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Immunology and Infection

न्यूट्रलाइजेशन परख के माध्यम से SARS-CoV-2 के खिलाफ हास्य प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं की निगरानी के लिए एक आणविक उपकरण के रूप में छद्म टाइप वायरस

Published: November 21, 2023 doi: 10.3791/65658
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1, 1, 2, 2, 3, 3, 1, 1
1Department of Neuroscience, Biomedicine and Movement, University of Verona, 2Laboratory of Molecular Neurovirology, Faculty of Health Science, University of Brasília, 3Viral Pseudotype Unit, Medway School of Pharmacy, Universities of Kent and Greenwich at Medway
* These authors contributed equally

Summary

स्यूडोटाइप वायरस (पीवी) प्रतिकृति-दोषपूर्ण विषाणु हैं जिनका उपयोग प्रामाणिक वायरस को संभालने की तुलना में सुरक्षित परिस्थितियों में होस्ट-वायरस इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए किया जाता है। यहां प्रस्तुत एक विस्तृत प्रोटोकॉल है जो दिखाता है कि COVID-2 टीकाकरण के बाद रोगियों के सीरम की बेअसर करने की क्षमता का परीक्षण करने के लिए SARS-CoV-19 PVs का उपयोग कैसे किया जा सकता है।

Abstract

स्यूडोटाइप वायरस (पीवी) आणविक उपकरण हैं जिनका उपयोग होस्ट-वायरस इंटरैक्शन का अध्ययन करने और सीरम नमूनों की बेअसर करने की क्षमता का परीक्षण करने के लिए किया जा सकता है, इसके अलावा जीन थेरेपी में उनके बेहतर ज्ञात उपयोग के अलावा ब्याज की जीन की डिलीवरी के लिए। पीवी प्रतिकृति दोषपूर्ण हैं क्योंकि वायरल जीनोम को विभिन्न प्लास्मिड में विभाजित किया जाता है जो पीवी में शामिल नहीं होते हैं। यह सुरक्षित और बहुमुखी प्रणाली जैव सुरक्षा स्तर 2 प्रयोगशालाओं में पीवी के उपयोग की अनुमति देती है। यहां, हम यहां बताए गए तीन प्लास्मिड के आधार पर लेंटिवायरल पीवी का उत्पादन करने के लिए एक सामान्य पद्धति प्रस्तुत करते हैं: (1) संक्रमण की निगरानी के लिए आवश्यक रिपोर्टर जीन को ले जाने वाली रीढ़ की प्लाज्मिड; (2) पीवी उत्पन्न करने के लिए आवश्यक सभी संरचनात्मक प्रोटीन के लिए जीन ले जाने वाली पैकेजिंग प्लाज्मिड; (3) लिफाफा सतह ग्लाइकोप्रोटीन अभिव्यक्ति प्लास्मिड जो वायरस ट्रोपिज्म को निर्धारित करता है और मेजबान सेल में वायरल प्रविष्टि की मध्यस्थता करता है। इस काम में, SARS-CoV-2 स्पाइक गैर-प्रतिकृति SARS-CoV-2 छद्म टाइप लेंटिवायरस के उत्पादन के लिए उपयोग किया जाने वाला लिफाफा ग्लाइकोप्रोटीन है।

संक्षेप में, पैकेजिंग कोशिकाओं (HEK293T) मानक तरीकों का उपयोग कर तीन अलग प्लास्मिड के साथ सह ट्रांसफ़ेक्ट थे. 48 घंटे के बाद, पीवी युक्त सतह पर तैरनेवाला काटा, फ़िल्टर्ड, और -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया गया था. SARS-CoV-2 PVs की संक्रामकता का परीक्षण संक्रमण के बाद 48 घंटे की लक्ष्य सेल लाइन में रिपोर्टर जीन (लूसिफ़ेरेज़) की अभिव्यक्ति का अध्ययन करके किया गया था। सापेक्ष ल्यूमिनेसेंस इकाइयों (आरएलयू) के लिए मूल्य जितना अधिक होगा, संक्रमण/पारगमन दर उतनी ही अधिक होगी। इसके अलावा, संक्रामक पीवी को क्रमिक रूप से पतला सीरम नमूनों में जोड़ा गया था ताकि लक्ष्य कोशिकाओं में स्यूडोवायरस के प्रवेश की न्यूट्रलाइजेशन प्रक्रिया का अध्ययन किया जा सके, जिसे आरएलयू तीव्रता में कमी के रूप में मापा जाता है: उच्च न्यूट्रलाइजिंग गतिविधि के अनुरूप कम मूल्य।

Introduction

स्यूडोटाइप वायरस (पीवी) होस्ट-वायरस और रोगज़नक़-रोगज़नक़ इंटरैक्शन 1,2,3,4का अध्ययन करने के लिए माइक्रोबायोलॉजी में उपयोग किए जाने वाले आणविक उपकरण हैं। पीवी में एक आंतरिक भाग होता है, वायरल कोर जो वायरल जीनोम की रक्षा करता है, और एक बाहरी भाग, वायरस की सतह पर लिफाफा ग्लाइकोप्रोटीन जो ट्रोपिज्म5 को परिभाषित करता है। एक स्यूडोवायरस लक्ष्य सेल में प्रतिकृति-अक्षम है क्योंकि इसमें नए वायरल कणों को उत्पन्न करने के लिए सभी आनुवंशिक जानकारी नहीं होती है। अजीबोगरीब विशेषताओं का यह संयोजन पीवी को वाइल्डटाइप वायरस का एक सुरक्षित विकल्प बनाता है। दूसरी ओर, वाइल्डटाइप वायरस अत्यधिक रोगजनक हैं और विश्लेषणके लिए बीएसएल 2 प्रयोगशालाओं में उपयोग नहीं किए जा सकते हैं।

पीवी की संक्रामकता की निगरानी एक रिपोर्टर जीन द्वारा की जा सकती है, आमतौर पर एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी, आरएफपी, वाईएफपी) या एक एंजाइम के लिए कोडिंग जो केमिलुमिनसेंट उत्पादों (लूसिफ़ेरेज़) का उत्पादन करता है। यह पीवी उत्पादन के लिए उपयोग किए जाने वाले प्लास्मिड में से एक में निहित है और स्यूडोवायरस7 के जीनोम में शामिल है।

वर्तमान में कई प्रकार के पीवी कोर मौजूद हैं, जिनमें एचआईवी -1 जीनोम पर आधारित लेंटिवायरल-व्युत्पन्न कण शामिल हैं। अन्य प्लेटफार्मों पर एचआईवी-1-आधारित पीवी का महान लाभ लक्ष्य सेल जीनोम8 में उनकी आंतरिक एकीकरण प्रक्रिया है। हालांकि एचआईवी -1 एक अत्यधिक संक्रामक वायरस है और एड्स का प्रेरक एजेंट है, ये लेंटिवायरल वैक्टर वर्षों से व्यापक अनुकूलन चरणों के कारण उपयोग करने के लिए सुरक्षित हैं। इष्टतम सुरक्षा की स्थिति 2एनडी-पीढ़ी लेंटिवायरल वैक्टर की शुरूआत के साथ हासिल की गई थी, जिसमें वायरल जीन ट्रांसडक्शन क्षमताओं को प्रभावित किए बिना समाप्त हो गए थे9. 3और 4वीं पीढ़ियों अलग प्लास्मिड10,11 में वायरल जीनोम के आगे विभाजन के साथ lentiviral वेक्टर हैंडलिंग की वृद्धि हुई सुरक्षा में योगदान दिया. पीवी की नवीनतम पीढ़ियों को आमतौर पर जीन थेरेपी के लिए लेंटिवायरल वैक्टर का उत्पादन करने के लिए नियोजित किया जाता है।

पीवी का उपयोग उत्पादन और संक्रमण चरणों दोनों के दौरान वायरस और मेजबान कोशिकाओं के बीच बातचीत का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है। पीवी विशेष रूप से स्यूडोवायरस न्यूट्रलाइजेशन परख (पीवीएनए) में कार्यरत हैं। PVNAs व्यापक रूप से PV लिफाफा12,13 पर वायरल ग्लाइकोप्रोटीन को लक्षित करके सीरम या प्लाज्मा के बेअसर क्षमता का आकलन करने के लिए मान्य हैं. निरोधात्मक एकाग्रता 50 (IC50) के रूप में व्यक्त की गई न्यूट्रलाइजेशन गतिविधि को सीरम / प्लाज्मा के कमजोर पड़ने के रूप में परिभाषित किया गया है जो वायरल कण प्रविष्टि14 के 50% को अवरुद्ध करता है। इस प्रोटोकॉल में, हमने बूस्टर वैक्सीन खुराक प्राप्त करने से पहले और बाद में एकत्र किए गए सीरा में गंभीर तीव्र श्वसन सिंड्रोम - कोरोनावायरस 2 (SARS-CoV-2) के खिलाफ एंटीबॉडी गतिविधि का परीक्षण करने के लिए एक PVNA के सेट-अप का वर्णन किया।

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Protocol

वर्तमान प्रोटोकॉल द्वारा अनुमोदित किया गया है और वेरोना विश्वविद्यालय (अनुमोदन प्रोटोकॉल संख्या 1538) की नैतिक समिति के दिशानिर्देशों का पालन करता है। अध्ययन में भाग लेने वाले मानव विषयों से सूचित लिखित सहमति प्राप्त की गई थी। पूरे रक्त के नमूने स्वास्थ्य कार्यकर्ता (एचसीडब्ल्यू) स्वयंसेवकों से एकत्र किए गए थे जो SARS-CoV-2 विरोधी टीके प्राप्त करने की प्रक्रिया में थे। इन नमूनों सीरम15 के बाद अलगाव के लिए anticoagulants युक्त प्लास्टिक ट्यूबों में एकत्र किए गए थे.

निम्नलिखित सभी प्रक्रियाओं को कक्षा -2 जैविक हुड में किया जाना चाहिए, जो बाँझ परिस्थितियों में काम कर रहा है। वायरस से निपटने को देखभाल के साथ किया जाना चाहिए, और सभी अपशिष्ट उत्पादों को पतला ब्लीच समाधान में बेअसर किया जाना चाहिए। प्रोटोकॉल का अवलोकन चित्र 1 में प्रदर्शित किया गया है।

Figure 1
चित्रा 1: एक तटस्थता परख का चित्रमय प्रतिनिधित्व। (ए) पीवी उत्पादन, (बी) पीवी अनुमापन, और (सी) तटस्थता परख। सभी प्रक्रियाओं बाँझ शर्तों के तहत एक वर्ग -2 जैविक हुड में प्रदर्शन कर रहे हैं. न्यूट्रलाइजेशन परख (सी) में उपयोग करने से पहले पीवी के संक्रामकता स्तर को मानकीकृत करने के लिए अनुमापन चरण (बी) को करने की आवश्यकता है। यह आंकड़ा BioRender के साथ बनाया गया था। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

1. SARS-CoV-2 PVs उत्पादन और संक्रामकता परीक्षण

  1. बीज 5 x 105 HEK293T पूर्ण Dulbecco संशोधित ईगल माध्यम में कोशिकाओं (DMEM, उच्च ग्लूकोज, 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), 1% एल ग्लूटामाइन, 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन) एक 6 अच्छी तरह से प्लेट (6WP) में एक उपयुक्त सेल घनत्व तक पहुँचने के लिए इस्तेमाल किया अभिकर्मक अभिकर्मक के साथ संगत करने के लिए. polyehtylenimine (पीईआई) (निर्माता के निर्देशों के बाद अभिकर्मक तैयार) के साथ अभिकर्मक प्रदर्शन के मामले में, सुनिश्चित करें कि कोशिकाओं अभिकर्मक (1.3 कदम) के दिन पर 40-60% घनत्व तक पहुँचने. कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर एक आर्द्र इनक्यूबेटर में रखें।
  2. अभिकर्मक से पहले, उच्च अभिकर्मक दक्षता प्राप्त करने के लिए एंटीबायोटिक दवाओं (डीएमईएम, उच्च ग्लूकोज, 10% एफबीएस, 1% एल-ग्लूटामाइन) के बिना ताजा माध्यम के साथ खर्च सेल माध्यम को बदलें।
    नोट: बीजारोपण के बाद दिन, HEK293T कोशिकाओं को ट्रांसफ़ेक्ट करने के लिए तैयार हैं।
  3. निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक उपयुक्त अभिकर्मक अभिकर्मक के साथ ट्रांसफेक्ट HEK293T कोशिकाओं। यदि पीईआई का उपयोग कर रहे हैं, तो दो मिक्स तैयार करें और नीचे दिए गए चरणों का पालन करें।
    1. मिश्रण ए तैयार करने के लिए, pCMV-dR8.91 पैकेजिंग प्लाज्मिड16 के 500 एनजी, pCSFLW रिपोर्टर प्लाज्मिड16 के 750 एनजी, और SARS-CoV-2 स्पाइक के 450 एनजी कम सीरम माध्यम के 100 माइक्रोन में प्लाज्मिड व्यक्त करते हैं।
    2. मिक्स बी तैयार करने के लिए, पीईआई के 17.5 माइक्रोन (एकाग्रता: 1 मिलीग्राम/एमएल) को कम सीरम माध्यम के 100 माइक्रोन में जोड़ें।
    3. दोनों घोला जा सकता है 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान (आरटी) पर सेते हैं. अगला, डीएनए मिश्रण ए के लिए पीईआई मिश्रण बी जोड़कर दोनों ट्यूबों की सामग्री को एक साथ मिलाएं।
    4. आरटी पर 20-30 मिनट के लिए ट्यूब सेते हैं. मिश्रण को बढ़ाने के लिए ट्यूब धीरे हर 3-4 मिनट झटका. अंत में, मिश्रण को HEK293T कोशिकाओं में जोड़ें।
  4. अभिकर्मक के बाद 16-20 घंटे, ताजा, पूर्ण डीएमईएम के साथ संस्कृति माध्यम को बदलें। ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं द्वारा पीवी के उत्पादन की अनुमति देने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर इनक्यूबेट करें।
  5. अभिकर्मक के बाद 72 घंटे, पीवी युक्त सतह पर तैरनेवाला फसल. फिर सेल मलबे और मृत कोशिकाओं को हटाने और 0.45 माइक्रोन सेलूलोज़ एसीटेट फिल्टर के माध्यम से फ़िल्टर करने के लिए कमरे के तापमान पर 7 मिन के लिए 1600 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र।
  6. वैकल्पिक कदम: पीवी टिटर की अंतिम उपज बढ़ाने के लिए, कई अभिकर्मक प्रदर्शन करें, पीवी युक्त सेल मीडिया को पूल करें, और ध्यान केंद्रित ट्यूबों का उपयोग करके इसे केंद्रित करें।
  7. अगले चरणों ("पीवी अनुमापन", धारा 2) के साथ सीधे आगे बढ़ें या उपयोग होने तक -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करने के लिए उपयुक्त ट्यूबों में पीवी युक्त माध्यम को विभाज्य करें। अनुमापन के लिए इस्तेमाल किया जा करने के लिए एक अतिरिक्त विभाज्य (400-500 माइक्रोन) तैयार करें.
    नोट: कई aliquots बनाने अत्यधिक पिघलना फ्रीज चक्र से बचने के द्वारा प्रयोगों के बीच प्रजनन क्षमता की गारंटी देगा.

2. पीवी अनुमापन

  1. अगले चरणों के लिए ताजा पीवी युक्त माध्यम का उपयोग करें या नए वायरल स्टॉक के अनुमापन प्रदर्शन करने के लिए परीक्षण विभाज्य (चरण 1.7) पिघलना. एक ही पीवी स्टॉक के फ्रीजिंग एलिकोट प्रजनन क्षमता की गारंटी देंगे।
  2. पीवी स्टॉक को डुप्लिकेट करने के लिए आवश्यक 96 अच्छी तरह से प्लेट (96WP) के सभी कुओं में पूर्ण DMEM (या उपयोग में लक्ष्य सेल लाइन के साथ संगत पूर्ण माध्यम) के 50 माइक्रोन जोड़ें, पंक्ति "ए" खाली छोड़कर। पंक्ति "ए" में पीवी स्टॉक के 100 माइक्रोन जोड़ें। परीक्षण की जाने वाली तैयारियों की संख्या के आधार पर, वायरस के बिना एक कॉलम को "केवल सेल" नियंत्रण (चित्रा 2) के रूप में छोड़ दें।
  3. पंक्ति ए से पंक्ति बी तक पिपेट 50 माइक्रोन और प्रारंभिक स्टॉक के धारावाहिक कमजोर पड़ने को प्राप्त करने के लिए पंक्ति जी तक इस प्रक्रिया को दोहराएं। अंतिम पंक्ति से अतिरिक्त मात्रा को त्यागें।
  4. DPBS 1x के साथ खर्च किए गए माध्यम और धुलाई कोशिकाओं को दो बार हटाने के बाद, Dulbecco के फॉस्फेट बफर खारा 1x (DPBS 1x) में ट्रिप्सिन/एथिलीनमाइनेटेट्राएसेटिक एसिड 1x (EDTA) का उपयोग करके कोशिकाओं को अलग करें। कोशिकाओं को 4 x 105 कोशिकाओं/एमएल के घनत्व के लिए तैयार करें।
    नोट: इस प्रोटोकॉल में, पीवी संक्रमण अतिसंवेदनशील सेल लाइन HEK293T/एसीई 2 पर परीक्षण किया गया था; ऐसी कोशिकाओं को HEK293T से प्राप्त किया गया था, जो ACE2 रिसेप्टर को व्यक्त करने के लिए लेंटिवायरल वेक्टर का उपयोग करके ट्रांसड्यूस किया गया था।
  5. अच्छी तरह से प्रति 2 x 104 कोशिकाओं की सेल गिनती सुनिश्चित करने के लिए प्रत्येक अच्छी तरह से सेल निलंबन के 50 माइक्रोन जोड़ें।
  6. 48 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर इनक्यूबेट करें।
  7. इनक्यूबेशन के बाद, निर्माता के निर्देशों के अनुसार रीडिंग प्राप्त करने के लिए लूसिफ़ेरेज़ परख करें। कुओं में लूसिफ़ेरेज़ अभिकर्मक के 100 माइक्रोन जोड़ें और 2 मिन के लिए आरटी पर अंधेरे में इनक्यूबेट करें। एक काले 96 अच्छी तरह से थाली (उपलब्ध प्लेट रीडर के साथ संगत) के लिए प्रत्येक अच्छी तरह से की सामग्री ले जाएँ और एक 96 अच्छी तरह से थाली पाठक में प्लेटों को पढ़ें.
    नोट: लूसिफ़ेरेज़ रीडआउट के लिए उपयोग किया जाने वाला ल्यूमिनोमीटर कच्चे, असंसाधित डेटा के साथ एक स्प्रेडशीट फ़ाइल का उत्पादन करेगा जिसका उपयोग डाउनस्ट्रीम विश्लेषण (इस मामले में, एक एक्सेल फ़ाइल) के लिए किया जाएगा। वायरस की संक्रामकता को सापेक्ष ल्यूमिनेसेंस इकाइयों (आरएलयू) (पैराग्राफ 4.1 में वर्णित) के रूप में व्यक्त किया जाएगा।

Figure 2
चित्रा 2: पीवी अनुमापन के लिए 96 अच्छी तरह से प्लेट का प्रतिनिधि लेआउट। पीवी युक्त सतह पर तैरनेवाला की एक निश्चित मात्रा पंक्ति ए, कॉलम 1-11, और क्रमिक रूप से पतला करने के लिए जोड़ा जाता है. अंतिम स्तंभ "केवल कक्ष" नियंत्रण के रूप में छोड़ा गया है. यह आंकड़ा BioRender के साथ बनाया गया था। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

3. न्यूट्रलाइजेशन परख

  1. बर्फ पर मरीजों का सीरा पिघलाएं। सीरम नमूनों को 30 मिनट के लिए 56 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करके निष्क्रिय करें।
  2. एक 96 अच्छी तरह से थाली में, ताजा, पूरा DMEM (या लक्ष्य सेल लाइन के साथ संगत पूरा माध्यम) के 50 माइक्रोन निम्नलिखित कुओं में से प्रत्येक में: पंक्ति बी (कॉलम 1-10) से पंक्ति एच (कॉलम 1-10) तक. पंक्ति ए (कॉलम 1-10) में ताजा, पूर्ण डीएमईएम के 95 माइक्रोन रखो। क्रमशः कॉलम 11 और 12 के कुओं में पूर्ण डीएमईएम के 50 माइक्रोन और 100 माइक्रोन जोड़ें। ये संक्रमित (वायरस नियंत्रण, या वीसी) और असंक्रमित (केवल सेल, या सीसी) नियंत्रण, क्रमशः (चित्रा 3) होंगे।
  3. पंक्ति ए (कॉलम 1-10) में गर्मी-निष्क्रिय सीरम/प्लाज्मा नमूनों के 5 माइक्रोन जोड़ें। प्रत्येक नमूना दो प्रतियों में होगा। एक multichannel विंदुक के साथ, पहली पंक्ति में नमूने मिश्रण और पंक्ति एक से पंक्ति बी के लिए सीरम युक्त माध्यम के 50 माइक्रोन ले जाने अंतिम पंक्ति (चित्रा 3) तक इस प्रक्रिया को दोहराएँ. शेष 50 माइक्रोन त्यागें।
  4. पीवी के एलिकोट की आवश्यक संख्या को पिघलाएं और 104 आरएलयू / एमएल ≥ पतला करें। पतला पीवी युक्त माध्यम के 50 माइक्रोन को प्रत्येक अच्छी तरह से (कॉलम 1 से कॉलम 11 तक) का उपयोग करके वायरस को गर्मी निष्क्रिय सीरम / प्लाज्मा के 1:1 कमजोर पड़ने तक पहुंचने के लिए जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर इनक्यूबेट करें, 1 घंटे के लिए सीरम नमूनों में एंटीबॉडी को पीवी पर SARS-CoV-2 स्पाइक प्रोटीन से बांधने की अनुमति देने के लिए।
  5. 4 x 105 कोशिकाओं/एमएल के सेल घनत्व पर अतिसंवेदनशील कोशिकाओं (HEK293T/ACE2) के कम से कम 5 एमएल निलंबन तैयार करें। प्रत्येक अच्छी तरह से सेल निलंबन के 50 माइक्रोन जोड़ें और 48 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर सेते हैं।
  6. इनक्यूबेशन के बाद, निर्माता के निर्देशों के अनुसार लूसिफ़ेरेज़ परख पढ़ने का प्रदर्शन करें, जैसा कि चरण 2.7 में वर्णित है।
    नोट: लूसिफ़ेरेज़ रीडआउट के लिए उपयोग किया जाने वाला ल्यूमिनोमीटर कच्चे, असंसाधित डेटा के साथ एक स्प्रेडशीट फ़ाइल (इस मामले में, .xlsx) का उत्पादन करेगा जिसका उपयोग डाउनस्ट्रीम विश्लेषण (लूसिफ़ेरेज़ परख फ़ाइल) के लिए किया जाएगा।

Figure 3
चित्रा 3: सीरम कमजोर पड़ने के आधार पर प्लेट प्रतिनिधित्व। चमकीला लाल सीरम की एक उच्च मात्रा से मेल खाती है, और उज्ज्वल नीले रंग की लेन (स्तंभ 11) संक्रमित सेल नियंत्रण (कुलपति, वायरस नियंत्रण) से मेल खाती है. हल्के नीले रंग की लेन (स्तंभ 12) असंक्रमित कोशिकाओं (सीसी, सेल नियंत्रण) से मेल खाती है. यह आंकड़ा BioRender के साथ बनाया गया था। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

4. अनुमापन विश्लेषण

  1. लूसिफ़ेरेज़ परख फ़ाइल पर, संबंधित नमूनों को नाम/शीर्षक निर्दिष्ट करें।
  2. आरएलयू माप को कमजोर पड़ने वाले कारकों (ग्रिड के ऊपर से नीचे: 20x, 40x, 80x, 160x, 320x, 640x, 1,280x, 2,560x) से गुणा करें आरएलयू / एमएल प्राप्त करने के लिए। यदि विभिन्न कमजोर पड़ने वाले कारकों का उपयोग किया जाता है, तो तदनुसार गुणन कारकों को बदलें।
  3. प्रत्येक पीवी तैयारी के लिए औसत आरएलयू /

5. पीवी तटस्थीकरण परख विश्लेषण

  1. लूसिफ़ेरेज़ परख स्प्रेडशीट फ़ाइल पर (इस मामले में, .xlsx), परीक्षण किए गए नमूनों को संबंधित शीर्षक असाइन करें। नमूने का कमजोर पड़ने वाला कारक दर्ज करें (40s, 80x, 160x, 320x, 640x, 1,280x, 2,560x, 5,120x)। कमजोर पड़ने वाले कारकों के Log10 की गणना करें।
  2. असंक्रमित और संक्रमित नियंत्रण के औसत आरएलयू की गणना करें (चित्र 3, कॉलम 11 और 12, क्रमशः)। ये मान चरण 5.5 में सामान्यीकरण के लिए उपयोगी होंगे।
  3. डेटा विश्लेषण के लिए कोई नया दस्तावेज़ खोलें. X/Y विश्लेषण का चयन करें, X को संख्याओं के रूप में इनपुट करें और Y को Enter 2 के रूप में साथ-साथ उप-स्तंभों में मानों को दोहराएं।
  4. Log10 (कमजोर पड़ने) मानों को X संख्याओं के रूप में दर्ज करें। नमूनों का डुप्लिकेट आरएलयू दर्ज करें।
  5. विश्लेषण > सामान्यीकरण > एक ही शीट पर सभी नमूनों को ध्वजांकित करने के लिए जाएं। औसत वीसी और सीसी मूल्यों को इनपुट करें 0% कैसे परिभाषित किया जाता है?, और 100% कैसे परिभाषित किया जाता है?, क्रमशः। ओके पर क्लिक करें।
  6. सामान्यीकृत डेटा शीट पर, विश्लेषण > XY विश्लेषण > नॉनलाइनियर विश्लेषण (वक्र फिट) पर जाएं। सभी नमूनों को ध्वजांकित करें और ठीक क्लिक करें. खुराक-प्रतिक्रिया - निषेध के लिए, लॉग (अवरोधक) बनाम सामान्यीकृत प्रतिक्रिया - चर ढलान का चयन करें।
  7. Consstrain के अंतर्गत, HillSlope को 0 से कम होना चाहिए में बदलें.
  8. आउटपुट के अंतर्गत, सारांश तालिका और ग्राफ़ बनाएँ ध्वजांकित करें. अंतिम विश्लेषण प्राप्त करने के लिए ओके पर क्लिक करें। विश्लेषण के लिए एक टेम्पलेट के साथ एक कार्य पत्रक पूरक फ़ाइल 1 में प्रदान किया गया है।

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Representative Results

यह प्रोटोकॉल SARS-CoV-2 PVs के उत्पादन और इन PVs के डाउनस्ट्रीम एप्लिकेशन का वर्णन करता है ताकि एंटी-COVID-19 टीकाकरण प्राप्त करने वाले विषयों के सीरम/प्लाज्मा की न्यूट्रलाइजेशन गतिविधि का विश्लेषण किया जा सके17. इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल को बेअसर प्रतिक्रिया के विकास का परीक्षण करने के लिए प्रत्येक SARS-CoV-2 वैरिएंट ऑफ कंसर्न (VOC) के छद्म प्रकारों का उत्पादन करने के लिए लागू किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल के बावजूद COVID-19 टीकाकरण के बाद हास्य प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के अध्ययन की सुविधा, यह आसानी से विभिन्न वायरस 13,18,19 के खिलाफ विभिन्न सीरा/प्लाज्मा के बेअसर परीक्षण करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है.

चित्रा 4 ए आरएलयू सिग्नल की वृद्धि के अनुरूप सीरम (लॉग (कमजोर पड़ने)) के कमजोर पड़ने की वृद्धि का प्रतिनिधित्व करता है। इस प्रकार, नमूना के कमजोर पड़ने जितना अधिक होगा, वायरस प्रविष्टि उतनी ही कम अवरुद्ध होगी (चित्र 4A)। यह आगे तटस्थता (चित्रा 4 बी) के प्रतिशत के रूप में व्यक्त किया गया है।

IC50 परिणाम समय के साथ एकल वैक्सीन सीरम की न्यूट्रलाइजेशन क्षमता को दर्शाता है। चित्रा 4 सी में रिपोर्ट किए गए उदाहरण में, विषय ने टीकाकरण के चार सप्ताह बाद वायरस के खिलाफ एक मजबूत हास्य गतिविधि विकसित की; हालांकि, 16 सप्ताह के बाद IC50 वैक्सीन प्रशासन से पहले के समान है। इस मामले में, पीवीएनए ने समय के साथ न्यूट्रलाइजेशन क्षमता का नुकसान दिखाया।

Figure 4
चित्रा 4: पीवीएनए के प्रतिनिधि परिणाम। (ए) संक्रामकता (आरएलयू, और (बी) तटस्थता का प्रतिशत सप्ताह 0 (डब्ल्यू 0, टीकाकरण से पहले) में दिखाया गया है; W4 (टीकाकरण के चार सप्ताह बाद); W16 (W0 के सोलह सप्ताह बाद)। (सी) एक ही समय बिंदुओं पर IC50 मान। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक फ़ाइल 1: न्यूट्रलाइज़ेशन विश्लेषण टेम्पलेट। न्यूट्रलाइजेशन विश्लेषण करने के लिए टेम्पलेट के साथ एक वर्किंग शीट। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

हालांकि एक वाइल्डटाइप वायरस का उपयोग वास्तविक संक्रमण का अनुकरण करता है, लेंटिवायरल पीवी रोगजनक वायरस 4,20,21के साथ काम करने के लिए आवश्यक सख्त सुरक्षा आवश्यकताओं के बिना वायरल प्रविष्टि और संक्रमण से जुड़े तंत्र का अध्ययन करने का एक सुरक्षित विकल्प है। पीवी एक प्रतिकृति-दोषपूर्ण वायरल कोर से बना होता है जो एक रोगजनक वायरस की सतह लिफाफा ग्लाइकोप्रोटीन से घिरा होता है जो अध्ययन का उद्देश्य है।

एचआईवी-1-आधारित पीवी सबसे व्यापक रूप से उपयोग किए जाने वाले प्लेटफार्मों में से एक हैं और इन्हें SARS-CoV-2 छद्म वायरल कणों के उत्पादन के लिए इस प्रोटोकॉल में नियोजित किया गया है। पीवी के उपयोग के अनुसार रिपोर्टर जीन अलग हो सकता है; इस मामले में, लूसिफ़ेरेज़ रिपोर्टर जीन की पसंद उत्पादित पीवी की संक्रामकता का एक आसान, तेज़ और संवेदनशील रीडआउट प्रदान करती है।

लेंटिवायरस पर आधारित पीवी व्यापक रूप से एंटी-एचआईवी-1 हास्य प्रतिक्रिया22 का अध्ययन करने के लिए लागू होते हैं। PV तकनीक को हाल ही में COVID-19 महामारी के दौरान तुरंत लागू किया गया था, जो SARS-CoV-2 के कारण हुआ था। SARS-CoV-2 एक अत्यधिक रोगजनक मानव बीटाकोरोनावायरस है, जिसे चीन (वू हान) में पहली बार पहचाना गया है, जो तेजी से महामारी बन गया, जिससे दुनिया भर में 6 मिलियन से अधिक मौतें23,24 हो गईं। वैक्सीन रणनीतियों के सत्यापन के कारण, महामारी को काफी हद तक नियंत्रित किया गया है; फिर भी, अधिकांश कमजोर लोगों में, जैसे कैंसर रोगी या एचआईवी के साथ रहने वाले लोग, यह अभी भी 25,26,27 का खतरा पैदा करता है। इस संदर्भ में, गतिविधि को बेअसर करने के संदर्भ में टीका-विरोधी हास्य प्रतिक्रिया की निगरानी के लिए अभी भी मान्य परख की आवश्यकता है। इस लेख में हमने एक सरल प्रोटोकॉल का वर्णन किया है जिसे आसानी से प्रयोगशालाओं में श्रेणी -3 रोकथाम तक पहुंच के साथ किया जा सकता है। इसके अलावा, पीवी प्लेटफॉर्म विभिन्न SARS-COV-2 वायरस वेरिएंट का अध्ययन करने के लिए एक बहुमुखी प्रणाली है। दरअसल, विभिन्न स्पाइक्स के साथ लिफाफा-व्यक्त प्लाज्मिड को बदलकर, SARS-CoV-2 नए वेरिएंट या किसी अन्य कोरोनविर्यूज़28 के पीवी उत्पन्न करना संभव है। इन वायरस पोर्टफोलियो का उपयोग चिंता के विभिन्न प्रकारों के खिलाफ वैक्सीन-प्रेरित हास्य प्रतिक्रिया की प्रतिक्रियाशीलता का आकलन करने के लिए किया जा सकता है 15,29,30,31,32. यह जानकारी नए और अधिक प्रभावी टीकों की पीढ़ी का मार्गदर्शन कर सकती है।

अभिकर्मक स्थितियों, अनुमापन विफलता और/या बेअसर परख से संबंधित इस प्रोटोकॉल का पालन करते समय तीन प्रमुख बाधाओं का सामना करना पड़ सकता है। सबसे पहले, पैकेजिंग कोशिकाओं अभिकर्मक के समय पर्याप्त रूप से संगम नहीं हो सकता है. यह पोषक तत्वों की कमी के कारण हो सकता है। सुनिश्चित करें कि चरण 1.1. ठीक से पालन किया जाता है। अन्यथा, अभिकर्मक से पहले दिन की सुबह में बोने प्रदर्शन और विकास के समय को बढ़ाने के लिए अगले दिन बाद पैकेजिंग कोशिकाओं transfect. एक आवर्ती समस्या अगले दिन अभिकर्मक और मध्यम प्रतिस्थापन के बीच सेल माध्यम के संभावित संदूषण है. इस मामले में, BSL2 हुड के तहत काम करते समय उपयोग करने से पहले नसबंदी प्रक्रिया को बढ़ाकर प्रक्रिया को दोहराएं या अवांछित संदूषण से बचने के लिए एंटीबायोटिक्स शामिल करें। दूसरा, एक ज्ञात लूसिफ़ेरेज़ सिग्नल हो सकता है जिसे पीवी उत्पादन के विभिन्न चरणों या लक्ष्य सेल लाइन की विशेषताओं के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है। प्लास्मिड को एंडोटॉक्सिन मुक्त किट के साथ निकाला जाना चाहिए। अभिकर्मक कदम प्रोटोकॉल के परिणाम के लिए महत्वपूर्ण है. पीईआई अभिकर्मक को 1 मिलीग्राम / एमएल की सही एकाग्रता पर तैयार किया जाना चाहिए। धीरे अभिकर्मक घोला जा सकता है की तैयारी के दौरान ट्यूब flicking डीएनए पीईआई परिसरों के गठन को बढ़ाता है. यह सत्यापित करने के लिए कि कोशिकाओं को सही ढंग से ट्रांसफ़ेक्ट किया गया है, कोशिकाओं की कटाई के तुरंत बाद लूसिफ़ेरेज़ परख करने की सिफारिश की जाती है। इसके अलावा, एक नियंत्रण वायरस लिफाफा ग्लाइकोप्रोटीन जैसे वीएसवी शामिल करें: वीएसवी-पीवी मानव सेल लाइनों पर मजबूत आरएलयू संकेत देते हैं। इसके अलावा, यह उल्लेख करना आवश्यक है कि लक्ष्य सेल लाइन को रिसेप्टर को व्यक्त करना चाहिए, जिसे पश्चिमी धब्बा या प्रवाह साइटोमेट्री के माध्यम से आसानी से सत्यापित किया जाता है।

इस विधि को पहले प्रयोगात्मक स्थितियों के संबंध में16 अनुकूलित किया गया है, जिसमें अभिकर्मक अभिकर्मक का चयन, पीवी की पीढ़ी के लिए आवश्यक विभिन्न प्लास्मिड के बीच अनुपात का निर्धारण, और लक्ष्य सेल लाइनों का चयन, रिपोर्टर जीन के रूप में लूसिफ़ेरेज़ का उपयोग शामिल है। बहरहाल, प्रत्येक प्रयोगशाला को उपलब्ध उपकरणों के अनुसार प्रस्तावित विधियों को मान्य करने की आवश्यकता होगी। उदाहरण के लिए, (चरण 2.7) के रूप में निर्माता द्वारा सुझाव दिया लूसिफ़ेरेज़ सब्सट्रेट के 100 माइक्रोन के अतिरिक्त की आवश्यकता है: यह वर्तमान में उपलब्ध प्लेट रीडर के साथ लूसिफ़ेरेज़ परख के रीडआउट के लिए इष्टतम है। दूसरी ओर, एक अलग प्लेट रीडर से लैस हैं कि अन्य प्रयोगशालाओं विभिन्न लूसिफ़ेरेज़ सब्सट्रेट या अभिकर्मक33 की मात्रा का उपयोग प्रोटोकॉल अनुकूलित कर सकते हैं. इसके अलावा, अन्य लेखकों ने लूसिफ़ेरेज़ के बजाय एक रिपोर्टर जीन के रूप में ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) के उपयोग का प्रस्ताव दिया है। यह माना जा सकता है अगर एक प्रयोगशाला पूरी तरह से GFP readout के लिए सुसज्जित है, लेकिन नहीं luciferase34,35.

निष्कर्ष निकालने के लिए, पीवी एक लचीली और सीधी प्रणाली है जो एक सरल पहचान विधि का उपयोग करके संक्रमण को निर्धारित करने की अनुमति देती है। यह एक लागत प्रभावी दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व करता है जो कई शोध समूहों के लिए अधिक सुलभ है और रोगजनक वायरस के उपयोग से बचने की अनुमति देता है जिसके लिए जैव सुरक्षा स्तर 3 प्रयोगशाला21 की आवश्यकता होती है। PVs का उपयोग SARS-CoV-2 संक्रमण और/या टीकाकरण का अनुभव करने वाले व्यक्तियों में एंटीबॉडी-मध्यस्थता तटस्थता का अध्ययन करने के लिए एक अच्छी तरह से विशेषता और सुरक्षित दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व करता है।

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Disclosures

लेखकों ने हितों का कोई टकराव नहीं होने की घोषणा की है।

Acknowledgments

हम स्वास्थ्य देखभाल कार्यकर्ताओं, स्वयंसेवकों के योगदान को स्वीकार करते हैं। इस परियोजना को उत्कृष्टता विभाग 2023/2027, एमयूआर, इटली द्वारा समर्थित किया गया था। एआर और डीजेड को PRIN2022 (ईयू फंडिंग; नेक्स्टजेनरेशनईयू)

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.45 μm filter SARSTEDT 83 1826
6-well plate SARSTEDT 83 3920
96-well plate SARSTEDT 8,33,924
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units Merck 10403892
Black Opaque 96-well Microplate Perkin Elmer 60005270
Dulbecco's Modified Eagle Medium  SIGMA-ALDRICH D6546 - 500ML
Dulbecco's phosphate buffered saline (PBS 1x) AUROGENE AU-L0615-500
Foetal Bovine Serum AUROGENE AU-S1810-500
Graphpad Prism version 7 graphpad dotmatics NA In the manuscript, we replace the commercial name with 'data analysis program'
HEK293T cells ATCC CRL-3216
HEK293T/ACE2 cells ATCC CRL-3216 HEK293T has been transduced to overexpress ACE2 with a lentiviral vector.
L-glutamine  AUROGENE AU-X0550-100
Luminometer - Victor3 Perkin Elmer HH35000500 In the manuscript, we replace the commercial name with  'luminometer' 
Opti-MEM Thermo Fisher Scientific 11058021 In the manuscript, we replace the commercial name with 'reduced serum medium' 
p8.91 packaging plasmid Di Genova et al., 2021 A kind gift from Prof. Nigel Temperton (ref 16.)
pCSFLW reporter plasmid Di Genova et al., 2021 A kind gift from Prof. Nigel Temperton (ref 16.)
Penicillin/streptomycin AUROGENE AU-L0022-100
Polyethylenimine, branched (PEI) (25 kDa) SIGMA-ALDRICH 408727
RRL.sin.cPPT.SFFV/Ace2.IRES-puro.WPRE (MT126) Addgene 145839 This plasmid was used to generate HEK293Tcells/ACE2
SARS-CoV-2 Spike expressing plasmid Addgene pGBW-m4137382
steadylite plus Reporter Gene Assay System Perkin Elmer 6066759 In the manuscript, we replaced the commercial name with 'luciferase reading reagent'
Trypsin EDTA 1x AUROGENE AU-L0949-100

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न्यूट्रलाइजेशन परख के माध्यम से SARS-CoV-2 के खिलाफ हास्य प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं की निगरानी के लिए एक आणविक उपकरण के रूप में छद्म टाइप वायरस
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Fantoni, T., Bissoli, M., Stefani, C., Voi, M., Dabija, A., Casula, R., Minafra, D. L., da Fonseca Palmeira, J., Argañaraz, E. R., Mayora-Neto, M., Temperton, N. J., Zipeto, D., Ruggiero, A. Pseudotyped Viruses As a Molecular Tool to Monitor Humoral Immune Responses Against SARS-CoV-2 Via Neutralization Assay. J. Vis. Exp. (201), e65658, doi:10.3791/65658 (2023).

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