Summary
Pseudotypede vira (PV'er) er replikationsdefekte virioner, der bruges til at studere værtsvirusinteraktioner under sikrere forhold end håndtering af autentiske vira. Her præsenteres en detaljeret protokol, der viser, hvordan SARS-CoV-2 PV'er kan bruges til at teste den neutraliserende evne hos patienters serum efter COVID-19-vaccination.
Abstract
Pseudotypede vira (PV'er) er molekylære værktøjer, der kan bruges til at studere værtsvirusinteraktioner og til at teste serumprøvers neutraliserende evne ud over deres bedre kendte anvendelse i genterapi til levering af et gen af interesse. PV'er er replikationsdefekte, fordi det virale genom er opdelt i forskellige plasmider, der ikke er inkorporeret i PV'erne. Dette sikre og alsidige system tillader brug af solceller i laboratorier med biosikkerhedsniveau 2. Her præsenterer vi en generel metode til fremstilling af lentivirale PV'er baseret på tre plasmider som nævnt her: (1) rygradsplasmidet, der bærer reportergenet, der er nødvendigt for at overvåge infektionen; 2) emballageplasmidet, der bærer generne for alle de strukturelle proteiner, der er nødvendige for at generere solcellerne (3) kuvertoverfladen glycoproteinekspressionsplasmid, der bestemmer virustropisme og medierer viral indgang i værtscellen. I dette arbejde er SARS-CoV-2 Spike det kuvertglycoprotein, der anvendes til produktion af ikke-replikative SARS-CoV-2 pseudotypede lentivirus.
Kort fortalt blev emballeringsceller (HEK293T) co-transfekteret med de tre forskellige plasmider ved hjælp af standardmetoder. Efter 48 timer blev supernatanten indeholdende PV'erne høstet, filtreret og opbevaret ved -80 °C. Infektiviteten af SARS-CoV-2 PV'er blev testet ved at studere ekspressionen af reportergenet (luciferase) i en målcellelinje 48 timer efter infektion. Jo højere værdien for relative luminescensenheder (RLU'er), jo højere er infektions-/transduktionshastigheden. Desuden blev de infektiøse PV'er tilsat til de serielt fortyndede serumprøver for at studere neutraliseringsprocessen for pseudovirus' indtræden i målceller, målt som reduktionen i RLU-intensitet: lavere værdier svarende til høj neutraliserende aktivitet.
Introduction
Pseudotypede vira (PV'er) er molekylære værktøjer, der anvendes i mikrobiologi til at studere værtsvirus og patogen-patogeninteraktioner 1,2,3,4. PV'er består af en indre del, den virale kerne, der beskytter det virale genom, og en ydre del, kuvertglycoproteinerne på overfladen af virussen, der definerer tropismen5. Et pseudovirus er replikationsinkompetent i målcellen, fordi det ikke indeholder al den genetiske information til at generere nye virale partikler. Denne kombination af ejendommelige funktioner gør PV'er til et sikkert alternativ til en vildtypevirus. Vildtypevirus er derimod højpatogene og kan ikke anvendes i BSL 2-laboratorier til analyse6.
Infektiviteten af PV'er kan overvåges af et reportergen, der normalt koder for et fluorescerende protein (GFP, RFP, YFP) eller et enzym, der producerer kemiluminescerende produkter (luciferase). Dette er indeholdt i et af plasmiderne, der anvendes til PV-produktion og inkorporeret i pseudovirusets genom7.
Der findes i øjeblikket flere typer PV-kerner, herunder lentivirale afledte partikler baseret på HIV-1-genomet. Den store fordel ved HIV-1-baserede solceller i forhold til andre platforme er deres iboende integrationsproces i målcellegenomet8. Selvom HIV-1 er en meget smitsom virus og er årsagsmidlet til aids, er disse lentivirale vektorer sikre at bruge på grund af de omfattende optimeringstrin gennem årene. Optimale sikkerhedsforhold blev opnået med introduktionen af 2. generations lentivirale vektorer, hvor virale gener blev udtømt uden at påvirke transduktionsevnen9. 3. og 4. generation bidrog til den øgede sikkerhed ved lentiviral vektorhåndtering med yderligere opdeling af det virale genom i separate plasmider10,11. De nyeste generationer af PV'er anvendes generelt til at producere lentivirale vektorer til genterapi.
PV'er kan bruges til at studere interaktioner mellem vira og værtsceller under både produktions- og infektionsfaserne. PV'er anvendes især i pseudovirusneutraliseringsassays (PVNA). PVNA'er valideres bredt for at vurdere neutraliseringspotentialet for serum eller plasma ved at målrette det virale glycoprotein på PV's kuvert12,13. Neutraliseringsaktivitet, udtrykt som den hæmmende koncentration 50 (IC50), defineres som fortynding af serum/plasma, der blokerer 50% af viral partikelindgang14. I denne protokol beskrev vi opsætningen af et PVNA til test af antistofaktiviteten mod alvorligt akut respiratorisk syndrom - Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) i sera indsamlet før og efter modtagelse af en boostervaccinedosis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne protokol er godkendt af og følger retningslinjerne fra det etiske udvalg ved universitetet i Verona (godkendelsesprotokolnummer 1538). Der blev indhentet informeret skriftligt samtykke fra de mennesker, der deltog i undersøgelsen. Fuldblodsprøver blev indsamlet fra frivillige sundhedsarbejdere (HCW), der var i færd med at modtage anti-SARS-CoV-2-vacciner. Disse prøver blev opsamlet i plastrør indeholdende antikoagulantia til efterfølgende isolering af serum15.
Alle følgende processer skal udføres i en klasse 2 biologisk hætte, der arbejder under sterile forhold. Virushåndtering skal udføres med omhu, og alle affaldsprodukter skal neutraliseres i en fortyndet blegemiddelopløsning. En oversigt over protokollen vises i figur 1.
Figur 1: Grafisk gengivelse af et neutraliseringsassay. (A) PV-produktion, (B) PV-titrering og (C) neutraliseringsassay. Alle procedurer udføres i en klasse-2 biologisk hætte under sterile forhold. Titreringstrin (B) skal udføres for at standardisere infektivitetsniveauerne for PV'er før brug i neutraliseringsanalysen (C). Denne figur blev oprettet med BioRender. Klik her for at se en større version af denne figur.
1. SARS-CoV-2 PV'er produktion og infektivitetstest
- Seed 5 x 105 HEK293T celler i komplet Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM, højglukose, 10% føtalt bovint serum (FBS), 1% L-glutamin, 1% penicillin/streptomycin) i en 6-brønds plade (6WP) for at nå en passende celletæthed, der er kompatibel med det anvendte transfektionsreagens. Ved udførelse af transfektion med polyehtylenimin (PEI) (forbered reagenset efter producentens anvisninger), skal du sikre dig, at cellerne når 40-60% densitet på transfektionsdagen (trin 1.3). Opbevar cellerne i en befugtet inkubator ved 37 °C og 5% CO2.
- Før transfektion skal du udskifte det brugte cellemedium med frisk medium uden antibiotika (DMEM, høj glukose, 10% FBS, 1% L-glutamin) for at opnå højere transfektionseffektivitet.
BEMÆRK: Dagen efter såning er HEK293T celler klar til at blive transfekteret. - Transfekt klæbende HEK293T celler med et passende transfektionsreagens i henhold til producentens anvisninger. Hvis du bruger PEI, skal du forberede to blandinger og følge nedenstående trin.
- For at forberede blanding A tilsættes 500 ng pCMV-dR8.91 emballageplasmid16, 750 ng pCSFLW reporterplasmid16 og 450 ng SARS-CoV-2 Spike, der udtrykker plasmid i 100 μL reduceret serummedium.
- For at forberede blanding B tilsættes 17,5 μL PEI (koncentration: 1 mg / ml) til 100 μL af det reducerede serummedium.
- Lad begge blandinger inkubere ved stuetemperatur (RT) i 5 min. Bland derefter indholdet af begge rør sammen ved at tilsætte PEI-blandingen B til DNA-blandingen A.
- Inkuber røret i 20-30 minutter ved RT. Svip forsigtigt røret hvert 3.-4. minut for at forbedre blandingen. Til sidst tilsættes blandingen til de HEK293T celler.
- 16-20 timer efter transfektionen udskiftes kulturmediet med frisk, komplet DMEM. Der inkuberes ved 37 °C og 5 % CO2 for at muliggøre transfekterede cellers produktion af PV'er.
- 72 timer efter transfektionen høstes supernatanten indeholdende PV'er. Derefter centrifugeres ved 1600 x g i 7 minutter ved stuetemperatur for at fjerne cellerester og døde celler og filtreres gennem et 0,45 μm celluloseacetatfilter.
- VALGFRIT TRIN: For at øge det endelige udbytte af PV-titer skal du udføre flere transfektioner, samle cellemediet, der indeholder PV'er, og koncentrere det ved hjælp af koncentrerende rør.
- Fortsæt direkte med de næste trin ("PV-titrering", afsnit 2), eller alikvote det PV-holdige substrat i egnede reagensglas til opbevaring ved -80 °C indtil brug. Der fremstilles en yderligere prøveprøve (400-500 μL), der skal anvendes til titrering.
BEMÆRK: Fremstilling af flere alikvoter garanterer reproducerbarhed mellem eksperimenter ved at undgå overdrevne optøningscyklusser.
2. PV-titrering
- Brug det friske PV-holdige substrat til de næste trin, eller optø testalikvoten (trin 1.7) for at udføre titreringen af den nye virale stamme. Frysning af delprøver af samme PV-bestand garanterer reproducerbarhed.
- Der tilsættes 50 μL komplet DMEM (eller komplet medium, der er kompatibelt med målcellelinjen i brug) i alle hullerne i en 96 brøndplade (96WP), der er nødvendig for at teste PV-lageret i to eksemplarer, og lad række "A" være tom. Tilføj 100 μL PV-lager til række "A". Baseret på antallet af præparater, der skal testes, efterlades en kolonne uden virus som en "kun cellekontrol" (figur 2).
- Der pipetteres 50 μL fra række A til række B, og denne proces gentages op til række G for at opnå seriefortyndinger af startlageret. Kassér overskydende volumen fra den sidste række.
- Fjern celler ved hjælp af trypsin / ethylendiamintetraeddikesyre 1x (EDTA) i Dulbeccos fosfatbuffersaltvand 1x (DPBS 1x), efter at det brugte medium er fjernet, og vask celler med DPBS 1x to gange. Forbered celler til en densitet på 4 x 105 celler / ml.
BEMÆRK: I denne protokol blev PV-infektion testet på den modtagelige cellelinje HEK293T / ACE2; sådanne celler blev afledt af HEK293T, transduceret under anvendelse af en lentiviral vektor til ekspression af ACE2-receptor. - Der tilsættes 50 μL af cellesuspensionen i hvert hul for at sikre et celleantal på 2 x 104 celler pr. hul.
- Der inkuberes ved 37 °C og 5 % CO2 i 48 timer.
- Efter inkubationen skal du udføre Luciferase-analysen for at opnå aflæsningen i henhold til producentens anvisninger. Der tilsættes 100 μL luciferasereagens til hullerne og inkuberes i mørke ved RT i 2 minutter. Flyt indholdet af hvert hul til en sort 96-brøndplade (kompatibel med den tilgængelige pladelæser), og læs pladerne i en 96-brøndspladelæser.
BEMÆRK: Det luminometer, der bruges til luciferase-udlæsningen, producerer en regnearksfil med de rå, ubehandlede data, der vil blive brugt til downstream-analyse (i dette tilfælde en Excel-fil). Virussets infektivitet udtrykkes som relative luminescensenheder (RLU) (beskrevet i punkt 4.1).
Figur 2: Repræsentativt layout af en 96-brøndplade til PV-titrering. Et fast volumen PV-indeholdende supernatant tilsættes række A, kolonne 1-11, og seriefortyndes. Den sidste kolonne efterlades som kontrolelementet "kun celle". Denne figur blev oprettet med BioRender. Klik her for at se en større version af denne figur.
3. Neutraliseringsanalyse
- Optø patienternes sera på is. Serumprøver inaktiveres ved at inkubere dem ved 56 °C i 30 minutter.
- I en 96-brøndplade tilsættes 50 μL frisk, komplet DMEM (eller komplet medium, der er kompatibelt med den anvendte målcellelinje) i hvert af følgende huller: fra række B (kolonne 1-10) til række H (kolonne 1-10). Sæt 95 μL af den friske, komplette DMEM i række A (kolonne 1-10). Der tilsættes 50 μL og 100 μL komplet DMEM i hullerne i henholdsvis kolonne 11 og 12. Disse vil være henholdsvis de inficerede (viruskontrol eller VC) og ikke-inficerede (kun celle eller CC) kontroller (figur 3).
- Der tilsættes 5 μL varmeinaktiverede serum-/plasmaprøver i række A (kolonne 1-10). Hver prøve vil være i to eksemplarer. Bland prøverne i første række med en multikanalpipette og flyt 50 μL serum indeholdende serum fra række A til række B. Gentag denne proces op til sidste række (figur 3). Kassér de resterende 50 μL.
- Det nødvendige antal prøvelysninger optøs og fortyndes til ≥ 104 RLU/ml. Der tilsættes 50 μL af det fortyndede PV-holdige substrat til hvert hul (fra kolonne 1 til kolonne 11) ved hjælp af en multikanalpipette for at opnå en 1:1 fortynding af varmeinaktiveret serum/plasma til virus. Der inkuberes ved 37 °C og 5 % CO2 i 1 time for at lade antistofferne i serumprøverne binde til SARS-CoV-2 spikeproteinet på PV'erne.
- Forbered mindst 5 ml suspension af modtagelige celler (HEK293T/ACE2) ved en celletæthed på 4 x 105 celler/ml. Der tilsættes 50 μL af cellesuspensionen til hvert hul og inkuberes ved 37 °C og 5 % CO2 i 48 timer.
- Efter inkubationen udføres luciferaseanalysen i henhold til producentens anvisninger som beskrevet i trin 2.7.
BEMÆRK: Det luminometer, der bruges til luciferase-udlæsning, producerer en regnearksfil (i dette tilfælde .xlsx) med de rå, ubehandlede data, der vil blive brugt til downstream-analyse (Luciferase-analysefilen).
Figur 3: Pladerepræsentation baseret på serumfortynding. Lys rød svarer til en højere mængde serum, og lyseblå bane (kolonne 11) svarer til inficeret cellekontrol (VC, viruskontrol). Lyseblå bane (kolonne 12) svarer til uinficerede celler (CC, cellekontrol). Denne figur blev oprettet med BioRender. Klik her for at se en større version af denne figur.
4. Titreringsanalyse
- På Luciferase-analysefilen skal du tildele navnene/titlerne til de tilsvarende prøver.
- RLU-målingen multipliceres med fortyndingsfaktorerne (fra toppen til bunden af gitteret: 20x, 40x, 80x, 160x, 320x, 640x, 1,280x, 2,560x) for at opnå RLU/ml. Hvis der anvendes forskellige fortyndingsfaktorer, ændres multiplikationsfaktorerne tilsvarende.
- Beregn den gennemsnitlige RLU/ml for hvert PV-præparat.
5. PVs neutraliseringsassayanalyse
- På regnearksfilen Luciferase assay (i dette tilfælde .xlsx) skal du tildele de tilsvarende titler til de testede prøver. Indtast fortyndingsfaktoren for prøven (40s, 80x, 160x, 320x, 640x, 1,280x, 2,560x, 5,120x). Skyl Log10 for fortyndingsfaktorerne beregnes.
- Beregn den gennemsnitlige RLU for uinficeret og inficeret kontrol (figur 3, henholdsvis kolonne 11 og 12). Disse værdier vil være nyttige til normaliseringen i trin 5.5.
- Åbn et nyt dokument til dataanalyse. Vælg X/Y-analyse, indtast X som tal og Y som Indtast 2 replikerer værdier i underkolonner side om side.
- Indtast Log10-værdier (fortynding) som X-tal. Indtast den duplikerede RLU for prøverne.
- Gå til Analysér > normaliser > Markér alle eksemplerne på det samme ark med flag. Indtast de gennemsnitlige VC- og CC-værdier i henholdsvis Hvordan defineres 0% og Hvordan defineres 100%. Klik på OK.
- På det normaliserede datablad skal du gå til Analysér > XY-analyser > Ikke-lineære analyser (kurvetilpasning). Markér alle eksemplerne med flag, og klik på OK. For dosis-respons - hæmning skal du vælge log (inhibitor) vs normaliseret respons - variabel hældning.
- Under Begræns skal du ændre HillSlope til Skal være mindre end 0.
- Markér Opret oversigtstabel og graf med flag under Output. Klik på OK for at få de endelige analyser. Et arbejdsark med en skabelon til analysen findes i supplerende fil 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne protokol beskriver produktionen af SARS-CoV-2 PV'er og en downstream-anvendelse af disse PV'er til at analysere neutraliseringsaktiviteten af serum / plasma hos forsøgspersoner, der modtager anti-COVID-19-vaccination17. Desuden kan denne protokol anvendes til at producere pseudotyper af hver SARS-CoV-2-variant af bekymring (VOC) for at teste udviklingen af det neutraliserende respons. På trods af at denne protokol letter undersøgelsen af humoralt immunrespons efter COVID-19-vaccination, kan den tilpasses til let at teste neutraliseringen af forskellige sera / plasma mod forskellige vira 13,18,19.
Figur 4A viser forøgelsen af serumfortyndingen (log(fortynding)) svarende til forøgelsen af RLU-signalet. Jo højere fortynding af prøven er, desto mindre blokeret er virusindgangen således (figur 4A). Dette udtrykkes yderligere som en procentdel af neutralisering (figur 4B).
IC50-resultatet viser neutraliseringskapaciteten af et enkelt vaccineserum over tid. I eksemplet rapporteret i figur 4C udviklede forsøgspersonen en stærk humoristisk aktivitet mod virussen fire uger efter vaccination; efter 16 uger svarer IC50 imidlertid til den før vaccineadministration. I dette tilfælde viste PVNA tabet af neutraliseringspotentiale over tid.
Figur 4: Repræsentative resultater af PVNA. (A) Infektivitet (RLU og (B) procentdel af neutralisering vises ved uge 0 (W0, før vaccinationen); W4 (fire uger efter vaccination); W16 (seksten uger efter W0). C) IC50-værdier på samme tidspunkter. Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende fil 1: Skabelon til neutraliseringsanalyse. Et arbejdsark med en skabelon til gennemførelse af neutraliseringsanalysen. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Selvom brug af en vildtypevirus simulerer den faktiske infektion, er lentivirale PV'er en sikrere mulighed for at studere mekanismerne forbundet med viral indgang og infektion uden de strenge sikkerhedskrav, der er nødvendige for at arbejde med patogene vira 4,20,21. PV'er består af en replikationsdefekt viral kerne omgivet af overfladehylsterglycoprotein af en patogen virus, hvilket er formålet med undersøgelsen.
HIV-1-baserede PV'er er en af de mest anvendte platforme, og disse er blevet anvendt i denne protokol til produktion af SARS-CoV-2 pseudovirale partikler. Reportergenet kan være anderledes i henhold til brugen af PV'erne; i dette tilfælde giver valget af luciferase reporter-genet en nem, hurtig og følsom aflæsning af infektiviteten af de producerede PV'er.
PV'er baseret på lentivirus anvendes i vid udstrækning til at studere anti-HIV-1 humoralt respons22. PV-teknologien blev øjeblikkeligt anvendt under den nylige COVID-19-pandemi forårsaget af SARS-CoV-2. SARS-CoV-2 er en højpatogen human Betacoronavirus, identificeret for første gang i Kina (Wu Han), som hurtigt blev pandemisk og forårsagede mere end 6 millioner dødsfald på verdensplan23,24. På grund af valideringen af vaccinestrategier er pandemien stort set blevet kontrolleret; Ikke desto mindre udgør det hos de fleste sårbare mennesker, såsom kræftpatienter eller mennesker, der lever med hiv, stadig en risiko 25,26,27. I denne sammenhæng er der stadig behov for validerede assays for at overvåge anti-vaccine humoral respons med hensyn til neutraliserende aktivitet. I denne artikel har vi beskrevet en simpel protokol, der let kan udføres i laboratorier uden adgang til kategori-3-indeslutning. Desuden er PV-platformen et alsidigt system til at studere forskellige SARS-COV-2-virusvarianter. Ved at ændre det konvolutekspressive plasmid med forskellige pigge er det faktisk muligt at generere PV'er af SARS-CoV-2 nye varianter eller af andre coronavirus28. Disse virusporteføljer kan bruges til at vurdere reaktiviteten af vaccineinduceret humoralt respons mod de forskellige varianter af bekymring 15,29,30,31,32. Disse oplysninger kan være retningsgivende for udviklingen af nye og mere effektive vacciner.
Der kan opstå tre store forhindringer, når man følger denne protokol vedrørende transfektionsbetingelser, titreringssvigt og/eller neutraliseringsassay. For det første er emballagecellerne muligvis ikke tilstrækkeligt sammenflydende på transfektionstidspunktet. Dette kan skyldes manglen på næringsstoffer. Sørg for, at trin 1.1. følges korrekt. Ellers skal du udføre såning om morgenen dagen før transfektion og transfektere emballagecellerne senere den næste dag for at øge væksttiden. Et tilbagevendende problem er den potentielle forurening af cellemediet mellem transfektion og medium udskiftning den næste dag. I dette tilfælde gentages proceduren ved at øge steriliseringsproceduren før brug, når du arbejder under BSL2-hætten eller inkluderer antibiotika for at undgå uønskede forureninger. For det andet kan der forekomme et uopdaget luciferasesignal, der kan tilskrives forskellige stadier af PV-produktion eller målcellelinjens egenskaber. Plasmider bør ekstraheres med endotoksinfrie kits. Transfektionstrinnet er afgørende for resultatet af protokollen. PEI-reagens skal fremstilles i den korrekte koncentration på 1 mg/ml. Forsigtigt at flicke røret under fremstillingen af transfektionsblandinger forbedrer dannelsen af DNA-PEI-komplekser. For at kontrollere, at cellerne er transfekteret korrekt, anbefales det at udføre luciferase-analysen umiddelbart efter høst af cellerne. Derudover inkluderer et kontrolviruskuvertglycoprotein såsom VSV: VSV-PV'er giver stærke RLU-signaler på humane cellelinjer. Desuden er det nødvendigt at nævne, at målcellelinjen skal udtrykke receptoren, som let verificeres via western blot eller flowcytometri.
Denne metode er tidligere blevet optimeret16 med hensyn til de eksperimentelle betingelser, herunder udvælgelsen af transfektionsreagenset, bestemmelsen af forholdet mellem de forskellige plasmider, der er nødvendige til generering af PV, og udvælgelsen af målcellelinjerne, brugen af luciferase som reportergener. Ikke desto mindre skal hvert laboratorium validere de foreslåede metoder i henhold til det tilgængelige udstyr. For eksempel kræver (trin 2.7) tilsætning af 100 μL Luciferase-substrat som foreslået af producenten: dette er optimalt til aflæsning af luciferaseanalysen med den pladelæser, der i øjeblikket er tilgængelig. På den anden side kan andre laboratorier, der er udstyret med en anden pladelæser, tilpasse protokollen ved hjælp af forskellige luciferasesubstrater eller volumener af reagenset33. Desuden har andre forfattere foreslået brugen af det grønne fluorescerende protein (GFP) som et reportergen i stedet for luciferase. Dette kan overvejes, hvis et laboratorium er fuldt udstyret til GFP-aflæsning, men ikke luciferase34,35.
Afslutningsvis er PV'er et fleksibelt og ligetil system, der gør det muligt at kvantificere infektionen ved hjælp af en simpel detektionsmetode. Det repræsenterer en omkostningseffektiv tilgang, der er mere tilgængelig for mange forskergrupper og gør det muligt at undgå brug af patogene vira, der kræver et biosikkerhedsniveau 3 laboratorium21. Brugen af PV'er repræsenterer en velkarakteriseret og sikker tilgang til undersøgelse af antistofmedieret neutralisering hos personer, der oplevede SARS-CoV-2-infektion og / eller vaccination.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen interessekonflikt.
Acknowledgments
Vi anerkender bidraget fra sundhedspersonalets frivillige. Dette projekt blev støttet af Department of Excellence 2023/2027, MUR, Italien. AR og DZ blev støttet af PRIN2022 (EU-finansiering; NextGenerationEU)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.45 μm filter | SARSTEDT | 83 1826 | |
| 6-well plate | SARSTEDT | 83 3920 | |
| 96-well plate | SARSTEDT | 8,33,924 | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units | Merck | 10403892 | |
| Black Opaque 96-well Microplate | Perkin Elmer | 60005270 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | SIGMA-ALDRICH | D6546 - 500ML | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (PBS 1x) | AUROGENE | AU-L0615-500 | |
| Foetal Bovine Serum | AUROGENE | AU-S1810-500 | |
| Graphpad Prism version 7 | graphpad dotmatics | NA | In the manuscript, we replace the commercial name with 'data analysis program' |
| HEK293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| HEK293T/ACE2 cells | ATCC | CRL-3216 | HEK293T has been transduced to overexpress ACE2 with a lentiviral vector. |
| L-glutamine | AUROGENE | AU-X0550-100 | |
| Luminometer - Victor3 | Perkin Elmer | HH35000500 | In the manuscript, we replace the commercial name with 'luminometer' |
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 11058021 | In the manuscript, we replace the commercial name with 'reduced serum medium' |
| p8.91 packaging plasmid | Di Genova et al., 2021 | A kind gift from Prof. Nigel Temperton (ref 16.) | |
| pCSFLW reporter plasmid | Di Genova et al., 2021 | A kind gift from Prof. Nigel Temperton (ref 16.) | |
| Penicillin/streptomycin | AUROGENE | AU-L0022-100 | |
| Polyethylenimine, branched (PEI) (25 kDa) | SIGMA-ALDRICH | 408727 | |
| RRL.sin.cPPT.SFFV/Ace2.IRES-puro.WPRE (MT126) | Addgene | 145839 | This plasmid was used to generate HEK293Tcells/ACE2 |
| SARS-CoV-2 Spike expressing plasmid | Addgene | pGBW-m4137382 | |
| steadylite plus Reporter Gene Assay System | Perkin Elmer | 6066759 | In the manuscript, we replaced the commercial name with 'luciferase reading reagent' |
| Trypsin EDTA 1x | AUROGENE | AU-L0949-100 |
References
- Ozaki, D. A., et al. International technology transfer of a GCLP-compliant HIV-1 neutralizing antibody assay for human clinical trials. Plos One. 7 (1), e30963 (2012).
- Pouget, M., et al. Generation of liposomes to study the effect of Mycobacterium tuberculosis lipids on HIV-1 cis- and trans-infections. International Journal of Molecular Sciences. 22 (4), 1945 (2021).
- McKay, L. G. A., et al. The HCV envelope glycoprotein down-modulates NF-κB signalling and associates with stimulation of the host endoplasmic reticulum stress pathway. Frontiers in Immunology. 13, 831695 (2022).
- Xiang, Q., Li, L., Wu, J., Tian, M., Fu, Y. Application of pseudovirus system in the development of vaccine, antiviral-drugs, and neutralizing antibodies. Microbiological Research. 258, 126993 (2022).
- Li, Q., Liu, Q., Huang, W., Li, X., Wang, Y. Current status on the development of pseudoviruses for enveloped viruses. Reviews in Medical Virology. 28, e1963 (2018).
- D'Apice, L., et al. Comparative analysis of the neutralizing activity against SARS-CoV-2 Wuhan-Hu-1 strain and variants of concern: Performance evaluation of a pseudovirus-based neutralization assay. Frontiers in Immunology. 13, 981693 (2022).
- Falzarano, D., Groseth, A., Hoenen, T. Development and application of reporter-expressing mononegaviruses: current challenges and perspectives. Antiviral Research. 103, 78-87 (2014).
- Gutierrez-Guerrero, A., Cosset, F. -L., Verhoeyen, E. Lentiviral vector pseudotypes: Precious tools to improve gene modification of hematopoietic cells for research and gene therapy. Viruses. 12, 1016 (2020).
- Zufferey, R., Nagy, D., Mandel, R. J., Naldini, L., Trono, D. Multiply attenuated lentiviral vector achieves efficient gene delivery in vivo. Nature Biotechnology. 15 (9), 871-875 (1997).
- Dull, T. A third-generation lentivirus vector with a conditional packaging system. Journal of Virology. 72 (11), 8463-8471 (1998).
- Berkhout, B. A Fourth generation lentiviral Vector: Simplifying genomic gymnastics. Molecular Therapy. 25 (8), 1741-1743 (2017).
- Wu, X. Development and evaluation of a pseudovirus-luciferase assay for rapid and quantitative detection of neutralizing antibodies against Enterovirus 71. Plos One. 8 (6), e64116 (2013).
- Ferrara, F., et al. Development of lentiviral vectors pseudotyped with Influenza B hemagglutinins: application in vaccine immunogenicity, mAb potency, and sero-surveillance studies. Frontiers in Immunology. 12, 661379 (2021).
- Hu, J., et al. Development of cell-based pseudovirus entry assay to identify potential viral entry inhibitors and neutralizing antibodies against SARS-CoV-2. Genes & Diseases. 7 (4), 551-557 (2020).
- Dalle Carbonare, L., et al. Serology study after BTN162b2 vaccination in participants previously infected with SARS-CoV-2 in two different waves versus naïve. Communications Medicine. 1 (1), 38 (2021).
- Di Genova, C., et al. Production, titration, neutralisation, storage and lyophilisation of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) lentiviral pseudotypes. Bio-protocol. 11 (21), e4236 (2021).
- Chmielewska, A. M., Czarnota, A., Bieńkowska-Szewczyk, K., Grzyb, K. Immune response against SARS-CoV-2 variants: The role of neutralization assays. NPJ Vaccines. 6 (1), 1-8 (2021).
- Chen, Q., et al. Development and optimization of a sensitive pseudovirus-based assay for HIV-1 neutralizing antibodies detection using A3R5 cells. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 14 (1), 199-208 (2018).
- Gauger, P. C., Vincent, A. L. Serum virus neutralization assay for detection and quantitation of serum neutralizing antibodies to influenza A virus in swine. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J). 2123, 321-333 (2020).
- Miglietta, R., Pastori, C., Venuti, A., Ochsenbauer, C., Lopalco, L. Synergy in monoclonal antibody neutralization of HIV-1 pseudoviruses and infectious molecular clones. Journal of Translational Medicine. 12 (1), 346 (2014).
- Chen, M., Zhang, X. -E. Construction and applications of SARS-CoV-2 pseudoviruses: A mini review. International Journal of Biological Sciences. 17 (6), 1574-1580 (2021).
- Zipeto, D., et al. Induction of human immunodeficiency virus neutralizing antibodies using fusion complexes. Microbes and Infection. 8 (6), 1424-1433 (2006).
- WHO Coronavirus (COVID-19) Dashboard. , https://covid19.who.int (2022).
- Zhou, P. A pneumonia outbreak associated with a new coronavirus of probable bat origin. Nature. 579 (7798), 270-273 (2020).
- Chen, X., Huang, H., Ju, J., Sun, R., Zhang, J. Impact of vaccination on the COVID-19 pandemic in U.S. states. Scientific Reports. 12 (1), 1554 (2022).
- Stefani, C., Fantoni, T., Bissoli, M., Thomas, J., Ruggiero, A. HIV and SARS-CoV-2 Co-Infection: From Population Study Evidence to In Vitro Studies. Life. 12 (12), 2089 (2022).
- Watson, O. J., et al. Global impact of the first year of COVID-19 vaccination: a mathematical modelling study. The Lancet Infectious Diseases. 22 (9), 1293-1302 (2022).
- Cantoni, D. Analysis of antibody neutralisation activity against SARS-CoV-2 variants and seasonal human coronaviruses NL63, HKU1, and 229E induced by three different COVID-19 vaccine olatforms. Vaccines. 11 (1), 58 (2023).
- Siracusano, G., et al. Different decay of antibody response and VOC sensitivity in naïve and previously infected subjects at 15 weeks following vaccination with BNT162b2. Journal of Translational Medicine. 20 (1), 22 (2022).
- Ruggiero, A. SARS-CoV-2 vaccination elicits unconventional IgM specific responses in naïve and previously COVID-19-infected individuals. eBioMedicine. 77, (2022).
- Piubelli, C. Subjects who developed SARS-CoV-2 specific IgM after vaccination show a longer humoral immunity and a lower frequency of infection. eBioMedicine. 89, 104471 (2023).
- Zhang, G. F. Infectivity of pseudotyped SARS-CoV-2 variants of concern in different human cell types and inhibitory effects of recombinant spike protein and entry-related cellular factors. Journal of Medical Virology. 95 (1), e28437 (2023).
- da Costa, K. A. S. Influenza A (N1-N9) and Influenza B (B/Victoria and B/Yamagata) neuraminidase pseudotypes as tools for pandemic preparedness and improved influenza vaccine design. Vaccines. 10 (9), 1520 (2022).
- Condor Capcha, J. M. Generation of SARS-CoV-2 spike pseudotyped virus for viral entry and neutralization assays: a 1-week protocol. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 7, 618651 (2021).
- Diomede, L., et al. Doxycycline inhibition of a pseudotyped virus transduction does not translate to inhibition of SARS-CoV-2 infectivity. Viruses. 13 (9), 1745 (2021).
