Summary
Pseudotypade virus (PV) är replikationsdefekta virioner som används för att studera värd-virusinteraktioner under säkrare förhållanden än vid hantering av autentiska virus. Här presenteras ett detaljerat protokoll som visar hur SARS-CoV-2 PV kan användas för att testa den neutraliserande förmågan hos patienters serum efter COVID-19-vaccination.
Abstract
Pseudotypade virus (PV) är molekylära verktyg som kan användas för att studera värd-virusinteraktioner och för att testa den neutraliserande förmågan hos serumprover, förutom deras mer kända användning i genterapi för leverans av en gen av intresse. PV är replikationsdefekt eftersom virusgenomet är uppdelat i olika plasmider som inte är inkorporerade i PV:erna. Detta säkra och mångsidiga system gör det möjligt att använda solceller i laboratorier med biosäkerhetsnivå 2. Här presenterar vi en generell metod för att producera lentivirala PV baserade på tre plasmider som nämns här: (1) ryggradsplasmiden som bär reportergenen som behövs för att övervaka infektionen; 2. Förpackningsplasmiden som bär generna för alla strukturella proteiner som behövs för att generera PV. (3) Höljets ytglykoproteinuttrycksplasmid som bestämmer virusets tropism och förmedlar virusets inträde i värdcellen. I detta arbete är SARS-CoV-2 Spike det höljeglykoprotein som används för produktion av icke-replikativa SARS-CoV-2 pseudotypade lentivirus.
I korthet samtransfekterades förpackningsceller (HEK293T) med de tre olika plasmiderna med hjälp av standardmetoder. Efter 48 timmar skördades, filtrerades supernatanten som innehöll PV och förvarades vid -80 °C. Infektiviteten hos SARS-CoV-2 PV testades genom att studera uttrycket av reportergenen (luciferas) i en målcellinje 48 timmar efter infektion. Ju högre värde för relativa luminiscensenheter (RLU), desto högre infektions-/transduktionshastighet. Dessutom tillsattes de infektiösa PV:erna till de serieutspädda serumproverna för att studera neutraliseringsprocessen av pseudovirus inträde i målceller, mätt som minskningen av RLU-intensiteten: lägre värden motsvarande hög neutraliserande aktivitet.
Introduction
Pseudotypade virus (PV) är molekylära verktyg som används inom mikrobiologi för att studera värd-virus och patogen-patogeninteraktioner 1,2,3,4. PV består av en inre del, den virala kärnan som skyddar virusgenomet, och en yttre del, höljeglykoproteinerna på ytan av viruset som definierar tropismen5. Ett pseudovirus är replikationsinkompetent i målcellen eftersom det inte innehåller all genetisk information för att generera nya viruspartiklar. Denna kombination av märkliga egenskaper gör PV till ett säkert alternativ till ett vildtypsvirus. Wildtype-virus, å andra sidan, är högpatogena och kan inte användas i BSL 2-laboratorier för analys6.
Infektiviteten hos PV kan övervakas av en reportergen, som vanligtvis kodar för ett fluorescerande protein (GFP, RFP, YFP) eller ett enzym som producerar kemiluminescerande produkter (luciferas). Detta finns i en av de plasmider som används för PV-produktion och ingår i genomet hos pseudovirus7.
Det finns för närvarande flera typer av PV-kärnor, inklusive lentivirala partiklar baserade på HIV-1-genomet. Den stora fördelen med HIV-1-baserade PV jämfört med andra plattformar är deras inneboende integrationsprocess i målcellens genom. Även om HIV-1 är ett mycket smittsamt virus och orsakar AIDS, är dessa lentivirala vektorer säkra att använda på grund av de omfattande optimeringsstegen under åren. Optimala säkerhetsförhållanden uppnåddes med introduktionen av 2:a generationens lentivirala vektorer, där virala gener utarmades utan att påverka transduktionsförmågan9. Den 3:e och 4:e generationen bidrog till den ökade säkerheten för hantering av lentivirala vektorer genom ytterligare uppdelning av virusgenomet i separata plasmider10,11. De senaste generationerna av PV används i allmänhet för att producera lentivirala vektorer för genterapi.
PV kan användas för att studera interaktioner mellan virus och värdceller, både under produktions- och infektionsfasen. PV används särskilt i pseudovirusneutralisationsanalyser (PVNA). PVNA valideras i stor utsträckning för att bedöma neutraliseringspotentialen hos serum eller plasma genom att rikta in sig på det virala glykoproteinet på PV:s hölje12,13. Neutralisationsaktivitet, uttryckt som den hämmande koncentrationen 50 (IC50), definieras som den utspädning av serum/plasma som blockerar 50 % av viruspartikelposten14. I detta protokoll beskrev vi upplägget av en PVNA för att testa antikroppsaktiviteten mot Severe Acute Respiratory Syndrome - Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) i serum som samlats in före och efter att ha fått en boostervaccindos.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Detta protokoll har godkänts av och följer riktlinjerna från den etiska kommittén vid universitetet i Verona (godkännandeprotokoll nummer 1538). Informerat skriftligt samtycke erhölls från de försökspersoner som deltog i studien. Helblodsprover samlades in från frivilliga sjukvårdspersonal som var i färd med att få anti-SARS-CoV-2-vacciner. Dessa prover samlades in i plaströr innehållande antikoagulantia för efterföljande isolering av serum15.
Alla följande processer måste utföras i en biologisk huv av klass 2 och arbeta under sterila förhållanden. Virushantering måste utföras med försiktighet och alla avfallsprodukter måste neutraliseras i en utspädd blekmedelslösning. En översikt över protokollet visas i figur 1.
Figur 1: Grafisk representation av en neutralisationsanalys. (A) PV-produktion, (B) PV-titrering och (C) neutralisationsanalys. Alla ingrepp utförs i en biologisk huva av klass 2 under sterila förhållanden. Titreringssteg (B) måste utföras för att standardisera infektionsnivåerna för PV före användning i neutralisationsanalysen (C). Denna figur skapades med BioRender. Klicka här för att se en större version av denna figur.
1. Produktions- och infektionstest av SARS-CoV-2-solceller
- Frö 5 x 105 HEK293T celler i komplett Dulbeccos modifierade Eagle Medium (DMEM, hög glukos, 10 % fetalt bovint serum (FBS), 1 % L-glutamin, 1 % penicillin/streptomycin) i en 6-hålsplatta (6WP) för att uppnå en lämplig celltäthet som är kompatibel med det transfektionsreagens som används. Vid transfektion med polyehtylenimin (PEI) (bered reagenset enligt tillverkarens instruktioner), se till att cellerna når 40-60 % densitet på transfektionsdagen (steg 1.3). Förvara cellerna i en fuktad inkubator vid 37 °C och 5 % CO2 .
- Före transfektion, ersätt det förbrukade cellmediet med färskt medium utan antibiotika (DMEM, hög glukos, 10 % FBS, 1 % L-glutamin) för att uppnå högre transfektionseffektivitet.
OBS: Dagen efter sådd är HEK293T celler redo att transfekteras. - Transfekt vidhäftande HEK293T celler med ett lämpligt transfektionsreagens enligt tillverkarens anvisningar. Om du använder PEI, förbered två blandningar och följ stegen nedan.
- För att bereda blandning A, tillsätt 500 ng pCMV-dR8.91 förpackningsplasmid16, 750 ng pCSFLW reporterplasmid16 och 450 ng SARS-CoV-2 Spike-uttryckande plasmid i 100 μL reducerat serummedium.
- För att bereda blandning B, tillsätt 17,5 μL PEI (koncentration: 1 mg/ml) till 100 μL av det reducerade serummediet.
- Låt båda blandningarna inkubera i rumstemperatur (RT) i 5 minuter. Blanda sedan innehållet i båda rören genom att tillsätta PEI-blandningen B till DNA-blandningen A.
- Inkubera röret i 20-30 minuter vid RT. Snärta försiktigt röret var 3-4:e minut för att förbättra blandningen. Tillsätt slutligen blandningen till de HEK293T cellerna.
- 16-20 timmar efter transfektionen, byt ut odlingsmediet mot färskt, komplett DMEM. Inkubera vid 37 °C och 5 % CO2 för att möjliggöra produktion av solceller med transfekterade celler.
- 72 timmar efter transfektionen skördas supernatanten som innehåller PV. Centrifugera sedan vid 1600 x g i 7 minuter vid rumstemperatur för att avlägsna cellrester och döda celler och filtrera det genom ett 0,45 μm cellulosaacetatfilter.
- VALFRITT STEG: För att öka det slutliga utbytet av PV-titer, utför flera transfektioner, slå samman cellmediet som innehåller PV och koncentrera det med hjälp av koncentrerande rör.
- Fortsätt direkt med nästa steg ("PV-titrering", avsnitt 2) eller alikvot det PV-innehållande mediet i lämpliga rör för förvaring vid -80 °C fram till användning. Bered ytterligare en alikvot (400–500 μL) som ska användas för titrering.
OBS: Att göra flera alikvoter garanterar reproducerbarhet mellan experimenten genom att undvika överdrivna upptinings- och fryscykler.
2. Titrering av solceller
- Använd det färska mediet som innehåller solceller för nästa steg eller tina testalikvoten (steg 1.7) för att utföra titreringen av det nya virusbeståndet. Frysning av alikvoter av samma bestånd av solceller garanterar reproducerbarheten.
- Tillsätt 50 μL komplett DMEM (eller komplett medium som är kompatibelt med målcellinjen vid användning) i alla brunnar på en 96-brunnsplatta (96WP) som krävs för att testa i duplikat PV-materialet, lämna rad "A" tom. Tillsätt 100 μl PV-material till rad "A". Baserat på antalet preparat som ska testas, lämna en kolumn utan viruset som en "endast cell"-kontroll (figur 2).
- Pipettera 50 μL från rad A till rad B och upprepa denna process upp till rad G för att erhålla seriespädningar av den ursprungliga stammen. Ta bort överskottsvolymen från den sista raden.
- Lossa celler med hjälp av trypsin/etylendiamintetraättiksyra 1x (EDTA) i Dulbeccos fosfatbuffertsaltlösning 1x (DPBS 1x), efter att ha avlägsnat det förbrukade mediet och tvättat cellerna med DPBS 1x två gånger. Förbered cellerna till en densitet av 4 x 105 celler/ml.
OBS: I detta protokoll testades PV-infektion på den mottagliga cellinjen HEK293T/ACE2; sådana celler härrörde från HEK293T, transducerade med hjälp av en lentiviral vektor för att uttrycka ACE2-receptorn. - Tillsätt 50 μl av cellsuspensionen i varje brunn för att säkerställa ett celltal på 2 x 104 celler per brunn.
- Inkubera vid 37 °C och 5 % CO2 i 48 timmar.
- Efter inkubationen utförs Luciferas-analysen för att erhålla avläsningen enligt tillverkarens instruktioner. Tillsätt 100 μl luciferasreagens till brunnarna och inkubera i mörker vid RT i 2 minuter. Flytta innehållet i varje brunn till en svart 96-brunnsplatta (kompatibel med den tillgängliga plattläsaren) och läs av plattorna i en 96-håls plattläsare.
OBS: Luminometern som används för luciferasavläsningen kommer att producera ett kalkylblad file med råa, obearbetade data som kommer att användas för nedströmsanalys (i det här fallet en Excel-fil). Virusets smittsamhet uttrycks som relativa luminiscensenheter (RLU) (beskrivs i punkt 4.1).
Figur 2: Representativ layout av en 96-brunnsplatta för PV-titrering. En fast volym PV-innehållande supernatant tillsätts till rad A, kolumnerna 1–11, och späds seriellt. Den sista kolumnen lämnas som kontrollen "endast cell". Denna figur skapades med BioRender. Klicka här för att se en större version av denna figur.
3. Neutralisationsanalys
- Tina patienternas serum på is. Inaktiverar serumproverna genom att inkubera dem vid 56 °C i 30 minuter.
- Tillsätt 50 μl färsk, komplett DMEM (eller helmedium som är kompatibelt med den målcellinje som används) i var och en av följande brunnar i en platta med 96 brunnar: från rad B (kolumnerna 1–10) till rad H (kolumnerna 1–10). Placera 95 μL av färskt, komplett DMEM i rad A (kolumnerna 1–10). Tillsätt 50 μl och 100 μl komplett DMEM i brunnarna i kolonnerna 11 respektive 12. Dessa är de infekterade (viruskontrollen) respektive de oinfekterade (endast cellen eller CC) kontrollerna (figur 3).
- Tillsätt 5 μl värmeinaktiverat serum-/plasmaprov i rad A (kolumnerna 1–10). Varje prov kommer att vara i två exemplar. Blanda proverna i den första raden med en flerkanalspipett och flytta 50 μl serum som innehåller medium från rad A till rad B. Upprepa denna process fram till den sista raden (figur 3). Kassera de återstående 50 μL.
- Tina upp det nödvändiga antalet alikvoter för solceller och späd till ≥ 104 RLU/ml. Tillsätt 50 μl av det utspädda PV-innehållande mediet till varje brunn (från kolumn 1 till kolumn 11) med hjälp av en flerkanalspipett för att uppnå en 1:1-utspädning av värmeinaktiverat serum/plasma till virus. Inkubera vid 37 °C och 5 % CO2 i 1 timme så att antikropparna i serumproverna kan binda till SARS-CoV-2-spikproteinet på PV.
- Bered minst 5 ml suspension av mottagliga celler (HEK293T/ACE2) vid en celltäthet på 4 x 105 celler/ml. Tillsätt 50 μl av cellsuspensionen till varje brunn och inkubera vid 37 °C och 5 % CO2 i 48 timmar.
- Efter inkubationen ska luciferasanalysen läsas enligt tillverkarens anvisningar enligt beskrivningen i steg 2.7.
OBS: Luminometern som används för luciferasavläsning kommer att producera ett kalkylblad file (i det här fallet .xlsx) med råa, obearbetade data som kommer att användas för nedströmsanalys (Luciferase analysfil).
Figur 3: Plattrepresentation baserad på serumspädning. Klarrött motsvarar en högre mängd serum, och ljusblått fält (kolumn 11) motsvarar infekterad cellkontroll (VC, viruskontroll). Ljusblå fält (kolumn 12) motsvarar oinfekterade celler (CC, cellkontroll). Denna figur skapades med BioRender. Klicka här för att se en större version av denna figur.
4. Titrering analys
- På Luciferase-analysen file, tilldela namnen/titlarna till motsvarande samples.
- Multiplicera RLU-måttet med utspädningsfaktorerna (uppifrån och ned i rutnätet: 20x, 40x, 80x, 160x, 320x, 640x, 1,280x, 2,560x) för att erhålla RLU/ml. Om olika utspädningsfaktorer används, ändra multiplikationsfaktorerna i enlighet med detta.
- Beräkna medelvärdet för RLU/ml för varje PV-preparat.
5. Analys av PV-neutraliseringsanalys
- På Luciferase-analyskalkylbladet file (i det här fallet .xlsx), tilldela motsvarande titlar till de testade proverna. Ange utspädningsfaktorn för provet (40s, 80x, 160x, 320x, 640x, 1 280x, 2 560x, 5 120x). Beräkna log10 för utspädningsfaktorerna.
- Beräkna genomsnittlig RLU för oinfekterad och infekterad kontroll (figur 3, kolumn 11 respektive 12). Dessa värden är användbara för normaliseringen i steg 5.5.
- Öppna ett nytt dokument för dataanalys. Välj X/Y-analys, mata in X som tal och Y som Ange 2 replikeringsvärden i underkolumner sida vid sida.
- Ange Log10-värden (utspädning) som X-tal. Ange den duplicerade RLU:n för exemplen.
- Gå till Analysera > Normalisera > Flagga alla exempel på samma blad. Ange de genomsnittliga VC- och CC-värdena i Hur definieras 0 %? respektive Hur definieras 100 %. Klicka på OK.
- På det normaliserade databladet går du till Analysera > XY-analyser > Icke-linjära analyser (kurvanpassning). Flagga alla exempel och klicka på OK. För Dos-respons - Hämning väljer du log (inhibitor) vs normaliserad respons - variabel lutning.
- Under Begränsa ändrar du HillSlope till Måste vara mindre än 0.
- Under Utdata flaggar du Skapa sammanfattningstabell och diagram. Klicka på OK för att få de slutliga analyserna. Ett arbetsblad med en mall för analysen finns i tilläggsfil 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Detta protokoll beskriver produktionen av SARS-CoV-2 PV och en nedströms tillämpning av dessa PV för att analysera neutraliseringsaktiviteten hos serum/plasma hos försökspersoner som får anti-COVID-19-vaccination17. Dessutom kan detta protokoll användas för att producera pseudotyper av varje SARS-CoV-2-variant av oro (VOC) för att testa utvecklingen av det neutraliserande svaret. Trots att detta protokoll underlättar studiet av humoralt immunsvar efter COVID-19-vaccination, kan det anpassas för att enkelt testa neutraliseringen av olika serum/plasma mot olika virus 13,18,19.
Figur 4A visar ökningen av utspädningen av serum (Log(dilution)) som motsvarar ökningen av RLU-signalen. Ju högre utspädning av provet är, desto mindre blockerad är virusets inträde (figur 4A). Detta uttrycks vidare i procent av neutraliseringen (figur 4B).
IC50-resultatet visar neutraliseringskapaciteten hos ett enda vaccinserum över tid. I exemplet som redovisas i figur 4C utvecklade försökspersonen en stark humoral aktivitet mot viruset fyra veckor efter vaccinationen. Efter 16 veckor liknar dock IC50 den som gavs före administrering av vaccinet. I det här fallet visade PVNA förlusten av neutraliseringspotential över tid.
Figur 4: Representativa resultat av PVNA. (A) Infektionsförmåga (RLU och (B) procentuell neutralisering visas vid vecka 0 (W0, före vaccinationen). W4 (fyra veckor efter vaccination); W16 (sexton veckor efter W0). C) IC50-värden vid samma tidpunkter. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Tilläggsfil 1: Mall för neutraliseringsanalys. Ett arbetsblad med en mall för att utföra neutraliseringsanalysen. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Även om användning av ett vildtypsvirus simulerar den faktiska infektionen, är lentivirala PV ett säkrare alternativ för att studera mekanismerna i samband med virusinträde och infektion utan de strikta säkerhetskrav som krävs för att arbeta med patogena virus 4,20,21. PV består av en replikationsdefekt viruskärna omgiven av ythöljets glykoprotein från ett patogent virus, vilket är syftet med studien.
HIV-1-baserade PV är en av de mest använda plattformarna och dessa har använts i detta protokoll för produktion av SARS-CoV-2 pseudovirala partiklar. Reportergenen kan vara annorlunda beroende på användningen av PV:erna; I detta fall ger valet av luciferasreportergenen en enkel, snabb och känslig avläsning av smittsamheten hos de producerade PV:erna.
PV baserade på lentivirus används i stor utsträckning för att studera humoral respons mot HIV-122. Solcellstekniken tillämpades omedelbart under den senaste COVID-19-pandemin, orsakad av SARS-CoV-2. SARS-CoV-2 är ett högpatogent humant betacoronavirus, identifierat för första gången i Kina (Wu Han) som snabbt blev en pandemi och orsakade mer än 6 miljoner dödsfall över hela världen23,24. Tack vare valideringen av vaccinstrategierna har pandemin i stort sett kontrollerats. Men hos de mest sårbara människorna, som cancerpatienter eller personer som lever med hiv, utgör det fortfarande en risk 25,26,27. I detta sammanhang finns det fortfarande ett behov av validerade analyser för att övervaka det humorala svaret mot vaccin när det gäller neutraliserande aktivitet. I den här artikeln har vi beskrivit ett enkelt protokoll som enkelt kan utföras i laboratorier utan tillgång till kategori-3-inneslutning. Dessutom är PV-plattformen ett mångsidigt system för att studera olika SARS-COV-2-virusvarianter. Genom att ändra den höljeuttryckande plasmiden med olika spikar är det faktiskt möjligt att generera PV för nya varianter av SARS-CoV-2 eller av andra coronavirus28. Dessa virusportföljer kan användas för att bedöma reaktiviteten hos vaccininducerad humoral respons mot de olika varianterna av särskild betydelse 15,29,30,31,32. Denna information kan vägleda framtagandet av nya och mer effektiva vacciner.
Tre stora hinder kan stötas på när man följer detta protokoll när det gäller transfektionsförhållanden, titreringsfel och/eller neutralisationsanalys. För det första kan det hända att förpackningscellerna inte är tillräckligt sammanflytande vid tidpunkten för transfektionen. Detta kan bero på bristen på näringsämnen. Se till att steg 1.1. följs på rätt sätt. Annars, utför sådd på morgonen dagen före transfektion och transfektera förpackningscellerna senare nästa dag för att öka tillväxttiden. Ett återkommande problem är den potentiella kontamineringen av cellmediet mellan transfektion och mediebyte nästa dag. Upprepa i så fall proceduren genom att öka steriliseringsproceduren före användning när du arbetar under BSL2-huven eller inkludera antibiotika för att undvika oönskade kontamineringar. För det andra kan en odetekterad luciferassignal uppstå som kan hänföras till olika stadier av PV-produktion eller egenskaperna hos målcellinjen. Plasmider bör extraheras med endotoxinfria kit. Transfektionssteget är avgörande för resultatet av protokollet. PEI-reagens måste beredas i rätt koncentration av 1 mg/ml. Att försiktigt snärta röret under beredningen av transfektionsblandningar förbättrar bildandet av DNA-PEI-komplex. För att verifiera att cellerna har transfekterats korrekt rekommenderas att luciferastestet utförs omedelbart efter att cellerna har skördats. Dessutom, inkludera ett kontrollvirus hölje glykoprotein som VSV: VSV-PV ger starka RLU-signaler på humana cellinjer. Dessutom är det nödvändigt att nämna att målcellinjen måste uttrycka receptorn, vilket lätt kan verifieras via western blot eller flödescytometri.
Denna metod har tidigare optimerats16 med avseende på de experimentella förhållandena, inklusive valet av transfektionsreagens, bestämningen av förhållandena mellan de olika plasmiderna som behövs för genereringen av PV och valet av målcellinjer, användningen av luciferas som rapportgener. Icke desto mindre måste varje laboratorium validera de föreslagna metoderna i enlighet med den tillgängliga utrustningen. Till exempel (steg 2.7) krävs tillsats av 100 μl luciferassubstrat enligt tillverkarens förslag: detta är optimalt för avläsningen av luciferasanalysen med den plattläsare som för närvarande finns tillgänglig. Å andra sidan kan andra laboratorier som är utrustade med en annan plattläsare anpassa protokollet med hjälp av andra luciferassubstrat eller volymer av reagens33. Dessutom har andra författare föreslagit användningen av det gröna fluorescerande proteinet (GFP) som en reportergen istället för luciferas. Detta kan övervägas om ett laboratorium är fullt utrustat för GFP-avläsning men inte luciferas 34,35.
Sammanfattningsvis är PV ett flexibelt och okomplicerat system som gör det möjligt att kvantifiera infektionen med hjälp av en enkel detektionsmetod. Det är ett kostnadseffektivt tillvägagångssätt som är mer tillgängligt för många forskargrupper och som gör det möjligt att undvika användning av patogena virus som kräver ett laboratorium med biosäkerhetsnivå 321. Användningen av PV representerar ett välkarakteriserat och säkert tillvägagångssätt för att studera antikroppsmedierad neutralisering hos individer som upplevt SARS-CoV-2-infektion och/eller vaccination.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har någon intressekonflikt.
Acknowledgments
Vi vill tacka sjukvårdspersonalens volontärer för deras bidrag. Detta projekt stöddes av Department of Excellence 2023/2027, MUR, Italien. AR och DZ fick stöd av PRIN2022 (EU-finansiering; NextGenerationEU)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.45 μm filter | SARSTEDT | 83 1826 | |
| 6-well plate | SARSTEDT | 83 3920 | |
| 96-well plate | SARSTEDT | 8,33,924 | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units | Merck | 10403892 | |
| Black Opaque 96-well Microplate | Perkin Elmer | 60005270 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | SIGMA-ALDRICH | D6546 - 500ML | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (PBS 1x) | AUROGENE | AU-L0615-500 | |
| Foetal Bovine Serum | AUROGENE | AU-S1810-500 | |
| Graphpad Prism version 7 | graphpad dotmatics | NA | In the manuscript, we replace the commercial name with 'data analysis program' |
| HEK293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| HEK293T/ACE2 cells | ATCC | CRL-3216 | HEK293T has been transduced to overexpress ACE2 with a lentiviral vector. |
| L-glutamine | AUROGENE | AU-X0550-100 | |
| Luminometer - Victor3 | Perkin Elmer | HH35000500 | In the manuscript, we replace the commercial name with 'luminometer' |
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 11058021 | In the manuscript, we replace the commercial name with 'reduced serum medium' |
| p8.91 packaging plasmid | Di Genova et al., 2021 | A kind gift from Prof. Nigel Temperton (ref 16.) | |
| pCSFLW reporter plasmid | Di Genova et al., 2021 | A kind gift from Prof. Nigel Temperton (ref 16.) | |
| Penicillin/streptomycin | AUROGENE | AU-L0022-100 | |
| Polyethylenimine, branched (PEI) (25 kDa) | SIGMA-ALDRICH | 408727 | |
| RRL.sin.cPPT.SFFV/Ace2.IRES-puro.WPRE (MT126) | Addgene | 145839 | This plasmid was used to generate HEK293Tcells/ACE2 |
| SARS-CoV-2 Spike expressing plasmid | Addgene | pGBW-m4137382 | |
| steadylite plus Reporter Gene Assay System | Perkin Elmer | 6066759 | In the manuscript, we replaced the commercial name with 'luciferase reading reagent' |
| Trypsin EDTA 1x | AUROGENE | AU-L0949-100 |
References
- Ozaki, D. A., et al. International technology transfer of a GCLP-compliant HIV-1 neutralizing antibody assay for human clinical trials. Plos One. 7 (1), e30963 (2012).
- Pouget, M., et al. Generation of liposomes to study the effect of Mycobacterium tuberculosis lipids on HIV-1 cis- and trans-infections. International Journal of Molecular Sciences. 22 (4), 1945 (2021).
- McKay, L. G. A., et al. The HCV envelope glycoprotein down-modulates NF-κB signalling and associates with stimulation of the host endoplasmic reticulum stress pathway. Frontiers in Immunology. 13, 831695 (2022).
- Xiang, Q., Li, L., Wu, J., Tian, M., Fu, Y. Application of pseudovirus system in the development of vaccine, antiviral-drugs, and neutralizing antibodies. Microbiological Research. 258, 126993 (2022).
- Li, Q., Liu, Q., Huang, W., Li, X., Wang, Y. Current status on the development of pseudoviruses for enveloped viruses. Reviews in Medical Virology. 28, e1963 (2018).
- D'Apice, L., et al. Comparative analysis of the neutralizing activity against SARS-CoV-2 Wuhan-Hu-1 strain and variants of concern: Performance evaluation of a pseudovirus-based neutralization assay. Frontiers in Immunology. 13, 981693 (2022).
- Falzarano, D., Groseth, A., Hoenen, T. Development and application of reporter-expressing mononegaviruses: current challenges and perspectives. Antiviral Research. 103, 78-87 (2014).
- Gutierrez-Guerrero, A., Cosset, F. -L., Verhoeyen, E. Lentiviral vector pseudotypes: Precious tools to improve gene modification of hematopoietic cells for research and gene therapy. Viruses. 12, 1016 (2020).
- Zufferey, R., Nagy, D., Mandel, R. J., Naldini, L., Trono, D. Multiply attenuated lentiviral vector achieves efficient gene delivery in vivo. Nature Biotechnology. 15 (9), 871-875 (1997).
- Dull, T. A third-generation lentivirus vector with a conditional packaging system. Journal of Virology. 72 (11), 8463-8471 (1998).
- Berkhout, B. A Fourth generation lentiviral Vector: Simplifying genomic gymnastics. Molecular Therapy. 25 (8), 1741-1743 (2017).
- Wu, X. Development and evaluation of a pseudovirus-luciferase assay for rapid and quantitative detection of neutralizing antibodies against Enterovirus 71. Plos One. 8 (6), e64116 (2013).
- Ferrara, F., et al. Development of lentiviral vectors pseudotyped with Influenza B hemagglutinins: application in vaccine immunogenicity, mAb potency, and sero-surveillance studies. Frontiers in Immunology. 12, 661379 (2021).
- Hu, J., et al. Development of cell-based pseudovirus entry assay to identify potential viral entry inhibitors and neutralizing antibodies against SARS-CoV-2. Genes & Diseases. 7 (4), 551-557 (2020).
- Dalle Carbonare, L., et al. Serology study after BTN162b2 vaccination in participants previously infected with SARS-CoV-2 in two different waves versus naïve. Communications Medicine. 1 (1), 38 (2021).
- Di Genova, C., et al. Production, titration, neutralisation, storage and lyophilisation of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) lentiviral pseudotypes. Bio-protocol. 11 (21), e4236 (2021).
- Chmielewska, A. M., Czarnota, A., Bieńkowska-Szewczyk, K., Grzyb, K. Immune response against SARS-CoV-2 variants: The role of neutralization assays. NPJ Vaccines. 6 (1), 1-8 (2021).
- Chen, Q., et al. Development and optimization of a sensitive pseudovirus-based assay for HIV-1 neutralizing antibodies detection using A3R5 cells. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 14 (1), 199-208 (2018).
- Gauger, P. C., Vincent, A. L. Serum virus neutralization assay for detection and quantitation of serum neutralizing antibodies to influenza A virus in swine. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J). 2123, 321-333 (2020).
- Miglietta, R., Pastori, C., Venuti, A., Ochsenbauer, C., Lopalco, L. Synergy in monoclonal antibody neutralization of HIV-1 pseudoviruses and infectious molecular clones. Journal of Translational Medicine. 12 (1), 346 (2014).
- Chen, M., Zhang, X. -E. Construction and applications of SARS-CoV-2 pseudoviruses: A mini review. International Journal of Biological Sciences. 17 (6), 1574-1580 (2021).
- Zipeto, D., et al. Induction of human immunodeficiency virus neutralizing antibodies using fusion complexes. Microbes and Infection. 8 (6), 1424-1433 (2006).
- WHO Coronavirus (COVID-19) Dashboard. , https://covid19.who.int (2022).
- Zhou, P. A pneumonia outbreak associated with a new coronavirus of probable bat origin. Nature. 579 (7798), 270-273 (2020).
- Chen, X., Huang, H., Ju, J., Sun, R., Zhang, J. Impact of vaccination on the COVID-19 pandemic in U.S. states. Scientific Reports. 12 (1), 1554 (2022).
- Stefani, C., Fantoni, T., Bissoli, M., Thomas, J., Ruggiero, A. HIV and SARS-CoV-2 Co-Infection: From Population Study Evidence to In Vitro Studies. Life. 12 (12), 2089 (2022).
- Watson, O. J., et al. Global impact of the first year of COVID-19 vaccination: a mathematical modelling study. The Lancet Infectious Diseases. 22 (9), 1293-1302 (2022).
- Cantoni, D. Analysis of antibody neutralisation activity against SARS-CoV-2 variants and seasonal human coronaviruses NL63, HKU1, and 229E induced by three different COVID-19 vaccine olatforms. Vaccines. 11 (1), 58 (2023).
- Siracusano, G., et al. Different decay of antibody response and VOC sensitivity in naïve and previously infected subjects at 15 weeks following vaccination with BNT162b2. Journal of Translational Medicine. 20 (1), 22 (2022).
- Ruggiero, A. SARS-CoV-2 vaccination elicits unconventional IgM specific responses in naïve and previously COVID-19-infected individuals. eBioMedicine. 77, (2022).
- Piubelli, C. Subjects who developed SARS-CoV-2 specific IgM after vaccination show a longer humoral immunity and a lower frequency of infection. eBioMedicine. 89, 104471 (2023).
- Zhang, G. F. Infectivity of pseudotyped SARS-CoV-2 variants of concern in different human cell types and inhibitory effects of recombinant spike protein and entry-related cellular factors. Journal of Medical Virology. 95 (1), e28437 (2023).
- da Costa, K. A. S. Influenza A (N1-N9) and Influenza B (B/Victoria and B/Yamagata) neuraminidase pseudotypes as tools for pandemic preparedness and improved influenza vaccine design. Vaccines. 10 (9), 1520 (2022).
- Condor Capcha, J. M. Generation of SARS-CoV-2 spike pseudotyped virus for viral entry and neutralization assays: a 1-week protocol. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 7, 618651 (2021).
- Diomede, L., et al. Doxycycline inhibition of a pseudotyped virus transduction does not translate to inhibition of SARS-CoV-2 infectivity. Viruses. 13 (9), 1745 (2021).
