Summary
Pseudotypede virus (PVer) er replikasjonsdefekte virioner som brukes til å studere vertsvirusinteraksjoner under tryggere forhold enn å håndtere autentiske virus. Presentert her er en detaljert protokoll som viser hvordan SARS-CoV-2 PV-er kan brukes til å teste nøytraliseringsevnen til pasienters serum etter COVID-19-vaksinasjon.
Abstract
Pseudotypede virus (PV) er molekylære verktøy som kan brukes til å studere vertsvirusinteraksjoner og for å teste serumprøvers nøytraliserende evne, i tillegg til deres bedre kjente bruk i genterapi for levering av et gen av interesse. PV er replikasjonsdefekt fordi virusgenomet er delt inn i forskjellige plasmider som ikke er innlemmet i PVene. Dette sikre og allsidige systemet tillater bruk av PV i biosikkerhetsnivå 2-laboratorier. Her presenterer vi en generell metodikk for å produsere lentivirale PV basert på tre plasmider som nevnt her: (1) ryggradsplasmidet som bærer reportergenet som trengs for å overvåke infeksjonen; (2) emballasjeplasmidet som bærer genene for alle strukturelle proteiner som trengs for å generere PVene; (3) konvoluttoverflaten glykoprotein ekspresjonsplasmid som bestemmer virustropisme og medierer viral inngang i vertscellen. I dette arbeidet er SARS-CoV-2 Spike konvoluttglykoproteinet som brukes til produksjon av ikke-replikerende SARS-CoV-2 pseudotype lentivirus.
Kort fortalt ble pakkeceller (HEK293T) samtransfektet med de tre forskjellige plasmidene ved hjelp av standardmetoder. Etter 48 timer ble supernatanten som inneholdt PV-ene høstet, filtrert og lagret ved -80 °C. Smittsomheten til SARS-CoV-2 PV ble testet ved å studere ekspresjonen av reportergenet (luciferase) i en målcellelinje 48 timer etter infeksjon. Jo høyere verdien er for relative luminescensenheter (RLU), desto høyere er infeksjons-/transduksjonsraten. Videre ble de smittsomme PVene tilsatt de serielt fortynnede serumprøvene for å studere nøytraliseringsprosessen av pseudovirusets inntreden i målceller, målt som reduksjonen i RLU-intensitet: lavere verdier tilsvarende høy nøytraliserende aktivitet.
Introduction
Pseudotypede virus (PV) er molekylære verktøy som brukes i mikrobiologi for å studere vertsvirus og patogen-patogen-interaksjoner 1,2,3,4. PV består av en indre del, den virale kjernen som beskytter virusgenomet, og en ytre del, konvoluttglykoproteinene på overflaten av viruset som definerer tropismen5. Et pseudovirus er replikasjonsinkompetent i målcellen fordi det ikke inneholder all genetisk informasjon for å generere nye viruspartikler. Denne kombinasjonen av særegne egenskaper gjør PV-er til et trygt alternativ til et villtypevirus. Wildtype-virus er derimot høypatogene og kan ikke brukes i BSL 2-laboratorier for analyse6.
Smittsomheten til PV kan overvåkes av et reportergen, som vanligvis koder for et fluorescerende protein (GFP, RFP, YFP) eller et enzym som produserer kjemiluminescerende produkter (luciferase). Dette er inneholdt i et av plasmidene som brukes til PV-produksjon og innlemmet i genomet til pseudovirus7.
Flere typer PV-kjerner eksisterer for tiden, inkludert lentiviral-avledede partikler basert på HIV-1-genomet. Den store fordelen med HIV-1-baserte PV over andre plattformer er deres iboende integrasjonsprosess i målcellegenomet8. Selv om HIV-1 er et svært smittsomt virus og er årsaken til AIDS, er disse lentivirale vektorene trygge å bruke på grunn av de omfattende optimaliseringstrinnene gjennom årene. Optimale sikkerhetsforhold ble oppnådd ved innføring av 2. generasjons lentivirale vektorer, hvor virusgener ble utarmet uten å påvirke transduksjonsevnen9. 3. og 4. generasjon bidro til økt sikkerhet ved lentiviral vektorhåndtering med ytterligere spalting av virusgenomet i separate plasmider10,11. De siste generasjonene av PV er vanligvis ansatt for å produsere lentivirale vektorer for genterapi.
PV kan brukes til å studere interaksjoner mellom virus og vertsceller, både under produksjons- og infeksjonsfasen. PV er spesielt ansatt i pseudovirus nøytralisering analyser (PVNA). PVNA er allment validert for å vurdere nøytraliseringspotensialet til serum eller plasma ved å målrette det virale glykoproteinet på PVs konvolutt12,13. Nøytraliseringsaktivitet, uttrykt som den hemmende konsentrasjonen 50 (IC50), er definert som fortynning av serum / plasma som blokkerer 50% av viral partikkelinngang14. I denne protokollen beskrev vi oppsett av PVNA for å teste antistoffaktiviteten mot Severe Acute Respiratory Syndrome - Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) i sera samlet inn før og etter oppfriskningsvaksinedose.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Den nåværende protokollen er godkjent av og følger retningslinjene fra den etiske komiteen ved Universitetet i Verona (godkjenningsprotokoll nummer 1538). Informert skriftlig samtykke ble innhentet fra forsøkspersonene som deltok i studien. Hele blodprøver ble samlet inn fra helsepersonell (HCW) frivillige som var i ferd med å motta anti-SARS-CoV-2-vaksiner. Disse prøvene ble samlet i plastrør inneholdende antikoagulantia for påfølgende isolering av serum15.
Alle følgende prosesser må utføres i en klasse 2 biologisk hette, som arbeider under sterile forhold. Virushåndtering må utføres med forsiktighet, og alle avfallsprodukter må nøytraliseres i en fortynnet blekemiddelløsning. En oversikt over protokollen er vist i figur 1.
Figur 1: Grafisk fremstilling av en nøytraliseringsanalyse. (A) PV-produksjon, (B) PV-titrering og (C) nøytraliseringsanalyse. Alle prosedyrene utføres i en klasse 2 biologisk hette under sterile forhold. Titreringstrinn (B) må utføres for å standardisere smittsomhetsnivåene til PV før bruk i nøytraliseringsanalysen (C). Denne figuren ble opprettet med BioRender. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
1. SARS-CoV-2 PVs produksjons- og smittsomhetstest
- Frø 5 x 105 HEK293T celler i komplett Dulbeccos modifiserte ørnemedium (DMEM, høy glukose, 10% føtal bovint serum (FBS), 1% L-glutamin, 1% penicillin / streptomycin) i en 6-brønnsplate (6WP) for å nå en passende celletetthet kompatibel med transfeksjonsreagenset som brukes. Ved utførelse av transfeksjon med polyehtylenimin (PEI) (klargjør reagenset i henhold til produsentens instruksjoner), sørg for at cellene når 40-60% tetthet på transfeksjonsdagen (trinn 1.3). Hold cellene i en fuktet inkubator ved 37 ° C og 5% CO2.
- Før transfeksjon, erstatt det brukte cellemediet med ferskt medium uten antibiotika (DMEM, høy glukose, 10% FBS, 1% L-glutamin) for å oppnå høyere transfeksjonseffektivitet.
MERK: Dagen etter såing er HEK293T celler klare til å bli transfektert. - Transfekt adherent HEK293T celler med et egnet transfeksjonsreagens i henhold til produsentens instruksjoner. Hvis du bruker PEI, lag to blandinger og følg trinnene nedenfor.
- For å forberede blanding A, tilsett 500 ng pCMV-dR8.91 emballasjeplasmid16, 750 ng pCSFLW reporterplasmid16 og 450 ng SARS-CoV-2 Spike som uttrykker plasmid i 100 μL redusert serummedium.
- For å tilberede blanding B, tilsett 17,5 μl PEI (konsentrasjon: 1 mg/ml) til 100 μl av det reduserte serummediet.
- La begge blandingene ruges ved romtemperatur (RT) i 5 minutter. Bland deretter innholdet i begge rørene sammen ved å tilsette PEI-blandingen B til DNA-blanding A.
- Inkuber røret i 20-30 min ved RT. Knips røret forsiktig hvert 3-4 minutt for å forbedre blandingen. Til slutt legger du blandingen til de HEK293T cellene.
- 16-20 timer etter transfeksjonen, erstatt kulturmediet med frisk, komplett DMEM. Inkuber ved 37 ° C og 5% CO2, for å tillate produksjon av PV av transfekterte celler.
- 72 timer etter transfeksjonen, høst supernatanten som inneholder PV. Deretter sentrifuger ved 1600 x g i 7 minutter ved romtemperatur for å fjerne celleavfall og døde celler og filtrere det gjennom et 0,45 μm celluloseacetatfilter.
- VALGFRITT TRINN: For å øke det endelige utbyttet av PV-titer, utfør flere transfeksjoner, slå sammen cellemediet som inneholder PV, og konsentrer det ved hjelp av konsentrerende rør.
- Gå direkte videre til de neste trinnene ("PV-titrering", avsnitt 2) eller alikot det PV-holdige mediet i egnede rør for oppbevaring ved -80 °C til bruk. Klargjør en ekstra alikot (400-500 μL) som skal brukes til titrering.
MERK: Å lage flere alikoter vil garantere reproduserbarhet mellom eksperimenter ved å unngå overdreven tinefrysesykluser.
2. PV-titrering
- Bruk det ferske PV-holdige mediet til de neste trinnene, eller tine testalikoten (trinn 1.7) for å utføre titrering av den nye virusrullen. Frysing av alikoter av samme PV-lager vil garantere reproduserbarhet.
- Legg til 50 μL komplett DMEM (eller komplett medium kompatibelt med målcellelinjen i bruk) i alle brønnene til en 96-brønnplate (96WP) som er nødvendig for å teste i duplisere PV-lageret, og la rad "A" være tom. Legg til 100 μL PV-lager til rad "A". Basert på antall preparater som skal testes, la én kolonne være uten viruset som en "bare celle"-kontroll (figur 2).
- Pipett 50 μL fra rad A til rad B og gjenta denne prosessen opp til rad G for å oppnå serielle fortynninger av den opprinnelige stambunnen. Kast overflødig volum fra den siste raden.
- Løsne celler ved hjelp av trypsin / etylendiamintetraeddiksyre 1x (EDTA) i Dulbeccos fosfatbuffer saltvann 1x (DPBS 1x), etter å ha fjernet det brukte mediet og vasket celler med DPBS 1x to ganger. Forbered celler til en tetthet på 4 x 105 celler / ml.
MERK: I denne protokollen ble PV-infeksjon testet på den følsomme cellelinjen HEK293T / ACE2; slike celler ble avledet fra HEK293T, transdusert ved hjelp av en lentiviral vektor for å uttrykke ACE2-reseptor. - Legg til 50 μL av cellesuspensjonen i hver brønn for å sikre et celletall på 2 x 104 celler per brønn.
- Inkuber ved 37 °C og 5 % CO2 i 48 timer.
- Etter inkubasjonen, utfør Luciferase-analysen for å oppnå avlesningen i henhold til produsentens instruksjoner. Tilsett 100 μL av luciferase-reagenset til brønnene og inkuber i mørket ved RT i 2 minutter. Flytt innholdet i hver brønn til en svart 96 brønnplate (kompatibel med den tilgjengelige plateleseren) og les platene i en 96 brønnplateleser.
MERK: Luminometeret som brukes til luciferase-avlesningen, vil produsere en regnearkfil med rå, ubehandlede data som skal brukes til nedstrømsanalyse (i dette tilfellet en Excel-fil). Virusets smittsomhet vil uttrykkes som relative luminescensenheter (RLU) (beskrevet i avsnitt 4.1).
Figur 2: Representativ layout av en 96 brønnplate for PV-titrering. Et fast volum av PV-holdig supernatant legges til rad A, kolonne 1-11, og serielt fortynnes. Den siste kolonnen er igjen som "bare celle"-kontrollen. Denne figuren ble opprettet med BioRender. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
3. Nøytraliseringsanalyse
- Tine pasientens sera på is. Inaktiver serumprøver ved å inkubere dem ved 56 °C i 30 minutter.
- I en 96-brønnplate tilsettes 50 μL av den friske, komplette DMEM (eller komplett medium kompatibel med målcellelinjen som brukes) i hver av følgende brønner: fra rad B (kolonne 1-10) til rad H (kolonne 1-10). Sett 95 μL av den friske, komplette DMEM i rad A (kolonne 1-10). Tilsett 50 μL og 100 μL komplett DMEM i brønnene i henholdsvis kolonne 11 og 12. Disse vil være de infiserte (viruskontroll, eller VC) og ikke-infiserte (bare celle eller CC) kontroller, henholdsvis (figur 3).
- Tilsett 5 μL varmeinaktiverte serum-/plasmaprøver i rad A (kolonne 1-10). Hver prøve vil være i duplikat. Bland prøvene i den første raden med en flerkanalspipett og flytt 50 μL medium som inneholder serum fra rad A til rad B. Gjenta denne prosessen opp til siste rad (figur 3). Kast de resterende 50 μL.
- Tine det nødvendige antall PVs alikoter og fortynne til ≥ 104 RLU / ml. Tilsett 50 μL av det fortynnede PV-holdige mediet til hver brønn (fra kolonne 1 til kolonne 11) ved hjelp av en flerkanalspipett for å nå en 1:1 fortynning av varmeinaktivert serum/plasma til virus. Inkuber ved 37 °C og 5 % CO2 i 1 time slik at antistoffene i serumprøvene kan binde seg til SARS-CoV-2-piggproteinet på PV-ene.
- Klargjør minst 5 ml suspensjon av følsomme celler (HEK293T/ACE2) ved en celletetthet på 4 x 105 celler/ml. Tilsett 50 μL av cellesuspensjonen til hver brønn og inkuber ved 37 °C og 5 % CO2 i 48 timer.
- Etter inkubasjonen, utfør luciferase-analyseavlesningen i henhold til produsentens instruksjoner, som beskrevet i trinn 2.7.
MERK: Luminometeret som brukes til luciferase-avlesning, vil produsere en regnearkfil (i dette tilfellet .xlsx) med rå, ubehandlede data som skal brukes til nedstrømsanalyse (Luciferase-analysefilen).
Figur 3: Platerepresentasjon basert på serumfortynning. Lys rødt tilsvarer en høyere mengde serum, og lyseblå bane (kolonne 11) tilsvarer infisert cellekontroll (VC, viruskontroll). Lyseblå bane (kolonne 12) tilsvarer uinfiserte celler (CC, cellekontroll). Denne figuren ble opprettet med BioRender. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
4. Titreringsanalyse
- På Luciferase-analysefilen tilordner du navnene/titlene til de tilsvarende prøvene.
- Multipliser RLU-målet med fortynningsfaktorene (fra toppen til bunnen av rutenettet: 20x, 40x, 80x, 160x, 320x, 640x, 1,280x, 2,560x) for å oppnå RLU / ml. Hvis forskjellige fortynningsfaktorer brukes, endres multiplikasjonsfaktorene tilsvarende.
- Beregn gjennomsnittlig RLU / ml for hvert PV-preparat.
5. PVs nøytraliseringsanalyseanalyse
- På regnearkfilen Luciferase-analysen (i dette tilfellet .xlsx), tilordne de tilsvarende titlene til de testede prøvene. Skriv inn fortynningsfaktoren til prøven (40s, 80x, 160x, 320x, 640x, 1,280x, 2,560x, 5,120x). Beregn Log10 for fortynningsfaktorene.
- Beregn gjennomsnittlig RLU for uinfisert og infisert kontroll (figur 3, henholdsvis kolonne 11 og 12). Disse verdiene vil være nyttige for normaliseringen i trinn 5.5.
- Åpne et nytt dokument for dataanalyse. Velg X/Y-analyse, skriv inn X som tall og Y som Enter 2 replikerer verdier i underkolonner side ved side.
- Angi Log10-verdier (fortynning) som X-tall. Angi den dupliserte RLU-en for eksemplene.
- Gå til Analyser > Normaliser > Flagg alle eksemplene på samme ark. Skriv inn gjennomsnittlige VC- og CC-verdier i henholdsvis Hvordan defineres 0 % ?» og Hvordan defineres 100 %. Klikk OK.
- På det normaliserte databladet går du til Analyser > XY-analyser > ikke-lineære analyser (kurvetilpasning). Flagg alle eksemplene, og klikk OK. For dose-respons - Inhibering, velg log (inhibitor) vs normalisert respons - variabel stigningstall.
- Under Begrensning endrer du HillSlope til Må være mindre enn 0.
- Under Utdata flagger du Opprett sammendragstabell og graf. Klikk på OK for å få de endelige analysene. Et arbeidsark med mal for analysen er gitt i tilleggsfil 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne protokollen beskriver produksjonen av SARS-CoV-2 PV-er og en nedstrøms anvendelse av disse PV-ene for å analysere nøytraliseringsaktiviteten til serum/plasma hos personer som får anti-COVID-19-vaksinasjon17. Videre kan denne protokollen brukes til å produsere pseudotyper av hver SARS-CoV-2-variant av bekymring (VOC) for å teste utviklingen av den nøytraliserende responsen. Til tross for at denne protokollen letter studiet av humoral immunrespons etter COVID-19-vaksinasjon, kan den tilpasses for enkelt å teste nøytraliseringen av forskjellige sera / plasma mot forskjellige virus 13,18,19.
Figur 4A representerer økningen av fortynningen av serum (Log (fortynning)) som tilsvarer økningen av RLU-signalet. Jo høyere fortynning av prøven er, desto mindre blokkert er virusinngangen (figur 4A). Dette uttrykkes videre som en prosentandel av nøytralisering (figur 4B).
IC50-resultatet viser nøytraliseringskapasiteten til et enkelt vaksineserum over tid. I eksempelet rapportert i figur 4C utviklet forsøkspersonen en sterk humoral aktivitet mot viruset fire uker etter vaksinasjon; Men etter 16 uker er IC50 lik den før vaksineadministrasjon. I dette tilfellet viste PVNA tapet av nøytraliseringspotensial over tid.
Figur 4: Representative resultater av PVNA. (A) Smittsomhet (RLU, og (B) prosentandel av nøytralisering er vist ved uke 0 (W0, før vaksinasjon); W4 (fire uker etter vaksinasjon); W16 (seksten uker etter W0). (C) IC50-verdier på samme tidspunkt. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tilleggsfil 1: Mal for nøytraliseringsanalyse. Et arbeidsark med en mal for å gjennomføre nøytraliseringsanalysen. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Selv om bruk av et villtypevirus simulerer den faktiske infeksjonen, er lentivirale PV et tryggere alternativ for å studere mekanismene forbundet med viral oppføring og infeksjon uten de strenge sikkerhetskravene som er nødvendige for å arbeide med patogene virus 4,20,21. PV er sammensatt av en replikasjonsdefekt viral kjerne omgitt av overflatekonvoluttglykoprotein av et patogent virus, som er målet med studien.
HIV-1-baserte PV-er er en av de mest brukte plattformene, og disse har blitt brukt i denne protokollen for produksjon av SARS-CoV-2 pseudovirale partikler. Reportergenet kan være forskjellig i henhold til bruken av PV-ene; i dette tilfellet gir valget av luciferase reporter-genet en enkel, rask og sensitiv avlesning av smittsomheten til de produserte PV-ene.
PV basert på lentivirus er mye brukt for å studere anti-HIV-1 humoral respons22. PV-teknologien ble umiddelbart brukt under den nylige COVID-19-pandemien, forårsaket av SARS-CoV-2. SARS-CoV-2 er et høypatogent humant betakoronavirus, identifisert for første gang i Kina (Wu Han), som raskt ble pandemi og forårsaket mer enn 6 millioner dødsfall over hele verden,23 24. På grunn av valideringen av vaksinestrategier har pandemien i stor grad blitt kontrollert; Likevel, i de fleste sårbare mennesker, som kreftpasienter eller personer som lever med hiv, utgjør det fortsatt en risiko 25,26,27. I denne sammenheng er det fortsatt behov for validerte analyser for å overvåke antivaksinens humorale respons når det gjelder nøytraliserende aktivitet. I denne artikkelen har vi beskrevet en enkel protokoll som enkelt kan utføres i laboratorier uten tilgang til kategori-3-inneslutning. Videre er PV-plattformen et allsidig system for å studere forskjellige SARS-COV-2-virusvarianter. Faktisk, ved å endre det konvoluttuttrykkende plasmidet med forskjellige pigger, er det mulig å generere PV av SARS-CoV-2 nye varianter eller av andre koronavirus28. Disse virusporteføljene kan brukes til å vurdere reaktiviteten til vaksineindusert humoral respons mot de ulike variantene av bekymring 15,29,30,31,32. Denne informasjonen kan veilede genereringen av nye og mer effektive vaksiner.
Tre store hindringer kan oppstå mens man følger denne protokollen angående transfeksjonsbetingelser, titreringssvikt og/eller nøytraliseringsanalyse. For det første kan det hende at pakkecellene ikke er tilstrekkelig konfluente på transfeksjonstidspunktet. Dette kan skyldes mangel på næringsstoffer. Sørg for at trinn 1.1. følges riktig. Ellers utfører du såing om morgenen dagen før transfeksjon og transfekter pakkecellene senere neste dag for å øke veksttiden. Et tilbakevendende problem er potensiell forurensning av cellemediet mellom transfeksjon og mediumerstatning neste dag. I dette tilfellet, gjenta prosedyren ved å øke steriliseringsprosedyren før bruk når du arbeider under BSL2-hetten eller inkluderer antibiotika for å unngå uønskede forurensninger. For det andre kan det oppstå et uoppdaget luciferase-signal som kan tilskrives forskjellige stadier av PV-produksjon eller egenskapene til målcellelinjen. Plasmider bør ekstraheres med endotoksinfrie sett. Transfeksjonstrinnet er kritisk for utfallet av protokollen. PEI-reagens må tilberedes ved riktig konsentrasjon på 1 mg/ml. Forsiktig flikking av røret under fremstilling av transfeksjonsblandinger forbedrer dannelsen av DNA-PEI-komplekser. For å verifisere at cellene har blitt transfektet riktig, anbefales det å utføre luciferaseanalysen umiddelbart etter høsting av cellene. I tillegg inkluderer et kontrollvirus konvolutt glykoprotein som VSV: VSV-PVs gir sterke RLU-signaler på humane cellelinjer. Videre er det nødvendig å nevne at målcellelinjen må uttrykke reseptoren, som lett verifiseres via western blot eller flowcytometri.
Denne metoden har tidligere blitt optimalisert16 med hensyn til de eksperimentelle forholdene, inkludert valg av transfeksjonsreagenset, bestemmelsen av forholdene mellom de forskjellige plasmidene som trengs for genereringen av PV, og valget av målcellelinjene, bruken av luciferase som reportergener. Ikke desto mindre må hvert laboratorium validere de foreslåtte metodene i henhold til tilgjengelig utstyr. For eksempel krever (trinn 2.7) tilsetning av 100 μL Luciferase-substrat som foreslått av produsenten: dette er optimalt for avlesning av luciferase-analysen med plateleseren som er tilgjengelig for øyeblikket. På den annen side kan andre laboratorier som er utstyrt med en annen plateleser, tilpasse protokollen ved hjelp av forskjellige luciferase-substrater eller volumer av reagenset33. Videre har andre forfattere foreslått bruk av det grønne fluorescerende proteinet (GFP) som et reportergen i stedet for luciferase. Dette kan vurderes hvis et laboratorium er fullt utstyrt for GFP-avlesning, men ikke luciferase34,35.
For å konkludere, PV er et fleksibelt og greit system som gjør det mulig å kvantifisere infeksjonen ved hjelp av en enkel deteksjonsmetode. Det representerer en kostnadseffektiv tilnærming som er mer tilgjengelig for mange forskningsgrupper og gjør det mulig å unngå bruk av patogene virus som krever et biosikkerhetsnivå 3-laboratorium21. Bruken av PV representerer en godt karakterisert og sikker tilnærming til å studere antistoffmediert nøytralisering hos personer som opplevde SARS-CoV-2-infeksjon og / eller vaksinasjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de ikke har noen interessekonflikt.
Acknowledgments
Vi anerkjenner bidraget fra de frivillige helsearbeiderne. Dette prosjektet ble støttet av Department of Excellence 2023/2027, MUR, Italia. AR og DZ ble støttet av PRIN2022 (EU-midler; NextGenerationEU)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.45 μm filter | SARSTEDT | 83 1826 | |
| 6-well plate | SARSTEDT | 83 3920 | |
| 96-well plate | SARSTEDT | 8,33,924 | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units | Merck | 10403892 | |
| Black Opaque 96-well Microplate | Perkin Elmer | 60005270 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | SIGMA-ALDRICH | D6546 - 500ML | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (PBS 1x) | AUROGENE | AU-L0615-500 | |
| Foetal Bovine Serum | AUROGENE | AU-S1810-500 | |
| Graphpad Prism version 7 | graphpad dotmatics | NA | In the manuscript, we replace the commercial name with 'data analysis program' |
| HEK293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| HEK293T/ACE2 cells | ATCC | CRL-3216 | HEK293T has been transduced to overexpress ACE2 with a lentiviral vector. |
| L-glutamine | AUROGENE | AU-X0550-100 | |
| Luminometer - Victor3 | Perkin Elmer | HH35000500 | In the manuscript, we replace the commercial name with 'luminometer' |
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 11058021 | In the manuscript, we replace the commercial name with 'reduced serum medium' |
| p8.91 packaging plasmid | Di Genova et al., 2021 | A kind gift from Prof. Nigel Temperton (ref 16.) | |
| pCSFLW reporter plasmid | Di Genova et al., 2021 | A kind gift from Prof. Nigel Temperton (ref 16.) | |
| Penicillin/streptomycin | AUROGENE | AU-L0022-100 | |
| Polyethylenimine, branched (PEI) (25 kDa) | SIGMA-ALDRICH | 408727 | |
| RRL.sin.cPPT.SFFV/Ace2.IRES-puro.WPRE (MT126) | Addgene | 145839 | This plasmid was used to generate HEK293Tcells/ACE2 |
| SARS-CoV-2 Spike expressing plasmid | Addgene | pGBW-m4137382 | |
| steadylite plus Reporter Gene Assay System | Perkin Elmer | 6066759 | In the manuscript, we replaced the commercial name with 'luciferase reading reagent' |
| Trypsin EDTA 1x | AUROGENE | AU-L0949-100 |
References
- Ozaki, D. A., et al. International technology transfer of a GCLP-compliant HIV-1 neutralizing antibody assay for human clinical trials. Plos One. 7 (1), e30963 (2012).
- Pouget, M., et al. Generation of liposomes to study the effect of Mycobacterium tuberculosis lipids on HIV-1 cis- and trans-infections. International Journal of Molecular Sciences. 22 (4), 1945 (2021).
- McKay, L. G. A., et al. The HCV envelope glycoprotein down-modulates NF-κB signalling and associates with stimulation of the host endoplasmic reticulum stress pathway. Frontiers in Immunology. 13, 831695 (2022).
- Xiang, Q., Li, L., Wu, J., Tian, M., Fu, Y. Application of pseudovirus system in the development of vaccine, antiviral-drugs, and neutralizing antibodies. Microbiological Research. 258, 126993 (2022).
- Li, Q., Liu, Q., Huang, W., Li, X., Wang, Y. Current status on the development of pseudoviruses for enveloped viruses. Reviews in Medical Virology. 28, e1963 (2018).
- D'Apice, L., et al. Comparative analysis of the neutralizing activity against SARS-CoV-2 Wuhan-Hu-1 strain and variants of concern: Performance evaluation of a pseudovirus-based neutralization assay. Frontiers in Immunology. 13, 981693 (2022).
- Falzarano, D., Groseth, A., Hoenen, T. Development and application of reporter-expressing mononegaviruses: current challenges and perspectives. Antiviral Research. 103, 78-87 (2014).
- Gutierrez-Guerrero, A., Cosset, F. -L., Verhoeyen, E. Lentiviral vector pseudotypes: Precious tools to improve gene modification of hematopoietic cells for research and gene therapy. Viruses. 12, 1016 (2020).
- Zufferey, R., Nagy, D., Mandel, R. J., Naldini, L., Trono, D. Multiply attenuated lentiviral vector achieves efficient gene delivery in vivo. Nature Biotechnology. 15 (9), 871-875 (1997).
- Dull, T. A third-generation lentivirus vector with a conditional packaging system. Journal of Virology. 72 (11), 8463-8471 (1998).
- Berkhout, B. A Fourth generation lentiviral Vector: Simplifying genomic gymnastics. Molecular Therapy. 25 (8), 1741-1743 (2017).
- Wu, X. Development and evaluation of a pseudovirus-luciferase assay for rapid and quantitative detection of neutralizing antibodies against Enterovirus 71. Plos One. 8 (6), e64116 (2013).
- Ferrara, F., et al. Development of lentiviral vectors pseudotyped with Influenza B hemagglutinins: application in vaccine immunogenicity, mAb potency, and sero-surveillance studies. Frontiers in Immunology. 12, 661379 (2021).
- Hu, J., et al. Development of cell-based pseudovirus entry assay to identify potential viral entry inhibitors and neutralizing antibodies against SARS-CoV-2. Genes & Diseases. 7 (4), 551-557 (2020).
- Dalle Carbonare, L., et al. Serology study after BTN162b2 vaccination in participants previously infected with SARS-CoV-2 in two different waves versus naïve. Communications Medicine. 1 (1), 38 (2021).
- Di Genova, C., et al. Production, titration, neutralisation, storage and lyophilisation of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) lentiviral pseudotypes. Bio-protocol. 11 (21), e4236 (2021).
- Chmielewska, A. M., Czarnota, A., Bieńkowska-Szewczyk, K., Grzyb, K. Immune response against SARS-CoV-2 variants: The role of neutralization assays. NPJ Vaccines. 6 (1), 1-8 (2021).
- Chen, Q., et al. Development and optimization of a sensitive pseudovirus-based assay for HIV-1 neutralizing antibodies detection using A3R5 cells. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 14 (1), 199-208 (2018).
- Gauger, P. C., Vincent, A. L. Serum virus neutralization assay for detection and quantitation of serum neutralizing antibodies to influenza A virus in swine. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J). 2123, 321-333 (2020).
- Miglietta, R., Pastori, C., Venuti, A., Ochsenbauer, C., Lopalco, L. Synergy in monoclonal antibody neutralization of HIV-1 pseudoviruses and infectious molecular clones. Journal of Translational Medicine. 12 (1), 346 (2014).
- Chen, M., Zhang, X. -E. Construction and applications of SARS-CoV-2 pseudoviruses: A mini review. International Journal of Biological Sciences. 17 (6), 1574-1580 (2021).
- Zipeto, D., et al. Induction of human immunodeficiency virus neutralizing antibodies using fusion complexes. Microbes and Infection. 8 (6), 1424-1433 (2006).
- WHO Coronavirus (COVID-19) Dashboard. , https://covid19.who.int (2022).
- Zhou, P. A pneumonia outbreak associated with a new coronavirus of probable bat origin. Nature. 579 (7798), 270-273 (2020).
- Chen, X., Huang, H., Ju, J., Sun, R., Zhang, J. Impact of vaccination on the COVID-19 pandemic in U.S. states. Scientific Reports. 12 (1), 1554 (2022).
- Stefani, C., Fantoni, T., Bissoli, M., Thomas, J., Ruggiero, A. HIV and SARS-CoV-2 Co-Infection: From Population Study Evidence to In Vitro Studies. Life. 12 (12), 2089 (2022).
- Watson, O. J., et al. Global impact of the first year of COVID-19 vaccination: a mathematical modelling study. The Lancet Infectious Diseases. 22 (9), 1293-1302 (2022).
- Cantoni, D. Analysis of antibody neutralisation activity against SARS-CoV-2 variants and seasonal human coronaviruses NL63, HKU1, and 229E induced by three different COVID-19 vaccine olatforms. Vaccines. 11 (1), 58 (2023).
- Siracusano, G., et al. Different decay of antibody response and VOC sensitivity in naïve and previously infected subjects at 15 weeks following vaccination with BNT162b2. Journal of Translational Medicine. 20 (1), 22 (2022).
- Ruggiero, A. SARS-CoV-2 vaccination elicits unconventional IgM specific responses in naïve and previously COVID-19-infected individuals. eBioMedicine. 77, (2022).
- Piubelli, C. Subjects who developed SARS-CoV-2 specific IgM after vaccination show a longer humoral immunity and a lower frequency of infection. eBioMedicine. 89, 104471 (2023).
- Zhang, G. F. Infectivity of pseudotyped SARS-CoV-2 variants of concern in different human cell types and inhibitory effects of recombinant spike protein and entry-related cellular factors. Journal of Medical Virology. 95 (1), e28437 (2023).
- da Costa, K. A. S. Influenza A (N1-N9) and Influenza B (B/Victoria and B/Yamagata) neuraminidase pseudotypes as tools for pandemic preparedness and improved influenza vaccine design. Vaccines. 10 (9), 1520 (2022).
- Condor Capcha, J. M. Generation of SARS-CoV-2 spike pseudotyped virus for viral entry and neutralization assays: a 1-week protocol. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 7, 618651 (2021).
- Diomede, L., et al. Doxycycline inhibition of a pseudotyped virus transduction does not translate to inhibition of SARS-CoV-2 infectivity. Viruses. 13 (9), 1745 (2021).
