षित नहीं है, के रूप में इस कोशिकाओं टुकड़ा कर सकते हैं.
  2. छोटे सर्जिकल संदंश का प्रयोग करें कटौती omentum का एक टुकड़ा लेने के लिए. इंजेक्शन की सुविधा के लिए ओमेंटम को एक अलग काम करने वाले बाँझ पकवान में स्थानांतरित करें। धीरे सुई टिप के साथ ओमेंटम छेदता है और ऊतक (चित्रा 2C) में सेल निलंबन की एक छोटी मात्रा इंजेक्षन करता है।
  3. कम से कम 100 माइक्रोन या 100,000 कोशिकाओं की कुल मात्रा में ओमेंटम के कई क्षेत्रों पर इंजेक्शन दोहराएं। ध्यान दें कि सेल निलंबन का अधिकांश नमूना के आसपास पूल करने के लिए प्रकट हो सकता है। यदि इंजेक्शन की गुणवत्ता के बारे में चिंता है, तो इंजेक्शन दोहराएं या नमूने में सेल निलंबन की एक बड़ी मात्रा इंजेक्ट करें।
  4. एक 24 अच्छी तरह से संस्कृति थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से में इंजेक्शन omentum नमूने लौटें. ध्यान दें कि ओमेंटम कल्चर मीडिया की मात्रा एक स्तर तक होती है जो ओमेंटम को तैरने की अनुमति दिए बिना कवर करती है। ध्यान से थाली संभाल और एक इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2) के अंदर जगह है.
  5. वैकल्पिक: आसान इंजेक्शन और अधिक केंद्रित सेल निलंबन वितरण की अनुमति देने के लिए एक ठोस मैट्रिक्स में ओमेंटम ऊतक को निलंबित करने के लिए मैट्रिगेल (तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स) का उपयोग करें।
    1. तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स को 4 डिग्री सेल्सियस पर पिघलाएं और उपयोग करने से तुरंत पहले ओमेंटम कल्चर मीडिया के साथ 1:1 अनुपात में मिलाएं। तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स मिश्रण को बर्फ पर या इंजेक्शन तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। ओमेंटम के एक कटे हुए टुकड़े को विसर्जित करने के लिए पर्याप्त तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स मिश्रण के साथ खाली कुओं को भरें।
    2. तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स मिश्रण में नमूने रखें और फिर 20 मिनट के लिए एक इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2) में 24 अच्छी तरह से संस्कृति प्लेट रखें। एक बार मिश्रण जम जाने के बाद, ऊपर वर्णित इंजेक्शन के साथ जारी रखें।
  6. फ्लोरोसेंट इमेजिंग का उपयोग कर सफल इंजेक्शन की पुष्टि करें. फ्लोरोसेंट संकेत की एक लकीर इंजेक्शन साइटों (चित्रा 2 डी) पर कल्पना की है सुनिश्चित करें. ध्यान दें कि इंजेक्शन के बाद ओमेंटम से जुड़ी कोशिकाओं की वास्तविक संख्या अप्रत्याशित है।

4. मानव ओमेंटम और डिम्बग्रंथि के कैंसर कोशिकाओं की सह-संस्कृति

  1. ताजा omentum संस्कृति मीडिया के 500-2000 माइक्रोन जोड़कर हर 48-72 घंटे में मीडिया बदलें. ओमेंटम ऊतक के शीर्ष पर सीधे मीडिया को पाइप न करें, क्योंकि यह कैंसर कोशिकाओं को विस्थापित कर सकता है। ध्यान दें कि यदि मीडिया का रंग पीला हो जाता है, तो मीडिया को बदल दें।
    नोट: मीडिया परिवर्तन की आवृत्ति इस्तेमाल किया मीडिया की मात्रा और कैंसर कोशिका के विकास के प्रक्षेपवक्र पर निर्भर करेगा। एक बार जब कैंसर कोशिकाओं ने ओमेंटम को बीज दिया है, तो ओमेंटम टुकड़ा तैर रहा है या नहीं, यह अब महत्वपूर्ण नहीं है।
  2. वैकल्पिक: यदि एक तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स का उपयोग किया गया था, तो मैट्रिक्स आमतौर पर पहले मीडिया परिवर्तन के समय तक भंग हो जाएगा।
  3. फ्लोरोसेंट इमेजिंग का उपयोग कर डिम्बग्रंथि के कैंसर ट्यूमर के विकास की निगरानी करें। इमेजिंग की आवृत्ति अन्वेषक के विवेक पर है। लगभग 14 दिनों तक छोटे ट्यूमर के साक्ष्य का अनुमान लगाएं (चित्र 3ए-सी)। इंजेक्शन की गुणवत्ता के आधार पर परिणाम भिन्न हो सकते हैं।
  4. प्रयोग समापन बिंदु के आधार पर प्रयोग समाप्त करें.
    नोट: ट्यूमर विकास और ओमेंटम ऊतक की अखंडता पिछले 50 दिनों में देखी गई है।

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Representative Results

ओमेंटम नमूनों में डिम्बग्रंथि के कैंसर कोशिकाओं की सफल स्थापना लगभग 14 दिन (चित्रा 3 ए-सी) से स्पष्ट थी। कम से कम 24 प्रतिकृतियां तैयार की गईं और आगे के प्रयोग की अनुमति देने के लिए प्रति एकत्रित नमूने को इंजेक्ट किया गया। फ्लोरोसेंट छवियों(चित्रा 3 डी,ई) लेने के द्वारा ट्यूमर विकास की निगरानी की गई थी. छवियों को सावधानीपूर्वक व्याख्या की जानी चाहिए क्योंकि कैंसर कोशिकाओं का एक मोनोलेयर भी प्रत्येक कुएं के तल पर बढ़ता था जो ओमेंटम से जुड़ा नहीं था। हम ओमेंटम की छवियों को लेना पसंद करते थे जब इसे कैंसर सेल मोनोलेयर के साथ फ्लोरोसेंट संकेतों को ओवरलैप करने से बचने के लिए मीडिया में निलंबित कर दिया गया था।

दिन 14 तक फ्लोरोसेंट सिग्नल की अनुपस्थिति को असफल इंजेक्शन माना जा सकता है। यह देखा गया कि कैंसर कोशिकाएं शुरू में पहले 7 दिनों के दौरान ओमेंटम की सतह पर फैल गईं, लेकिन समय के साथ, वे ट्यूमर बनाने के लिए एकत्र हुईं (चित्र 3 ए-डी)। नमूनों के बीच ट्यूमर के बोझ के लिए एक सरोगेट उपाय वह दर थी जिस पर ओमेंटम कल्चर मीडिया ने लाल से पीले रंग में रंग बदल दिया (चित्र 3एफ)। हमने फ्लोरोसेंट इमेजिंग, हिस्टोलॉजिक समीक्षा और सह-संस्कृति (चित्रा 4) के 50 दिनों के ट्यूमर विकास और ओमेंटल ऊतक व्यवहार्यता की पुष्टि करने के लिए सकल निरीक्षण का उपयोग किया।

Figure 1
चित्रा 1: प्रोटोकॉल में सामान्य चरणों का चित्रण। (ए) चरण 1: ओमेंटम की तैयारी; (बी) चरण 2: कैंसर कोशिकाओं का इंजेक्शन; (सी) चरण 3: कैंसर सेल-ओमेंटम माइक्रोएन्वायरमेंट की स्थापना। (चित्र BioRender.com में तैयार किया गया)। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: ओमेंटम में कैंसर कोशिकाओं की तैयारी और इंजेक्शन । (ए) ओमेंटम को 1x1 सेमी टुकड़ों में काटा जाता है। (बी) प्रत्येक टुकड़ा एक 24 अच्छी तरह से थाली के एक कुएं में रखा है और मीडिया के 500 माइक्रोन के साथ कवर किया गया है. (सी) ओमेंटम टुकड़े में कैंसर कोशिकाओं का इंजेक्शन। (डी) इंजेक्शन के बाद फ्लोरोसेंट कैंसर कोशिकाओं की एक लकीर देखी जाती है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: सह-संस्कृति के 14 और 25 दिनों के बाद प्रतिनिधि छवियां। (ए-सी) सह-संस्कृति के 14 दिनों के बाद प्रतिनिधि छवियां: (ए) चरण, (बी) एमचेरी चैनल, (सी) विलय। (डीई) सह-संस्कृति के 25 दिनों के बाद प्रतिनिधि चित्र। (एफ) गुलाबी से पीले रंग में मीडिया रंग में परिवर्तन सफल कैंसर सेल इंजेक्शन और सह-संस्कृति की स्थापना का संकेत है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: सकल आकृति विज्ञान और हेमेटोक्सिलिन और ईओसिन (एच एंड ई) धुंधला। (ए, बी) 50 दिन में सह-संस्कृतियों के प्रतिनिधि सकल आकारिकी; तीर mCherry+ डिम्बग्रंथि के कैंसर कोशिकाओं के विकास की साइटों की ओर इशारा करते हैं। (सी, डी) प्रतिनिधि एच एंड ई 50 दिन में सह-संस्कृतियों का धुंधलापन। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

इस प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, डिम्बग्रंथि के कैंसर के लिए पेरिटोनियल कार्सिनोमैटोसिस का एक प्रीक्लिनिकल मॉडल इन विट्रो और पूर्व विवो तकनीकों में बुनियादी के संयोजन का उपयोग करके विकसित किया गया था। mCherry+ OCSC1-F2 मानव डिम्बग्रंथि के कैंसर कोशिकाओं के साथ ओमेंटम नमूनों को बोने के बाद सह-संस्कृति के 50 दिनों में एक प्रगतिशील ट्यूमर वृद्धि देखी गई। इस विधि को विभिन्न ओमेंटम नमूनों का उपयोग करके कई प्रयोगात्मक परीक्षणों में विकसित और अनुकूलित किया गया था। सफल ट्यूमर विकास ओमेंटम की गुणवत्ता, कैंसर कोशिकाओं की व्यवहार्यता और इंजेक्शन की प्रभावशीलता पर निर्भर करता है। इस रिपोर्ट में, हमने केवल mCherry+ OCSC1-F2 कोशिकाओं और mCherry+ R182 मानव डिम्बग्रंथि के कैंसर लाइनों का उपयोग किया था जो पहले कई प्रकाशनों 12,15,16,17,18,19,20,21,22 में रिपोर्ट की गई थीं। अलग-अलग दोहरीकरण समय (OCSC1-F2 के लिए 16 घंटे और R182 के लिए 36 घंटे) के साथ इन दो सेल लाइनों का उपयोग करते हुए, ओमेंटल ऊतक के भीतर लघुगणकीय विकास को प्राप्त करने के समय में अंतर नोट किया गया था। फिर भी, हम सह-संस्कृति प्रणाली में दोनों सेल लाइनों को स्थापित करने में सफल रहे।

जांचकर्ताओं, अनुसंधान समन्वयकों और सर्जिकल टीमों के बीच कुशल संचार ओमेंटम नमूनों के संग्रह और प्रसंस्करण के लिए महत्वपूर्ण था। अन्वेषक ने प्रोटोकॉल उम्मीदवारों की पहचान की, अनुसंधान समन्वयकों ने सर्जरी से पहले रोगियों से सहमति प्राप्त की, और अन्वेषक ने ऑपरेटिंग कमरे से नमूने एकत्र किए। इस वर्कफ़्लो को देखते हुए, अन्वेषक के शेड्यूल को लचीला होना था क्योंकि संग्रह को प्रभावित करने वाले कई रोगी-पक्षीय कारक अप्रत्याशित थे (उदाहरण के लिए, सर्जरी रद्द कर दी गई, सर्जरी का समय बदल गया, अपर्याप्त या कोई ओमेंटम नहीं हटाया गया)। ऑपरेटिंग रूम से ऊतकों के प्रत्यक्ष दृश्य और चयन ने नमूना अखंडता, सर्जिकल बाँझपन और समय पर प्रसंस्करण सुनिश्चित किया। प्रारंभ में, नमूना संग्रह अनुसंधान समन्वयकों को सौंपा गया था; हालांकि, कुछ नमूने एकत्र किए जाने के बाद, हमने नोट किया कि प्रसंस्करण के समय में देरी हुई (यानी, >4 एच) और ओमेंटम की गुणवत्ता घोर हीन थी (जैसे, ऊतक टुकड़ों में था)। एक प्रयोगात्मक परीक्षण में, ओमेंटल ऊतक इंजेक्शन से पहले 48 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया गया था क्योंकि कैंसर कोशिकाएं समय पर तैयार नहीं थीं। इसी तरह के ट्यूमर की वृद्धि अभी भी देखी गई थी, लेकिन इस क्रम को दोहराया नहीं गया था क्योंकि तापमान परिवर्तन ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट (टीएमई) को प्रभावित करने के लिए जाना जाता है।

नमूना संग्रह से पहले, सर्जरी अनुसूची के अनुसार पर्याप्त रूप से संगम कैंसर कोशिकाओं का होना महत्वपूर्ण था। चूंकि हर महीने एकत्र किए गए नमूनों की संख्या अलग-अलग होती है, इसलिए डिम्बग्रंथि के कैंसर कोशिकाओं की सक्रिय संस्कृतियों को हमेशा बनाए नहीं रखा जाता था। जमे हुए कोशिकाओं को कम से कम 1 सप्ताह पहले पिघलाया गया था, एक मानक प्रोटोकॉल का उपयोग करके चढ़ाया गया था, और फिर व्यवहार्यता सुनिश्चित करने के लिए कम से कम एक बार कोशिकाओं को पारित किया गया था। इस प्रोटोकॉल में उपयोग की जाने वाली सेल लाइनें अपेक्षाकृत लचीली थीं; हालांकि, हमें अभी भी ऐसे उदाहरणों का सामना करना पड़ा जब कोशिकाएं सर्जरी के दिन तक ठीक नहीं हुई थीं और उन्हें इंजेक्ट नहीं किया जा सकता था। इस अध्ययन में, कैंसर कोशिकाओं को इंजेक्ट करने का कोई प्रयास नहीं किया गया था जो 50% से कम संगम थे। सेल तैयारी से संबंधित बाद में देरी प्रत्याशित नमूना संग्रह अनुसूची के आधार पर संगम बनाए रखने के लिए अनुपात में अच्छा बाँझ तकनीक और विभाजन कोशिकाओं का उपयोग करके कम कर रहे थे. हम केवल दो fluorescently टैग कैंसर सेल लाइनों के लिए प्रोटोकॉल सीमित, लेकिन यह फ्लोरोसेंट प्रोटीन के बिना अन्य स्थापित कैंसर सेल लाइनों या प्राथमिक कैंसर कोशिकाओं भी इस्तेमाल किया जा सकता है कि ध्यान दें महत्वपूर्ण है.

अंत में, ट्यूमर के विकास की दर इंजेक्शन के तुरंत बाद एडिपोसाइट्स से सटे और भीतर कैंसर कोशिकाओं के संगम से संबंधित थी। यह इंजेक्शन के बाद सभी ओमेंटम नमूनों की फ्लोरोसेंट छवियां लेकर निर्धारित किया गया था। ठोस अंगों या चमड़े के नीचे के ऊतकों के ट्यूमर सेल टीकाकरण की तुलना में, कैंसर कोशिकाओं को ओमेंटल ऊतक में इंजेक्ट करना अधिक चुनौतीपूर्ण था। ओमेंटम की ढीली संरचना और वसायुक्त स्थिरता ऊतक को लीक किए बिना सेल निलंबन की मात्रा को प्रभावी ढंग से रखने से रोकती है। जब एक छोटी सुई (यानी, 30 ग्राम या संकीर्ण) का उपयोग इंजेक्ट करने के लिए किया गया था, तो सेल प्रसार कम होने के कारण सेल विखंडन के लिए चिंता थी। हमने विभिन्न इंजेक्शन तकनीकों, सेल नंबरों और सेल निलंबन संस्करणों का परीक्षण किया और ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल के साथ लगातार परिणाम पाए। एक ही समय में, हम स्वीकार करते हैं कि प्रोटोकॉल के लिए इस तरह के बदलाव अभी भी कोशिकाओं की घातक प्रकृति को देखते हुए इसी तरह के परिणाम का उत्पादन करने की संभावना है. मैट्रिगेल के अलावा इंजेक्शन चरण को आसान बना दिया क्योंकि बाह्य मैट्रिक्स ने सेल निलंबन को बेहतर तरीके से रखा; हालांकि, यह विधि अधिक महंगी है और नमूनों में लगातार उच्च ट्यूमर का बोझ पैदा नहीं करती है। कुल मिलाकर, किसी भी ओमेंटम नमूने के लिए ट्यूमर विकसित नहीं होना दुर्लभ था, लेकिन ट्यूमर की संख्या और विकास की गति भिन्न थी।

इस मॉडल ने वसा युक्त पेरिटोनियल ऊतकों के लिए प्रारंभिक मेटास्टेसिस की नकल करके डिम्बग्रंथि के कैंसर ट्यूमरजेनेसिस की एक बानगी का अनुकरण किया। यह प्रोटोकॉल बिना किसी आवश्यक कौशल के भिन्नता की अनुमति देता है, दोहराने में आसान है, और संभावित अनुवाद मूल्य के साथ एक प्रणाली उत्पन्न करता है। डिम्बग्रंथि के कैंसर में मौजूदा इन विट्रो और पूर्व विवो मॉडल की तुलना में, यहां वर्णित विधि एक मॉडल का उत्पादन करने के लिए कई तकनीकों को जोड़ती है जो लंबे जीवनकाल में ट्यूमर वास्तुकला और टीएमई को बरकरार रखती है। इसके अतिरिक्त, हमने देखा कि जब कई ट्यूमर के साथ एक ओमेंटम नमूना एक नए कुएं में स्थानांतरित किया गया था और कैंसर मुक्त ओमेंटम (यानी, इंजेक्शन नहीं) के साथ सुसंस्कृत किया गया था, तो भोले ओमेंटम को 7 दिनों के भीतर कैंसर कोशिकाओं के साथ वरीयता दी गई थी। इस खोज से पता चलता है कि प्रतिकृति ट्यूमर उपकला-मेसेनकाइमल संक्रमण के माध्यम से मेटास्टेटिक क्षमता को बनाए रखते हैं। हमने साहित्य में किसी भी समान डिम्बग्रंथि के कैंसर मॉडल की पहचान नहीं की जो समय की विस्तारित अवधि के लिए ऊतक बायोप्सी को सुसंस्कृत करता है। इस दृष्टिकोण को पिछली खोज द्वारा समर्थित किया गया है कि माउस ओमेंटम से अलग मेसोथेलियल कोशिकाओं को संग्रह23 के बाद 30 से अधिक मार्ग के लिए सुसंस्कृत किया जा सकता है।

इस अध्ययन में वर्णित मॉडल को डिम्बग्रंथि के कैंसर कोशिकाओं और वसा युक्त ओमेंटम के भीतर कोशिकाओं के बीच प्रत्यक्ष संपर्क के प्रभाव को और समझने के लिए नियोजित किया जा सकता है। कैंसर कोशिकाओं को ओमेंटम ऊतकों से अलग किया जा सकता है और ट्रांसक्रिप्टोमिक या इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (आईएचसी) विश्लेषण के लिए प्राप्त किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, कोशिकाओं का उपयोग दवा प्रतिक्रिया अध्ययन के लिए किया जा सकता है।

इस मॉडल की प्राथमिक सीमाएं यह हैं कि ट्यूमर की संख्या, ट्यूमर के विकास की दर और ट्यूमर का स्थान अप्रत्याशित था। नमूनों में मानकीकरण और भिन्नता का अभाव इस मॉडल के आवेदन को सीमित कर सकता है। हमने कई अवलोकन भी किए हैं जिन्हें इस प्रोटोकॉल के विकास के दौरान आगे की परीक्षा की आवश्यकता होगी। उदाहरण के लिए, एक प्रयोग में "नियंत्रण" प्रतिकृतियां वास्तव में कैंसर मुक्त नहीं थीं क्योंकि रोगी को बाद में ओमेंटल माइक्रोमेटास्टेसिस का निदान किया गया था; हालांकि, गैर-इंजेक्शन ट्यूमर प्रयोगात्मक अवधि के दौरान व्यवहार्य रहे। इस मॉडल के भविष्य के अनुप्रयोगों में प्रारंभिक ट्यूमरजेनेसिस के दौरान TME के आणविक अध्ययन, प्रतिरक्षा कोशिकाओं को इंजेक्ट करके TME में हेरफेर और दवा प्रतिक्रिया जांच शामिल होगी। संक्षेप में, हम मानते हैं कि यहां वर्णित प्रीक्लिनिकल मॉडल मौजूदा शोध उपकरणों के प्रदर्शनों की सूची में जोड़ देगा और डिम्बग्रंथि के कैंसर में TME के आणविक तंत्र को स्पष्ट करने में मदद करेगा।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस अध्ययन को जेनेट बुरोस मेमोरियल फाउंडेशन द्वारा भाग में वित्त पोषित किया गया है। हम ओमेंटम नमूनों के संग्रह के लिए रोगियों और कर्मनोस कैंसर संस्थान स्त्री रोग संबंधी ऑन्कोलॉजी विभाग को स्वीकार करते हैं। हम रोगी भर्ती और पैथोलॉजी स्लाइड की तैयारी के समन्वय के लिए कर्मनोस कैंसर संस्थान में बायोबैंक और सहसंबंधी विज्ञान कोर को भी स्वीकार करते हैं। बायोबैंक और सहसंबंधी विज्ञान कोर एनआईएच सेंटर अनुदान पी 30 CA22453 वेन स्टेट यूनिवर्सिटी में कर्मनोस कैंसर संस्थान द्वारा समर्थित है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.05% Trypsin-EDTA (1x) Gibco 25300054
1 mL Insulin Syringe with 26 G detachable needle BD 329652
10 mL Serological Pipets CELLTREAT 229010B
100 mm Tissue Culture Dish Fisherbrand FB012924
15 mL Centrifuge Tube CELLTREAT 229411
24 Well Cell Culture Plate Costar 3524
50 mL Centrifuge Tube CELLTREAT 229421
75 cm2 Tissue Culture Flask CELLTREAT 229341
Corning Cell Counter Corning 9819000
Cytation 5 imager Biotek
DMEM/F12 (1:1) (1x), +L-Glutamine, +2.438 g/L Sodium Bicarbonate Gibco 11320033
Fetal Bovine Serum, Qualified Gibco 1043028
Matrigel Corning 356230 Basement membrane matrix
No. 10 Stainless Steel Disposable Scalpel Integra-Miltex 4410
Penicillin Streptomycin Gibco 15140122
Phosphate Buffered Saline, pH 7.4 (1x) Gibco 10010023
Revolve microscope Echo

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References

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कैंसर अनुसंधान अंक 203
डिम्बग्रंथि के कैंसर पेरिटोनियल मेटास्टेसिस का एक <em>पूर्व विवो</em> मॉडल मानव ओमेंटम का उपयोग कर
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Wong, T., Tedja, R., Chehade, H., Morris, R., Alvero, A. B., Mor, G. An Ex Vivo Model of Ovarian Cancer Peritoneal Metastasis Using Human Omentum. J. Vis. Exp. (203), e66031, doi:10.3791/66031 (2024).

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