Summary
يصف هذا البروتوكول إنشاء نموذج ثلاثي الأبعاد (3D) خارج الجسم الحي للتفاعل بين الخلايا السرطانية والثرب. يوفر النموذج منصة لتوضيح الآليات المؤيدة للورم داخل المكانة الدهنية ولاختبار العلاجات الجديدة.
Abstract
سرطان المبيض هو أكثر الأورام الخبيثة النسائية فتكا. يلعب الثرب دورا رئيسيا في توفير بيئة دقيقة داعمة لخلايا سرطان المبيض النقيلي بالإضافة إلى الإشارات المعدلة المناعية التي تسمح بتحمل الورم. ومع ذلك ، لدينا نماذج محدودة تحاكي عن كثب التفاعل بين خلايا سرطان المبيض والأنسجة الغنية بالدهون. لمزيد من الفهم للآليات الخلوية والجزيئية التي يوفر بها الثرب بيئة دقيقة مؤيدة للورم ، قمنا بتطوير نموذج 3D ex vivo فريد من نوعه للتفاعل بين الخلايا السرطانية والثرب. باستخدام الثرب البشري ، نحن قادرون على زراعة خلايا سرطان المبيض داخل هذه البيئة المكروية الغنية بالدهون ومراقبة العوامل المسؤولة عن نمو الورم وتنظيم المناعة. بالإضافة إلى توفير منصة لدراسة هذه البيئة المكروية الغنية بالورم الدهني ، يوفر النموذج منصة ممتازة لتطوير وتقييم مناهج علاجية جديدة لاستهداف الخلايا السرطانية النقيلي في هذا المجال. النموذج المقترح سهل الإنشاء وغير مكلف وقابل للتطبيق على التحقيقات الانتقالية.
Introduction
سرطان المبيض هو أكثر الأورام الخبيثة النسائية فتكا في جميع أنحاء العالم1. يبلغ خطر الإصابة بهذا السرطان مدى الحياة حوالي 1 من كل 70 ، مع متوسط عمر التشخيص عند 63 عاما2. تصنف أورام المبيض الخبيثة الأولية نسيجيا على أنها إما ظهارية أو غير ظهارية. تمثل سرطانات المبيض الظهارية (EOC) أكثر من 90٪ من الأورام ، والنوع الفرعي الأكثر شيوعا هو السرطان المصلي عالي الدرجة (HGSC) ، والذي يمثل حوالي 70٪ -80٪ من EOCs. حاليا ، لا توجد طرق فحص فعالة للكشف عن المرض مبكرا. لذلك يتم تشخيص معظم المرضى في مرحلة متقدمة (أي الاتحاد الدولي لأمراض النساء والتوليد [FIGO] المرحلة الثالثة أو الرابعة) بعد انتشار السرطان في جميع أنحاء التجويف البريتوني2.
العلاج القياسي في الخطوط الأمامية هو الجراحة الخلوية لإزالة جميع الأمراض العيانية المرئية ، يليها العلاج الكيميائي المساعد القائم على البلاتين لتدمير أي مرض مجهري متبقي. في حين كان هناك العديد من التطورات في علاج سرطان المبيض على مدى العقدين الماضيين ، فإن ما يقرب من 70 ٪ من المرضى الذين يعانون من مرض متقدم سوف ينتكسون في غضون 3 سنوات من العلاج3. بالنظر إلى التشخيص السيئ العام لهؤلاء المرضى ، تهدف الجهود البحثية الانتقالية الجارية والمستقبلية في EOC إلى تحديد المؤشرات الحيوية للكشف المبكر ، ومنع ورم خبيث ، وتحسين العلاجات الحالية لتجنب المقاومة وتطوير علاجات شخصية جديدة للسرطان.
ورم خبيث معمم داخل التجويف البريتوني والمقاومة الكيميائية المرتبطة به هما من القيود الرئيسية لتحسين علاج المرضى الذين يعانون من سرطان المبيض 4,5. الثرب ، وهو هيكل يشبه المريلة الدهنية يتدلى من المعدة فوق الأمعاء ، هو الموقع الرئيسي لورم خبيث لسرطان المبيض 6,7. بالإضافة إلى وظيفته كحاجز مادي ، فقد ثبت أن الثرب له قدرات متجددة وعائية ويمتلك أنشطة مناعية ، والتي تعزز معا الأوعية الدموية ، وتسريع التئام الجروح ، والحد من العدوى8. يحتوي على تركيز عال من الخلايا الجذعية التي يمكن أن تتمايز إلى أنواع مختلفة من الخلايا ويمكن أن تساعد في إصلاح الأنسجة التالفة. يمكن أن يلتهب الثرب استجابة للإصابة أو العدوى ، مما يؤدي إلى هجرة الخلايا المناعية إلى موقع الإصابة9. تطلق هذه الخلايا المناعية عوامل النمو والجزيئات الأخرى التي تساعد على تعزيز إصلاح وتجديد الأنسجة التالفة. الخلايا المناعية ، مثل الضامة والخلايا الليمفاوية وخلايا البلازما ، المترجمة في الثرب هي هياكل تعرف باسم "البقع اللبنية" ، وهي المسؤولة عن اكتشاف مسببات الأمراض ومهاجمتها وتنظيم المناعة البريتونية. كما ثبت أن الثرب يلعب دورا في تحفيز التحمل المناعي10 ، وهو قدرة الجهاز المناعي على تحمل المستضدات الذاتية وعدم مهاجمة الأنسجة السليمة. ومع ذلك ، فإن نفس الأنشطة المتعلقة بالمناعة تشارك أيضا في الاستجابات المرضية ، مثل نمو الأورام الأذنية ، ورم خبيث ، والهروب من المراقبة المناعية 9,11. أظهرت الدراسات السابقة من مختبرنا وغيره دورا فريدا ونشطا للبيئة المكروية الدهنية في تثبيط الاستجابات المناعية المضادة للأورام وفي اكتساب المقاومة الكيميائية12،13،14. لسوء الحظ ، لدينا معلومات محدودة عن الآليات الخلوية والجزيئية التي يوفر بها الثرب بيئة دقيقة مؤيدة للورم.
لفهم التفاعلات بين الخلايا السرطانية والثرب بشكل أفضل ، تم تطوير نظام ثقافة 3D يتكون من خلايا سرطان المبيض البشري ونباتات الثرب المشتقة من المريض. يمثل البروتوكول الموصوف هنا نموذجا جديدا خارج الجسم الحي للسرطان البريتوني. يحاكي هذا النموذج التطور الطبيعي لتكوين أورام سرطان المبيض في هذا النسيج الغني بالدهون. النموذج المقترح سهل التوليد وغير مكلف ويحتمل أن يكون قابلا للتطبيق على التحقيقات الانتقالية في أبحاث سرطان المبيض.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت مراجعة بروتوكول البحث التالي والموافقة عليه من قبل مجلس المراجعة المؤسسية بجامعة واين ستيت (IRB). تم الحصول على موافقة مستنيرة من جميع المرضى قبل الجراحة. يوضح الشكل 1 الخطوات العامة الثلاث في هذا البروتوكول.
1. إعداد أنسجة الثرب البشري
- تحضير وسائط زراعة الثرب (DMEM / F12 + 10٪ مصل بقري جنيني + 1٪ بنسلين ستربتومايسين) وتخزينها في درجة حرارة 4 درجات مئوية. القسمة 30-40 مل من هذه الوسائط في أنبوب مخروطي معقم سعة 50 مل أو حاوية عينة جراحية.
- الحصول على عينات جراحية من خزعة الأذن أو جراحة استئصال الثرب. اغمر العينة المعقمة في وسائط زراعة الثرب فور إزالتها في غرفة العمليات. إذا كان سير العمل لا يسمح بذلك ، فضع العينة في وسائط ثقافة الثرب في أسرع وقت ممكن. انقل العينة عن طريق وضعها على الثلج وتخزينها على حرارة 4 درجات مئوية حتى المعالجة.
ملاحظة: سيحدد حجم عينة الثرب التي تمت إزالتها كمية الأنسجة العملية. - قم بمعالجة عينة الثرب في غضون 1-2 ساعة من التجميع باستخدام غطاء التدفق الرقائقي. تأكد من أن جميع المواد والأدوات معقمة أو معقمة.
- أخرج الثرب من حاوية التجميع وانقله إلى طبق استزراع 100 مم. اغمر العينة في محلول ملحي مخزن بالفوسفات 1x (1x PBS) واغسل العينة برفق لإزالة أي جلطات دموية أو حطام.
- قطع الأنسجة إلى قطع (0.5 سم × 0.5 سم أو 100-200 ملغ. الشكل 2 أ) باستخدام مقص جراحي صغير أو مشرط 10-15 ملم. استخدم ملقط جراحي صغير للمساعدة في معالجة الأنسجة وتجنب سحق الثرب. إذا تم استخدام جهاز طاقة لإزالة عينة الثرب جراحيا ، فتجنب استخدام الأنسجة المشوهة عند الحافة المختومة.
- ضع كل قطعة من الثرب المقطوع في آبار فردية من صفيحة استزراع مكونة من 24 بئرا واملأ الآبار ب 500 ميكرولتر من وسائط استزراع الثرب أو بحجم يكفي لتغطية الثرب دون السماح لقطعة الثرب بالطفو فوق أرضية البئر (الشكل 2 ب).
- قم بتخزين قطع الثرب في وسائط استزراع طازجة على حرارة 4 درجات مئوية حتى تصبح جاهزة للحقن.
2. تحضير خلايا سرطان المبيض
- زراعة خلايا سرطان المبيض البشري في قارورة مزرعة 75 سم 2 عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 إلى التقاء 75٪ على الأقل بحلول يوم جمع الثرب.
ملاحظة: يستخدم هذا البروتوكول خلايا سرطان المبيض البشري OCSC1-F2 الإيجابية mCherry الموصوفة سابقا15،16،17،18. يمكن تعديله إلى أي خط خلية سرطانية موسوم بإشارة مضان. - تحضير الخلايا داخل غطاء التدفق الصفحي مباشرة بعد جمع عينة الثرب. تأكد من أن جميع المواد والأدوات معقمة أو معقمة.
- أضف 10 مل من 1x PBS المعقم إلى قارورة الثقافة واغسل الخلايا عن طريق هز القارورة برفق. قم بإزالة 1x PBS ثم أضف 3 مل من 0.05٪ Trypsin-EDTA.
- هز قارورة الثقافة برفق لتغطية جميع الخلايا ، ثم ضع القارورة في حاضنة (37 درجة مئوية و 5٪ CO2) لمدة لا تزيد عن 5 دقائق. اضغط على قارورة الثقافة لفصل الخلايا تماما ، ثم قم بتحييد التربسين بإضافة 3 مل من وسائط زراعة الثرب.
- امزج تعليق الخلية عن طريق السحب ، ثم انقل التعليق إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل. جهاز طرد مركزي التعليق لمدة 5 دقائق عند 1200 × جم عند 24 درجة مئوية. قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليق حبيبات الخلية في 6 مل من وسائط زراعة الثرب الطازجة.
- عد الخلايا باستخدام مقياس الدم. تمييع تعليق الخلية إلى ما لا يقل عن 100000 خلية لكل 100-200 ميكرولتر من التعليق. هذا هو حجم الحقن في كل قطعة قطع من الثرب.
- نقل عدد مناسب من الخلايا إلى دورق مزرعة جديد لمواصلة مرور الخلية.
3. حقن خلايا سرطان المبيض
- استخدم حقنة سعة 1 مل لسحب تعليق الخلية ، ثم قم بتوصيل إبرة 26-G. لا تقم بسحب تعليق الخلية باستخدام الإبرة ، لأن هذا يمكن أن يجزئ الخلايا.
- استخدم ملقط جراحي صغير لالتقاط قطعة من الثرب المقطوع. انقل الثرب إلى طبق معقم منفصل لتسهيل الحقن. اخترق الثرب برفق بطرف الإبرة وحقن كمية صغيرة من تعليق الخلية في الأنسجة (الشكل 2C).
- كرر الحقن على عدة مناطق من الثرب إلى حجم إجمالي لا يقل عن 100 ميكرولتر أو 100000 خلية. لاحظ أن الكثير من تعليق الخلية قد يبدو أنه يتجمع حول العينة. إذا كان هناك قلق بشأن جودة الحقن ، فكرر الحقن أو حقن كمية أكبر من تعليق الخلية في العينة.
- أعد عينات الثرب المحقونة في كل بئر من صفيحة استزراع 24 بئرا. لاحظ أن حجم وسائط زراعة الثرب يصل إلى مستوى يغطي الثرب دون السماح له بالطفو. تعامل بعناية مع اللوحة وضعها داخل حاضنة (37 درجة مئوية و 5٪ CO2).
- اختياري: استخدم Matrigel (مصفوفة الغشاء القاعدي) لتعليق أنسجة الثرب في مصفوفة صلبة للسماح بحقن أسهل وتوصيل معلق خلوي أكثر تركيزا.
- قم بإذابة مصفوفة الغشاء القاعدي عند 4 درجات مئوية واخلطها بنسبة 1: 1 مع وسائط زراعة الثرب مباشرة قبل الاستخدام. يخزن خليط مصفوفة الغشاء القاعدي على الثلج أو على حرارة 4 درجات مئوية حتى الحقن. املأ الآبار الفارغة بما يكفي من خليط مصفوفة الغشاء القاعدي لغمر قطعة مقطوعة من الثرب.
- ضع العينات في خليط مصفوفة الغشاء القاعدي ثم ضع صفيحة استزراع البئر 24 في حاضنة (37 درجة مئوية و 5٪ CO2) لمدة 20 دقيقة. بمجرد أن يتجمد الخليط ، استمر في الحقن كما هو موضح أعلاه.
- تأكيد الحقن الناجح باستخدام التصوير بالفلورسنت. تأكد من تصور خط من إشارة الفلورسنت في مواقع الحقن (الشكل 2D). لاحظ أن العدد الفعلي للخلايا المرتبطة بالثرب بعد الحقن لا يمكن التنبؤ به.
4. الزراعة المشتركة للثرب البشري وخلايا سرطان المبيض
- قم بتغيير الوسائط كل 48-72 ساعة بإضافة 500-2000 ميكرولتر من وسائط زراعة الثرب الطازجة. لا تقم بسحب الوسائط مباشرة فوق أنسجة الثرب ، لأن هذا قد يحل محل الخلايا السرطانية. لاحظ أنه إذا تحول لون الوسائط إلى اللون الأصفر ، فقم بتغيير الوسائط.
ملاحظة: يعتمد تواتر تغيير الوسائط على حجم الوسائط المستخدمة ومسار نمو الخلايا السرطانية. بمجرد أن تزرع الخلايا السرطانية الثرب ، لم يعد من المهم ما إذا كانت قطعة الثرب عائمة أم لا. - اختياري: إذا تم استخدام مصفوفة غشاء القاعدية ، عادة إذابة المصفوفة بحلول وقت تغيير الوسائط الأول.
- مراقبة نمو أورام سرطان المبيض باستخدام التصوير بالفلورسنت. تواتر التصوير هو حسب تقدير المحقق. توقع وجود أورام صغيرة بحوالي 14 يوما (الشكل 3A-C). قد تختلف النتائج حسب جودة الحقن.
- قم بإنهاء التجربة استنادا إلى نقطة نهاية التجربة.
ملاحظة: لوحظ نمو الورم وسلامة أنسجة الثرب بعد 50 يوما.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
كان التأسيس الناجح لخلايا سرطان المبيض في عينات الثرب واضحا بحلول اليوم 14 تقريبا (الشكل 3A-C). تم تحضير ما لا يقل عن 24 نسخة مكررة وحقنها لكل عينة تم جمعها للسماح بإجراء مزيد من التجارب. تمت مراقبة نمو الورم عن طريق التقاط صور الفلورسنت (الشكل 3D ، E). كان لا بد من تفسير الصور بعناية على أنها طبقة أحادية من الخلايا السرطانية نمت أيضا في قاع كل بئر لم يتم ربطها بالثرب. فضلنا التقاط صور للثرب عندما تم تعليقه في الوسائط لتجنب تداخل إشارات الفلورسنت مع الطبقة الأحادية للخلية السرطانية.
يمكن اعتبار عدم وجود إشارة الفلورسنت بحلول اليوم 14 بمثابة حقن فاشلة. لوحظ أن الخلايا السرطانية انتشرت في البداية عبر سطح الثرب خلال أول 7 أيام ، ولكن بمرور الوقت ، تجمعت لتشكيل أورام (الشكل 3A-D). كان المقياس البديل لعبء الورم بين العينات هو المعدل الذي تغير به لون وسائط زراعة الثرب من الأحمر إلى الأصفر (الشكل 3F). استخدمنا التصوير الفلوري والمراجعة النسيجية والفحص الإجمالي لتأكيد نمو الورم وصلاحية الأنسجة المنتجية بعد 50 يوما من الثقافة المشتركة (الشكل 4).
الشكل 1: توضيح للخطوات العامة في البروتوكول. (أ) الخطوة 1: تحضير الثرب؛ (ب) الخطوة 2: حقن الخلايا السرطانية؛ (ج) الخطوة 3: إنشاء بيئة مجهرية للخلايا السرطانية. (الشكل معد في BioRender.com). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تحضير الخلايا السرطانية وحقنها في الثرب . (أ) قطع الثرب إلى قطع مقاس 1 × 1 سم. (ب) توضع كل قطعة في بئر من صفيحة 24 بئرا ومغطاة ب 500 ميكرولتر من الوسائط. ج: حقن الخلايا السرطانية في قطعة الثرب. (د) لوحظ وجود سلسلة من الخلايا السرطانية الفلورية بعد الحقن. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: صور تمثيلية بعد 14 و 25 يوما من الثقافة المشتركة. (A-C) صور تمثيلية بعد 14 يوما من الثقافة المشتركة: (A) المرحلة ، (B) قناة mCherry ، (C) مدمجة. (د-هاء) صور تمثيلية بعد 25 يوما من الثقافة المشتركة. (F) التغيير في لون الوسائط من الوردي إلى الأصفر هو مؤشر على نجاح حقن الخلايا السرطانية وإنشاء ثقافة مشتركة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: التشكل الإجمالي وتلطيخ الهيماتوكسيلين والإيزين (H&E). (أ ، ب) التشكل الإجمالي التمثيلي للثقافات المشتركة في اليوم 50 ؛ تشير الأسهم إلى مواقع نمو خلايا سرطان المبيض mCherry +. (ج، د) تلطيخ H& E التمثيلي للثقافات المشتركة في اليوم 50. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
باستخدام هذا البروتوكول ، تم تطوير نموذج قبل السريري لسرطان الصفاق لسرطان المبيض باستخدام مزيج من التقنيات الأساسية في المختبر وخارج الجسم الحي. لوحظ نمو تدريجي للورم على مدار 50 يوما من الثقافة المشتركة بعد بذر عينات الثرب بخلايا سرطان المبيض البشري mCherry + OCSC1-F2. تم تطوير هذه الطريقة وتحسينها عبر العديد من التجارب التجريبية باستخدام عينات مختلفة من الثراب. يعتمد نمو الورم الناجح على جودة الثرب وصلاحية الخلايا السرطانية وفعالية الحقن. في هذا التقرير ، استخدمنا فقط خلايا mCherry + OCSC1-F2 وخطوط سرطان المبيض البشري mCherry + R182 التي تم الإبلاغ عنها سابقا في العديد من المنشورات 12،15،16،17،18،19،20،21،22. باستخدام هذين الخطين الخلويين بأوقات مضاعفة مختلفة (16 ساعة ل OCSC1-F2 و 36 ساعة ل R182) ، لوحظ اختلاف في الوقت لتحقيق نمو لوغاريتمي داخل الأنسجة الذهنية. ومع ذلك ، فقد نجحنا في إنشاء كلا خطي الخلية في نظام الثقافة المشتركة.
كان التواصل الفعال بين الباحثين ومنسقي البحوث والفرق الجراحية أمرا بالغ الأهمية لجمع ومعالجة عينات الثرب. حدد الباحث المرشحين للبروتوكول ، وحصل منسقو البحث على موافقة المرضى قبل الجراحة ، وجمع المحقق العينات من غرفة العمليات. بالنظر إلى سير العمل هذا ، كان يجب أن يكون جدول المحقق مرنا لأن العديد من العوامل من جانب المريض التي تؤثر على الجمع لا يمكن التنبؤ بها (على سبيل المثال ، تم إلغاء الجراحة ، أو تغيير وقت الجراحة ، أو عدم كفاية أو عدم إزالة الثرب). يضمن التصور المباشر واختيار الأنسجة من غرفة العمليات سلامة العينات والعقم الجراحي والمعالجة في الوقت المناسب. في البداية ، تم تفويض جمع العينات إلى منسقي البحوث. ومع ذلك ، بعد جمع عدد قليل من العينات ، لاحظنا أن وقت المعالجة قد تأخر (أي >4 ساعات) وأن جودة الثرب كانت رديئة بشكل كبير (على سبيل المثال ، كانت الأنسجة مقطعة). في إحدى التجارب التجريبية ، تم تخزين الأنسجة الأمينية عند 4 درجات مئوية لمدة 48 ساعة قبل الحقن لأن الخلايا السرطانية لم تكن جاهزة في الوقت المناسب. لا يزال يلاحظ نمو ورم مماثل ، ولكن لم يتكرر هذا التسلسل حيث من المعروف أن التغيرات في درجات الحرارة تؤثر على البيئة المكروية للورم (TME).
قبل جمع العينات ، كان من المهم أن يكون لديك خلايا سرطانية متقاربة بما فيه الكفاية وفقا لجدول الجراحة. نظرا لاختلاف عدد العينات التي يتم جمعها كل شهر ، لم يتم الحفاظ دائما على الثقافات النشطة لخلايا سرطان المبيض. تم إذابة الخلايا المجمدة على الأقل 1 أسبوع مقدما ، مطلية باستخدام بروتوكول قياسي ، ثم مرت الخلايا مرة واحدة على الأقل لضمان البقاء. كانت خطوط الخلايا المستخدمة في هذا البروتوكول مرنة نسبيا. ومع ذلك ، ما زلنا نواجه حالات لم تتعاف فيها الخلايا بحلول يوم الجراحة ولا يمكن حقنها. في هذه الدراسة ، لم تكن هناك محاولة لحقن الخلايا السرطانية التي كانت أقل من 50 ٪ متقاربة. تم تخفيف التأخيرات اللاحقة المتعلقة بإعداد الخلايا باستخدام تقنية معقمة جيدة وتقسيم الخلايا بنسب للحفاظ على الالتقاء اعتمادا على الجدول الزمني المتوقع لجمع العينات. لقد قصرنا البروتوكول على خطين فقط من الخلايا السرطانية الموسومة بالفلورسنت ، ولكن من المهم ملاحظة أنه يمكن أيضا استخدام خطوط الخلايا السرطانية الأخرى أو الخلايا السرطانية الأولية التي لا تحتوي على بروتينات الفلورسنت.
أخيرا ، ارتبط معدل نمو الورم بالتقاء الخلايا السرطانية المجاورة للخلايا الشحمية وداخلها مباشرة بعد الحقن. تم تحديد ذلك عن طريق التقاط صور الفلورسنت لجميع عينات الثرب بعد الحقن. بالمقارنة مع تلقيح الخلايا السرطانية للأعضاء الصلبة أو الأنسجة تحت الجلد ، كان حقن الخلايا السرطانية في الأنسجة الأمينية أكثر صعوبة. يمنع الهيكل الرخو والاتساق الدهني للثرب الأنسجة من الاحتفاظ بأحجام تعليق الخلية بشكل فعال دون تسرب. عندما تم استخدام إبرة أصغر (أي 30 جم أو أضيق) للحقن ، كان هناك قلق بشأن تجزئة الخلايا مع انخفاض تكاثر الخلايا. اختبرنا العديد من تقنيات الحقن وأرقام الخلايا وأحجام تعليق الخلايا ووجدنا نتائج متسقة مع البروتوكول الموضح أعلاه. في الوقت نفسه ، نقر بأن مثل هذه الاختلافات في البروتوكول من المرجح أن تؤدي إلى نتائج مماثلة نظرا للطبيعة الخبيثة للخلايا. جعلت إضافة Matrigel خطوة الحقن أسهل لأن المصفوفة خارج الخلية تمسك بتعليق الخلية بشكل أفضل. ومع ذلك ، فإن هذه الطريقة أكثر تكلفة ولم تنتج باستمرار عبئا أكبر للورم في العينات. بشكل عام ، كان من النادر ألا تنمو أي من عينات الثرب ، لكن عدد الأورام وسرعة النمو اختفت.
يحاكي هذا النموذج السمة المميزة لتكوين ورم سرطان المبيض عن طريق تكرار ورم خبيث مبكر إلى الأنسجة البريتونية الغنية بالدهون. يسمح هذا البروتوكول بالاختلاف بدون مهارة مطلوبة ، ويسهل تكراره ، ويولد نظاما ذا قيمة انتقالية محتملة. بالمقارنة مع النماذج الموجودة في المختبر وخارج الجسم الحي في سرطان المبيض ، فإن الطريقة الموضحة هنا تجمع بين العديد من التقنيات لإنتاج نموذج يحتفظ ببنية الورم و TME على مدى عمر طويل. بالإضافة إلى ذلك ، لاحظنا أنه عندما تم نقل عينة من الثرب مع أورام متعددة إلى بئر جديد واستزراعها بالثرب الخالي من السرطان (أي لم يتم حقنه) ، تم زرع الثرب الساذج بالخلايا السرطانية في غضون 7 أيام. تشير هذه النتيجة إلى أن الأورام المتضاعفة تحتفظ بإمكانية نقيلية عن طريق الانتقال الظهاري الوسيط. لم نحدد أي نماذج مماثلة لسرطان المبيض في الأدبيات التي زرعت خزعات الأنسجة لفترات طويلة من الزمن. ويدعم هذا النهج اكتشاف سابق مفاده أن الخلايا الظهارية المعزولة من ثرب الفأر يمكن استزراعها لأكثر من 30 ممرا بعد جمع23.
يمكن استخدام النموذج الموصوف في هذه الدراسة لفهم تأثير التفاعل المباشر بين خلايا سرطان المبيض والخلايا داخل الثرب الغني بالدهون. يمكن فصل الخلايا السرطانية عن أنسجة الثرب والحصول عليها لتحليل الكيمياء النسيجية أو المناعية (IHC). بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام الخلايا لدراسات الاستجابة للأدوية.
القيود الأساسية لهذا النموذج هي أن عدد الأورام ومعدل نمو الورم وموقع الأورام لا يمكن التنبؤ بها. يمكن أن يؤدي الافتقار إلى التوحيد القياسي والتباين عبر العينات إلى الحد من تطبيق هذا النموذج. كما أبدينا العديد من الملاحظات التي تتطلب مزيدا من الفحص أثناء تطوير هذا البروتوكول. على سبيل المثال ، لم تكن النسخ المكررة "الضابطة" في تجربة واحدة خالية من السرطان في الواقع حيث تم تشخيص المريض لاحقا بورم خبيث في النقائل الدقيقة. ومع ذلك ، ظلت الأورام غير المحقونة قابلة للحياة طوال الفترة التجريبية. ستشمل التطبيقات المستقبلية لهذا النموذج الدراسات الجزيئية ل TME أثناء تكوين الورم المبكر ، والتلاعب ب TME عن طريق حقن الخلايا المناعية ، وتحقيقات الاستجابة للأدوية. باختصار ، نعتقد أن النموذج قبل السريري الموصوف هنا سيضيف إلى ذخيرة أدوات البحث الحالية ويساعد في توضيح الآليات الجزيئية ل TME في سرطان المبيض.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
يتم تمويل هذه الدراسة جزئيا من قبل مؤسسة جانيت بوروس التذكارية. نحن نعترف بالمرضى وقسم الأورام النسائية في معهد كارمانوس للسرطان لجمع عينات الثرب. كما نعترف بالبنك الحيوي وجوهر العلوم المترابطة في معهد كارمانوس للسرطان لتنسيق توظيف المرضى وإعداد شرائح علم الأمراض. يتم دعم البنك الحيوي وجوهر العلوم المرتبطة جزئيا من خلال منحة مركز المعاهد الوطنية للصحة P30 CA22453 لمعهد كارمانوس للسرطان في جامعة واين ستيت.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1x) | Gibco | 25300054 | |
| 1 mL Insulin Syringe with 26 G detachable needle | BD | 329652 | |
| 10 mL Serological Pipets | CELLTREAT | 229010B | |
| 100 mm Tissue Culture Dish | Fisherbrand | FB012924 | |
| 15 mL Centrifuge Tube | CELLTREAT | 229411 | |
| 24 Well Cell Culture Plate | Costar | 3524 | |
| 50 mL Centrifuge Tube | CELLTREAT | 229421 | |
| 75 cm2 Tissue Culture Flask | CELLTREAT | 229341 | |
| Corning Cell Counter | Corning | 9819000 | |
| Cytation 5 imager | Biotek | ||
| DMEM/F12 (1:1) (1x), +L-Glutamine, +2.438 g/L Sodium Bicarbonate | Gibco | 11320033 | |
| Fetal Bovine Serum, Qualified | Gibco | 1043028 | |
| Matrigel | Corning | 356230 | Basement membrane matrix |
| No. 10 Stainless Steel Disposable Scalpel | Integra-Miltex | 4410 | |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Phosphate Buffered Saline, pH 7.4 (1x) | Gibco | 10010023 | |
| Revolve microscope | Echo |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Wagle, N. S., Jemal, A.
- Berek, J. S., Renz, M., Kehoe, S., Kumar, L., Friedlander, M. Cancer of the ovary, fallopian tube, and peritoneum: 2021 update. Int J Gynaecol Obstet. 155 (Suppl 1), 61-85 (2021).
- Ledermann, J. A., et al. Newly diagnosed and relapsed epithelial ovarian carcinoma: ESMO clinical practice guidelines for diagnosis, treatment and follow-up. Ann Oncol. 24 (Suppl 6), vi24-32 (2013).
- Jelovac, D., Armstrong, D. K. Recent progress in the diagnosis and treatment of ovarian cancer. CA Cancer J Clin. 61 (3), 183-203 (2011).
- Morgan, R. J. Jr, et al. Ovarian cancer. Clinical practice guidelines in oncology. J Natl Compr Canc Netw. 6 (8), 766-794 (2008).
- Nieman, K. M., et al. Adipocytes promote ovarian cancer metastasis and provide energy for rapid tumor growth. Nat Med. 17 (11), 1498-1503 (2011).
- Motohara, T., et al. An evolving story of the metastatic voyage of ovarian cancer cells: cellular and molecular orchestration of the adipose-rich metastatic microenvironment. Oncogene. 38 (16), 2885-2898 (2019).
- Di Nicola, V. Omentum a powerful biological source in regenerative surgery. Regen Ther. 11, 182-191 (2019).
- Meza-Perez, S., Randall, T. D.
- Liu, M., Silva-Sanchez, A., Randall, T. D., Meza-Perez, S. Specialized immune responses in the peritoneal cavity and omentum. J Leukoc Biol. 109 (4), 717-729 (2021).
- Lee, W., et al. Neutrophils facilitate ovarian cancer premetastatic niche formation in the omentum. J Exp Med. 216 (1), 176-194 (2019).
- Cardenas, C., et al. Adipocyte microenvironment promotes Bclxl expression and confers chemoresistance in ovarian cancer cells. Apoptosis. 22 (4), 558-569 (2017).
- Wu, Q., et al. Cancer-associated adipocytes: key players in breast cancer progression. J Hematol Oncol. 12 (1), 95 (2019).
- Zhang, Z., Scherer, P. E. Adipose tissue: The dysfunctional adipocyte - a cancer cell's best friend. Nat Rev Endocrinol. 14 (3), 132-134 (2018).
- Alvero, A. B., et al. TRX-E-002-1 Induces c-Jun-dependent apoptosis in ovarian cancer stem cells and prevents recurrence in vivo. Mol Cancer Ther. 15 (6), 1279-1290 (2016).
- Alvero, A. B., et al. Novel approach for the detection of intraperitoneal micrometastasis using an ovarian cancer mouse model. Sci Rep. 7, 40989 (2017).
- Craveiro, V., et al. Phenotypic modifications in ovarian cancer stem cells following Paclitaxel treatment. Cancer Med. 2 (6), 751-762 (2013).
- Sumi, N. J., et al. Murine model for non-invasive imaging to detect and monitor ovarian cancer recurrence. J Vis Exp. (93), e51815 (2014).
- Agarwal, R., et al. Macrophage migration inhibitory factor expression in ovarian cancer. Am J Obstet Gynecol. 196 (4), 348.e1-348.e5 (2007).
- Kelly, M. G., et al. TLR-4 signaling promotes tumor growth and paclitaxel chemoresistance in ovarian cancer. Cancer Res. 66 (7), 3859-3868 (2006).
- Li, J., et al. CBX7 binds the E-box to inhibit TWIST-1 function and inhibit tumorigenicity and metastatic potential. Oncogene. 39 (20), 3965-3979 (2020).
- Tedja, R., et al. Generation of stable epithelial-mesenchymal hybrid cancer cells with tumorigenic potential. Cancers (Basel). 15 (3), 15030684 (2023).
- Dauleh, S., et al. Characterisation of cultured mesothelial cells derived from the murine adult omentum. PLoS One. 11 (7), e0158997 (2016).
